专利名称：：成纤维细胞激活剂及成纤维细胞活化方法、胶原合成促进剂及胶原合成促进方法、以及皮...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及与胶原的分解、合成相关的、活化成纤维细胞的成纤维细胞激活剂及成纤维细胞活化方法、胶原合成促进剂及胶原合成促进方法、以及通过活化成纤维细胞和促进胶原合成而防止皮肤老化的皮肤老化预防剂及预防皮肤老化的方法。
背景技术：
：通常，皮肤老化是指伴随年龄增加的生理老化与紫外线照射等光老化相互影响而产生的一种生理现象。20~30岁以后，皮肤的真皮层中构成肌肤弹力基本单位的胶原等蛋白质减少。此外，产生胶原的成纤维细胞本身的能力也衰减。光老化是指皮肤经紫外线照射后分泌出分解胶原的酶，由此胶原受到破坏、真皮的弹力消失的现象。胶原量的降低和成纤维细胞的功能降低是产生皱紋、松弛等老化现象的主要因素。迄今为止，作为抗老化的对策有应用抑制胶原分解酶(胶原酶)活性的抗老化成分的^R案。例如，有应用下列物质作为胶原酶抑制剂的提案，某种蘑菇的提取物(特开平9-40552)、艾蒿属植物的提取物(特开平10-194982)、葡萄种子和苹果种子、虎耳草科植物全草的提取物(特开平11-71294)、麝香草属植物的提取物(特开平11-79970)、蓝桉(五wca/3^MSg/o&w/ws)、鼠尾、蕺草、牡丹、芍药等的提取物(特开平11-147833)、藤黄、贯叶连翘的提取物(特开平11-315008)、梅雨花(Oocasmi'"Xcrocoamae/Zora)球才艮的提取物(特开2000-191512)、茜草(及w&aceae)、柿、地榆、薄荷等的提取物(特开2000-159631)。但是，这仅仅是抑制胶原分解酶(胶原酶)的活性，仅仅是预防紫外线造成的胶原分解(光老化)，而不能有效改善紫外线和随增龄而发生的肌肤老化。已知有视黄醇酸(视黄酸，维生素A衍生物)这种能有效促进胶原自身合成的抗老化成分(MethodsinEnzymology,1990，vol.190,p352-360)。但是，视黄醇酸刺激性强，在日本限定了医师的使用。因此，迫切期望开发有效性高且安全的老化防止剂。
发明内容为了达成上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现葡萄树液具有成纤维细胞活化作用和促进成纤维细胞胶原合成的作用，从而完成了本发明。本发明涉及包含以葡萄树液为有效成分的成纤维细胞激活剂、使用葡萄树液的成纤维细胞的活化方法、以及将葡萄树液作为成纤维细胞激活剂使用的方法。本发明还涉及包含以葡萄树液为有效成分的胶原合成促进剂及使用葡萄树液的胶原合成促进方法、以及将葡萄树液作为胶原合成促进剂使用的方法。此外，本发明还涉及包含以葡萄树液为有效成分的皮肤老化预防剂及使用葡萄树液的皮肤老化预防方法、以及将葡萄树液作为皮肤老化预防剂使用的方法。发明的效果根据本发明可促进胶原的合成，有效防止皮肤的老化。此外，本发明中，如果葡萄树液与脯氨酸并用可进一步增强葡萄树液的效果。发明的最佳实施方式以下，进一步对本发明进行详细i兌明。本发明涉及包含以葡萄树液为有效成分的成纤维细胞激活剂，本发明的成纤维细胞激活剂除了葡萄树液之外可包含脯氨酸。本发明涉及使用葡萄树液的成纤维细胞的活化方法，本发明的成纤维细胞的活化方法除了葡萄树液之外可同时使用脯氨酸。本发明涉及将葡萄树液作为成纤维细胞激活剂使用的方法，本发明的使用方法中，成纤维细胞激活剂除了葡萄树液之外还可包含脯氨酸。胶原是一种纤维状蛋白质，存在于皮肤、血管、肌腱、牙齿等大多数细胞中，占构成人体总蛋白质的30%左右。人体由60兆个以上的细胞构成，细胞和细胞所构成的脏器，是靠细胞外基质的连接作用形成的。