用途的制作方法

专利名称：：用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及BiP在制备用于预防或治疗骨丢失或骨吸收的组合物中的用途。本发明也涉及方法，例如诊断方法和测定方法，药物组合物、转基因动物以及制备他们的方法。
背景技术：
：骨再造失调是许多疾病病理学的主要部分。在这种情形下，骨再吸收破骨细胞群的加速产生和激活是由至今未确认的异常调节因子网络引起的。在过去的十年中，已经鉴定出控制造血干细胞和单核细胞/巨噬细胞前体向破骨细胞系定向和分化、破骨细胞增殖和激活的主要信号通路和转录因子(1-5)。现在认识到通过结合RANK配体(RANKL)的破骨细胞前体上组成性表达的NF-KB受体活化剂(RANK)信号传导和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的激活一起产生了导致成熟破骨细胞生成的系列事件。在体内由成骨细胞提供M-CSF和RANKL，其和假目标受体骨保护素(OPG)(6-7)一起负责调节破骨细胞分化和骨吸收。通过成骨细胞组分，其中全身性激素和细胞因子直接影响该过程，与RANKL/OPG的相对比精密地控制破骨细胞生成。但是，在病理状态(例如，类风湿性关节炎(RA))下，激活的丁细胞、成纤维样滑膜细胞及其他基质细胞可以另外提供RANKL(8-10)。RANKL-RANK结合通过几个关键阶段激活细胞信号传递级联反应。该过程依赖于TNF受体相关因子蛋白质(TRAFs)的募集、除Src-和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)介导的Akt激活之外的促分裂素激活的蛋白激酶级联反应(ERK、JNK和p38)，而且所有这些RANK信号路径最终都集中激活几个转录因子家族，例如NF-KB(11)、活化蛋白质-1(AP-I)(12)，特别是c-Fos(13)和激活的T细胞核因子(NFAT)，具体地是NFATcI(1;5;14;15)。小白鼠体内的功能缺矢突变体已经明确表明这些信号分子和转录因子在破骨细胞分化和激活中具有必需的作用(5)。已经报道了以不同方式已知作为结合免疫球蛋白蛋白质(BiP)或葡萄糖调节蛋白质(Grp)的人分子伴侣蛋白的抗炎特性(17)。已经克隆编码BiP的基因，而且也已经表达重组人(rhu)蛋白质(WO00/21995)。给具有胶原诱导关节炎(CIA)的小白鼠施用rhuBiP可以防止诱导试验性关节炎(17)。BiP抗炎作用机理的指征是发现对rhuBiP响应的T细胞克隆产生细胞因子IL-IO、IL-4和IL-5(18)，而且，BiP刺激的外周血(PB)单核细胞(MC)产生伴随TNF产生减少的高浓度IL-10。PBMC也造成IL-IR拮抗剂和可溶性TNFRII数量的增加(19)。从对BiP作出响应的PBMC中释放的细胞因子可以调节破骨细胞生成(20;21)。为了强化BiP的这些细胞外功能具有生物学关联性的事实，滑膜液的免疫测定己经显示来自RA病人的大部分滑膜液包含可溶性BiP(19)。已知CD86和HLA-DR表达下调后单核细胞(MO)的抗原提呈功能会降低，而且BiP可以延缓和防止纯化的PBMO发育成熟为不成熟的树状细胞(iDC)(22)。WO02/072133中描述了BiP在制备用于治疗不想要的免疫反应的药物中的用途。骨分别由称为成骨细胞和破骨细胞的特化细胞不断地产生或消化。由于骨形成和骨溶解之间的不平衡而导致骨腐蚀或变薄发生的疾病有许多。因此，该领域需要开发能调节(例如预防)该过程的药物。发明概述本发明部分上是以BiP抑制、防止或减少骨吸收和破骨细胞成熟这一令人惊讶的发现为基础的。在不希望受任何特定理论束缚的情形下，认为这种抑制是通过调节分化过程中被激活的必需信号通路而发挥作用的。因此，BiP尤其在调节骨丢失方面具有治疗用途。WO02/072133中已经教导BiP具有免疫调节特性，而且其中也描述了BiP治疗或防止不想要的免疫反应中的用途。此外，也公开了BiP治疗自身免疫疾病的用途。通过实施例，引用文献教导用BiP培养的人血液单核细胞释放可以下调在此讨论的自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎(RA)的IL-10。而且，Corrigall等(17)教导BiP可用于抑制类风湿性关节炎的发展，是免疫治疗这种紊乱的候选物。因此，虽然已经描述了BiP的免疫调节和抗炎特性，但现有技术没有公开在此介绍的BiP可以直接调节骨吸收和破骨细胞成熟这一令人惊讶的发现。体外破骨细胞分化测定中使用了在存在M=CSF和RANKL的条件下培养的小白鼠骨髓巨噬细胞(BMM)和人PBMC。结果显示在小白鼠和人分化测定中，通过酒石酸盐抗性酸性磷酸酶(TRAP)染色、玻璃体结合蛋白受体(VnR，otvf33)或F肌动蛋白环的存在目视观察到的破骨细胞的数目都降低了，而且这种变化与吸收活性的降低是平行的(图3)。而且，将BiP添加到成熟破骨细胞中降低了破骨细胞的数目(图4)。在此描述的更进一步的系列实验也己经对响应BiP的纯化PBMO中的基因表达的总体变化进行了研究。与未经过刺激的PBMO相比，利用Affymetrix基因阵列技术的实验已经显示纯化的PBMO的BiP治疗导致许多基因下调和上调。BiP下调在破骨细胞分化中都发挥重要作用或者对破骨细胞分化都必不可少的VnR(24)、CD44(25)、骨桥蛋白(26)、IK(14)和c-Fos(13)的表达(图5)。发明概要第一方面，提供BiP或其变异体、同系物、衍生物或片段在制备预防或治疗骨丟失的药物中的用途。第二方面，提供BiP或其变异体、同系物、衍生物或片段在制备预防或治疗骨吸收的药物中的用途。第三方面，提供BiP调节破骨细胞成熟的用途。第四方面，提供预防或治疗骨丢失的方法，包括施用BiP或其变异体、同系物、衍生物或片段以产生有益的预防或治疗效果。第五方面，提供预防或治疗骨吸收失的方法，包括施用BiP或其变异体、同系物、衍生物或片段以产生有益的预防或治疗效果。第六方面，提供调节破骨细胞发育的方法，包括使破骨细胞接触BiP或其变异体、同系物、衍生物或片段。第七方面，提供诊断由骨丢失引起或与骨丢失有关的疾病或综合症的方法，包括步骤(a)检测受试者的BiP活性；(b)与未受影响的对照比较BiP活性；和(c)将从对照中获得的数值与从受试者中获得的数值进行比较；其中，从对照中获得的数值与从受试者中获得的数值之间存在的差异指示受试者患有这种疾病或综合症。第八方面，提供了鉴定调节骨破坏或骨丟失的试剂的测定方法，包括步骤(i)选择调节BiP活性的试剂；禾Q(ii)测量存在所述试剂时破骨细胞的成熟情况；其中，缺少所述试剂和存在所述试剂时的破骨细胞成熟之间存在差异指示该试剂能调节骨组织破坏或骨丢失。第九方面，提供了包含下列步骤的方法(a)实施根据本发明的第八方面的测定方法；(b)鉴定调节骨破坏或骨丢失的一种或多种试剂；禾n(c)制备大量的已鉴定的一种或多种试剂。第十方面，提供通过根据本发明的第八方面的测定方法获取的试剂。第十一方面，提供确定BiP或其变异体、同系物、衍生物或片段对破骨细胞分化的影响的方法，包括步骤(a)将BiP添加到处于破骨细胞分化的一个或多个不同阶段的一个或多个破骨细胞中；和(b)确定BiP对破骨细胞生成的影响。第十二方面，本发明涉及鉴定在破骨细胞分化期间受BiP调节的一种或多种蛋白质的方法，包括步骤(a)在存在和缺少BiP的情况下分化破骨细胞；和(b)鉴定与缺少BiP时分化的破骨细胞相比，在有BiP时分化的破骨细胞中表达存在差异的一种或多种蛋白质。第十三方面，本发明涉及BiP或其变异体、同系物、衍生物或片段在制备预防或治疗骨质疏松症的药物中的用途。优选实施例本发明优选涉及BiP在制备治疗骨丢失药物中的用途。本发明优选涉及BiP在制备治疗骨吸收药物中的用途。本发明优选涉及BiP在治疗骨丢失中的用途。本发明优选涉及BiP在治疗骨吸收中的用途。骨丢失或骨吸收优选是与癌症或癌转移有关的骨破坏。这种骨组织破坏与这此讨论的其他形式的骨丢失具有相同的生物学基础。骨丢失或骨吸收优选与肌肉骨骼疾病有关。肌肉骨骼疾病优选是骨质疏松症。调节优选是抑制、减少或防止破骨细胞的成熟或发育。破骨细胞成熟的调节优选在体内或体外实施。破骨细胞优选是破骨细胞前体、多核前体或成熟的破骨细胞。优选的，在根据本发明第七方面的方法中，与从对照中获得的数值相比，BiP活性降低。根据本发明第七方面的方法优选包含测量破骨细胞发育或骨吸收的可选歩骤。优选的，在此描述的试剂升高或下调BiP活性。优选的，在根据本发明第i^一方面的方法中，以0.02-20jag/ml的浓度添加BiP。优选通过测量TRAP活性、VnR和/或F-肌动蛋白环来量化破骨细胞的数目。根据本发明第十一方面的方法优选包含量化骨吸收的可选步骤。优选的，利用测量一种或多种破骨细胞特异标记表达的PCR来证实破骨细胞分化。破骨细胞特异标记优选是降钙素受体基因或组织蛋白酶K基因。优选的，根据本发明第十二方面鉴定的蛋白质是信号分子或转录因子。优选的，在根据本发明第十二方面的方法中，优选在培养开始时或出现多核破骨细胞的培养接近结束时的24-72hr期间内添加BiP。优选利用qt-RT-PCR禾n/或Western印迹检测编码蛋白质的核酸或蛋白质。图1BiP.FITC结合外周血单核细胞。利用人血清白蛋白.FITC(实线)或BiP.FITC(空白线)在(C对人单核细胞进行染色，持续20mins，并通过流式细胞计测量荧光。FACscan直方图是利用Cellquest软件产生的。图2BiP在小鼠颅盖模型中抑制骨吸收。将BiP(l-1000ng/ml)添加到用RANKL孵育5天的小鼠颅盖中。通过钙释放确定骨吸收。图3BiP与M-CSF和RANKL—起添加时对破骨细胞分化的影响。与单独用M-CSF+RANKL的对照培养相比，在用BiP(0.02-20pg/ml)和M-CSF+RANKL培养人单核细胞14天后，用TRITC毒伞素来检测F-肌动蛋白环阳性细胞。通过甲苯胺蓝染色牙本质切片上的骨吸收陷窝骨吸收陷窝来测量骨吸收。*p<0.03。图4添加BiP到成熟破骨细胞中。在第10天，添加BiP(2-5(Vg/ml)到成熟的人破骨细胞中。在第14天，利用TRITC-毒伞素测量F-肌动蛋白环阳性的细胞。图5通过Affymetrix基因阵列测量BiP诱导的基因活性的成倍降低。利用通过免疫磁珠负选择制备的，在缺少或存在BiP(20pg/ml)的条件下培养24小时的纯化的人单核细胞进行双重Affymetrix基因阵列芯片分析。表达的倍数差异通过BiP处理的和静息的细胞间基因表达的差异来计算。所有的数据通过GeneSpring软件分析。图6Affymetrix基因阵列分析。用BiP刺激或者不刺激纯化的单核细胞，测量基因活化，并在一式两份样品中进行比较。照这样标记了在R&D细胞因子基因阵列上因为出现类似上调或下调而被记录的那些基因(*)，或者流式细胞计和/或蛋白质生产已经证实的那些基因CJ。降低-20倍是BiP处理的单核细胞中缺少基因活性的图形显示。发明详述BIP在此使用的术语"BiP"指WO00/21995中公开的78kD的内质网伴侣蛋白。优选的BiP多肽具有WO00/21995的第23页的附录2所示的氨基酸序列。