放射核素标记肿瘤血管化特异性多肽及其用途的制作方法

专利名称：：放射核素标记肿瘤血管化特异性多肽及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于核医学领域，涉及放射核素标记的多肽及其在肿瘤示踪剂和放射性抗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
：核素放射影像在临床诊断中发挥了日渐有益的作用，不同的显像剂的疾病，目前理想和临床应用广泛的显像剂是以核素氟-18标记肿瘤代谢显像剂氟-18氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)，它应用正电子发射计算机进行断层肿瘤显像(18F_FDGPET)。然而，18F-FDGPET尚存在有以下缺点1，18F-FDGPET检査价格昂贵，一次检查需要花费人民币1万元以上；2，高能正电子核素18F对肿瘤没有治疗价值；3，肿瘤与炎症在早期显像无法分辨。与PET比较，单光子发射计算机断层显像(SPECT)的检査成本相对低很多。虽然有些单光子核素化合物也有亲肿瘤特征，但目前为止尚没有能够替代正电子，-FDG的单光子核素化合物。研究报道，原发实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的生成(angiogenesis)，肿瘤组织既可通过肿瘤血管从宿主获取营养和氧气，又可通过肿瘤血管向机体的其他部位输送转移细胞继续生长和诱导血管形成，导致肿瘤转移。新生血管生成抑制剂能破坏或抑制血管生成，有效地阻止肿瘤的生长和转移。但由于肿瘤血管生成的复杂性、异时性及抗肿瘤血管生成疗法不能直接杀伤肿瘤细胞，至多使肿瘤体积縮小到一种不生长的静息状态等原因，血管生成抑制治疗的临床疗效并不很理想。但血管生成肿瘤治疗中所发现的一些与肿瘤新生血管亲和性高、特异性强的小肽分子，例如通过噬菌体展示技术筛选出小肽肿瘤血管化抑制剂-PRPGAPLAGSWPGTS-、-DRWRPALPVVLFPLH-和-ASSSYPLIHWRPWAR-，其肽链上肽的抗体决定的序列-WRP-和-PRP-，再在-WRP-和-PRP-的基础上修饰，得到五肽肿瘤血管化抑制剂-GPRPAA-、-APRWR-和-HWRPW-。经试验证明其具有抑制肿瘤血管生长的作用。因其与直接以肿瘤组织为靶目标的方法相比其具有高效性、广谱性、不易产生耐药性及无明显毒副反应等优点。如能在保持其原有活性的基础上，选择血本底清除较快的小肽分子，以核素标记，就可成为一种高效性、广谱性、低毒性的肿瘤显像剂。单光子核素锝-99m(99Tcm)来源方便，价格便宜，半衰期适合(W^6小时)，能量适中，是目前全球应用最广泛的核素。目前有关实验研究采用的肿瘤血管化显像剂主要是"Tc"一RGD，但尚未在临床上广泛使用。
发明内容本发明的目的是提供放射核素标记肿瘤血管化特异性多肽及其用途，具体涉及放射性核素标记的多肽的肿瘤示踪剂或放射性核素标记的抗肿瘤药物。本发明在保持所述的多肽原有生理活性的基础上，将其以单光子核素锝-99m("Tc"标记，可用于肿瘤显像，并能明确区分肿瘤与炎症，价格低廉，应用广泛；或将所述的短肽以锝-99m的类似物e粒子发射核素铼一188('88Re)标记，可在其原有血管抑制的生理活性上，以放射性e射线增加其肿瘤杀伤作用，达到事半功倍的效果。本发明所说的多肽是-PRPGAPLAGSWPGTS-、-DRWRPALPVVLFPLH-、-ASSSYPLIHWRPWAR-、-GPRPAA-、-APRWR-、-HWRPW-、-WRP-或-PRP-。本发明将上述特异性多肽分别接上2个D-Ala和双功能连接剂肼基尼可酰胺(hydra-zinonicotinamide，HYNIC)后，以"Tc"标记，应用于肿瘤显像。本发明将上述特异性多肽分别接上2个D-Ala和双功能连接剂HYNIC后，以'^e标记，应用于杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。本发明采用间接标记法在上述特异性多肽上加上一段无活性的多肽短链，再结合一个双功能连接剂后进行放射性核素标记，所述的放射性核素标记以氯化亚锡为还原剂，以tricine—NaOH调节PH值，加Tc淋洗液后加热标记。所述的无活性的多肽短链是D-Ala-D-Ala。所述的双功能连接剂是HYNIC。本发明的目的通过下述技术方案实现一.合成双功能连接剂HYNIC按式(I)的合成路线，以6-氯酸烟碱(6-chlironicotinicacid)为原料，加氢氧化肼(hydrazinehydrate),合成6-肼哒嗪-3-羧酸，将其分离纯化后，再加入碳酸氢二特丁基振荡反应，与N—羟基琥珀酰亚胺混合，用DMF溶解该混合物，另加二环己基碳二亚胺(DCCI)，振荡反应，得到棕色固体产品。