胶原是构成细胞外基质的一种蛋白质，作为细胞存在的场所，有助于其增殖和功能的维持，在软骨和骨中，基质蛋白质作为其构成成分发挥着重要作用。成纤维细胞是产生胶原的主要细胞之一，由成纤维细胞分泌的胶原分布在细胞之间，形成细胞间基质。本发明者的研究结果新发现葡萄树液具有活化成纤维细胞本身的作用(成纤维细胞活化作用)。葡萄树液与脯氨酸一起使用时，可进一步增强葡萄树液具有的成纤维细胞活化作用。脯氨酸优选使用L-脯氨酸。本发明涉及包含以葡萄树液为有效成分的胶原合成促进剂，本发明的胶原合成促进剂除了葡萄树液之外可包含脯氨酸。本发明涉及使用葡萄树液的胶原合成促进方法，本发明的胶原合成促进方法除了葡萄树液之外可同时使用脯氨酸。本发明涉及将葡萄树液作为胶原合成促进剂使用的方法，本发明的使用方法，其中胶原合成促进剂除了葡萄树液之外还可包含脯氨酸。如上所述，葡萄树液具有成纤维细胞活化作用。此外，本发明者们的研究结果新发现，葡萄树液具有促进成纤维细胞胶原合成的作用。本发明的胶原合成促进剂，包含以作用于成纤维细胞自身，具有活化细胞自身和促进成纤维细胞胶原合成作用的葡萄树液作为有效成分，可有效促进胶原合成。葡萄树液与脯氨酸一起使用时，可进一步增强葡萄树液具有的胶原合成促进作用。脯氨酸优选使用L-脯氨酸。本发明涉及包含以葡萄树液为有效成分的皮肤老化预防剂，本发明的皮肤老化预防剂除了葡萄树液之外可包含脯氨酸。本发明涉及使用葡萄树液的皮肤老化预防方法，本发明的皮肤老化预防方法除了葡萄树液之外可同时使用脯氨酸。本发明涉及将葡萄树液作为皮肤老化预防剂使用的方法，本发明的使用方法，其中皮肤老化预防剂除了葡萄树液之外还可包含脯氨酸。成纤维细胞的性质和状态的变化、成纤维细胞的作用与张力降低、皱紋等皮肤的老化密切相关。这是因为除了水分，皮肤的大约80%由胶原构成。皮肤从表面开始顺次分为表皮、真皮、皮下组织3层。胶原存在于其中的真皮，占据其中的大部分，具有纤维状构造的性质。皮肤要承受外界的各种各样的力，要求它具有强度和柔软性，而使它具有这样性质的发挥主要作用的就是胶原。成纤维细胞控制着胶原的分解和合成，并且成纤维细胞的力量通常保持拉长状态。本发明的皮肤老化预防剂含有葡萄树液作为有效成分，通过胶原合成促进作用和成纤维细胞活化作用，有效防止张力降低、皱紋等皮肤的老化。葡萄树液与脯氨酸一起使用时，可进一步增强葡萄树液具有的预防皮肤老化效果。脯氨酸优选使用L-脯氨酸。葡萄树液是葡萄(Vitis科)植林的活体内流淌的植物导管水。本发明中使用的葡萄树液可利用葡萄、山葡糖等树液，对其种属无特殊限定，只要是葡萄属植物的树液即可。例如，至于葡萄可使用巨峰、曱州、曱斐路、蜜思嘉(t久力7卜.弋ijA)、玫瑰露(f，々工7)、康拜尔(《々.7-卩-)、PIONE(匕。才-净)、白浮士德(净才.7义力少卜)、尼亚加4i(大47*方，，)、康可(-》3誦卜、、)、斯图本(只f工誦《>)、赤霞珠(力《/k净乂々4-3^)、黑比"i若(匕°乂乂7/D、MERLOT(爿y^口一)、森美戎(七；、3乂)、雷司令(卩-义卩》夕')、霞多丽(；Y^K才)等品种。此外，对栽培地域、栽培方法等无限定，但其中优选春天发芽期前从修剪下的葡萄枝溢出的树液。可切开葡萄茎采集流出的树液获得葡萄树液。对树液的采集方法无特殊限定，例如，将小型容器放置到要流出树液的修剪部位采集树液、将之收集到加入了防腐剂的大型保存容器中。优选使用一次性可从不同位置采集树液的装置，例如特开平10-295207号公报中记载的采集装置，特开2005-118035公报中记载的应用受液器采集等，这样作业效率高，且可防止品质恶化。所采集的葡萄树液，既可作为液状物质(必要时与防腐剂等混合)应用，也可作为冷冻干燥品应用。