专利名称：免疫球蛋白融合蛋白制剂的制作方法
本申请要求2005年11月22日申请的美国申请号60/739,271的优先权，其在本文引用作为参考。
发明领域 本发明涉及蛋白质制剂领域。更具体而言，本发明涉及包含免疫球蛋白(Ig)融合蛋白的药物组合物。
背景 生物技术的发展使生产多种用于药学应用的蛋白质成为可能。生产之后，经常必需在使用前贮藏蛋白质药物。适合贮藏的蛋白质药物的制剂和加工部分地由于蛋白质通常比“传统的”药物大并且更加复杂而特别具有挑战性。蛋白质药物制剂和加工设计的综述见Carpenter等人，Pharmaceutical Research 14969-975(1997)；Wang，International Journalof Pharmaceutics 2031-60(2000)；以及Tang和Pikal，PharmaceuticalResearch 21191-200(2004)。
在设计蛋白质药物生产的制剂和工艺过程中可考虑几个因素。首先要考虑的是任何或所有制备、运输和处理步骤中蛋白质的稳定性，这可包括制备组合物、冷冻、干燥、贮藏、运输、重建(reconstitution)、冷冻/融化循环和最终使用者的重建后贮藏(post-reconstitution storage)。其它潜在的考虑包括制备、处理和分送的简化和经济；给患者施用的最终产品的组成；最终使用者使用的方便，包括冻干制剂在重建后的可溶性。
液体制剂可可满足某些目的。液体制剂的可能优点包括制造的简化和经济以及方便最终使用者。
冻干制剂也可提供某些优势。冻干的潜在好处包括提高蛋白质稳定性以及简化和节约运输和贮藏。
除了选择组合物的基本形式(例如冻干的、液体的、冷冻的)之外，蛋白质制剂的优化一般包括改变制剂的组分及它们分别的浓度以使蛋白质稳定性最高。许多因素可影响蛋白质稳定性，包括离子强度、pH值、温度、冷冻/融化循环、剪切力、冷冻、干燥、搅拌和重建。蛋白质不稳定性可由物理降解(例如变性、聚集或沉淀)或化学降解(例如脱酰胺作用、氧化或水解)造成。制剂组分和浓度的优化可包括克服不稳定性来源的实验研究和/或合理方法。
因此，需要提供允许稳定贮藏多种蛋白质并且特别地适于各种类型蛋白质药物和免疫球蛋白(Ig)融合蛋白的制剂。
概述 本发明至少部分是基于发现了在长期贮藏过程中和/或一个或更多个冷冻/融化循环之后足够稳定的含有Ig融合蛋白的某些组合物。本发明提供了这样的药物组合物，其含有Ig融合蛋白和至少下列四种非蛋白质组分(1)填充剂，(2)二糖，(3)表面活性剂，和(4)缓冲剂。在一些实施方案中，组合物还含有NaCl。组合物不含有精氨酸或半胱氨酸。
Ig融合蛋白为本领域已知并且在例如美国专利5,516,964、5,225,538、5,428,130、5,514,582、5,714,147、5,455,165和6,136,310中描述。在一些实施方案中，Ig融合蛋白为酸性的，例如pI低于6.0的Ig融合蛋白。在阐述性的实施方案中，酸性Ig融合蛋白为PSGL-Ig、GP1b-Ig、IL-13R4g和IL-21R-Ig。
在一些实施方案中，Ig融合蛋白为强酸性的，例如pI低于4.0的Ig融合蛋白。在阐述性的实施方案中，强酸性Ig融合蛋白为PSGL-Ig。
在一些实施方案中，Ig融合蛋白的非Ig部分为细胞因子受体，例如白细胞介素受体。在阐述性的实施方案中，细胞因子受体为IL-13R和IL-21R。
在一些实施方案中，Ig融合蛋白的非Ig部分为硫酸化的、磷酸化的和/或糖基化的。在阐述性的实施方案中，硫酸化的Ig融合蛋白为PSGL-Ig和GP1b-Ig。在阐述性的实施方案中，糖基化的Ig融合蛋白为PSGL-Ig、GP1b-Ig和IL-13R-Ig。在一些实施方案中，糖基化的Ig融合蛋白为岩藻糖基化的(fucosylated)和/或唾液酸化的(sialylated)。在阐述性的实施方案中，岩藻糖基化的Ig融合蛋白为PSGL-Ig和GP1b-Ig。在阐述性的实施方案中，唾液酸化的Ig融合蛋白为PSGL-Ig、GP1b-Ig和IL-13R-Ig。
填充剂的阐述性实例包括甘氨酸和甘露糖醇。阐述性的二糖包括蔗糖和海藻糖。表面活性剂的阐述性实例包括聚山梨酯20(polysorbate-20)和聚山梨酯80(polysorbate-80)。缓冲剂的阐述性实例包括胺和磷酸盐缓冲剂。基于胺的缓冲剂的阐述性实例包括组氨酸和三羟甲基氨基甲烷(Tris)。
在一些实施方案中，本发明的组合物的组分以定义的浓度范围存在。在一些实施方案中，蛋白质浓度为0.025-60mg/ml；填充剂的浓度为0.5-5％；二糖的浓度为0.5-5％；表面活性剂的浓度为0.001-0.5％；所有组分互相独立。在一些实施方案中，NaCl浓度为1-200mM。在某些实施方案中，NaCl浓度低于35mM。在特别的实施方案中，药物组合物包含1-4％的填充剂，0.5-2％的二糖和0.005-0.02％的表面活性剂。在阐述性的实施方案中，组合物包含2％的填充剂，1％的二糖和0.01％的表面活性剂。
本发明还涉及制剂的物理状态。本发明非限制地提供液体的、冷冻的、冻干的和重建的制剂。
本发明还提供制备本发明组合物的方法，所述方法包括这样的方法，其中通过包括退火步骤的过程冻干组合物。
前面的概述和下面的详述仅为示例性和解释性的，并不限制所要求保护的本发明。
附图简述