以硅胶柱分离纯化。产物用质谱进行分析鉴定。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(I)二.合成多肽、无活性的多肽短链和双功能连接剂HYNIC采用组合化学的标准的Fmoc固相合成法合成GPRPAA(D)A(D)、APRWRA(D)A(D)和HWRPWA(D)A(D)等具肿瘤血管化抑制活性的多肽。在MBHA树脂上，用所需的氨基酸加縮合剂(TBTU和D正A)，将目标氨基酸依次縮合在树脂上；再用配制的HYNIC縮合反应液(HYNIC、HATU、HOBT、D正A以最小体积的DMF溶解)将HYNIC与肽链縮合。用95%的三氟醋酸将多肽及文库从树脂上切下来，同时切除侧链保护。产品离心分离，乙醚冲洗3次后，负压抽干。产品用高效液相进行分析纯化，以质谱进行分析鉴定。三.采用下述方法选择核素标记多肽在保持肿瘤血管抑制性多肽原有生理活性的基础上，将其以单光子核素锝-99m("Tc"1)标记，并且得到较高的标记率并且稳定的标记产物。采用"T,间接标记法，以氯化亚锡为还原剂，通过不同条件标记方案，选择其中的稳定高效的方法，表1是以氯化亚锡为还原剂的条件下的七种不同条件标记方法。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>结果显示，上述方法3为优选，其中经放射性检测标记物的放化纯度>98%，且该纯化的产品放置于室温下6h，其放化纯度〉93%，其标记产品在体外6h内稳定。四.核素标记特异性多肽荷瘤裸鼠模型试验，筛选用于肿瘤显像剂的特异性多肽常规方法培养肺腺癌细胞H460，将细胞悬液接种于裸鼠右侧上肢外侧的皮下，约4周后，肿瘤直径达到1.5cm左右后，用于核素标记特异性多肽的体内筛选、体内竞争、核素分布和竞争分布实验。五.核素标记特异性多肽Vx2兔肿瘤、炎症模型试验将Vx2肿瘤癌细胞肿块接种于新西兰白兔左上肢肌腔内，1015天后，于所述的实验兔右上肢肌腔内注射约0.7ml的松节油，48小时左右刺激性无菌性炎症形成后，同时肿瘤直径达到1.52cm，进行核素标记特异性多肽RGD-"Tc"1与GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm比较实验和GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm动态显像试验。目的在于证实GPRPAAA(D)A(D)-HYNIO"Tc"对不同性质、不同来源的实体肿瘤均产生较好的显像效果，但对于炎症不显像。试验结束后，通过病理分析证明本发明所建立的模型是成功的。本发明的技术方案具有如下特点1、本发明在多种实验筛选的基础上，选定在特异性多肽上添加一段无活性的二肽，即2个D-Ala。在特异性多肽上添加一段无活性的短肽，即不改变原有多肽的生理活性，又使多肽与放射性核素之间有一定的空间距离，有利于保持多肽与放射性核素各自的生理活性。本发明进行了多种实验方法研究测试多肽与放射性核素能否保持各自的生理活性，例如，用核素直接标记多肽，结果显示，因核素的刚性使多肽失去自由旋转的能力而失活，无法做为显像剂；在多肽上连接不同长度的无活性的短肽，例如，连接上无活性的五肽和四肽，结果显示，因被体内的酶分解而失活，无法做为显像剂；如连接上无活性的三肽，结果显示，因部分多肽被酶分解而部分失活，在使核素肿瘤的浓聚过少，肿瘤与肌肉本底差异不大，无法成为一种优质的显像剂；如连接上无活性的单肽，同样因核素的刚性使多肽失去自由旋转的能力而部分失活，无法成为一种优质的显像剂。2、添加双能基连接剂(BFCA)本发明对用于锝-99ra("Tc"标记多肽的双能基连接剂DTPA、HYNIC、CTPA和PnAo进行了试验选择，结果表明，其中HYNIC的放射性核素的标记率最高，且核素标记后产物较稳定，体内稳定性和重现性好，同时也使多肽与放射性核素之间有一定的空间距离，有利于保持多肽与放射性核素各自的生理活性。图l.核素标记肿瘤血管化多肽的七种方法薄层层析后的显像图(方法7至1)。图2.核素标记肿瘤血管化多肽的二种方法薄层层析后的显像图(方法3和1)。图3.核素标记肿瘤血管化多肽的二种方法6小时后薄层层析的显像图(方法3和1)。图4.新西兰兔Vx2肿瘤病理切片。图5.新西兰兔肌肉炎症病理切片。图6.GPRPAAA(D)A(D)七肽以HPLC纯化图。图7.GPRPAAA(D)A(D)-HNYIC以HPLC分析纯化图。图8.GPRPAAA(D)A(D)-HNYIC以HPLC的空白分析纯化图。