此外，所采集的葡萄树液必要时可进行加热处理、澄清处理。这样可防止树液的白浊和褐变。加热处理时，将葡萄树液加热，例如60100。C，优选80-90。C，例如10分钟以上。加热处理既可对采集后的葡萄树液直接进行处理，也可在制成制品后进行。此外，澄清处理可应用公知的澄清剂，例如，活性炭、硅胶、硅溶胶、聚乙烯基聚吡咯垸酮(polyvinylpolypyrrolidone,PVPP)等。本发明的成纤维细胞激活剂、胶原合成促进剂和皮肤老化预防剂，均既可包含葡萄树液的原液体，也可包含其冷冻千燥品。对其剂型无特殊限定，可提供洗剂、乳剂、胶剂、乳膏剂、软膏剂、粉末剂、颗粒剂等各种剂型。本发明的成纤维细胞激活剂、胶原合成促进剂和皮肤老化预防剂，可单独包含葡萄树液、或包含葡萄树液和脯氨酸，必要时适当配合常规医药品、医药外用品、皮肤化妆品等中配合使用的油性成分、表面活性剂、保湿剂、颜料、紫外线吸收剂、抗氧化剂、香料、色素、抗菌剂、防徵剂、酒精、水等。另外，在不破坏本发明效果的范围内可与其它的细胞激活剂、胶原合成促进剂、老化预防剂等并用。本发明的成纤维细胞激活剂、胶原合成促进剂和皮肤老化预防剂，换算成未调整的树液，包含1质量％以上，更优选3质量％~100质量％,更优选10质量％~80质量％的葡萄树液。本发明中，葡萄树液作为成纤维细胞激活剂、胶原合成促进剂、皮肤老化预防剂应用。本发明的成纤维细胞激活剂、胶原合成促进剂和皮肤老化预防剂中，除葡萄树液之外还配合脯氨酸时，其配合量适于在0.1%~3质量%、优选0.1质量％~1.5质量％的范围内。脯氨酸的配合量是与葡萄树液合计为100%时的比率。本发明的成纤维细胞激活剂、胶原合成促进剂和皮肤老化预防剂作为皮肤外用剂的适用方法，可按照外用剂的类型进行适当选择。通常情况下，作为以洗剂、乳剂、胶剂、乳膏剂、软膏剂等剂型制备的外用剂适用的情况是，针对面部等皮肤，优选每天涂抹约1~2次。本发明的成纤维细胞激活剂、胶原合成促进剂和皮肤老化预防剂也可作为化妆品使用，可用于洗剂、乳液、美容液、乳膏剂、液体粉底霜、粉状粉底霜、口红等。本发明的成纤维细胞激活剂、胶原合成促进剂和皮肤老化预防剂作为粉末剂、颗粒剂等经口服用的药物应用时的施用量，可根据施用者的年龄、肌肤状况等条件进行适当选择。施用量，例如成人每人在100~1000mg(有效成分量)的范围内。但是，上述施用量可按照上述条件进行适当的增减。实施例以下，进一步对本发明的实施例进行详细说明。但是，本发明并不限定于这些实施例。以下实施例中使用的葡萄树液，是2005年4月上旬，在山梨县东山梨群胜沼町的葡萄园中，从修剪中的葡萄(品种，甲州)枝流出的树液，是应用特开平10-295207号公报中记载的装置采集的，lg葡萄树液的冷冻干燥品相当于280g未调整的树液。实施例1(成纤维细胞激活作用实验)3-(4，5-二曱基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)，能被线粒体中细胞内能量代谢过程中产生的NADPH或NADH还原，生成曱腊。曱腊的生成量作为细胞活化作用的指标。将正常人成纤维细胞以3.0x104细胞/孔的细胞密度接种到96孔培养板。在含有1%胎牛血清(FBS)的Dulbecco，s改进的Eagle培养基(DMEM培养基)中培养24小时后，换成含有表1中所示浓度葡萄树液冷冻干燥品且含有1%FBS的DMEM。应用含5%FBS的DMEM作为阳性对照(PC)。再培养48小时后，换成含0.4mg/mLMTT(大力，4)的、含1%FBS的DMEM，培养2小时。洗涤细胞后，用2-丙醇溶解细胞内生成的曱腊，用酶标仪测定550nm和650nm的吸光度，以二者的差作为细胞内生成的甲腊量进行评价。细胞激活作用是以未添加样品培养的细胞(对照)的吸光度(ABS.)