BiP蛋白质优选具有WO00/21995的SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。在此使用的BiP序列优选缺乏标签，例如存在于上文提到的多肽中的6His标记。在此使用的术语"氨基酸序列"和术语"多肽"和/或术语"蛋白质"同义。在有些情况下，术语"氨基酸序列"和术语"肽"同义。在有些情况下，术语"氨基酸序列"和术语"蛋白质"同义。BiP蛋白质优选由WO00/21995的SEQIDNO.3给出的核苷酸序列编码。核苷酸序列可以是基因组、合成或重组来源的DNA或RNA，例如cDNA。核苷酸序列可以是代表有义链或反义链或其组合的双链或单链。利用重组DNA技术(例如重组DNA)可以制备核苷酸序列。特别值得注意的是WO00/21995中公开了在大肠杆菌中表达BiP和纯化重组蛋白质的方法。核苷酸序列可以与天然形式相同，或者可以是其片段、同系物、变异体或衍生物。这里使用的术语"BiP活性"指BiP表达和/或活性的水平和/或模式。破骨细胞在此使用的术语"破骨细胞"指积极重新吸收骨以便成骨细胞能够替代新生骨的细胞。该术语至少包括破骨细胞前体、多核破骨细胞前体和成熟破骨细胞。对于破骨细胞再吸收骨水平异常(例如，水平异常高)和成骨细胞形成骨水平正常的疾病，例如肌肉骨骼疾病，例如骨质疏松症，破骨细胞是治疗靶标。举例来说，治疗策略依赖于降低破骨细胞数目或破骨细胞的吸收活性。这种策略可以用来恢复骨吸收和形成之间的平衡，在本发明的上下文中，治疗目标是利用BiP调节(例如抑制)破骨细胞发育，优选是调节破骨细胞成熟。在本发明的上下文中，破骨细胞成熟也包括所附实施例中描述的破骨细胞分化和发育。破骨细胞成熟包括，但不局限于破骨细胞前体(例如分化)或多核前体成熟发育为成熟破骨细胞。有关成骨细胞和破骨细胞在骨形成和吸收过程中的综述可以参考H.Fleisch,BisphosphonatesInBoneDisease,FromTheLaboratoryToThePatient,3rdEdition,ParthenonPublishing(1997)。依照背景信息可知破骨细胞是与骨重新塑型有关的骨再吸收细胞。他们是富含酒石酸盐抗性酸性磷酸酶的多核吞噬细胞，由来源于单核细胞z巨噬细胞系的前体细胞融合形成。已经鉴定了几个在调节破骨细胞分化过程中非常重要的分子(BrMedJ1997;315:469-472)。早期破骨细胞前体上表达的转录因子PU-I是破骨细胞和单核细胞初期分化所必需的，而包括c-fos和NF-kB的其他转录因子在刺激已定向前体分化为成熟破骨细胞的过程中起重要作用。破骨细胞的形成和激活也依赖于破骨细胞前体和骨髓基质细胞之间的紧密接触。基质细胞分泌细胞因子M-CSF，M-CSF对于来自常见前体的破骨细胞和巨噬细胞的分化是必不可少的。基质细胞也在细胞表面上表达被称为RANK配体(RANKL)的分子，RANK配体与破骨细胞前体上的另一种被称为RANK(核因子kB受体活化剂)细胞表面受体相互作用从而促进破骨细胞前体向成熟的破骨细胞分化。被称为骨保护素(OPG)的另一种分子可以阻断RANK-RANKL相互作用，骨保护素是RANK的"假"配体，因此是破骨细胞形成的有效抑试剂。成熟的破骨细胞在骨表面形成密封层，并通过分泌经"皱折缘"进入在破骨细胞下方的间隙(豪希普陷窝)的盐酸和蛋白水解酶来再吸收骨。皱折缘的形成关键取决于一种细胞膜相关信号蛋白质c-src的存在。破骨细胞分泌的盐酸可以溶解羟基磷灰石，而且盐酸也允许蛋白水解酶(主要是组织蛋白酶K和基质金属蛋白酶)降解胶原及其他基质蛋白质。已经确定在调节破骨细胞活性中起重要作用的分子包括催化破骨细胞内氢离子形成的碳酸酐酶II(Ca-II);编码破骨细胞质子泵亚单位的TCIRG1以及降解胶原及其他非胶原蛋白质的组织蛋白酶K。完成吸收之后，破骨细胞将经历程序性细胞死亡(凋亡)，这也称为预示骨形成开始的逆转阶段。骨丢失与骨丢失有关或与骨丢失相关的紊乱包括，但不局限于佩吉特(氏)病、原发性和继发性骨质疏松症、绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、牙周病、牙槽骨丢失、截骨术后的骨丢失和儿童期自发性骨丢失、骨质疏松症的长期并发症例如脊椎骨弯曲和高度损失，和假体手术的长期并发症，以及假体关节例如髋、膝等等的松弛。骨丢失可以表现为骨破坏、骨腐蚀、骨变薄或骨消化。骨沉积和骨吸收平衡的病理变化会导致上述情况发生，这一点是很明显的。在另一个的实施方案中，BiP可以用于治疗与低骨质量有关的状况。当骨质量水平低于世界卫生组织骨折风险评估及其筛选绝经后骨质疏松(1994)的应用，世界卫生组织研究组的报告，世界卫生组织技术系列843的标准(standardsbyWorldHealthOrganizationAssessmentofFractureRiskanditsApplicationtoScreeningforPostmenopausalOsteoporosis(1994))所限定的特定年龄的正常值时，这种情形是很明显的。短语"骨质量低的状态"也指脊椎动物，例如患骨质疏松症的机会比平均机会显著增高的己知脊椎动物，例如哺乳动物(例如绝经后妇女，年龄50岁以上的男人)。其他的骨质量增加或增强的用途包括骨恢复、增加骨折愈合速度、完全代替骨移植手术、增强成功骨移植的比率、面部再建或上颌骨再建或下颌骨再建后的骨愈合、假体向内生长、脊椎骨结合或长骨延伸。在高度优选的实施方案中，BiP被用来预防或治疗骨吸收。在本发明的上下文中，通过直接或间接改变破骨细胞的形成或活性来调节(例如防止)骨吸收从而预防或治疗骨吸收。通过直接或间接改变破骨细胞的形成或活性来抑制从矿物相和/或有机基质相中除去存在的骨可以调节骨吸收。人及其他哺乳动物的多种紊乱包括异常的骨吸收或与异常的骨吸收有关。这种紊乱包括，但不局限于骨质疏松症、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、佩吉特(氏)病、异常增加的骨翻转、牙周病、牙丢失、骨折、假体周围骨质溶解、成骨不全、转移性骨疾病、恶性肿瘤高钙血症和多发性骨髓瘤。骨丢失或骨吸收优选与肌肉骨骼疾病，例如骨质疏松症或佩吉特(氏)病有关。骨丢失或骨吸收优选导致肌肉骨骼疾病，例如骨质疏松症或佩吉特(氏)病的基础。在高度优选的实施方案中，这种与骨丢失或骨吸收有关的情形是骨质疏松症。骨质疏松症是社会上主要的健康问题，即使存在其他的导致骨质量降低的疾病，即佩吉特(氏)病，骨质疏松症目前仍然是最常见的疾病，而且从卫生保健的角度来说，这种疾病的花费也是最多的。因为雌激素是直接和间接调节骨代谢的激素，因此绝经后妇女中雌激素生成的下降和雄激素(在男性体内酶促转变为雌激素)的生成随年龄的衰退导致患骨质疏松症的风险，估计年龄在45岁以上的85%的妇女和15%的男性都存在患骨质疏松症的风险。在骨质疏松症中，通常会发生由于衰老过程而导致成骨细胞负责的骨形成的下降。关于骨质疏松症的一个最令人遗憾的误解是普遍认为骨质疏松症几乎是专门的衰老病。虽然经绝后骨质疏松是老年妇女疾病最常见的疾病之—，但其导致骨丢失残废的过程在很早以前就开始了。实际上，估计年龄在25-35之间的女性群体中有令人吃惊的大部分人存在加快的骨丢失。在女性生命一半的时间里，即在女性开始经历绝经症状以前，骨丟失己经发生了。治疗"继发性骨质疏松症"的方法也包括在本发明的范围内。"继发性骨质疏松症"包括，但不局限于脊椎动物，例如哺乳动物(包括人)中的糖皮质激素诱导的骨质疏松症、甲状腺机能亢进诱导的骨质疏松症、固定诱导的骨质疏松症、肝素诱导的骨质疏松症和免疫抑制诱导的骨质疏松症。利用本领域已知的各种方法，例如实施骨吸收评估可以确定骨丢失或骨吸收的存在。这是骨丢失生物化学标记的非侵入性评价。在利用其他措施，例如骨密度检测这些问题很久以前，也可以利用它来测量骨丢失速度。因为骨基质骨架经历吸收，因此稳定胶原的交联例如脱氧吡啶诺林(D-pyd)和/或吡啶(Pyd)会在尿中排泄，，他们相对于正常水平的水平是骨丢失速度多快的指征。当这些标记水平高时，表明骨正在以大于机体能够替换它的速度丢失。另夕卜，通过临床技术，例如脊柱和/或股骨颈的双能X射线吸收仪(DEXA)扫描可以确定骨丢失或吸收。在哺乳动物中甚至可以促进骨生长。有益于促进骨生长的情形包括在脊椎动物，例如哺乳动物(包括人)等等中增强骨移植、诱导脊椎骨结合、增强长骨延伸、在面部再建、上颌骨再建和/或下颌骨再建后增强骨愈合。诊断在更进一步的方面，本发明涉及诊断由骨丢失或骨吸收引起的疾病或综合症，或与骨丢失或骨吸收有关的疾病或综合症的方法。为了提供诊断这种疾病的基础，应建立BiP表达和/或活性的正常或标准水平或模式。通过测试来自一个或多个正常受试者，例如正常动物或受试验的人的样品中的BiP的表达和/或活性的水平或模式可以完成这一过程。通过将样品中的BiP与系列稀释的阳性对照进行比较可以量化样品中BiP表达和/或活性的标准水平和/或模式，其中系列稀释的阳性对照中BiP的表达和/或活性的水平或模式的量是已知的。然后，将从正常样品中获得标准值与从样品中获得的数值相比较，其中样品来自可能受骨丢失或骨吸收引起的疾病或与骨丢失或骨吸收有关的疾病影响的受试者。对照和受试者的数值的偏差可以用来确定疾病状态的存在。典型地，与对照相比，来自可能受疾病影响的受试者的样品中的这种偏差会是BiP表达和/或活性的水平或模式的下降。为了实现诊断，量化破骨细胞和成骨细胞是必需的，在破骨细胞吸收骨水平异常(例如，水平异常高)和成骨细胞形成骨水平正常的疾病，例如肌肉骨骼疾病，例如骨质疏松症的诊断中更是如此。通过量化破骨细胞和成骨细胞，确定骨吸收和形成之间的平衡并确定疾病或综合症是否与这种平衡之间出现不平衡有关症是可能的。BiP多核苷酸或其片段、变异体、同系物或衍生物为诊断试验提供了基础。为诊断的目的，BiP多核苷酸序列或其任何部分可以用来检测和量化BiP基因表达和/或活性。例如编码BiP的多核苷酸序列，例如WO00/21995的SEQIDNo.3可以用于样品杂交或PCR测定以检测BiP表达的异常。这种定性或定量方法的形式包括Southern或Northern分析、斑点印迹或其他基于膜的技术；PCR技术；标尺、针或芯片技术；以及ELISA或其他多样品形式技术。所有这些技术本领域已经熟知，而且他们实际上也是许多市场上可买到的诊断试剂盒的基础。例如通过从受试者，例如人取样可以实施诊断测定。从样品中提取核酸，例如DNA、cDNA或RNA。利用PCR，例如实时定量PCR(qRT-PCR)可以检测BiP表达。可以设计PCR引物以检测BiP。WO00/21995中列出了这些引物的实例。BiP诊断测定也可以包括利用抗体，优选融合到标记上的抗体检测包含，例如体液、细胞，例如来自或来源于骨的细胞(例如破骨细胞)、组织、这些组织的切片或提取物的样品中的多肽的方法。可以使用修饰或未经修饰的多肽和抗体。通常通过共价或非共价地将多肽和抗体与报告分子连接来标记他们。多种报告分子是本领域普通技术人员己知的。BiP特异性抗体也可以用于诊断在此描述的疾病。利用具有确定的特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争性结合或免疫放射测定的多种操作规程在本领域已知的。