图1显示了多达14个冷冻/融化循环之后聚山梨酯80对GP1b-Ig制剂中蛋白质聚集和蛋白质回收的影响。GP1b-Ig在20mM Tris pH 7.2，50mMNaCl和0％、0.005％、0.01％或0.02％聚山梨酯80中制备成2mg/mL。每一种制剂的小瓶进行多达14个循环的冷冻/融化并通过SEC-HPLC测定高分子量种类(HMW)百分比。通过280和214nm处的HPLC检测器信号监测蛋白质回收。X轴显示了冷冻/融化循环数。Y轴显示HMW百分比。详述 本发明提供了含Ig融合蛋白的组合物。本发明至少部分地基于发现含Ig融合蛋白、缓冲剂、二糖、填充剂和表面活性剂的组合物对长期贮藏和/或一个或更多个冷冻/融化循环提供足够的稳定性。本发明也提供了制备Ig融合组合物的方法。
Ig融合蛋白 本发明提供了含免疫球蛋白(Ig)融合蛋白的组合物。
Ig融合蛋白为包含与Ig部分(b)连接的非Ig部分(a)的蛋白质，所述的Ig部分衍生自免疫球蛋白的恒定区。
在一些实施方案中，Ig融合蛋白为酸性的，例如等电点(pI)低于6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0或2.5的Ig融合蛋白。在阐述性的实施方案中，例如酸性Ig融合蛋白为PSGL-Ig、GP1b-Ig、IL-13R-Ig和IL-21R-Ig。蛋白质的等电点为其净电荷为零的pH值。测定目的蛋白质等电点的方法为本领域所熟知，并且包括但不限于基于蛋白质氨基酸序列的理论计算和通过等电聚焦(IEF)直接测量pI。Skoog，B.和Wichman，A.，Trends Anal.Chem.582-83(1986)；Patrickios，CS.和Yamasaki，E.N.，Anal.Biochem.，23182-91(1995)；Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，第三版，第171页(1994)。
在一些实施方案中，Ig融合蛋白是强酸性的，例如pI低于4.0、3.5、3.0或2.5的Ig融合蛋白。在阐述性的实施方案中，强酸性Ig融合蛋白为PSGL-Ig。
在一些实施方案中，Ig融合蛋白的非Ig部分衍生自受体，例如细胞因子受体。在阐述性的实施方案中，细胞因子受体为白细胞介素受体。在阐述性的实施方案中，细胞因子受体为IL-13R和IL-21R。可以使用其它细胞因子受体，例如Cytokine Reference，第二卷Receptors，Oppenheim&Feldman编辑，Academic Press，2001中所述的细胞因子受体。
在一些实施方案中，Ig融合蛋白包含硫酸化的、磷酸化和/或糖基化的非Ig部分。在阐述性的实施方案中，硫酸化的Ig融合蛋白为PSGL-Ig和GP1b-Ig。在阐述性的实施方案中，糖基化的Ig融合蛋白为PSGL-Ig、GP1b-Ig和IL-13R-Ig。在一些实施方案中，糖基化的Ig融合蛋白为岩藻糖基化的和/或唾液酸化的。在阐述性的实施方案中，岩藻糖基化的Ig融合蛋白为PSGL-Ig和GP1b-Ig。在阐述性的实施方案中，唾液酸化的Ig融合蛋白为PSGL-Ig、GP1b-Ig和IL-13R-Ig。检测和分析蛋白质的硫酸化、磷酸化和糖基化的方法为本领域所熟知并在例如PosttranslationalModifications of ProteinsTools for Functional Proteomics(Methods inMolecular Biology)，Christoph Kannicht编辑(2002)中描述。
在一些实施方案中，Ig融合蛋白的Ig部分衍生自免疫球蛋白的Fc结构域，所述免疫球蛋白例如人、鼠或其它物种的IgG(IgG1、IgG4或另一种IgG同种型)，并包括天然存在的Ig序列的功能部分以及此类序列的突变和修饰。多种Fc结构域的序列为本领域已知并在例如Sequences ofProteins of Immunological Interest，US Department of Health and HumanServices，Kabat等人编辑，1991中提供。Ig部分可含有Fc结构域的下列任何一个或全部部分CH1、CH2、CH3和铰链区。例如Fc结构域可含有CH2、CH3和铰链区，但不含有CH1。
因此，Ig融合蛋白可包含连接非Ig部分和Ig部分的接头。
在一些实施方案中，本发明组合物中Ig融合蛋白的浓度低于100mg/ml，低于90mg/ml，低于80mg/ml，低于70mg/ml，低于60mg/ml，低于50mg/ml，低于40mg/ml，低于30mg/ml，低于20mg/ml，低于15mg/ml，低于10mg/ml或者低于5mg/ml。在一些实施方案中，本发明组合物中的Ig融合蛋白的浓度选自下列范围大约0.025-大约60mg/ml，大约0.025-大约40mg/ml，大约0.025-大约20mg/ml或者大约0.025-大约10mg/ml。在一个阐述性的实施方案中，Ig融合蛋白的浓度为大约10mg/ml。
缓冲剂 本发明的组合物包含部分地发挥维持pH值在所需范围的缓冲剂。适用于本发明的缓冲剂包括但不限于磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和胺缓冲剂。磷酸盐缓冲剂可为例如磷酸钾或磷酸钠。胺缓冲剂可为例如组氨酸、三(羟甲基)氨基甲烷(“tris”)或者二乙醇胺。