作为IOO的活性指标(ActivationIndex)(%)。结果如表l所示。所有的结果均以均值士标准差表示。用Student-t;险验进行显著性差异的检测。当p值p0.05时为有显著性差异。如表1中所示，可确认通过用添加了葡萄树液的培养基进行培养，激活了成纤维细胞。对成纤维细胞的激活作用(n=5)浓度(|ig/ml)活性指标(％)平均值士SDP(t國试验)对照一100.0±1.7l細PC一116.0±2.9O細葡萄树液冷冻干燥品500.0114.6±6.7o扁1000.0120.3±6.90.001下划线有细胞激活作用实施例2(成纤维细胞的胶原合成促进作用实验)通过应用ELISA对培养上清中分泌的I型胶原进行定量来评价成纤维细胞的胶原合成。将正常人成纤维细胞以3.0x104细胞/孔的细胞密度接种到96孔培养板。在含有0.5%FBS的DMEM培养基中培养24小时后，换成含有表2中所示浓度的葡萄树液冷冻干燥品且含有0.5%FBS的DMEM。应用抗坏血酸磷酸镁酯(VCPMg)作为PC。再培养48小时后，回收上清用于I型胶原的ELISA。将培养上清及作为标准应用的I型胶原加入到96孔培养板中，4。C包被一晚。用1%牛血清白蛋白(BSA)溶液37。C封闭1小时，然后与一抗(抗人i型胶原(兔))37。C反应1.5小时。再与二抗(HistofinePO(兔))37。C反应1.5小时后，加入含有0.3mg/ml2,2,连氮画双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵(ABTS)的磷酸-柠檬酸緩冲液(O.IM，pH4.0)，20分钟后，用酶标仪测定405nm的吸光度。根据同一块板中测定出的标准曲线算出培养上清中的胶原量。同时用BCAProteinAssayReagent(PIERCE)对细胞的蛋白质进行定量。用培养上清中的胶原量除以蛋白质量，算出单位蛋白质量中的胶原量，作为细胞的胶原合成量。结果如表2所示。所有的结果均以均值土标准差表示。用Student-t检验进行显著性差异的检测。当p值p0.05时为有显著性差异。如表2中所示，通过用添加了葡萄树液的培养基进行培养，促进了成纤维细胞的胶原合成，大约是未添加(对照)时的1.2~3.6倍。尤其是，在应用含500jig/ml以上的葡萄树液冷冻干燥品的培养基时，其作用显著。此外，在应用含250iig/ml以上的葡萄树液冷冻干燥品的培养基时，可以确认其蛋白质量有显著性增加。蛋白质的增加表示活化了成纤维细胞使之增殖。表2中所示的胶原量是与蛋白质量的比值，可以看出各个细胞的胶原合成量有显著性增力口。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>下划线显著性促进胶原的合成下划线显著性促进胶原的合成实施例3(联合使用脯氨酸的实验)试验样品的制备为了验证葡萄树液与脯氨酸并用的效果，按表3中的配方制备用于下述官能评价实验和皱紋评价实验的软膏。表3中所示组成物的配合量都以质量％表示。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>官能评价实验选诉说肌肤干燥和柔软性、弹力性的60名30~50岁的女性作为受试者。受试者分为4组，15名每组，组间没有年龄偏差。将按照表3中所示比较例1和例1~3的4种配方例的乳膏分别施用给受试者，早晚1日2次，连续使用30天，将使用感分为湿润感(湿润性)、弹力感(弹力性)和柔软感(柔软性)进行功能评价实验。评价标准如表4所示，官能评价实验的结果如表5所示。