这种免疫测定典型地包括BiP和它的特异性抗体(或类似的受体结合分子)之间形成复合物和测定复合物的形成。免疫测定可以是利用与BiP上的两个互不干扰的表位反应的单克隆抗体的基于双位点单克隆的免疫测定。也可以使用竞争性结合测定。MaddoxDE等(1983，JExpMed158:1211)中描述了这种测定的实例。这种诊断测定甚至适合于评估特殊治疗方案的功效，而且也可以用于动物研究、临床试验或监测病人个体的治疗。为了提供诊断疾病的基础，应如上所述建立BiP表达的正常、标准或对照图谱。标准和受试者的数值间的偏差可以确定疾病状态的存在。如果确立了一种或多种疾病状态，那么就可以施用已有的治疗剂，而且也可以产生治疗谱或数值。最后，可以定期重复测定以判定所述数值是前进了，还是回到了正常或标准模式。连续的治疗谱可以用来显示几天或几个月期间的治疗功效。因此，更进一步的方面提供了确定至少一种药物或给药方案预防或治疗骨组织破坏或骨丢失的有效性的方法(优选体外方法)，所述方法包括(a)测量存在所述药物或给药方案时的BiP活性；和(b)至少确定与对照相比所述药物或给药方式在预防或治疗骨组织破坏或骨丢失方面是否有效。优选的是，可能受骨破坏或骨丢失引起的疾病或与骨破坏或骨丢失有关的疾病影响的受试者体内的BiP表达和/或活性的水平或模式与从对照中获得的标准值相比下降了。诊断方法甚至可以包括检测破骨细胞成熟或骨吸收的可选步骤。样品在此使用的术语"样品"具有其通常的含义。样品可以是依照本发明的方法测定BiP表达和/或活性水平和/或模式的任何物理实体。样品可以是其中破骨细胞发育或骨吸收被测量的任何物理实体。样品可以是或来源于生物材料，例如组织、细胞(例如破骨细胞)或液休。组织、细胞或液体可以是或来源于骨。样品可以是或来源于活检或尸检。测定方法更进一步的方面，本发明提供了鉴定调节骨破坏或骨丢失试剂的测定方法。相应的，测定方法可以用来鉴定一种或多种试剂，其是BiP拮抗剂，其减少，降低或减低BiP表达和/或活性的水平或模式。本发明的测定方法优选可以用来鉴定一种或多种试剂，其是BiP激动剂，其加强，增强或增加BiP表达和/或活性的水平和/或模式。激动剂通过加强，增强或增加BiP表达和/或活性可以调节与骨丢失或骨消化有关的紊乱，例如与骨质疏松症有关或是骨质疏松症导致的骨丢失或骨吸收。激动剂通过加强，增强或增加BiP表达和/或活性可以方便地抑制、减少或降低破骨细胞的成熟。融合蛋白质可以用于高通量筛选测定以鉴定调节BiP活性和/或表达的试剂(参见D.Bennettetal.,JMolRecognition,8:52-58(1995);andK,Johansonetal,JBiolChem,270(16):9459-9471(1995))。另一种筛选技术基于WO84/03564中详细描述的方法，其提供了高通量筛选(HTS)具有适当结合亲和力的试剂的方法。筛选的概要说明可以参见RamakrishnaSeethala，PrabhavathiB.Fernandes.NewYork,NY,MarcelDekker,2001编车葺的HandbookofDrugScreening(ISBN0-8247-0562-9)。预期本发明的测定方法适合于试剂的小规模和大规模筛选，以及定量测,丄，疋。筛选方法可以通过直接或间接与试剂有关的标记测量试剂与BiP的结合。另外，筛选方法包括与标记的竞争物的竞争。可以筛选多种试剂。当候选化合物是蛋白质，例如抗体或肽时，可以利用噬菌体显示技术筛选候选化合物库。噬菌体显示是利用重组噬菌体的分子筛选规程。该技术包括用编码候选化合物库的基因转化噬菌体，这样每个噬菌体或噬菌颗粒都表达一个特定的候选化合物。转化的噬菌体(优选固定到固相载体上)表达适当的候选化合物并显示在他们的噬菌体外壳上。通过以亲合相互作用为基础的选择策略富集能够与BiP相互作用的特异候选化合物。然后描述成功的候选试剂的特性。噬菌体显示具有优于标准亲和配体筛选技术的优点。噬菌体表面以与候选试剂的天然构象更相似的三维构型形式显示候选试剂。这为实现筛选目标提供了更特异和更高亲合力的结合。另一个筛选化合物库的方法利用被表达化合物库的重组DNA分子稳定转化的真核或原核宿主细胞。活的或固定形式的这种细胞都可以用于标准结合配偶体测定。也参见描述检测细胞反应的灵敏方法的Parceetal.(1989)Science246:243-247和Owickietal.(1990)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA87;4007-4011。竞争性测定特别有用，其中表达化合物库的细胞用标记抗体，例如1251抗体和测试样品，例如其对结合组合物的结合亲合性正被测量的候选化合物，一起孵育。然后分离结合和游离的被标记的结合配偶体以评价结合程度。测试样品结合的数值与结合的标记抗体的数值成反比。可以使用许多技术中的任何一种技术从游离的结合配偶体中分离结合的配偶体以评价结合的程度。分离步骤典型地可以包括例如，吸附到滤纸上然后进行洗涤、吸附到塑料上然后进行洗涤或离心细胞膜的过程。候选化合物筛选的另一个技术包括WO84/03564中详细描述的提供高通量(HTS)筛选具有适当结合亲和力的新化合物的方法。首先，在固体基片，例如塑料针或其它适当的表面上合成大量不同的小肽试剂。然后让所有的针与溶解的蛋白质起反应，并进行洗涤。下一步包括检测结合的蛋白质。可利用单克隆抗体完成检测。因此可以鉴定特异地与蛋白质相互作用的化合物。可能与BiP相互作用的候选化合物的合理设计可以以蛋白质和/或它的体内结合配偶体的分子形态的结构研究为基础。确定哪个位点与特定其他蛋白质相互作用的一种方式是物理结构测定，例如X射线结晶学或二维的NMR技术。这些将为哪个氨基酸残基形成分子接触区提供指导。蛋白质结构测定的详细说明可以参见，例如BlundellandJohnson(1976)ProteinCrystallography,AcademicPress,NewYork。-一旦已经鉴定出调节BiP活性和/或表达的试齐IJ，就可以利用，例如在此描述的方法测量存在所述试剂时，破骨细胞成熟或骨吸收状况。a)缺少试剂时的破骨细胞成熟或骨吸收与b)存在试剂时的破骨细胞成熟或骨吸收之间存在差异显示试剂可以调节骨组织破坏。差异优选是存在试剂时，破骨细胞成熟被降低或受抑制。差异优选是存在试剂时，骨吸收被降低或受抑制。只通过举例来说，可以利用冲击研究(pulsestudies)来评价破骨细胞成熟或骨吸收，其中例如，在前体分化早期或形成多核细胞之后添加BiP。在适当的时间，固定培养物并，或者利用抗体，例如23C6抗体(例如，来自eBioscienceInc的产品目录编号14-0519)和TRITC-毒伞素分别通过免疫定位的方法针对TRAP活性或者VnR和F-肌动蛋白环进行组织化学染色，并量化破骨细胞的数目。从牙本质切片中除去破骨细胞并利用甲苯胺蓝染色后，可以量化吸收。通过分子技术，例如测量破骨细胞特异的标记基因，例如降钙素受体和组织蛋白酶K表达的实时PCR可以另外确认破骨细胞的分化。调节在BiP以及骨吸收和破骨细胞成熟调节的上下文中，术语"调节"优选地指利用BiP防止、制止、减轻、降低、抑制或防止骨吸收和破骨细胞的成熟。因此，本发明尤其涉及测定调节或影响BiP表达和/或活性的水平和/或模式的调节的方法、过程以及试剂。举例来说，如果BiP表达和/或活性的水平和/或模式被防止、制止、减轻、降低、抑制或防止，那么破骨细胞的成熟和骨吸收就能够恢复、升高或增加。优选的情形是，BiP表达和/或活性的水平和/或模式恢复、升高或增加，因此破骨细胞的成熟和骨吸收就能够被防止、制止、减轻、降低、抑制或防止。试剂试剂可以是有机化合物或其他化学试剂。试剂可以是从任何适当来源获得的或通过任何适当来源生产的天然或人工化合物。试剂可以是氨基酸分子、多肽或其化学衍生物或者它们的组合。试剂甚至可以是多核苷酸分子，其中多核苷酸分子可以是有义或反义分子，或抗体，例如多克隆抗体、单克隆抗体或单克隆人源化抗体。已经研发了生产具有人特性的单克隆抗体的多种策略，其绕过了对生产抗体的人细胞系的需要。例如通过连接啮齿类动物的可变区和人恒定区已经将有用的鼠单克隆抗体"人源化"(Winter,G.andMilstein,C.(1991)Nature349,293-299)。这种方式降低了抗体的人抗鼠免疫原性，但由于外来的V区域框架而保留了剩余的免疫原性。而且，抗原结合特异性基本上是鼠供体的抗原结合特异性。CDR嫁接和框架操作(EP0239400)已经将抗体操作改善和改进到能生产人体治疗性应用可接受的人源化鼠抗体的程度。利用本领域众所周知的其他方法可以获取人源化抗体(例如，US-A-239400中描述的方法)。通过可水解的双功能衔接物可以将试剂附着于实体(例如有机分子)上。可以设计或者从包括肽及其他化合物，例如小有机分子的化合物库中获取实体。举例来说，实体可以是天然物质、生物高分子、从生物材料，例如细菌、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制备的提取物、有机或无机分子、合成剂、半合成试剂、结构或功能模拟物、肽、肽模拟物、切割完整蛋白质所得到的肽、合成的肽(例如，利用肽合成器或重组技术或其组合合成)、重组试剂、抗体、天然或非天然试剂、融合蛋白质或其等效物和突变体、衍生物或其组合。实体典型地是有机化合物。在一些实例中，有机化合物包括两个或更多个烃基。术语"烃基"在在此指至少包含C和H的并且可选地包含一个或多个其他适当的取代基的基团。这种取代基的实例可以包括卣素、烷氧基、硝基、烷基、环状基团等等。除取代基是环状基团这种可能性之外，取代基的组合也可以形成环状基团。如果烃基包含一个以上C，那么那些碳不必彼此连接。例如至少两个碳可以通过适当的元件或基团连接。因此，烃基基团可以包含杂原子。适当的杂原子对本领域熟练技术人员来说是显而易见的，例如，包括硫、氮和氧。在一些应用中，实体优选包含至少一个环状基团。环状基团可以是多环基团，例如未融合的多环基团。在一些应用中，实体包含所述环状基团中的至少一个与另一个烃基连接。实体可以包含卤素基团，例如氟、氯、溴或碘基团。如上所述，试剂可以是抗体。本领域众所周知的方法可以用来生产BiP的抗体。这种抗体包括，但不局限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和通过Fab表达库产生的片段。诊断和治疗特别优选中和抗体，即调节BiP生物活性的那些抗体。为了生产抗体，可以通过注射一种或多种在此描述的多肽或其任何部分、变异体、同系物、片段或衍生物或保留免疫原特性的寡肽免疫包括山羊、兔子、大白鼠、小白鼠等等的各种宿主。取决于宿主物种，可以用多种佐剂增强免疫反应。这种佐剂包括，但不局限于弗氏佐剂、矿物凝胶，例如氢氧化铝，表面活性物质，例如溶血卵磷脂、复合多元醇、多聚阴离子、肽、油乳胶、钥孔血蓝素和二硝基酚。可以使用的BCG(卡介苗)和短棒状杆菌是可能有用的人佐剂。抗体优选是单克隆抗体。利用能通过培养传代细胞系产生抗体分子的任何技术可以制备单克隆抗体。