图9.GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm、APRWRA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"和RGD-99Tc"荷瘤裸鼠O.5h图。图10.GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc、APRWRA(D)A(D)-HYNIC-"TV和RGD-99Tc"荷瘤裸鼠2h图。图11.GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-99Tcm、APRWRA(D)A(D)-HYNIC-"TV和RGD-99Tc"荷瘤裸鼠6h图。图12.GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm及GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm与GPRPAA混合液在荷瘤裸鼠O.5h显像图。图13.GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm及GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC_99Tcm与GPRPAA混合液在荷瘤裸鼠4h显像图。图14.GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc及GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm与GPRPAA混合液在荷瘤裸鼠7h显像图。图15.RGD-"Tc"与GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"分别在新西兰兔Vx2肿瘤0.5h显像图。图16.RGD-"TV与GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"分别在新西兰兔Vx2肿瘤3h显像图。图17.RGD-"Tc"与GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"分别在新西兰兔Vx2肿瘤8h显像图。图18.RGD-"Tc"与GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"分别在新西兰兔Vx2肿瘤/炎症值。图19GPRPAAA(D)A(D)-HYNIO"TcraSPECT与18F-FDGPETVx2肿瘤兔显像比较。具体实施例方式实施例1合成肼基尼可酰胺(hydrazinonicotinamide，HYNIC)精称6-氯酸烟碱(4.0g，50.77mmo1)加入到100X氢氧化肼(17.5ml)中，将装有反应液的烧瓶置100'C油浴，同时磁力搅拌器搅拌5.5h后停止，取出烧瓶，使反应液冷却至室温，反应液呈澄清棕黄色；将装有反应液的烧瓶置于回旋蒸发器，于95t:，负压约O.08Mpa抽干，反应液抽干至白色固体。收集白色固体，用纯净水饱和溶解，测定其PH"8，再用盐酸酸化溶解液，调节PH值至5.5，沉淀形成析出；将上述沉淀品收集过滤，同时用95%乙醇冲洗后，室温下晾干，获得约6.0g6-肼哒嗪-3-羧酸，产率约为77%;称取4.2g6-肼哒嗪-3-羧酸和3.6ml三甲基胺，用30mlDMF溶解，溶解后在反应液中加入6.39g碳酸氢二特丁基，室温振荡18h;将装有反应液的烧瓶置于回旋蒸发器，于95i:，负压约0.08Mpa抽干，获得棕黄色固体。粉碎棕黄色固体，将l/2体积的硅胶加入其中混合，用乙酸乙酯倒入调节混合物成糊状物。然后将该糊状物加到硅胶-乙酸乙酯湿柱上，用乙酸乙酯淋洗硅胶柱。收集到浅黄色淋洗液，用滤纸过滤淋洗液，于55'C，负压抽干过滤液得到约7g6-碳酸氢二特丁基-肼哒嗪一3—羧酸产品；取6-碳酸氢二特丁基-肼哒嗪一3—羧酸6g和N—羟基琥珀酰亚胺2.73g混合，用40mlDMF溶解该混合物，获得溶解液l;另外将4.89g二环己基碳二亚胺(DCCI)用20mlDMF溶解，获得溶解液2。将溶解液1加入到溶解液2中混合，混合后强烈振荡，lh后反应液变成云雾状，再将反应液置于振荡器上连续振荡18h;将上述反应液通过滤纸过滤，然后收集过滤液，置于负压下抽干，得到棕色固体产品。将棕色固体粉碎，加入l/2体积的硅胶混合，用乙酸乙酯倒入调节混合物成糊状物。然后将该糊状物加到硅胶-乙酸乙酯湿柱上，用乙酸乙酯淋洗硅胶柱。收集到浅黄色淋洗液，用滤纸过滤淋洗液，于55t，负压抽干过滤液，获得黄色产品HYNIC-B0C。