本发明组合物中缓冲剂的浓度可选自下列范围大约1-大约1000mM，大约1-大约200mM，大约1-大约100mM，大约1-大约50mM，大约1-大约40mM，大约1-大约30mM，大约1-大约20mM或者大约1-大约10mM。在阐述性的实施方案中，组合物中缓冲剂的浓度为大约10mM。
本发明组合物的pH可选自下列范围4-10，5-9，优选地6-8。患者的不适可通过将注射组合物的pH值定为生理水平或接近生理水平最小化。为此目的，药物组合物的pH优选地为大约5.8-大约8.4，更优选地为大约6.2-大约7.4。此范围之内或之外的常规pH调节可能是提高组合物中多肽或其它组分溶解性或稳定性所必需的。
二糖 本发明的组合物还包含二糖。优选地，二糖为非还原糖，例如蔗糖或海藻糖。在某些实施方案中，组合物中二糖的浓度选自下列范围0.5-5％，0.5-4％，0.5-3％，0.5-2.5％，0.5-2％，0.5-1.5％，0.5-1％，1-1.5％，1.5-2％，2-2.5％，2.5-3％，3-4％，4-5％或者高于5％。在特定的实施方案中，组合物中二糖的浓度为大约0.5-5％，例如大约0.5-2.0％。在阐述性的实施方案中，二糖浓度为0.9％或1.0％。
在一个方面，二糖起到在冷冻过程中稳定蛋白质的作用。因为冷冻过程中的保护作用可取决于二糖的绝对浓度(Carpenter等人，Pharmaceutical Research 14969-975(1997))，所以5％以上的浓度可能是获得最大稳定性所必需的。
在一个方面，二糖在干燥过程中稳定蛋白质。干燥过程中的保护作用可取决于二糖和蛋白质之间的最终质量比。Carpenter等人，Pharmaceutical Research 14969-975(1997)。因此，在一些实施方案中，选择二糖浓度以实现二糖与蛋白质的所希望的质量比，一般至少为1∶1。在一些实施方案中，大约5∶1的二糖∶蛋白质质量比优化稳定性。在其它实施方案中，二糖∶蛋白质质量比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、100∶1、200∶1、300∶1、400∶1、500∶1、600∶1、700∶1、800∶1、900∶1、1000∶1或高于1000∶1。
二糖可作为冻干保护剂(lyoprotectant)或冻存保护剂(cryoprotectant)。“冻干保护剂”包括冻干和随后贮藏过程中防止或降低蛋白质的化学或物理不稳定性的物质。在一个方面，由于在干燥过程中从组合物中去除水，冻干保护剂防止或降低蛋白质中的化学或物理不稳定性。在另一个方面，冻干保护剂通过氢键帮助维持蛋白质的适当构象稳定蛋白质。
“冻存保护剂”包括在生产、冷冻、贮藏、处理、分送、重建或使用过程中为冷冻蛋白质提供稳定性的物质。在特定的方面，“冻存保护剂”包括保护蛋白质不受冷冻过程诱导的胁迫的物质。冻存保护剂可具有冻干保护剂作用。
填充剂 本发明的组合物还包含下列一种或更多种填充剂甘氨酸和甘露糖醇。填充剂起到对冻干饼的质量和物理结构发挥作用。在一个方面，填充剂有助于形成一流的饼(elegant cake)。更特别地，填充剂促进形成美学可接受的、均匀的或者机械上强硬的饼。填充剂也促进形成开孔结构(open porestructure)并简化和加速重建。填充剂也减少或防止饼崩解、低共熔或保留残留水分。在另一个方面，填充剂帮助保护蛋白质抗胁迫(例如物理和化学胁迫)并帮助维持蛋白质活性。
在某些实施方案中，组合物中填充剂的浓度选自下列范围0.5-1％、1-1.5％、1.5-2％、2-2.5％、2.5-3％、3-3.5％、3.5-4％、4-4.5％、4.5-5％、高于5％、0.5-5％、0.5-4％、0.5-3％、0.5-2.5％、0.5-2％、0.5-1.5％或0.5-1％。在某些实施方案中，组合物中填充剂的浓度为0.5-5％，例如0.5-3％，甚至更准确地为1.8-2％。
表面活性剂 优选地，本发明的组合物也包含表面活性剂。在一个方面，表面活性剂保护蛋白质不受界面处(例如空气/溶液界面或溶液/表面界面)诱导的胁迫。在一个实施方案中，表面活性剂防止或减少聚集。表面活性剂包括洗涤剂，如聚山梨酯(例如聚山梨酯20或聚山梨酯80)和聚合物(如聚乙二醇)。本领域已知多种表面活性剂(见例如美国专利6,685,940，16栏，10-35行)。在阐述性的实施方案中，表面活性剂为植物来源的聚山梨酯80。
在某些实施方案中，组合物中表面活性剂的浓度为0.001-0.5％、0.001-0.2％、0.001-0.1％、0.001-0.05％、0.001-0.01％或者0.001-0.005％。在阐述性的实施方案中，组合物中表面活性剂的浓度为0.005-0.01％。
其它组分 组合物还包含其它可药用组分。适当的其它组分包括本领域已知的其它张力调节剂和其它赋形剂。
张力调节剂是对组合物的重量克分子渗透浓度有贡献的物质。人血清的重量克分子渗透浓度大约为300±50mOsM/kg。为维持蛋白质稳定性并最小化患者不适，通常优选的是药物组合物是等渗的，即具有与人血清大约相等的重量克分子渗透浓度。因此，组合物的重量克分子渗透浓度优选地为180-420mOsM/kg。然而，本领域的技术人员理解组合物的重量克分子渗透浓度可根据特定疾病的需要提高或降低。本领域已知多种张力调节剂(见例如美国专利申请20030180287，0047段)。组合物的其它组分也可对组合物的重量克分子渗透浓度有贡献，其中所述组合物的其它组分包括但不限于缓冲剂、二糖、填充剂和表面活性剂。