这些技术包括，但不局限于KoehlerandMilstein(1975Nature256:495-497)最先描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kosboretal(1983)ImmunolToday4:72;Coteetal(1983)ProcNatlAcadSci80:2026-2030)和EBV杂交瘤Inc,pp77-96)。另外，可以使用为产生"嵌合抗体"而研发的，可以将小白鼠抗体基因与人抗体基因拼接以获取具有适当抗原特异性和生物活性的分子的技术(Morrisonetal(1984)ProcNatlAcadSci81:6851-6855;Neubergeretal(1984)Nature312:604-608;Takedaetal(1985)Nature314:452-454)。另外，可以改动己描述的产生单链抗体的技术(美国-A-4，946,779)以产生抑制剂特异的单链抗体。通过Orlandi等(1989,ProcNatlAcadSci86:3833-3837)，以及WinterG和MilsteinC(1991;Nature349:293-299)公开的体内诱导淋巴细胞群体产生，或者通过筛选重组免疫球蛋白库或高度特异结合试剂组也可以产生抗体。也可以产生包含BiP特异结合部位的抗体片段。例如这种片段包括，但不局限于可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab')2片段和可以通过还原F(ab')2片段的二硫键而产生的Fab片段。或者，可以构建允许迅速和容易鉴定具有想要特异性的单克隆Fab片段的Fab表达库(HuseWDetal(1989)Science256:1275-1281)。一种可替换的技术包括筛选噬菌体显示库，例如他们的膜表面上表达具有多种互补决定区(CDRs)的scFv片段。该技术在本领域为大家所熟知。抗体优选是人源化抗体。通过用人蛋白质替换小白鼠抗体的恒定区，并利用人蛋白质替换部分抗体可变区已经获得人源化抗体。通常，人源化抗体的5-10%来源于小白鼠，90-95%来源于人。开发人源化抗体以对抗鼠和嵌合抗体会出现的免疫反应。临床试验中使用的人源化抗体的数据显示人免疫系统对人源化抗体产生最低限度的应答或者不产生应答。人源化抗体的一个更复杂的方法不仅包括提供从人衍生得到的恒定区，而且也包括修饰可变区。这种方式允许尽可能以接近人抗体形式改造抗体。重链和轻链的可变区都包含三个根据所讨论的抗原和决定结合能力而变化的互补决定区(CDRs)，其侧面连接有在给定的物种中相对保守的并推定为CDRs提供支架的四个框架区(FRs)。当制备出针对特殊抗原的非人抗体时，可以通过将来源于非人抗体的CDRs嫁接到被修饰的人抗体的FRs上以"改造"或"人源化"可变区。例如，CancerRes(1993)53:851-856，Nature(1988)332:323-327,Science(1988)239:1534-1536,ProcNatlAcadSciUSA(1991)88:4181-4185和JImmunol(1992)148:1149-1154中己经报道了这种方法。依照本发明的试剂可以结合编码BiP的核苷酸序列、或与核苷酸编码序列有关的控制区域或它的对应RNA转录产物以调节(例如增加)BiP转录或翻译的速度。例如通过调节BiPmRNA的转录或调节mRNA的处理过程等等可以调节BiP的表达。也可以将调节BiPmRNA翻译BiP的过程作为调节蛋白质表达的方式。这种调节可以利用本领域已知的方法，例如利用影响转录或翻译的试剂。这种试剂甚至可以调节更进一步的实体的活性。特别优选增加、增强或上调BiP表达和/或活性的试剂。从这方面来讲，试剂可以是通过，例如同源重组插入的调节序列，例如增加、增强或上调BiP表达的启动子或增强子。优选在插入调节序列后，可操作地连接BiP和调节序列。通过这种方式将"可操作地连接的"调节序列连接到BiP编码序列上以实现编码序列能够在与对照序列相适合的条件下表达。前体药物本领域熟练技术人员应理解实体可能来源于前体药物。前体药物的实例包括不具有药理学活性的某些被保护的基团，但是在某些情况下，可以施用(例如口服或胃肠外施用)它们，它们随后在体内能够代谢形成有药理学活性的实体。适当的前体药物包括，但不局限于阿霉素、丝裂霉素、石炭酸芥末、密都锭、抗叶酸剂、氯霉素、喜树碱、5-氟尿嘧啶、氰化物、奎宁、潘生丁和紫杉醇。试剂(例如，抗体或其片段)可以通过化学方法与敢兴趣的酶连接。另外，连接物可以是利用重组DNA技术生产的融合蛋白质，其具有抗体可变区基因和酶编码基因。前体药物优选是无毒的对内源性酶作用具有抗性的药物，只能由靶酶将其转变为有活性的药物。Senetr&Springer(2001)AdvancedDrugDeliveryReviews53,247-264中综述了mAb-酶连接物选择性激活抗癌前体药物的情形。应更进一步地理解某些被称为"前部分"的部分，例如H.Bundgaard,Elsevier,1985的"DesignofProdrugs"中描述的部分可以被放置在该试剂的适当功能区。这种前体药物也包括在本发明的范围内。该试剂可以以药学可接受的盐，例如添加酸的盐或碱性盐，或其溶剂化物，包括其水合物的形式存在。关于适当的盐的综述参见Bergeetal，J.Pharm.ScL，1977,66,1-19。本发明的试剂能显示出其他的治疗特性。该试剂可以与一种或多种其他药学活性剂组合使用。如果施用活性剂组合，那么可以同时、分别或依次地施用活性剂组合。立体和几何异构体实体可以以立体异构体和/或几何异构体存在，例如实体可以具有一个或多个不对称中心和/或几何中心，因此可以存在两种或多种立体异构形式和/或几何异构形式。本发明意图利用那些实体的所有单独的立体异构体和几何异构体，以及他们的混合物。药物的盐本发明的试剂可以以药学可接受的盐的形式施用。药学可接受的盐为本领域熟练技术人员所熟知，例如，包括Berge等在丄Pharm.Sci.,66,1-19(1977)中提到的那些盐。适当的添加酸的盐由形成无毒盐的酸形成，包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、醋酸盐、三氟醋酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、抗坏血酸、琥珀酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯碘酸盐和苯甲磺酸i卜jm。当存在一种或多种酸部分时，形成无毒盐的碱可以形成适当的药学可接受的添加碱的盐，包括铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌，和药学上有活性的胺，例如二乙醇胺盐。将试剂的溶液与想要的酸或碱一起混合可以适当地很容易地制备试剂的药学可接受盐。盐可以从溶液中沉淀出来，通过过滤可以收集盐，或者可以通过蒸发溶剂回收盐。试剂可以以多晶型存在。本发明的试剂可以包含一个或多个不对称的碳原子，因此它存在两个或多个立体异构形式。试剂包含链烯基或亚链烯基基团时，也可能出现顺式(E)和反式(Z)异构现象。本发明包括试剂独立的立体异构体，以及其独立的互变异构形式和其混合物。通过常规技术，例如通过试剂的立体异构混合物或其适当的盐或衍生物的分步结晶、色谱法或H.P.L.C.可以实现分离非对映异构体或顺反异构体。从对应的光学纯的中间物或者通过利用适当的手性支持的对应的外消旋物的分辨，例如通过H.P丄.C.，或者通过对应的外消旋物与视情况而定的光学活性的酸或碱反应形成的非对映异构的盐的分步结晶也可以制备试剂独立的对映体。试剂也可以包括试剂或其药学可接受的盐所有适当的同位素变异体。试剂或其药学可接受的盐的同位素变异体被定义为其中至少一个原子被具有相同原子序号，但原子质量不同于自然界中通常发现的原子质量的原子替代。可以包含到到试剂和其药学可接受的盐中的同位素实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，例如分别为2H,3H,'3C/4C,15N,170，180,31P,32P,35S，18F和36C1。试剂和其药学可接受的盐的某些同位素变异体，例如其中包含了放射性同位素，例如3H或14C的同位素变异体可用于药物和/或底物组织分布研究中。同位素氚，即SH和碳14，即"C因为容易制备和检测，所以是特别优选的。另外，用同位素，例如氖，即"H进行替换可以提供由更高的代谢稳定性带来的某些治疗优点，例如体内半衰期增加或降低的给药量，因此在某些情况下是优选的。通常，通过常规程序利用适当试剂的合适的同位素变异体可以制备本发明的试剂和其药学可接受的盐的同位素变异体。药学上有活性的盐可以以药学可接受的盐施用试剂。典型地，利用视情况而定的想要的酸或碱可以很容易地制备药学可接受的盐。盐可以从溶液中沉淀出来，通过过滤可以收集盐，或者可以通过蒸发溶剂回收盐。化学合成方法通过化学合成技术可以制备试剂。在合成本发明的化合物期间，敏感的功能基团需要保护和去保护，这--点对本领域熟练技术人员来说是显而易见的。通过常规技术，例如"ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis"byTWGreeneandPGMWuts,JohnWileyandSonshie.(1991)禾口PJ.Kocienski,in"ProtectingGroups",GeorgThiemeVerlag(1994)中描述的技术可以实现这一过程。在一些反应期间，存在的任何立构中心在一定条件下被外消旋化是可能的，例如，如果在与具有旋光中心的底物的反应中使用碱就可以导致上述情形发生，其中旋光中心包含碱敏感基团。例如，在鸟苷酸化(guanylatkm)步骤期间是可能发生的。例如，通过选择反应序列、条件、试剂、保护/去保护方式等等避免潜在问题发生是可能的，这一点本领域已经公知。利用常规方法可以分离和纯化化合物和盐。通过常规方法，例如通过分子式(I)的化合物的立体异构混合物或其适当的盐或衍生物的分步结晶、色谱法或H.P丄.C.可以实现分离非对映体的过程。从对应的光学纯的中间物或者通过利用适当地手性支持对应的外消旋物的分辨，例如通过H.P.L.C.的分辨，或者通过对应的外消旋物与适当的光学活性的酸或碱反应形成的非对映盐的分步结晶也可以制备分子式(I)的化合物的独立的对映体。利用化学方法合成试剂的整体或部分可以生产试剂或其变异体、同系物、衍生物、片段或模拟物。例如如果试剂包含肽，那么可以通过固相技术合成这种肽，从树脂上可以切割分离肽，最后可以通过预备的高效液相色谱法纟4H七月太(伊j々卩，Creighton(1983)ProteinsStructuresAndMolecularPrinciples,WHFreemanandCo,NewYorkNY)。通过氨基酸分析或测序(例如，上文的theEdmandegradationprocedure;Creighton)可以确认合成肽的纟且成。利用各种固相技术可以实现合成肽抑制剂(或其变异体、同系物、衍生物、片段或模拟物)的过程(RobergeJYetal(1995)Science269:202-204)并进行自动合成，例如依照厂家提供的说明书利用ABI431APeptideSynthesizer(PerkinElmer)。