2.以质谱对HYNIC-BOC进行鉴定。采用日本岛津LCMS-201A质谱仪，电离方式是ESI，电离电压为+4.5kv，氮气流速为1.5L/min，采集电压为1.5kv，加热块温度为25(TC，流动相流速为O.2ml/min，流动相百分比浓度为50%水和50%乙腈。HYNIC-B0C的理论分子量为638.8，实测结果[M+H]+为638.50，峰度为100%，由此说明所获得的黄色产品为目标化合物HYNIC-BOC。实施例2以组合化学的标准Fmoc固相合成法合成GPRPAA(D)A(D)、APRWR(D)A(D)和HWRPWA(D)A(D)多肽精称MBHA树脂25mg共20份，分别放入20个半透瓶中，加盖。再将半透瓶分别放入相应的具塞试管中，将其按1至20次序编号。配制脱Fmoc液30mlH-DMF加編重蒸哌啶混匀。脱Fmoc:用加样枪在每个试管中加入lml脱Fmoc液，然后试管放在振荡器上振荡15min。弃去试管中的反应液后，再用加样枪在每个试管中加入lml脱Fmoc液，振荡器上振荡15min，再弃去试管中的反应液。冲洗在每个试管中加入lmlDMF，将试管放在振荡器上振荡3min，弃去试管中的液体，将该步骤重复5次；在每个试管中加入lml无水甲醇，将试管放在振荡器上振荡3min，弃去试管中的液体，将该步骤重复3次；在每个试管中加入lml无水乙醚，将试管放在振荡器上振荡3min，弃去试管中的液体，将该步骤重复3次。抽干将每个试管中的半透瓶置于负压下抽干。分别精称所需的L型氨基酸各两批，每份含2eq氨基酸，在每份氨基酸中加入2eqH0BT及2eqTBTU,将其放入相应的真空瓶中。氨基酸縮合反应在每个真空瓶中分别加入0.06ml(4eq)DIEA，然后用最小体积的H-DMF溶解，将20种氦基酸縮合反应液分别加入到相应编号的装有半透瓶的试管中，以氮气饱和试管，封口膜密封管口后放在振荡器上振荡1.5h。1.5h后弃去反应液，再将第二批氨基酸縮合反应液分别加入相应试管中，重复上述步骤，1.5h后弃去反应液。冲洗在每个试管中加入lmlDMF，将试管放在振荡器上振荡3min，弃去试管中的液体，将该步骤重复5次；在每个试管中加入lml无水甲醇，将试管放在振荡器上振荡3min，弃去试管中的液体，将该步骤重复3次；在每个试管中加入lml无水乙醚，将试管放在振荡器上振荡3min，弃去试管中的液体，将该步骤重复3次。抽干将每个试管中的半透瓶置于负压下抽干。至此合成了目标多肽的一个氨基酸位点，按照上述方法依次合成七个位点的氨基酸，得到所需的具肿瘤血管化抑制活性的多肽。2.用高效液相对所合成的GPRPAAA(D)A(D)七肽进行分析纯化采用日本岛津(SHIMADZU)LC-10ATvp的梯度液相色谱仪和GRACEVYDACC18柱，检测器是紫外光谱仪。采用高压梯度法溶液A:0.1%三氟醋酸水溶液；溶液B:0.1%三氟醋酸乙腈溶液，流速为1.0ml/min，紫外检测波长为220nm，积分方法为面积归一法。再以质谱对GPRPAAA(D)A(D)七肽进行鉴定采用日本岛津LCMS-201A的质谱仪，电离方式是ESI，电离电压为+4.5kv，氮气流速为1.5L/min，采集电压为1.5kv，加热块温度为250'C,流动相流速为O.2ml/min，流动相百分比浓度为50%水和50%乙腈。GPRPAA(D)A(D)的理论分子量为253，实测结果[M-Hr为210.10，峰度为100%，由此说明此所获产品为目标化合物GPRPAA(D)A(D)。实施例3.连接HYNIC和肿瘤血管化特异性多肽配制HYNIC縮合反应液称取HYNIC2eq，HATU2eq,HOBT2eq，DIEA4eq,混合后加入最小体积的H-DMF溶解。HYNIC縮合反应将HYNIC縮合反应液分别加入到相应的装有半透瓶的试管中，以氮气饱和试管，封口膜密封管口后放在振荡器上振荡1.5h。1.5h后弃去反应液，再将第二批氨基酸縮合反应液分别加入相应试管中，重复上述步骤，1.5h后弃去反应液。之后冲洗、抽干等步骤同氨基酸縮合反应。实施例4活化HYNIC—肿瘤血管化特异性多肽配制脱Fmoc液30mlH-DMF力卩10ml重蒸哌啶混匀。脱Fmoc:每个试管中加入lml脱Fmoc液，然后试管放在振荡器上振荡15min。弃去试管中的反应液后，再用加样枪在每个试管中加入lml脱Fmoc液，振荡器上振荡15min，再弃去试管中的反应液。配制TFA混合液TFA:苯甲醚苯酚(体积比为96:2:2)。每管中加入TFA混合液0.75ml，以氮气饱和，封口膜封闭试管后振荡l.5h。然后试管中的反应液，分别倒入相应编号的真空瓶中。再将TFA混合液加入到试管中，每管0.5ml，以氮气饱和，封口膜封闭试管后振荡0.5h。