赋形剂包括但不限于化学添加剂、共溶质和共溶剂。优选地，赋形剂对蛋白质的稳定性有贡献，但是应理解到赋形剂可另外地有利于组合物的物理、化学和生物学特性。本领域已知多种赋形剂(见例如美国专利申请20030180287，0048-0049段)。
在一些实施方案中，组合物还包含氯化钠。在特定的实施方案中，组合物包含1-200mM，或低于50mM，低于40mM，低于35mM，低于30mM，低于25mM，低于20mM，低于15mM，低于10mM或者低于5mM的NaCl。在某些条件下，NaCl可在冻干过程中造成困难或者在重建冻干物过程中导致出现乳光。因此，在特定的实施方案中，组合物不包含NaCl。
应理解到组合物的某些组分可与本领域已知的备选物交换。然而，本领域的技术人员也应理解到由于包括但不限于化学相容性、pH、张力和稳定性的原因，包括某些组分将排除使用其它组分、浓度或者制备药物组合物的方法。
本发明的组合物含有不高于0.5mM、0.1mM、0.01mM、不可检测到水平的精氨酸或其盐或者半胱氨酸或其盐，或者不含有精氨酸或其盐或者半胱氨酸或其盐。在制备组合物过程中不添加这些化合物，或者在组合物中不能超过这些限度地被检测到。与多肽中存在的精氨酸和/或半胱氨酸相比，这些限制条件仅用于游离氨基酸及其盐。
阐述性实施方案 在一些实施方案中，药物组合物基本由Ig融合蛋白、缓冲剂、二糖、填充剂和表面活性剂组成。在一些实施方案中，药物组合物包含Ig融合蛋白、缓冲剂、二糖、填充剂和表面活性剂。
在一个阐述性的实施方案中，药物组合物包含药学有效量的Ig融合蛋白、1mM到1M的缓冲剂、0.5-5％的二糖、0.5-5％的填充剂和0.001-0.5％的表面活性剂。在其它实施方案中，药物组合物包含药学有效量的Ig融合蛋白、1mM到1M的缓冲剂、0.5-5％的二糖、0.5-5％的填充剂、0.001-0.5％的表面活性剂和1-200mM的NaCl。在其它实施方案中，药物组合物包含药学有效量的Ig融合蛋白、1mM到1M的缓冲剂、0.5-5％的二糖、0.5-5％的填充剂、0.001-0.5％的表面活性剂和低于35mM的NaCl。在其它实施方案中，药物组合物包含药学有效量的Ig融合蛋白、1mM到1M的缓冲剂、0.5-5％的二糖、0.5-5％的填充剂和0.001-0.5％的表面活性剂并且不含有NaCl。
在一个阐述性的实施方案中，药物组合物包含0.025-20mg/ml的Ig融合蛋白、5-30mM的缓冲剂、0.5-2％的二糖、1.5-2.5％的填充剂和0.001-0.02％的表面活性剂。
在其它实施方案中，药物组合物包含大约10mg/ml的Ig融合蛋白，大约10mM的缓冲剂，大约1.8-大约2％的填充剂，大约0.9-大约1％的二糖和大约0.005-大约0.01％的表面活性剂。
在其它实施方案中，药物组合物包含大约10mg/ml的Ig融合蛋白，大约10mM的缓冲剂，大约1.8-大约2％的甘氨酸，大约0.9-大约1％的二糖和大约0.005-大约0.01％的表面活性剂。
在其它实施方案中，药物组合物包含大约10mg/ml的Ig融合蛋白，大约10mM的缓冲剂，大约1.8-大约2％的甘露糖醇，大约0.9-大约1％的二糖，大约0.005-大约0.01％的表面活性剂和低于35mM的NaCl。
在一个阐述性的实施方案中，药物组合物包含10mg/ml的PSGL-Ig，10mM的组氨酸，260mM的甘氨酸，10mM的NaCl，1％蔗糖和0.005％的聚山梨酯80。
在一个阐述性的实施方案中，药物组合物包含10mg/ml的GP1b-Ig，10mM的组氨酸，1.8％的甘氨酸，25mM的NaCl，0.9％的蔗糖和0.01％的聚山梨酯80。
在一个阐述性的实施方案中，药物组合物包含10mg/ml的IL-13R-Ig，10mM的Tris，2％的甘露糖醇，40mM的NaCl，1％的蔗糖和0.01％的聚山梨酯80。
组合物的物理状态 适于本发明药物组合物的多种物理状态包括但不限于液体、冷冻液体、冻干的制剂和重建的制剂。重建的制剂包括已经重悬于液体(一般为注射用水(WFI))中的冻干组合物。对冻干组合物来说，浓度和重量克分子渗透浓度一般指冻干液体组合物之前的浓度和重量克分子渗透浓度，但是这些值可备选地指重建的组合物的浓度和重量克分子渗透浓度。对冷冻的液体组合物来说，浓度和重量克分子渗透浓度一般指冷冻前的液体组合物。
制备药物组合物的方法 本领域的技术人员已知适于制备本发明的药物组合物的多种方法。技术人员也应理解到一些组分可能以对某些方法或制备顺序不利的方式相互作用。
在一个实施方案中，组合物通过将经纯化的蛋白质变成含除表面活性剂外的所有剩余组合物组分的溶液并且随后添加所需浓度的表面活性剂来制备。