另外，在直接合成和/或与化学方法组合合成期间，可以利用来自其他亚单位的序列或其任何部分改变包含试剂的氨基酸序列以产生变异体试剂。化学衍生物在此使用的术语"衍生物"或"衍生化"包括试剂的化学修饰。这种化学修饰的例证说明可以是氢被卤素基团、垸基、酰基或氨基替换。化学修饰试剂可以是修饰试剂，例如，但不限于化学修饰试剂。试剂的化学修饰可以增强或降低氢键键合相互作用、电荷相互作用、疏水性相互作用、VanDerWaals相互作用或偶极子相互作用。--方面，该试剂可以作为开发其他化合物的模型(例如模板)。药物组合物本发明的药物组合物可以包含治疗有效量的试剂。本发明的药物组合物可以包含治疗有效量的BiP。本发明的药物组合物可以包含治疗有效量的试剂和BiP。药物组合物可以在人药品和兽医药品中供人或动物使用，而且典型地包括任何一种或多种药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。供治疗使用的可接受的载体或稀释剂在药物领域为大家所熟知，而且在例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)中已经进行了描述。可以根据预定的给药途径和标准的制药实践选择药物载体、赋形剂或稀释剂。药物组合物可以包括作为载体、赋形剂或稀释剂的任何适当的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣衣料、增溶剂或除载体、赋形剂或稀释剂之外的任何适当的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣衣料、增溶剂。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料，甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和p-羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。可以有不同的组合物/剂型要求，这取决于不同的递药系统。举例来说，本发明的药物组合物可以配制成利用小泵或通过粘膜途径进行施用，例如，鼻腔喷雾剂或供吸入的气溶胶或可吸收的溶液、或配制成以可注射形式递送的胃肠外组合物，例如，通过静脉内、肌内或皮下途径。或者，可以将剂型设计成能通过许多途径施用。如果通过胃肠粘膜以粘膜式施用试剂，那么试剂应该在穿过胃肠道期间保持稳定；例如它应该对蛋白水解引起的降解有抵抗力，在酸性pH中保持稳定，而且对胆汁的去污效应具有抵抗力。在适当时候，可以通过吸入、以栓剂或阴道栓剂形式、以表皮乳液、溶液、乳膏、软膏或扑粉形式、使用皮肤贴片、以包含赋形剂，例如淀粉或乳糖的片剂、单独或与赋形剂混合的胶囊或胚珠形式口服、或者以包含调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液形式施用药物组合物，或者可以胃肠外注射，例如静脉内、肌内或皮下注射该药物组合物。为了进行肠胃外给药，最好以无菌水溶液形式使用组合物，其可包含其他物质，例如使溶液与血液等渗的足量盐或单糖。为了进行口腔或舌下给药，可以以常规方式配制的片剂或锭剂形式施用组合物。试剂可以与环糊精组合使用。已知环糊精能与药物分子形成包埋和非包埋的复合物。药物环糊精复合物的形成可以改变药物分子的溶解性、溶解速率、生物利用率和/或稳定性。药物环糊精复合物通常对大多数剂型和给药途径都是有用的。环糊精直接与药物络合的另一种方式是用作辅助添加剂，例如作为载体、稀释剂或溶解剂(solubiliser)。使用最常使用的环糊精是a-、0_禾。7-环糊精，WO-A-91/11172，WO-A-94/02518和WO-A-98/55148中描述了适当的实例。如果试剂是蛋白质，那么可以在待治疗的受试者体内原位制备所述蛋白质。在这方面，可以通过利用非病毒技术(例如，通过利用脂质体)和/或病毒技术(例如，通过利用逆转录病毒载体)递送编码所述蛋白质的核苷酸序列，从而从所述核苷酸序列表达所述蛋白质，下文已经描述这一点。施用在此使用的术语"施用"指通过病毒或非病毒技术的递送。非病毒递送装置包括，但不局限于转染、脂质介导的转染、脂质体微脂粒、免疫脂质体、脂质转染、阳离子面部亲水脂分子(CFAs)和其组合。将核酸物理性地注射到细胞中代表了最简单的基因递送系统(Vile&Hart(1994)Ann.Oncol,suppl.5，59)。因此，包含核苷酸序列的载体可以直接以"裸核酸构建体"形式施用，其可以更进一步地包含与宿主细胞基因组同源的侧接序列。注射后，核酸进入细胞中并转移到细胞核中，在细胞核中它可以从附着位置短暂表达，若已经整合到宿主基因组中，则可以稳定表达。编码BiP的基因置于启动子控制下。物理干预，例如聚焦超声(focusedultrasound)可以增加转染效率。用基因枪注射包被了金颗粒的DNA可以增加体内的细胞转染效率(Fyanetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sd.USA90,11478)。脂质体是由可以包装各种物质，包括核酸的磷脂双层膜组成的小囊。脂质和核酸的混合物会形成可以体外和体内转染细胞的复合物(脂质体复合物lipoplexes)。脂质介导的基因递送具有不需要与特异受体的相互作用就能够转染各种不同的细胞的能力，具有脂质组分最小限度的免疫原性从而便于多次给药，具有大容量载体因此能够递送大的DNA序列，而且容易生产。将聚乙二醇衍生物插入到脂膜中或聚乙二醇化(pegylation)可以提高给药后脂质体的循环半衰期。改变脂膜的组分可以改变脂质体的药物动力学、生物分布和融合(ftisogenicity)。特别是在脂质体的某些阳离子脂质，例如DMRIE、DOSPA禾口DOTAP中掺入中性或辅助共同脂质，例如胆固醇或DOPE可以提高他们融合细胞膜和递送内含物到细胞中的能力。许多非脂质聚阳离子聚合物与核酸形成促进核酸递送到细胞中的复合物(LiandHuang(2000)GeneTher.7,31)。优选的非脂质聚阳离子聚合物包括，但不局限于聚-L-赖氨酸、聚氮丙啶(polyethylenimine)、聚葡萄糖胺(polyglucosamines)和类肽。聚氮丙啶可以保护形成复合物的核酸避免在内涵体内降解，而且它也提供了一种促进核酸从内涵体腔释放并随后移位到细胞核的方式(Boussifetal.(1995)Proc.Natl,Acad.ScLUSA92，7297)。聚乙二醇化的聚氮丙啶聚合物可以降低与血清蛋白的相互作用，并能够延长循环半衰期，而且可以在不产生明显毒性的情形下将基因递送到细胞中。也可以使用经过遗传加工的能释放生物治疗分子的细胞的移植，这些细胞例如，自体同源细胞、同种异体细胞和异种基因细胞。可以用完全包含并保护被移植的细胞不受宿主免疫系统攻击的选择性渗透膜围绕被移植的细胞。这种包囊方法允许实施同种异体来源和异体基因来源的初级细胞或细胞系的神经移植。各种类型的包囊技术在本领域已知。微包囊方法允许将小细胞群俘获在薄的球形半透薄膜内，其中半透薄膜典型地由聚合电解质构成。病毒递送装置是吸引人的基因递送载体，因为它们已经发展成为进入人细胞和表达它们的基因的特异有效的方式。优选对病毒基因组迸行修饰以除去病毒复制和致病性所需要的序列。用外源基因，例如BiP替换病毒编码序列是更优选的。病毒递送装置包括，但不局限于逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、慢病毒载体、杆状病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、(x病毒(aviruse)和水泡性口膜炎病毒载体。逆转录病毒是单链二倍体RNA病毒，其通过env基因编码的表面膜蛋白的结合进入细胞。进入细胞后，pol基因编码的逆转录酶将病毒基因组转录成双链DNA拷贝，其可以进入分裂细胞的细胞核并随机整合到宿主基因组中。优选通过除去逆转录病毒的gag、pol和env基因使他们不能复制从而加工成用于病毒递送的逆转录病毒。因此，在包装细胞系中可以产生感染性的非复制逆转录病毒颗粒，其中包装细胞系由缺乏包装序列的质粒表达逆转录病毒gag、pol禾口env基因。逆转录病毒的亚型-慢病毒代表逆转录病毒的另一种可选择方式。慢病毒，例如HIV、猿和猫免疫缺陷病毒可以感染非分裂细胞，而且能够按照与其他逆转录病毒相同的方式进行整合。已经显示复制缺陷和多重减毒的慢病毒载体能导致啮齿类动物和灵长目动物的CNS中长期表达多种转基因(Bensadounetal.(2000)Exp.Neurol.164,15-24;Kordoweretal.(2000)Exp.Neurol.160,1-16)。慢病毒载体可以从注射部位扩散2-3mm，从而可以转换数目众多的神经元可以持续的表达基因达至少一年。其他的病毒还可以是包含双链DNA病毒的腺病毒。己经鉴定出在6群(A-F)中40种以上的腺病毒血清型。对C群病毒(血清型Ad2和Ad5)作为基因递送的候选物进行了最广泛地评价(Zhang(1999)CancerGeneTher.6,11)。腺病毒通过结合柯萨奇病毒和腺病毒受体进入细胞，这种结合有助于病毒精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列与细胞整合素(integrins)相互作用。内化后，病毒从细胞内涵体中脱离，部分分解并移位到细胞核中，并在此开始表达病毒基因。优选不能复制的腺病毒。通过删除一个或多个腺病毒基因，例如早期腺病毒基因E1-E4可以实现这一目的。这可以进一步扩展除去腺病毒基因组完整的编码序列。这种病毒可以用来包装BiP基因，但它必须在存在辅助病毒的在生产细胞系中生长，其中辅助病毒可以提供所有必需的病毒基因功能以帮助包装包含BiP基因的具有感染性的不能复制的腺病毒。腺相关病毒是单链DNA病毒，它是天然人病毒并未发现它能引起任何疾病。他们通过结合硫酸乙酰肝素进入细胞，但他们需要与所谓的辅助病毒，例如腺病毒或疱疹病毒的协同感染才能复制。腺相关病毒载体具有许多潜在的优点。他们能感染非分裂细胞，而且能稳定地整合并维持在宿主基因组中；整合作用优选发生在染色体19上的一个位点依赖基因座(sitedependentlociis)，因此能降低插入突变的风险。但是，为了降低出现能复制的腺相关病毒的风险而缺失rep蛋白质，会导致腺相关病毒载体的这种特征性的整合作用的丧失。单纯疱疹病毒是大病毒，具有编码70种以上病毒蛋白质的大约150kbp的线性双链DNA基因组。这些病毒通过将病毒糖蛋白结合到细胞表面的硫酸乙酰肝素残基上进入细胞。优选通过失活少量基因，例如快速早期基因ICPD、ICP4、10P22和ICP27使单纯疱疹病毒成为复制缺陷病毒。因为可以删除许多单纯疱疹病毒基因而不影响产生病毒载体的能力，因此包含多基因和他们的调节元件的大核酸序列可以包装在单纯疱疹病毒载体内。痘病毒是包括牛痘苗和金丝雀痘或ALVAC的双链DNA病毒。痘病毒优选是包含BiP基因的重组痘病毒。