然后试管中的反应液，分别倒入相应编号的真空瓶中。在收集到的TFA反应液中分别加入0.5ml甲苯，然后于负压下抽干。在抽干的真空瓶中分别加入lml的无水乙醚析出肽，再将肽转移到离心管中。重复上述收集肽的操作一次。将收集到多肽的离心管置于低温离心机内，离心5分钟。弃去上清液，再加入无水乙醚，再离心5min。重复离心3次后，弃去上清液。将离心后多肽于负压下抽干，呈白色粉状固体。2.用高效液相对所合成的GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC进行分析仪器采用型号为(SHIMADZU)LC-lOATvp的梯度液相色谱仪和GRACEVYDACC18柱，检测器是紫外光谱仪。方法采用高压梯度法溶液A是O.1%三氟醋酸水溶液；溶液B是O.1%三氟醋酸乙腈溶液，流速为1.0ml/min，紫外检测波长为220nm，积分方法为面积归一法。再将分析结果扣除空白图像后的两个主峰(7.671和9.31S)调整具体梯度再次分析纯化。最后将纯化后的GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC进行质谱鉴定，以质谱对HYNIC-BOC进行鉴定。仪器采用为日本岛津LCMS-201A的质谱仪，电离方式是ESI，电离电压为+4.5kv，氮气流速为1.5L/min，采集电压为1.5kv，加热块温度为25(TC，流动相流速为0.2ml/min，流动相百分比浓度为50%水和50%乙腈。GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC的理论分子量为773.8'实测结果[M+2H]2+为387.45，峰度为100%;[M+H]+为773.65，峰度为10%，由此可基本说明此白色产品为目标化合物GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC。实施例5选择核素标记多肽的方法
技术领域：
：本发明的关键是在保持肿瘤血管化抑制性多肽原有生理活性的基础上，将其以单光子核素锝-99m(99Tcm)标记，得到较高的标记率，获得理想的肿瘤血管化显像剂，本发明以氯化亚锡为还原剂，设计下述七种不同条件标记方法方法1:将20rag亚锡用0.lml盐酸溶解后，以N2饱和，加入1.9ml的蒸馏水，制成亚锡还原液。取300mgtricine，用5ml的0.lmol/L的氢氧化钠溶解后制成酸碱调节液。取肽50ug加入真空瓶中，再用酸碱调节液稀释和15ul亚锡还原液后，即刻加入O.lml"Tc"淋洗液，室温下反应l小时。方法2:将20mg亚锡用0.lml盐酸溶解后，以N2饱和，加入1.9ml的蒸馏水，制成亚锡还原液。以0.lmol/L的氢氧化钠为酸碱调节液。取肽50ug加入真空瓶中，再用酸碱调节液稀释和15ul亚锡还原液后，即刻加入O.lml"Tc"淋洗液，水浴加热至100°CIO分钟。方法3:将20mg亚锡用0.lml盐酸溶解后，以N2饱和，加入1.9ml的蒸馏水，制成亚锡还原液。取300mgtricine，用5ml的0.lmol/L的氢氧化钠溶解后制成酸碱调节液。取肽50ug加入真空瓶中，再用酸碱调节液稀释和15ul亚锡还原液后，即刻加入O.lml"Tc"淋洗液，水浴加热至10(TC10分钟。方法4:将20mg亚锡用0.lml盐酸溶解后，以N2饱和，加入1.9ml的蒸馏水，制成亚锡还原液。取300mgtricine，用5ml的0.lmol/L的PBS液溶解后制成酸碱调节液。取肽50ug加入真空瓶中，再用酸碱调节液稀释和15ul亚锡还原液后，即刻加入0.lml"Tc"淋洗液，室温下反应1小时。方法5:将20mg亚锡用0.lml盐酸溶解后，以N2饱和，加入1.9ml的蒸馏水，制成亚锡还原液。取300mgtricine，用5ml的0.lmol/L的PBS液溶解后制成酸碱调节液。取肽50ug加入真空瓶中，再用酸碱调节液稀释和15ul亚锡还原液后，即刻加入O.lml"Tcm淋洗液，水浴加热至10(TCIO分钟。方法6:将20mg亚锡用0.lml盐酸溶解后，以N2饱和，加入1.9ml的蒸馏水，制成亚锡还原液。取30ul0.lg/ml酒石酸钠溶解液，用5ml的0.lmol/L的PBS液溶解后制成酸碱调节液。取肽50ug加入真空瓶中，再用酸碱调节液稀释和15ul亚锡还原液后，即刻加入O.lml"TV淋洗液，水浴加热至100'CIO分钟。方法7:将20mg亚锡用0.lml盐酸溶解后，以N2饱和，加入1.9ml的蒸馏水，制成亚锡还原液。取30ul0.lg/ml酒石酸钠溶解液，用5ml的0.lmol/L的氢氧化钠液溶解后制成酸碱调节液。