在一个实施方案中，组合物通过这样的方法冻干，所述方法包括退火步骤，即，将组合物维持在最终冷冻温度以上的温度一段时间以促进潜在的结晶组分的结晶。在一个方面，退火允许填充剂完全或更彻底的结晶，其可改进块结构或提高蛋白质稳定性。此外，填充剂的结晶可增加非晶相的Tg′，其可通过允许在更高的温度进行初次干燥来促进更有效的干燥，并导致改进饼质量或提高稳定性。见Wang，International Journal ofPharmaceutics 2031-60(2000)。此外，不能完全结晶填充剂可允许初次干燥过程中的结晶，这可导致小瓶破碎(Tang和Pikal，PharmaceuticalResearch 21191-200(2004))，或者不能完全结晶填充剂可允许贮藏过程中的结晶，这可使蛋白质不稳定(Carpenter等人，Pharmaceutical Research14969-975(1997))。
在阐述性的实施方案中，药物组合物通过包括下列步骤的方法冻干在低于-40℃的温度冷冻组合物；在-5℃到-40℃之间退火足够促进填充剂结晶的时间；将温度降低到低于-35℃；建立真空；在-20℃到+30℃之间的温度干燥组合物。
稳定性 在一个方面，本发明涉及稳定的药物组合物。“稳定的”组合物为在贮藏或使用后其中的蛋白质基本保留某些物理和化学特性的组合物。在一个方面，“贮藏或使用”包括一个或更多个冷冻/融化循环。蛋白质稳定性和/或不稳定性的各种测定法在实施例和本领域所熟知的其它适当方法中描述并在例如Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.1029-90(1993)中综述。此类测定法包括但不限于高分子量物质(例如聚集物)的定量、低分子量物质(例如降解物)的定量、蛋白质浓度的定量、蛋白质活性的定量和翻译后氨基酸修饰的定量。本发明的药物组合物在贮藏或使用后优选地含有低于10％、低于5％、低于4％、低于3％、低于2％、低于1％、低于0.5％的聚集物(高分子量)或降解物(低分子量)物质。类似地，本发明的药物组合物在贮藏或使用后优选地保留80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的蛋白质活性。
在一些实施方案中，组合物在某些温度(例如-80℃至40℃、-40℃至40℃、大约20℃)稳定特定的时间期间(例如1、4、7、12或24周；或者1、2、3、4、6、7.5、9或12个月；或者更长时间)。
在一些实施方案中，组合物在特定数量的冷冻/融化循环之后是稳定的(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或者更多个循环)。
在一个方面，药物组合物在任何或所有制备、运输和处理步骤中为稳定的蛋白质，这可包括制备组合物、冷冻、干燥、贮藏、运输、重建、冷冻/融化循环和最终使用者的重建后贮藏。
多种因素可影响蛋白质稳定性，这包括离子强度、pH、温度、冷冻/融化循环、剪切力、冷冻、干燥、搅拌和重建。蛋白质不稳定可由物理降解(例如变性、聚集或沉淀)或化学降解(例如脱酰胺作用、氧化或水解)造成。
实施例 实施例1PSGL-Ig制剂 A.PSGL-Ig背景 P选凝素糖蛋白配体-1(PSGL-1)是人白细胞上P选凝素的主要高亲和性受体。如美国专利5,827,817所述，PSGL-Ig是包含与突变的人IgG1 Fc结构域连接的可溶PSGL的融合蛋白。PSGL-Ig的等电聚焦(IEF)在pH值2.8-3.3显示明显条带，聚集在大约3的pI附近。PSGL-Ig的翻译后修饰包括硫酸化和糖基化。PSGL-Ig的糖基化包括O-连接的和N-连接的聚糖。PSGL-Ig中O-连接的聚糖包括唾液酸化的和/或岩藻糖基化的结构。PSGL的翻译后修饰及其生物学意义的综述见Liu等人，Journal of BiologicalChemistry 2737078-7087(1998)。
B.PSGL-Ig制剂的优化 经QAE柱纯化PSGL-Ig并制备成在PBS-CMF或者“His/Suc/Gly”(10mM组氨酸，260mM甘氨酸，1％蔗糖)中的大约25μg/ml。冷冻/融化循环前在无聚山梨酯80或者有以0.005％添加的聚山梨酯80存在下处理样品，或者在冷冻/融化循环后但在HMW测量前(仅用于PBS-CMF)有以0.005％添加的聚山梨酯80存在下处理样品。将样品进行20个循环的冷冻/融化。在冷冻/融化循环之前和之后通过分子筛层析(SEC)-HPLC测定高分子量(HMW)种类百分比。如表1所示，聚山梨酯80显著降低PBS-CMF和His/Suc/Gly中的HMW的积累，但是仅在冷冻/融化之前添加时显著降低。
表1PSGL-Ig制剂的优化 为了测定缓冲剂和pH值对PSGL-Ig稳定性的作用，将PSGL-Ig制备成仅于15mM缓冲液(不合其它赋形剂)的大约50μg/ml的溶液。在总共7个pH值检测5种缓冲液(琥珀酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸缓盐冲液和Tris)(见表2)。将样品进行5个循环的冷冻/融化。在冷冻/融化循环之前和之后通过SEC-HPLC测定HMW百分比。如表2所示，冷冻/融化之后柠檬酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液造成HMW百分比的最小变化，而tris、磷酸盐缓冲液和琥珀酸盐缓冲液造成较高的HMW百分比增加。