可以单独施用该组分，但通常以药物组合物的形式施用，例如，当组分处于包含有适当的依据预定的给药途径和标准的制药实践而选择的药物赋形剂、稀释剂或载体的混合物中时，就是以组合物的形式施用的。例如该组分可以以包含调味剂或着色剂的片剂、胶囊、胚珠、酏剂、溶液或悬浮液的形式施用，可采用速溶、延迟释放、缓释、持续释放、脉冲释放或控制释放模式。如果药物是片剂，那么片剂可以包含赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联甲羧纤维素钠和特定的复合硅酸酯；以及制粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另夕卜，也可以包括，润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石粉。也可以使用相似类型的固体组合物作为明胶胶囊填充剂。从这方面来说，优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或高分子量聚乙二醇。对水悬浮液和/或酏剂来说，试剂可以与多种甜味剂或调味剂、色素或染料、乳化剂和/或悬浮剂和稀释剂，例如水、乙醇、丙二醇和甘油，以及其组合进行组合使用。给药(递送)途径包括，但不局限于一种或多种口服形式(例如，以片剂、胶囊、或可吸收溶液形式)、表皮给药、粘膜给药(例如，以鼻腔喷雾剂或气溶胶形式吸入)、鼻给药、肠胃外给药(例如，通过可注射的形成)、胃肠给药、脊柱内给药、腹腔内给药、肌内给药、静脉内给药、子宫内给药、眼内给药、真皮内给药、颅内给药、气管内给药、阴道内给药、脑室内给药、脑内给药、皮下给药、眼(包括玻璃体内或前房内)给药、透皮给药、直肠给药、面颊给药、阴道给药、硬膜外给药、舌下给药。剂量水平典型地，由内科医师决定最适合于个体受试者的实际剂量。任何特定病人用药量的具体剂量水平和频率可能会不同，它们取决于多种因素，包括使用的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用时间的长度、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、给药的模式和时间、排泄的速度、药物组合、特定状况的严重性，以及个体所经受的治疗。给药量通过常规实验可以确定，而且在临床医师的判断能力范围之内。通常，有效量为0.01mg/kg-50mg/kg;更优选为0.01mg/kg-40mg/kg;更优选为0.01mg/kg-30mg/kg;更优选为0.01mg/kg-20mg/kg;更优选为0.01mg/kg-10mg/kg;最优选为0.05mg/kg-10mg/kg。配制组分可以配制到药物组合物中，例如，可以利用本领域己知的技术将组分与一种或多种适当的载体、稀释剂或赋形剂混合进行配制。片段/变异体/同系物/衍生物本发明包括BiP片段、变异体、同系物和衍生物的用途。术语"变异体"用来指不同于野生型序列的天然多肽或核苷酸序列。术语"片段"指包含野生型序列的一部分的多肽或核苷酸序列。它可以包含序列的一个或多个较大的连续部分或许多较小的部分。该序列也可以包含序列的其他元件，例如，它可以是与另一种蛋白质的融合蛋白。序列优选包含野生型序列的至少50%、更优选至少65%、更优选至少80%、最优选至少90%。术语"同系物"指与受试的氨基酸序列和核苷酸序列具有一定同源性的实体。在在此，术语"同源性"可以等同于"同一性"。在本发明的上下文中，认为同源序列包括与受试序列至少75、85或90%相同，优选至少95、96、97或98%相同的氨基酸序列。同系物典型地包含与受试的氨基酸序列相同的活性部位等等。虽然也可以按照相似性(即具有相似的化学性能/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但是在本发明的上下文中，优选的按照序列同一性来表述同源性。在本发明的上下文中，认为同源序列包括与受试序列至少75、85或90%相同，优选至少95、96、97或98%相同的核苷酸序列。同系物典型地包含与受试序列具有相同的编码活性部位等等的序列。虽然也可以按照相似性(即具有相似的化学性能/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但是在本发明的上下文中，按照序列同一性来表述同源性是优选的。可以通过眼睛来进行同源性比较，但更常见的是借助于容易获得的序列比较程序进行同源性比较。这些市场上可买到的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的百分比同源性。可以计算临近序列的百分比同源性，即将一个序列与另一个序列进行比对，一个序列中的每个氨基酸直接地与另一个序列中的对应氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这被称作"无空位(ungapped)"比对。一般只能对相对短数Fl的残基进行这种无空位比对。虽然这是非常简单和连贯的方法，但它没有考虑到，例如在其他方面相同的一对序列中，一个插入或缺失将使后面的氨基酸残基的比对走样，因此可能导致进行总体比对时，百分比同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法考虑了可能的插入和缺失，不会过度地对整个同源性罚分而设计，从而能产生最佳比对。通过在序列比对中插入"空位"使局部同源性最大化可以实现这一点。但是，这些更复杂的方法对存在于比对中的每个空位处以"空位罚分"，这样对相等数量的相同氨基酸来说，具有尽可能少的空位的序列比对-反映两个比较的序列之间有更高相关性，与具有许多空位的比对相比将能得到更高的分数。典型地使角"仿射缺口成本(Affinegapcosts)"，其中对一个空位算计为相对高的罚分，而该空位中的每个后续的残基计为较小的罚分。这是最常使用的空位评分系统。当然高的空位罚分将会产生具有较少空位的优化比对。大多数比对程序允许修饰空位罚分。但是，当利用这种软件进行序列比较时，优选使用缺省值。例如当利用GCGWisconsinBestfit程序包时，氨基酸序列的空位罚分是一个空位计为-12分，每个延伸计为-4分。因此，最大百分比同源性的计算首先需要进行考虑了间隔罚分的最佳比对。实施这种比对的适当的计算机程序是GCGWisconsinBestfit程序包(UniversityofWisconsin,U.S.A.;Devereuxetal,1984，NucleicAcidsResearch12:387)。能够实行序列比较的其他软件的实例包括，但不局限于BLAST程序包(参见Ausubdetal.,1999ibid-Chapter18)，FASTA(Atschuletal.,1990,J.Mol.Biol.,403-410)和比较工具GENEWORKS套件。BLAST和FASTA都可用于脱机和联机搜索(参见Ausubeletal,1999ibid,pages7-58to7-60)。但是，在一些应用中，更优选使用GCGBestfit程序。称为BLAST2Sequences的新工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMSMicrobiolLett1999174(2):247-50;FEMSMicrobiolLett1999177(1):187-8)。虽然最终的百分比同源性能够以同一性进行测算，但比对过程本身典型地不是以全或无配对比较为基础的。通常改为使用规模相似性得分矩阵(scaledsimilarityscorematrix),其根据化学相似性或进化距离给每个成对比较分配得分。通常使用的这种模型的实例是BLOSUM62模型--BLAST程序套件的缺陷模型。GCGWisconsin程序通常使用公共缺省值或定制的符号比较表，如果提供符号比较表的话(参见用户手册了了解更多细节)。在一些应用中，对GCG程序包来说，使用公共缺省值是优选的，在其他软件情况下，使用缺省矩阵，例如BLOSUM62是优选的。一旦软件产生了最佳比对，那么就可能计算百分比同源性，优选的百分比序列同一性。软件一般将这一过程作为序列比较的一部分来并产生数值结果。序列也可以具有产生沉默变化和功能等效物质的氨基酸残基的缺失、插入或替换。只要保留了物质的第二结合活性，就可以基于残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或中极两性性质方面的相似性来产生仔细考虑的氨基酸替换。例如带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；有不带电荷的极性头部基团的具有相似的亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。例如，可以依照下表进行保守替换。第二列相同区，优选的第三列中同行的氨基酸可以彼此替换:<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>本发明也包括发生的同源替换(在此使用的替换和替换都指现有氨基酸残基与替换残基的互换)，即相似-对-相似的替换方式，例如碱性氨基酸残基替换碱性氨基酸残基、酸性氨基酸残基替换酸性氨基酸残基、极性氨基酸残基替换极性氨基酸残基等等。也可能发生非同源替换，即从一类残基替换为另一类，或者涉及包含非天然氨基酸，例如鸟氨酸(以下简称z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下简称B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下简称O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸的情形。也可以用非天然氨基酸进行替换，非天然氨基酸包括a*和a-二基取代*氨基酸、N-垸基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物，例如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯丙氨酸*、p-Br-苯丙氨酸*、p-1-苯丙氨酸*、L-烯丙-甘氨酸*、(3-丙氨酸*、L-a-氨基丁酸*、L-Y-氨基丁酸*、L-a-氨基异丁酸*、L-s-氨基异己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜^、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、p-硝基丄-苯丙氨酸*、L-羟基脯氨酸^L-硫杂脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物，例如4-甲基-苯丙氨酸*、5-甲基-苯丙氨酸*、L-苯丙氨酸(4-氨基)#、L-酪氨酸(甲基)*、L-苯丙氨酸(4-异丙基)*、L-Tic(1，2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸，nL-苯丙氨酸(4-苯甲基)*。