取肽50ug加入真空瓶中，再用酸碱调节液稀释和15ul亚锡还原液后，即刻加入0.lml"TV淋洗液，水浴加热至IO(TC10分钟。将上述七种标记方法所得的产品，进行薄层层析法(TLC)SPECT显像比较，结果显示方法7较差，剔除后再次标记后，进行薄层层析法(TLC)SPECT显像比较，结果显示方法1和方法3效果较好。将方法1和3再单独进行薄层层析法(TLC)进行SPECT显像比较，并在6小时后再次，进行薄层层析法(TLC)进行SPECT显像比较，结果显示方法3为佳，即用氯化亚锡为还原剂用tricine-NaOH液稀释。加热的方法，其结果标记率高，经放射性检测标记物的放化纯度>98%后，用于荷瘤裸鼠显像中。且该纯化的产品放置于室温下6h,其放化纯度〉93%，其标记产品在体外6h内稳定。实施例6荷瘤裸鼠显像法体内无创伤性筛选采用德国西门子公司MULTISPECT。将GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm、APRWRA(D)A(D)-HYNIC_MTcm和RGD-MTcm分别注入荷瘤裸鼠体内进行显像筛选。即将3只荷瘤裸鼠随机抽取，分别在正常清醒状态下，每只荷瘤裸鼠尾静脉注射0.lml(3.7MBq)"Tc"标记肿瘤血管化特异性多肽。注射后，每只裸鼠用氯胺酮(2mg/ml)下肢肌肉注射0.03ml及硫喷妥钠(10mg/ml)腹腔内注射O.12ml，麻醉后俯卧固定。注射显像剂后0.5h、lh、2h、3h、6h、22h分别采集图像。采集条件采用低能平行孔高分辨准直器，能量选择140Kev，窗宽15%，矩阵256X256，放大倍数3.2，动物距探头1.5cm，每只裸鼠的累积计数1X106。在荷瘤裸鼠显像图上利用感兴趣区(regionofinterest,ROI)技术，分别计算不同时相肿瘤及全身的放射性计数，然后计算其ID%/g，结果显示，注射显像剂0.5h后肿瘤部位即显影，GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc，中瘤部位0.5小时就有放射性浓聚，至注射后22小时肿瘤部位仍有浓聚，并且从0.5小时至22小时本底都较低，肿瘤显像明显，效果优于APRWRA(D)A(D)-HYNIC-99Tcm和RGD-"Tcm。实施例7GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC_99Tcra与GPRPAA荷瘤裸鼠竞争实验随机抽取2只荷瘤裸鼠，将GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"与GPRPAA和GPRPAA分别注入荷瘤裸鼠体内进行竞争显像。在正常清醒状态下，给2只荷瘤裸鼠分别尾静脉注射GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm与GPRPAA。注射后每只裸鼠用氯胺酮(2mg/ml)下肢肌肉注射0.03ml及硫喷妥钠(10mg/ml)腹腔内注射O.12ml，麻醉后俯卧固定。于注射示踪剂后0.5h、lh、2h、3h、4h、5h、6h和7h行全身静态显像。采集条件采用低能平行孔高分辨准直器，能量选择140Kev，窗宽15%，矩阵256X256，放大倍数3.2，动物距探头1.5cm，每只裸鼠的累积计数1X106。结果显示肿瘤血管化特异性多肽GPRPAA基本完全竞争抑止GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-，c"的生理活性，基本可说明添加无活性的短肽-A(D)A(D)-和双功能连接剂HYNIC并没有改变肿瘤血管化特异性显像剂GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-99Tcm的生理活性。实施例8GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"荷瘤裸鼠体内分布实验将15只荷瘤裸鼠随机分成5组，禁食6-12小时，在正常清醒状态下，依次给每只荷瘤裸鼠尾静脉注射筛选出的O.lml(3.7MBq)GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"，注射体积小于0.2ml。分别于O.5h、lh、2h、3h和6h等不同时相，处死荷瘤裸鼠，取血经肝素抗凝，解剖取出重要脏器和组织称重并测定其放射性计数，测量每克组织计数和注射总计数，计算每克组织计数占注射总计数百分比aiD/g)及肿瘤组织与各器官组织的放射性比值(T/NT)。