表2PSGL-Ig制剂pH值对HMW积累的影响 C.PSGL-Ig制剂的长期稳定性 将纯化的PSGL-Ig以5mg/mL换到1％蔗糖，260mM甘氨酸，10mMNaCl和10mM组氨酸，pH 6.5-6.6中。添加聚山梨酯80到终浓度0.005％。将1ml等份装入2ml管制I型玻璃瓶并塞住。冻干样品并贮藏于5℃、25℃或40℃，或者以冷冻液体贮藏在-80℃。通过HMW形成、亚硫酸化(hyposulfation)程度、以相对结合单位(RBU)测量的生物学活性和N端谷氨酰胺环化至焦谷氨酸的程度评价蛋白质稳定性。零时间样品由冻干前和冻干后制剂组成。也分析在上文所列温度贮藏3或7.5个月之后的样品。如表3所示，冻干的和冷冻液体制剂在所检测的条件下是稳定的。
表3PSGL-Ig制剂的稳定性
实施例2GP1b-Ig制剂 A.GP1b-Ig背景 GP1b-α是血小板表达的受体。GP1b-α的主要配体是冯维勒布兰德因子(VWF)。如PCT公开号WO 02/063003所述，GP1b-Ig是包含与灭活的人IgG1 Fc的225个氨基酸连接的GP1b-α的可溶性N端290个氨基酸的配体结合结构域的融合蛋白。GP1b-Ig的VWF结合结构域包含两个获得的功能突变，M239V和G233V，这能提高其VWF结合亲和力。GP1b-Ig的等电聚焦(IEF)在4.1-5.6的pH值范围显示主要条带，聚集在大约5的pI附近。GP1b-Ig的翻译后修饰包括N连接的糖基化。GP1b-Ig中N连接的聚糖包括唾液酸化的和/或岩藻糖基化的结构。
B.GP1b-Ig制剂的优化 在2ml聚丙烯小瓶中评价聚山梨酯80对GP1b-Ig稳定性的影响。将GP1b-Ig制备成20mM Tris pH 7.2，50mM NaCl和各种浓度的聚山梨酯80(0％、0.005％、0.01％或0.02％)中2mg/ml的溶液。在液氮中浸没1分钟冷冻小瓶并通过在20℃水中孵育到不再有冰来融化。将样品进行14个循环的冷冻/融化，在每一循环之后取出小份进行分析。通过SEC-HPLC测定HMW百分比。通过整合280nm处吸收信号上蛋白质峰的面积评价蛋白质回收。如图1所示，添加聚山梨酯80显著降低HMW积累。
以类似的方式评价甘氨酸对GP1b-Ig稳定性的影响。将GP1b-Ig制备成于10mM组氨酸pH 6.5，25mM NaCl，0.9％蔗糖，0.01％聚山梨酯80和各种浓度甘氨酸(0％、1.0％、1.8％、2.0％或4.0％w/v)的5mg/ml的溶液。在液氮中浸没1分钟冷冻小瓶并通过在20℃水浴中孵育到不再有冰来融化。将样品进行10个循环的冷冻/融化，在每一循环之后取出小份进行分析。通过SEC-HPLC测定HMW百分比。如表4所示，添加1.8％的甘氨酸在第6、8和10个冷冻/融化循环之后使HMW积累最少。
表4甘氨酸浓度对GP1b-Ig制剂中％HMW的影响
以类似的方式评价pH值对GP1b-Ig稳定性的影响。在不同的pH值水平(5.0、6.0、7.0或8.0)将GP1b-Ig制剂成于20mM磷酸钠中的1mg/ml。在液氮中浸没1分钟冷冻小瓶并通过在20℃水浴中孵育到不再有冰来融化。将样品进行10个冷冻/融化循环，在每一循环之后取出小份进行分析。通过SEC-HPLC测定HMW百分比并通过280nm处和214nm处的HPLC检测器信号监测蛋白质回收。10个循环之后，pH 5.0和6.0的样品变得混浊，这是可溶性蛋白回收下降的指示。如表5所示，在pH 5.0或6.0的制剂导致HMW积累的增加和蛋白质回收的减少。
表5pH对GP1b-Ig制剂中％HMW和蛋白质回收的影响
于10mM组氨酸，pH 6.5，1.8％甘氨酸，25mM NaCl，0.9％蔗糖和0.01％聚山梨酯80中的0.25、10或19mg/ml的GP1b-Ig半填充于20ml瓶中评价蛋白质浓度对GP1b-Ig稳定性的影响。在液氮中浸没10分钟冷冻瓶子并通过在25℃水浴中孵育15-20分钟融化。将样品进行10个循环的冷冻/融化，第0、1、2、4、6、8和10个循环之后取出小份用于分析。分析之前通过在另一相同制剂中稀释到0.25mg/ml将所有样品中的蛋白质浓度归一。通过SEC-HPLC测定HMW百分比。如表6所示，GP1b-Ig在此制剂的大浓度范围中稳定。
表6蛋白质浓度对GP1b-Ig制剂中％HMW的影响
C.GP1b-Ig制剂的长期稳定性 将经纯化的GP1b-Ig贮藏在-80℃直到融化使用。A280估计的蛋白质浓度为19mg/ml。通过稀释适当的贮存液将GP1b-Ig制剂成于10mM组氨酸，pH 6.5，1.8％甘氨酸，25mM NaCl，0.9％蔗糖和0.01％聚山梨酯80中的10mg/ml GP1b-Ig。得到的制剂通过0.2μm滤过单位过滤并分发至玻璃小瓶中。将小瓶放于不锈钢托盘上并冷冻干燥。根据表7概括的循环参数进行冷冻干燥。
表7GP1b-Ig冻干循环 循环完成之后，用无水氮气回填冷冻干燥室，之后压下塞子并释放残余的真空。立即将小瓶锁缝、标记并存于2-8℃、25℃或40℃。
在每一个时间点(0、1、2、3、4、6、9和12个月)之后打开一个或更多个冷冻干燥小瓶。通过卡尔费歇尔滴定法评价产物饼的外观和残留水分。然后将饼重建于1ml注射用水(WFI)中，监测外观和重建时间。重建之后通过将电极浸入含400μl制剂的2ml冷冻小瓶中测量pH值。将剩余的溶液分成3×200μl等份，其中两个冷冻于-80℃，其中一个用于分析并存于2-8℃。