[表4][评价标准]使用感评价点评价湿润感(湿润性)非常湿润4湿润3普通2不湿润1根本不湿润弹力感(弹力性)非常有弹力4有弹力3普通2没有弹力1根本没有弹力柔软感(柔软性)非常柔软4柔软3普通2不柔软1根本不柔软[表5]比较例1例1例2例3湿润感(湿润性)2.94.14.24.6弹力感(弹力性)2.83.23.94.5柔软感(柔软性)2.73.13.54.2平均值2.83.53,94.4*各组15名的平均评价分值、及3项评价指标的总平均值铍紋评价实验选肌肤出现皱紋(尤其是眼睛周围的细小皱紋)的40名40~60岁的女性作为受试者。受试者分为4组，IO名每组，组间没有年龄偏差。将按照表3中所示比较例1和例1~3的4种配方例的乳膏分别施用给受试者，早晚1日2次，以容易出现皱紋的眼睛四周为中心，连续使用30天，应用紫外线照片通过视觉判定法比较使用前后眼睛周围的皱紋条数。其结果示于表6中。比專交例1例1例2例3涂抹前(第0天)的皱紋数24222729涂抹后(第30天)的皱紋数22171918皱紋条数改善(减少)率8%23%30%38%*各组IO名的平均皱紋条数、及涂抹前后的改善(减少率)试验结果无论是显示功能评价实验结果的表5中，还是显示皱紋评价实验结果的表6中，与比较例1的含有脯氨酸的乳膏相比，例1的含有葡萄树液的乳膏对千燥、弹力、皱紋等的改善效果高。此外，与葡萄树液和脯氨酸单独作用时相比，例2和例3的葡萄树液与脯氨酸组合的乳膏对干燥、弹力、皱紋等的改善效果更高。也就是说，葡萄树液对干燥、弹力、皱紋等的改善效果很好，再向葡萄树液中组合使用构成胶原的氨基酸尤其是脯氨酸，肌肤的保湿效果高，显著减少皱紋的效果更南。产业上利用的可能性本发明通过葡萄树液的成纤维细胞激活作用和成纤维细胞的胶原合成促进作用可有效防止皮肤的老化。本发明的胶原合成促进剂及成纤维细胞激活剂，除防止老化之外，还可期待用于粉刺痕、妊娠紋的治愈、烧伤等的创伤治疗、人工皮肤的培养促进等领域。权利要求1.一种成纤维细胞激活剂，其包含葡萄树液作为有效成分。2.权利要求1中的成纤维细胞激活剂，其还包含脯氨酸。3.—种使用葡萄树液的成纤维细胞活化方法。4.权利要求3的成纤维细胞活化的方法，其还联合应用脯氨酸。5.将葡萄树液作为成纤维细胞激活剂使用的方法。6.权利要求5的方法，其中所述成纤维细胞激活剂还包含脯氨酸。7.—种胶原合成促进剂，其包含葡萄树液作为有效成分。8.权利要求7中的胶原合成促进剂，其还包含脯氨酸。9.一种使用葡萄树液促进胶原合成的方法。10.权利要求9的促进胶原合成的方法，其还联合应用脯氨酸。11.将葡萄树液作为胶原合成促进剂使用的方法。12.权利要求11的方法，其中所述胶原合成促进剂还包含脯氨酸。13.—种皮肤老化预防剂，其包含葡萄树液作为有效成分。14.权利要求13中的皮肤老化预防剂，其还包含脯氨酸。15.—种使用葡萄树液预防皮肤老化的方法。16.权利要求15的预防皮肤老化的方法，其还联合应用脯氨酸。17.将葡萄树液作为皮肤老化预防剂使用的方法。18.权利要求17的方法，其中所述皮肤老化预防剂还包含脯氨全文摘要本发明涉及包含以葡萄树液为有效成分的成纤维细胞激活剂、使用葡萄树液的成纤维细胞的活化方法、以及将葡萄树液作为成纤维细胞激活剂使用的方法。此外，本发明涉及包含以葡萄树液为有效成分的胶原合成促进剂及使用葡萄树液的胶原合成促进方法、以及将葡萄树液作为胶原合成促进剂使用的方法。此外，本发明涉及包含以葡萄树液为有效成分的皮肤老化预防剂及使用葡萄树液的皮肤老化预防方法、以及将葡萄树液作为皮肤老化预防剂使用的方法。本发明提供安全性高且有效预防老化的手段。文档编号A61P43/00GK101299991SQ200680039019公开日2008年11月5日申请日期2006年10月17日优先权日2005年10月18日发明者今村一幸,渡边东申请人:美露香株式会社