为了说明以上讨论(与同源或非同源替换有关)，利用注释*表示衍生物的疏水性，而用#表示衍生物的亲水性，#*表示两亲特性。变异体氨基酸序列可以包括在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的适当的间隔基团，间隔基团除氨基酸间隔物，例如甘氨酸或(3-丙氨酸残基之外，还包括垸基，例如甲基、乙基或丙基。变异更进一步的形式包括类肽形式中存在的一个或多个氮基酸残基，本领域熟练技术人员很容易理解这一点。为了避免引起疑问，"类肽形式"用来指其中(X-碳取代基位于残基的氮原子上，而不是位于(X-碳上的变异体氨基酸残基。制备类肽形式的肽的工艺是本领域已知的，例如参见SimonRJetal，PNAS(1992)89(20),9367-9371和HorwellDC,TrendsBiotechnol.(1995)13(4),132-H4。供本发明使用的核苷酸序列可以在其内部包含合成或修饰的核苷酸。寡核苷酸的许多不同修饰类型是本领域已知的。其中包括膦酸甲酯和磷硫酰骨架，和/或在分子的3'和/或5'末端添加吖啶或聚赖氨酸链。应认识到，为实现本发明的目的可以利用本领域任何己有方法修饰核苷酸序列。这种修饰可以用来增强在本发明中有用的核苷酸序列的体内活性或延长其有效期限。片段优选是功能性片段。在此使用的术语"功能性片段"指能够引发全长BiP蛋白质的至少部分活性的BiP片段。功能性片段特别地具有下列功能中的至少一种使CD14+细胞释放IL-10;刺激CD8+细胞增殖并释放IL-10;抑制记忆抗原反应；激活单核细胞中一系列抗炎基因，包括游走抑制因子(MIF)、可溶性TNF受体II和TIMPs的表达；抑制破骨细胞成熟；抑制骨吸收。功能性片段的长度优选是至少20个氨基酸，更优选至少50个氨基酸，最优选至少IOO个氨基酸。特别优选的片段包含保守区，已经发现该保守区与许多天然发生的BiP蛋白质同源。认为这种保守区具有特定功能。在此使用的术语"功能性同系物"指保留全长BiP蛋白质的至少部分活性的同系物。尤其是，优选的功能性同系物具有下列功能中的至少一种使CD14+细胞释放IL-10;刺激CD8+细胞增殖并释放IL-10;抑制记忆抗原反应；激活单核细胞中一系列抗炎基因，包括游走抑制因子(MIF)、可溶性TNF受体II和TIMPs的表达；抑制破骨细胞成熟；抑制骨吸收。基因治疗本发明更进一歩地涉及体内调节编码BiP的核苷酸序列的基因治疗。例如通过施用结合核苷酸编码序列、或与BiP的核苷酸编码序列有关的控制区域、或它对应的RNA转录产物从而修饰，优选提高转录或翻译的速度的试剂可以完成对表达的调节。举例来说，编码BiP的核苷酸序列可以受同源或异源表达调节元件，例如启动子或启动子和增强子的控制。增强子和/或启动子甚至可以在特定组织中有活性，因此，可以优先表达编码BiP的核苷酸序列。产生调节性表达的增强子元件或其他元件可以以多拷贝形式存在。同样，或者此外，增强子和/或启动子可以优先在一种或多种细胞类型，例如一种或多种骨细胞类型，例如破骨细胞表现出活性。通过操作启动子区域可以调节编码核苷酸序列的表达水平。例如启动子区域内部的不同结构域可以具有不同的基因调节活性。典型地，利用具有不同的启动子变异体，其启动子的特定区域被删除(即缺失分析)的载体构建物可以评价这些不同区域的作用。通用的重组DNA方法技术除非另有陈述，否则本发明使用在本领域普通技术人员能力范围内的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规方法。文献中对这些技术进行了解释。例如，参见J.Sambrook,E.RFritsch,andT.Maniatis，1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,Books1-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel,F.M.etal.(1995andperiodicsupplements;CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13,and16,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree，andA.Kalm，1996,DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWiley&Sons;M.J.Gait(Editor),1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,HPress;and,D.M.J.LilleyandJ.E.Dahlberg，1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress。在此通过引用将这些通用教科书中的每一篇都合并在内。更进一歩的应用本发明优选被用于防止或者抑制破骨细胞的发育和/或破骨细胞的功能。通过实施例对本发明进行更进一步的描述，实施例的目的是帮助本领域普通技术人员实施本发明，无意用实施例来限制发明的范围。实施例实施例1s/尸^/激诱导卓^:智應^^fi^^^^众谱。BiP或葡萄糖调节蛋白质78(grp78)是功能上负责蛋白质正确折叠的内质网(ER)伴侣蛋白。当通过葡萄糖饥饿、缺氧或活性氧簇干扰ER的功能时，会导致BiP上调，最终引起未折叠蛋白质的积聚。这些也是在发炎的关节中普遍存在的影响类风湿性关节炎(RA)发病机理的因素。我们利用蛋白组学，在RA中分离和鉴定了作为自身抗原的BiP。随后，我们证明从RA病人的滑膜液(SF)中分离的单核细胞(MC)在存在重组人(rhu)BiP的情况下能够增殖，而在RA周围血液(PB)MC和来自OIJDPB和SFMC中的结果则相反。这些细胞几乎没有产生IFNy。来自BiP剌激的PBMC的上清液的细胞因子分析显示高浓度的IL-IO，少许TNFa、IFNy和IL-1P，没有IL-2或者IL-15。在RA动物模型中，先用BiP疫苗显示出可以防止小白鼠中胶原诱导的关节炎(CIA)的发作。静脉内或皮下施用BiP也对小白鼠的CIA早期有治疗作用。为了研究BiP的作用机制，利用两种不同的基因阵列技术进行了更进一步的体外试验来分析用rhuBiP刺激的纯化单核细胞的细胞因子谱。方法利用免疫磁珠负分离纯化单核细胞。从未经BiP刺激和用BiP刺激(20pg/ml)24小时的这些细胞中分离总RNA。然后依照厂家的说明书，在Affymetrix基因阵歹lJ(U95version2)或R&D细胞因子基因阵列中使用RNA。在Affymetrix阵列中使用了来自受试者的一式双份样品，在R&D基因阵列中使用了两个正常对照受试样品。结果结果显示在表1和图6中。结论BiP诱导了在炎性反应的单核细胞中激活的许多基因下调。这些基因包括那些参与抗原提呈、粘附和细胞迁移、细胞信号传导和破骨细胞分化的基因。利用R&D细胞因子基因活化阵列和Affymetrix阵列获得的结果是一致的。单核细胞基因活化的这些变化的全部产生了了抗炎谱。已经显示BiP通过受体样分子结合人单核细胞，其中受体样分子不象HSP60或70和grp94使用的那些分子。为了研究BiP激活单核细胞的后果，使用了两种基因阵列。利用375个细胞因子/趋化因子，以及他们的受体的限制性基因阵列针对来自两个正常个体的单核细胞(未经刺激或用BiP刺激24h)进行了分析。之后，用Affymetrix基因阵列对单个样品进行一式两份的实验，并利用Genespring软抖二进行分析。Affymetrix阵列显示900个基因受BiP影响并下调>75%。三个阵列的结果都显示il-10降低了，而il-i受体拮抗体增高了。hla-dr、cd40、cd86，以及c-fos、IKKa、粘附分子CD54、avP3、CD18和CDllc都下调了。虽然，几个趋化因子受体随之出现了下调(CCR1、ccr2禾nCXCR4)，但趋化因子groa、0、y，以及il-6、mcp-i和rantes都增强了。用BiP刺激人单核细胞后出现的基因活化方面的变化会影响抗原提呈、细胞迁移和炎性细胞因子的生产。实施例2乂,V、/^嵐系统^历p齊动游被骨潘應f成游潘應厉f沐//#^游#/0^夕緣"^7汰众。利用人和小白鼠细胞实施所有的体外实验。通过分离单核细胞的密度离心(27)从外周血分离人细胞。按照以前的描述(28)，从5-8周龄的成年小白鼠的股骨和胫骨分离小白鼠细胞。通过计数TRAP阳性细胞的数目(小白鼠)，或表达玻璃体结合蛋白受体(VnR)和/或F肌动蛋白环(人)的细胞数目对两个系统中的破骨细胞分化进行了评价。在牙本质切片上培养细胞后，通过量化骨吸收陷窝的形成评价两个系统的吸收功能。在实验条件下4-5天(小白鼠)，或10-12天(人)后收集破骨细胞培养物，分别在7天和14天后对小白鼠和人破骨细胞进行吸收测定。在M-CSF(25ng/ml)中培养过夜后，制备PBMC(人)或BMM(小白鼠)。为了产生破骨细胞，随后用M-CSF(25ng/ml)和RANKL(10ng/ml)在连续存在和缺少一定浓度范围(0.02-20(ig/ml)的BiP的条件下培养依赖M-CSF的非粘附细胞。也可以利用冲击研究(pulsestudies)来评价BiP对破骨细胞分化不同阶段的影响，其中冲击研究是在前体分化早期或形成多核细胞之后添加BiP。在适当的时间,固定培养物并针对TRAP活性进行组织化学染色(mouse),或者通过利用23C6抗体和TRITC-毒伞素免疫定位分别对VnR和F-肌动蛋白环进行染色(人)，并量化破骨细胞的数目。从牙本质切片中除去破骨细胞并利用甲苯胺蓝染色后，量化吸收。通过分子技术，利用实时PCR测量破骨细胞特异的标记基因，例如降钙素受体和组织蛋白酶K表达可以另外确认破骨细胞分化的数据，特别是可以确认小白鼠细胞内的数据。因为BiP刺激PBMC(19)产生IL-IO，IL-10抑制破骨细胞分化(29)。培养24h后，可以通过ELISA在蛋白水平或通过实时PCR在tnRNA水平测量小白鼠和人破骨细胞前体产生的IL-10。利用抗IL-10或抗IL-10受体的中和单克隆抗体的附加实验可以评价在使用BiP中观察到的任何抑制效果是单独由IL-10引起的，还是应归于其他因素。也解释说明了凋亡引起破骨细胞数目减少的可能性，并利用DAPI染色从形态上以及TUNEL测定从生物化学角度研究用BIP处理过的细胞的凋亡。实施例3BiP对参与被骨潘應生成^7骨级欲游主要潘應,号遂径游f拔。从细胞表面到转录因子(例如，RANK和c-Fms、TRAFs、c-Fos、NFATcI、MAPK[p38，jun禾DERK1/2〗、IKK和NF-KB和Akt)，通过磷酸化的抑制和分子的激活可以直接调查这一过程，或者可以通过抑制性细胞因子，例如IL-10的释放进行间接调查。利用人和小白鼠细胞实施所有的体外实验。通过分离单核细胞的密度离心(27)从外周血分离人细胞。按照以前的描述(28)，从5-8周龄的成年小白鼠的股骨和胫骨分离小白鼠细胞。通过计数TRAP阳性细胞的数目(小白鼠)，或表达玻璃体结合蛋白受体(VnR)和/或F肌动蛋白环(人)的细胞数目对两个系统中的破骨细胞分化进行了评价。