将重建的GP1b-Ig制剂在相同溶液中稀释10倍以在理论上得到1mg/ml的溶液。用能透过UV的96孔板通过UV光谱学测量实际的蛋白质浓度。通过下面公式计算蛋白质浓度浓度(mg/ml)＝稀释系数×(A280-A320)/(1.1)。
生物学活性评价为GP1b-Ig与人血浆来源的VWF结合的程度。用测量的蛋白质浓度计算以单位/微克为单位的比活性。
通过SEC-HPLC测量HMW积累并表示为总种类的百分比。
通过反相(RP)-HPLC监测低分子量种类(LMW)的积累并表示为总种类的百分比。
通过阴离子交换层析(AEX)测定硫酸化的同种型的分布。
如表8-10所示，这些测定法证明此GP1b-Ig制剂在检测至少9个月的条件下稳定。表8显示了在2-8℃贮藏获得的结果。表9显示了在25℃贮藏获得的结果。表10显示了在40℃贮藏获得的结果。
表8GP1b-Ig制剂在2-8℃的稳定性 表9GP1b-Ig制剂在25℃的稳定性 表10GP1b-Ig制剂在40℃的稳定性 实施例3IL-13R-Ig制剂 A.IL-13R-Ig背景 IL-13R是白细胞介素-13(IL-13)的主要受体。IL-13R-Ig是如美国专利6,268,480所述的包含与间隔序列和人IgG1的铰链CH2CH3区连接的IL-13Rα2可溶性胞外结构域的融合蛋白。IL-13R-Ig的等电聚焦(IEF)显示3.8-4.7pH范围内的明显条带，聚集在大约4.3的pI附近。IL-13R-Ig的翻译后修饰包括N连接的糖基化。IL-13R-Ig中N连接的聚糖包括唾液酸化的结构。
B.IL-13R-Ig制剂的优化 IL-13R-Ig在4种不同制剂中制剂为10mg/ml10mM NaPO4，0.01％聚山梨酯80，1％蔗糖和2％甘露糖醇，pH 7.4；10mM NaPO4，0.01％聚山梨酯80，0.9％蔗糖和1.8％甘氨酸，pH 7.4；10mM Tris，0.01％聚山梨酯80，1％蔗糖和2％甘露糖醇，pH 7.4；或者10mM Tris，0.01％聚山梨酯80，0.9％蔗糖和1.8％甘氨酸，pH 7.4。将冷冻干燥小瓶在4℃、25℃和40℃贮藏达12周。在每一个时间点，重建每一种制剂和温度组合的一个或更多个小瓶并测定蛋白质回收(通过A280或SEC)、HMW积累(通过SEC-HPLC)或者生物学活性(通过测定抑制依赖IL-13的细胞系增殖的IC50)。表11显示了贮藏12周之后通过A280评价的每一种制剂和温度的蛋白质回收百分比。表12显示了贮藏12周之后通过SEC评价的每一种制剂和温度的蛋白质回收百分比。表13显示了通过SEC-HPLC评价的制剂(上文所列四种之一)、温度(4℃、25℃或40℃)和贮藏时间(0、1个月、7周或12周)的每一组合的HMW积累百分比以及冷冻干燥起始材料之后的HMW积累百分比。表14显示了4周(2-8℃或25℃)、7周(2-8℃或25℃)或12周(2-8℃、25℃或40℃)之后以及冷冻干燥起始材料之后每一种制剂的IC50数据。
表1112周时IL-13R-Ig制剂对％蛋白质回收(通过A280)的影响
表1212周时IL-13R-Ig制剂对％蛋白质回收(通过SEC)的影响
表13IL-13R-Ig制剂对％HMW的影响(通过SEC测量)
表14IL-13R-Ig制剂对生物活性的影响(IC50，pM)
C.IL-13R-Ig制剂的长期稳定性 将经纯化的IL-13R在1％蔗糖，2％甘露糖醇，40mM NaCl，0.01％聚山梨酯80和10mM Tris，pH 7.4中制剂成10mg/ml。将1ml的每一种制剂装入5ml管制小瓶中并在Lyo-StarTM高级干燥器中干燥。将冷冻干燥小瓶存于2-8℃、25℃或40℃达24周，在0、4、7、12和24周分析样品。分析样品的外观(重建之前和之后)、pH值、蛋白质浓度(A280)、HMW(SEC-HPLC)和生物活性(IC50)。如表15-17所示，IL-13R-Ig制剂在所检测的条件下至少24周是稳定的。表15显示了在2-8℃贮藏后获得的结果。表16显示了在25℃贮藏后获得的结果。表17显示了在40℃贮藏之后获得的结果。
表15IL-13R-Ig制剂在2-8℃的稳定性 表16IL-13R-Ig制剂在25℃的稳定性 表17IL-13R-Ig制剂在40℃的稳定性 说明书中的实施方案提供了本发明实施方案的描述并且不应解释为限制本发明的范围。技术人员容易地认识到本发明包括许多其它的实施方案。本公开中引用的所有出版物和专利在此全部引用作为参考。及至参考中所引入的物质与本说明书矛盾或不一致时，以本说明书替代任一此种物质。本文引用的任何参考文献不是承认此类参考文献是本发明的现有技术。除非另外说明，所有的百分数指重量/重量。
权利要求
1.药物组合物，其包含a)具有低于6的pI的Ig融合蛋白，b)甘氨酸，c)二糖，d)表面活性剂和e)缓冲剂；其中该组合物含有0.5-5％的甘氨酸，0.5-5％的二糖和0.001-0.5％的表面活性剂。
2.权利要求1的组合物，其还包含1-200mM浓度的NaCl。
3.权利要求1或权利要求2的组合物，其中组合物中Ig融合蛋白的浓度为0.025-60mg/ml。
4.权利要求1-3中任意一项所述的组合物，其中Ig融合蛋白具有低于4的pI。
5.权利要求1-4中任意一项所述的组合物，其中Ig融合蛋白包含衍生自受体的非Ig部分。