结果显示GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"在血、心、肝、肺、脾和肾的等重要脏器放射性计数随时间的增加而逐步减少，而肿瘤在注射6h后每克组织百分注射剂量率仍有12.6425±0.7777%ID/g,明显高于其它组织。结果与体内显像实验结果相符合。表1是GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"^在荷瘤裸鼠0.5h-6h每克组织计数占注射总计数百分比(^ID/g)。表2是GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"T(^在荷瘤裸鼠0.5h-6h肿瘤组织与各器官组织的放射性比值(T/NT)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例9GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm与GPRPAA荷瘤裸鼠体内竞争分布实验将6只荷瘤裸鼠随机分成2组，禁食6-12小时，在正常清醒状态下，依次给每只荷瘤裸鼠尾静脉注射筛选出的0.lml(3.7MBq)GPRPAAA(D)A(D)-I1YNIC-"Tc"与GPRPAA混合液，注射体积小于0.2ml。分别于0.5h和2h等不同时相，处死荷瘤裸鼠，取血经肝素抗凝，解剖取出重要脏器和组织称重并测定其放射性计数，测量每克组织计数和注射总计数，计算每克组织计数占注射总计数百分比anvg)及肿瘤组织与各器官组织的放射性比值(T/NT)。结果显示GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tr7在血、心、肝、肺、脾和肾的等重要脏器放射性计数都略有下降，而肿瘤的减少最为明显，在注射0.5h后每克组织百分注射剂量率由原来的12.8476±0.691%ID/g，下降为1.0382±0.1971;在注射2h后每克组织百分注射剂量率由原来的7.1448±0.7146%ID/g，下降为0.7568±0.1539。下降率明显高于其它组织。这一结果与体内竞争显像实验结果相符合。表3是GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-99Tcm与GPRPAA混合液在荷瘤裸鼠0.5h和2h每克组织计数占注射总计数百分比(％ID/g)。表4是GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"与GPRPAA混合液在荷瘤裸鼠0.5h和2h肿瘤组织与各器官组织的放射性比值(T/NT)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例IOGPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"TcVx2肿瘤兔子模型显像实验仪器采用德国西门子公司MULTISPECT。随机抽取2只Vx2肿瘤兔，分别给每只下肢肌肉注射2.5ml左右戊巴比妥(30mg/kg)，等其麻醉后俯卧固定，将其分别放置在SPECT的采集床上，在采集条件(具体采集条件同荷瘤裸鼠显像采集条件)下分别在每只Vx2肿瘤兔耳源静脉注射0.15ml左右的GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"的同时开始动态采集。并动态采集结束后，不改变Vx2肿瘤兔的位置，每隔15min采集一张静态图像，采集时间为l分钟。在图上利用感兴趣区(regionofinterest,ROI)技术，由2名以上核医学科医生计算出不同时相肿瘤及全身的放射性计数，然后计算其ID%/g，结果显示GPRPAAA(D)A(D)_HYNIC-99Tcm的在Vx2肿瘤兔上显像结果与荷瘤裸鼠显像结果一致，肿瘤显像明显，本底较低，说明GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"对不同性质、不同来源的实体肿瘤均显示较好的显像效果。实施例llGPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm与RGD-"TcmVx2肿瘤兔比较显像实验随机抽取2只Vx2肿瘤兔，将GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"和RGD-"Tc"分别注入Vx2肿瘤兔体内进行显像比较。在正常清醒状态下，分别在每只Vx2肿瘤兔耳源静脉注射O.15ml左右的GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm。注射后，分别给每只兔子的下肢肌肉注射2.5ml左右戊巴比妥(30mg/kg),麻醉后俯卧固定。注射显像剂后0.5h、lh、2h、3h、6h、8h分别采集图像。采集条件采用低能平行孔高分辨准直器，能量选择140Kev，窗宽15%，矩阵256X256，放大倍数3.2，动物距探头1.5cm，每只兔子的累积计数1X106。在Vx2肿瘤兔显像图上利用感兴趣区(regionofinterest,R0I)技术，由2名以上核医学科医生计算出不同时相肿瘤及全身的放射性计数，然后计算其IDX/g，结果显示GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"TV的荷瘤裸鼠显像图，肿瘤显像明显，本底较低，炎症区域基本不显像；图像优于RGD-"Tcm。说明GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"对不同性质、不同来源的实体肿瘤显像效果优于RGD-"Tcm。实施例12GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-99TcraSPECT与18F-FDGPETVx2肿瘤兔显像比较实验随机抽取2只Vx2肿瘤兔，在正常清醒状态下，将GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tcm和"F-FDG分别注入Vx2肿瘤兔体内，注射后，分别给每只兔子的下肢肌肉注射2.5ml左右戊巴比妥(30mg/kg),麻醉后俯卧固定。注射显像剂lh后注射GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-99Tcm的肿瘤兔用SPECT采集图像；注射18F-FDG的肿瘤兔用PET采集图像。在Vx2肿瘤兔显像图上利用感兴趣区(regionofinterest,ROI)技术，分别计算出不同时相肿瘤及全身的放射性计数，然后计算其ID%/g，结果显示GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-"Tc"的早期显像图肿瘤显像明显，炎症区域基本不显像；而18F_FDGPET肿瘤与炎症都有放射性浓聚，均有明显显像，较难区别。说明GPRPAAA(D)A(D)-HYNIC-MTcmSPECT的区别肿瘤与炎症的能力明显优于18F-FDGPET，且锝-99m(99Tcm)和SPECT显像的价格远远低于氟-18(18F)和PET显像的价格。权利要求1.放射核素标记肿瘤血管化特异性多肽，其特征是以放射性核素用间接标记法标记肿瘤血管化特异性多肽，所述放射性核素是99Tcm或188Re，所述的肿瘤血管化特异性多肽选自-PRPGAPLAGSWPGTS-、-DRWRPALPVVLFPLH-、-ASSSYPLIHWRPWAR-、-GPRPAA-、-APRWR-、-HWRPW-、-WRP-或-PRP-。2.按权利要求1所述的放射核素标记肿瘤血管化特异性多肽，其特征是所述的间接标记是在所述的肿瘤血管化特异性多肽上加上一段无活性的多肽短链，再结合一个双功能连接剂后进行放射性核素标记。3.按权利要求2所述的放射核素标记肿瘤血管化特异性多肽，其特征是所述的无活性的多肽短链是D-Ala-D-Ala。4.按权利要求2所述的放射核素标记肿瘤血管化特异性多肽，其特征是所述的双功能连接剂是肼基尼可酰胺。5.按权利要求2所述的放射核素标记肿瘤血管化特异性多肽，其特征是所述的放射性核素标记以氯化亚锡为还原剂，以tricine—NaOH调节PH值，加Tc淋洗液后加热标记。6.权利要求1的放射核素标记肿瘤血管化特异性多肽在制备肿瘤示踪剂中的应用。7.权利要求1的放射核素标记肿瘤血管化特异性多肽在制备放射性核素标记的抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明属于核医学领域，涉及放射核素标记肿瘤血管化特异性多肽。本发明将GPRPAA、APRWR和HWRPW等具抗肿瘤活性的特异性多肽分别接上2个D-Ala和双功能连接剂HYNIC后，以⁹⁹Tc^m和¹⁸⁸Re标记分别应用于肿瘤显像和抗肿瘤治疗。实验证实，本发明放射核素标记肿瘤血管化多肽肿瘤显像效果理想，能明显增加其抗肿瘤血管化作用，抑止肿瘤生长，减少肿瘤转移，可制备理想的放射核素标记多肽的肿瘤示踪剂和放射性核素标记的抗肿瘤药物。文档编号A61K51/08GK101347626SQ200710044038公开日2009年1月21日申请日期2007年7月20日优先权日2007年7月20日发明者刘慈懿,骏曾,钢黄申请人:上海市胸科医院