在牙本质切片上培养细胞后，通过量化骨吸收陷窝的形成评价两个系统的吸收功能。在实验条件下4-5天(小白鼠)，或10-12天(人)后收集破骨细胞培养物，分别在7天和14天后对小白鼠和人破骨细胞进行吸收测定。研究了RANKL/RANK和M-CSF/c-Fms结合下游的细胞信号级联中的几个关键蛋白质的表达。这些蛋白质包括，例如RANK和c-Fms、TRAF6、c-Fos、NFATcI、MAPK、IKK、NF-kB和Akt。最近己经显示这些蛋白质在破骨细胞生成中非常重要，因此，这为分析产生BiP抑制效果的机制提供了起点。在不希望受任何特定理论束缚的情形下，预计BiP具有对破骨细胞前体和成熟破骨细胞发挥其抑制效果的潜能。因此，在存在M-CSF和RANXL的情况下制备BMM和PBMC，可以在例如破骨细胞前体的培养开始时，或者多核破骨细胞明显出现的培养接近结束时的24~72h期间内添加最高有效浓度(根据实施例2确定)的BiP。在适当时间收获培养物，制备用于定量实时PCR和Western印迹分析的RNA或蛋白质提取物，分析针对包括c-Fms、RANK、c-Fos、NFATcI、TRAF6、IKK和Akt的信号分子/转录因子的表达。在一些情况下，利用针对pERK1/2、pp38和pJNK的特异性磷酸抗体来查看暴露在BiP中5-60min后给这些MAPK家族成员所带来的影响。在实时PCR中使用了适当的阳性和阴性对照，而且设计和使用了针对所有基因的特异性引物和荧光探针。利用之前描述的蛋白酶抑制因子(30;31)制备用于Western印迹的蛋白质溶解产物。测量蛋白质含量，以保证聚丙烯酰胺凝胶的上样量相等，并在变性条件下电泳样品。蛋白质被吸印到硝酸纤维上，并利用特异的第一和第二抗体标记，最后通过增强的化学发光显像。从Chemicon,SantaCruz禾卩Sigma可以获f寻所有抗j本。这些实验可用于确定在破骨细胞分化和激活中起重要作用的主要信号路径中的哪个信号路径受BiP调节。而且这些研究也将弄清楚BiP调节前体细胞分化的作用机制是否不同于激活成熟破骨细胞的作用机制。实施例4荐^力炬遂嫂:ft智應分众没牙i游动激瀠:^W秀S/P沐/^澄#在發骨潘應形成/〃費级欲方i游资力卵巢切除的CD1小白鼠会自发地过度产生破骨细胞，并发展形成骨质疏松症样疾病，其将在疾病的不同阶段用BiP治疗。利用人疾病模型确定BiP体内作用机制。在用动物模型的炎症细胞内的骨损失研究骨中，可以表达RANKL和导致骨吸收的T淋巴细胞和激活的成纤维细胞等等(9;10)，，以及细胞因子，例如TNFa和IL-ie(32)的产生会使实验复杂化。另外，T细胞细胞因子，IL-17(7)可以增强这一活性。详细研究了来自原始的预防和治疗CIA的BiP研究来源的小白鼠材料中的破骨细胞的存在情况。对切片TRAP染色，评估每组中破骨细胞/切片的数目，或者通过破骨细胞标记基因，例如利用本领域熟练技术人员已知的常规技术鉴定的组织蛋白酶K或MMP-9，对破骨细胞进行原位杂交。这为抗原驱动的关节炎模型中破骨细胞的发育提供了数据，抗原驱动关节炎模型中免疫细胞和细胞因子以与RA相似的方式发挥作用。在不依赖炎性反应的破骨细胞激活和骨丢失独立模型中，可以使用促进骨组织破坏和破骨细胞成熟卵巢切除小白鼠(33)模型。首先，使用BiP预防CIA的操作规定，其中在诱导疾病之前使用了可防止在诱导后一个月测量的症状的单剂量BiP(17)。因此，在卵巢切除(ovx)模型中，可以在三个时间点静脉施用BiP并将6只小白鼠分组ovx前1周、ovx时或ovx后每隔一星期，以确定BiP是否可以防止在撤除雌激素后对破骨细胞骨吸收的诱导。处死小白鼠，ovx后每隔一周对骨进行检査，直至ovx后6周。使用载体或不相干的蛋白质，例如人血清白蛋白处理的平行对照小白鼠组和假对照组。通过显微CT(microCT)和组织分析评价和量化骨矿物密度和骨吸收，并利用TRAP染色来显示破骨细胞的数目。这些实验可以用来更进一步地研究BiP在防止卵巢切除术诱导的骨丢失中的作用。总结BiP是具有破骨细胞激活的风湿性疾病的全新生物疗法，体外和体内实验证据支持在体外的破骨细胞生成系统中，BiP抑制人和鼠破骨细胞生成的断言。表i:通过光密度法分析的细胞因子基因阵列数据。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>分离外周血单核细胞，并用BiP(20mg/ml)刺激细胞(MO+BiP)或不刺激细胞(MO)，持续24h。通过光密度法分析细胞因子基因阵列放射自显影图，并将其标准化以产生最大(100%)或者没有检测到基因活化(ND)的表达百分比。所示结果来源于两个受试者的用BiP刺激的单核细胞和一个受试者的未经过刺激的单核细胞。与对照细胞相比，结果显示，两个样品中BiP刺激的细胞因子的mRNA上调或下调。参考文献(1)BoyleWJ，SimonetWS,LaceyDL.Osteoclastdifferentiationandactivation.Nature2003;423(6937):337-342.(2)ChambersTJ.Regulationofthedifferentiationandfiinctionofosteoclasts.JPathol2000;192(1):4-13.(3)P、oodmarLGD.Cellbiologyoftheosteoclast.ExpHematol1999;27(8):1229-1241.(4)SudaT,TakahashiN,UdagawaN，JimiE,GillespieMT，MartinTJ.tumornecrosisfactorreceptorandligandfamilies.EndocrRev1999;20(3):345-357.(5)WagnerEF，KarsentyG.Geneticcontrolofskeletaldevelopment.CurtOpinGenetDev2001;11(5):527-532.(6)Degli-EspostiM.Todieornottodie-thequestoftheTRAILreceptors.JLeukocBiol1999;65(5):535-542.(7)LubbertsE,vandenBL,Oppers-WalgreenB,SchwarzenbergerP，Coenen-deRooCJ,KollsJKetal.IL-17promotesboneerosioninmurinecollagen-inducedarthritisthroughlossofthereceptoractivatorofNP-kappaBligand/osteoprotegerinbalance.JImmunol2003;170(5》2655-2662.(8)UdagawaN.Themechanismofosteoclastdifferentiationfrommacrophages:possiblerolesofTlymphocytesinosteoclastogenesis.JBoneMinerMetab2003;21(6):337-343.(9)RifasL,ArackalS,WeitzmannMN.InflammatoryTcellsrapidlyinducedifferentiationofhumanbonemarrowstromalcellsintomatureosteoblasts.JCellBiochem2003;88(4):650-659.(10)TakayanagiH,IizukaH,JujiT,NakagawaT，YamamotoA，MiyazakiTetal.InvolvementofreceptoractivatorofnuclearfactorkappaBligand/osteoclastdifferentiationfactorinosteoclastogenesisfromsynoviocytesinrheumatoidarthritis.ArthritisRheum2000;43(2):259-269.(11)JimiE,AokiK,SaitoH,D'AcquistoF,MayMJ，NakamumIetal.Selec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数值进行比较；其中，从对照中获得的数值与从受试者中获得的数值之间存在的差异指示受试者患有这种疾病或综合症。15.根据权利要求14所述的方法，其中与从对照中获得的数值相比，BiP活性降低。16.根据权利要求14或15所述的方法，其包括测量破骨细胞发育或骨吸收的可选步骤。17.鉴定调节骨破坏或骨丢失的试剂的测定方法，其包括步骤(i)选择调节BiP活性的试剂；禾口(ii)测量存在所述试剂时破骨细胞的成熟情况；其中，缺少所述试剂的破骨细胞成熟和存在所述试剂的破骨细胞成熟之间存在的差异指示该试剂能调节骨破坏或骨丢失。18.根据权利要求17所述的测定方法，其中试剂升高或上调BiP活性。19.包括下列步骤的方法(a)实施根据权利要求17或18所述的测定方法；(b)鉴定调节骨破坏或骨丢失的一种或多种试剂；和(c)制备一定量的一种或多种己鉴定试剂。20.通过权利要求17或18所述的测定方法获得的试剂。21.确定BiP或其变异体、同系物、衍生物或片段对破骨细胞分化的影响的方法，其包括步骤(a)将BiP添加到处于破骨细胞分化的一个或多个不同阶段的一个或多个破骨细胞中；禾口(b)确定BiP对破骨细胞生成的影响。22.根据权利要求21所述的方法，其中以0.02-20pg/ml的浓度添加BiP。23.依照权利要求21或22所述的方法，其中通过测量TRAP活性、VnR和/或F-肌动蛋白环来量化破骨细胞的数目。24.依照权利要求21-23中任一项所述的方法，其包含量化骨吸收的可选步骤。25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中利用测量一种或多种破骨细胞特异标记表达的PCR来证实破骨细胞分化。26.根据权利要求25的方法，其中破骨细胞特异标记是降钙素受体基因或组织蛋白酶K基因。27.鉴定破骨细胞分化期间受BiP调节的一种或多种蛋白质的方法，包括步骤(a)在存在和缺少BiP的情况下分化破骨细胞；禾口(b)鉴定与缺少BiP时分化的破骨细胞相比，存在BiP时分化的破骨细胞中表达存在差异的一种或多种蛋白质。28.根据权利要求27所述的方法，其中蛋白质是信号分子或转录因子。29.根据权利要求27或28所述的方法，其中，在培养开始时或当多核破骨细胞出现培养接近结束时的24-72hr期间内添加BiP。30.依照权利要求27-29中任一项所述的方法，其中利用qt-RT-PCR和/或Western印迹检测编码蛋白质的核酸或蛋白质。31.BiP或其变异体、同系物、衍生物或片段在制备预防或治疗骨质疏松症的药物中的用途。全文摘要本发明涉及BiP或其变异体、同系物、衍生物或片段在制备预防或治疗骨丢失或骨吸收的药物中的用途。文档编号A61K38/16GK101163495SQ200680013159公开日2008年4月16日申请日期2006年4月18日优先权日2005年4月19日发明者加布里埃尔·斯塔夫罗斯·帕纳伊,瓦莱丽·玛丽·科里加尔申请人:伦敦王室学院