6.权利要求1-5中任意一项所述的组合物，其中Ig融合蛋白包含硫酸化的、磷酸化的、或糖基化的非Ig部分。
7.权利要求6的组合物，其中糖基化的非Ig部分为唾液酸化的或者岩藻糖基化的。
8.权利要求1-7中任意一项所述的组合物，其中Ig融合蛋白为IL-13R-Ig或IL-21R-Ig。
9.权利要求1-7中任意一项所述的组合物，其中Ig融合蛋白为PSGL-Ig或GP1b Ig。
10.权利要求1-9中任意一项所述的组合物，其中二糖为蔗糖或海藻糖。
11.权利要求1-10中任意一项所述的组合物，其中表面活性剂为聚山梨酯。
12.权利要求1-11中任意一项所述的组合物，其中组合物中缓冲剂的浓度为5-30mM。
13.权利要求1-12中任意一项所述的组合物，其中缓冲剂为组氨酸缓冲剂、tris缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。
14.权利要求1-13中任意一项所述的组合物，其中组合物不含NaCl。
15.权利要求1-14中任意一项所述的组合物，其中组合物已经进行了冷冻干燥。
16.权利要求1-15中任意一项所述的组合物，其中组合物在-80℃到+40℃至少一周是稳定的。
17.权利要求15的组合物，其中组合物已经被重建。
18.药物组合物，其包含a)具有低于6的pI的Ig融合蛋白，b)甘露糖醇，c)二糖，d)表面活性剂，e)缓冲剂，并且其中组合物含有0.5-5％的甘露糖醇，0.5-5％的二糖，0.001-0.5％的表面活性剂和低于35mM的NaCl。
19.权利要求18的组合物，其中Ig融和蛋白的浓度为0.025-60mg/ml。
20.权利要求18或权利要求19的组合物，其中Ig融合蛋白具有低于4的pI。
21.权利要求18-20中任意一项所述的组合物，其中Ig融合蛋白包含衍生自受体的非Ig部分。
22.权利要求18-21中任意一项所述的组合物，其中Ig融合蛋白包含硫酸化的、磷酸化的、或糖基化的非Ig部分。
23.权利要求22的组合物，其中糖基化的非Ig部分是唾液酸化的或岩藻糖基化的。
24.权利要求18-23中任意一项所述的组合物，其中Ig融合蛋白为IL-13R-Ig或IL-21-R-Ig。
25.权利要求18-23中任意一项所述的组合物，其中Ig融合蛋白为PSGL-Ig或GP1b Ig。
26.权利要求18-25中任意一项所述的组合物，其中二糖为蔗糖或海藻糖。
27.权利要求18-26中任意一项所述的组合物，其中表面活性剂为聚山梨酯。
28.权利要求18-27中任意一项所述的组合物，其中组合物中缓冲剂的浓度为5-30mM。
29.权利要求18-28中任意一项所述的组合物，其中缓冲剂为组氨酸缓冲剂、tris缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。
30.权利要求18-29中任意一项所述的组合物，其中组合物不含NaCl。
31.权利要求18-30中任意一项所述的组合物，其中组合物已经被冷冻干燥。
32.权利要求18-31中任意一项所述的组合物，其中组合物在-80℃到+40℃至少一周是稳定的。
33.权利要求31的组合物，其中组合物已经被重建。
34.药物组合物，其基本上由0.025-60mg/ml的酸性Ig融合蛋白、1-4％的甘氨酸、0.5-2％的二糖、0.005-0.02％的表面活性剂、1-40mM的缓冲剂、和任选地1-200mM的NaCl组成。
35.药物组合物，其基本上由0.025-60mg/ml的除PSGL-Ig或IL-13R-Ig外的酸性Ig融合蛋白、1-4％的甘露糖醇、0.5-2％的二糖、0.005-0.02％的表面活性剂、1-40mM的缓冲剂、和任选地1-200mM的NaCl组成。
36.药物组合物，其基本上由0.025-60mg/ml的酸性Ig融合蛋白、1-4％的甘露糖醇、0.5-2％的二糖、0.005-0.02％的表面活性剂和1-40mM的缓冲剂组成。
37.权利要求1、18和34-36中任意一项所述的组合物，其中组合物已经通过包括退火步骤的方法冷冻干燥。
38.制备权利要求37的组合物的方法，其中退火步骤通过将组合物维持在最终冷冻温度以上的温度一段定义的时间期间来促进填充剂结晶。
39.权利要求38的制备组合物的方法，其包括
a)将组合物冷冻到低于-40℃；
b)将组合物的温度升高到选自-5℃到-40℃范围的温度一段时间期间，所述时间期间足以促进组合物中甘氨酸或甘露糖醇的结晶；
c)将组合物的温度降低到低于-35℃；
d)建立真空；和
e)在选自-20℃到+30℃范围的温度干燥组合物。
全文摘要
本发明提供了Ig融合蛋白组合物，尤其是包括Ig融合蛋白、填充剂、二糖、表面活性剂和缓冲剂的组合物。在一个方面，这些组合物在长期的贮藏下或至少一个冷冻/融化循环下是稳定的。本发明也提供了制备Ig融合蛋白组合物的方法。在一个方面，本发明的组合物是冷冻干燥的。在进一步的方面，组合物通过包括退火步骤的方法冷冻干燥。
文档编号A61K39/395GK101312744SQ200680043787
公开日2008年11月26日 申请日期2006年11月21日 优先权日2005年11月22日
发明者A·巴里, T·克劳利, D·狄克逊, J·朱诺, A·库马尔, 黎 李, N·卢克沙, M·沙马萨金, E·索利, N·沃恩, C·韦布 申请人:惠氏公司