核磁共振血栓靶向对比剂及其制备方法

专利名称：核磁共振血栓靶向对比剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种核磁共振靶向对比剂，特别涉及一种基于单克隆抗体的 核磁共振血栓靶向对比剂及其制备方法。
背景技术：
血栓性疾病是一种严重危害人类生命和健康的血液回流障碍性疾病，包 括动脉血栓与静脉血栓性疾病，涉及临床各科尤见心、脑血管血栓性栓塞、 深静脉血栓形成、肺栓塞的并发症以及外周动脉闭塞性疾病，且发病率、死 亡率与致残率均高。
目前临床上对于血栓性疾病的影像诊断主要依赖于血管造影、多普勒超 声、放射性核素血管造影等技术。但是上述技术存在需注入造影剂、放射性 核素或者假阳性率高等缺点，且当血栓得到确诊时患者一般均己出现临床症
状，或者不可逆的器质性改变。而核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)是一种完全无创的影像学诊断方法，但核磁共振(MR)检査血栓采 用普通对比剂如顺磁性对比剂二乙三胺五乙酸钆(Gd-DTPA)等，不能使早 期血栓得到特异性增强。因此，血栓的早期诊断受到限制，以至不易掌握最 佳溶栓的治疗时间，进而影响其治疗效果，总之目前尚缺乏血栓早期特异诊 断方法。
现有研究证实，P-选择素参与免疫炎症损伤、血栓形成及肿瘤转移等多 种病理生理过程。在本申请人的专利号为ZL 200310108522.5的中国专利中， 公开了针对P-选择素lectin-EGF (L-EGF)功能域的鼠源单克隆抗体 (PsL-EGFmAb)及其制备方法(包括杂交瘤细胞)和应用。试验数据表明 PsL-EGF mAb较P-选择素全长单抗更具有抗黏附/抗炎耙向抑制效应。之后，
本申请人又成功地制得针对该功能域的人源单抗(参见申请号为CN20061 的专利申请)。为进一步研究抗PsL-EGF功能域单抗在诊断和治疗血栓性疾 病中的应用提供了基础。
本发明要解决的技术问题即是提供一种基于PsL-EGFmAb的核磁共振 血栓靶向对比剂及其制备方法。
本发明人选用目前应用最广泛的MR对比剂Gd-DTPA进行研究，其是 一种顺磁性T1加权阳性对比剂(结构式如下式I所示)，具有亲水性、分子 量小的特点，注入血管后迅速向周围组织间隙分布，由肾脏排泄，即使肾功 能有损害，它也能经肾排除。Gd-DTPA不具有组织或器官的选择性，故如 果要作为靶向的对比剂，即需要连接特异性的抗体。
本发明人经研究发现，由于DTPA (分子质量393.36)结合数量增加对 抗体具有一定的空间位阻效应，经DTPA修饰的抗体免疫活性随着DTPA结 合量的增加而降低，当DTPA连接数量〉30个后，其免疫活性较单抗的免疫 活性下降程度显著。而Gd-DTPA的连接数量又直接决定了对比剂的对比度， 当Gd-DTPA连接数量<30个后，其相对对比度已经很低不能达到肉眼明显 区分的目的。使用Gd-DTPA直接连接抗体不能同时满足具备相应的免疫结 合力和MR成像对比度的要求，并非最佳的对比剂结合方式。本发明人经过 进一步的研究发现，将PsL-EGFmAb通过大分子物质如血清白蛋白，特别是 牛血清白蛋白(BSA)与含顺磁性物质Gd-DTPA连接，制备了具有P-选择 素靶特异性的核磁共振对比剂(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb，进行了体外

发明内容
MR成像结果显示，该对比剂可明显增强模拟血小板血栓及全血血栓的MR 成像信号，同时亦能增强离体受损血管内膜的成像信号。在此基础上，本发 明人制备了犬股静脉血栓模型，利用(Gd-DTPAVBSA-PsL-EGFmAb进行体 内活体MR分子成像，结果表明该对比剂可早期显影和定位血栓，且能明显 提高血栓的MR信号强度和信噪比。
因此，本发明提供的一种核磁共振血栓靶向对比剂，其是由抗人P-选择 素凝集素-表皮生长因子功能域单克隆抗体与二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白 偶联而成的大分子多聚体。
根据本发明，所述的二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白优选二乙三胺五乙 酸钆-牛血清白蛋白，得到的对比剂为(Gd-DTPAVBSA-PsL-EGFmAb，其中 n=70~100。本发明利用BSA放大系统，可使一分子多聚体对比剂、即一分 子PsL-EGFmAb上载带有70 100个GdS+时，可增强对比剂效果，并保持了 单抗较佳的免疫结合力。
本发明还提供一种上述核磁共振血栓靶向对比剂的制备方法，其包括将 PsL-EGFmAb溶解在pH=9.6、 O.lmol/L的NaHC03/Na2C03缓冲液中，然后 加入EDC (偶联剂)和二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白，在室温下搅拌反应 24~30 hr后，利用Sepharose CL-4B层析柱除去未反应的抗体。
根据本发明，所述的二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白优选二乙三胺五乙 酸钆-牛血清白蛋白(Gd-DTPA-BSA)。
所述的Gd-DTPA-BSA可以根据现有技术(如文献Ogan MD， Schmiedl U， Moseley ME， et al. Albumin labeled with Gd-DTPA. An intravascular contrast-enhancing agent for magnetic resonance blood pool imaging: preparation and characterization. Invest Radiol, 1987, 22(8):665-71.)制备。
本发明具体采用的制备方法，可以包括下列步骤
①将BSA溶于pH=9.6、 O.lmol/L的NaHC03/Na2C03缓冲液中，在冰浴 中加入DTPA双酸酐溶液，其中BSA:DTPA双酸酐的摩尔比4:50，室温下
再搅拌反应20hr后结束反应，除去未反应的BSA，减压浓縮，得到 DTPA画BSA;
②在步骤①经过减压浓縮的DTPA-BSA溶液中加入GdCl3溶液，其中 GcP与DTPA-BSA中连接的DTPA等摩尔，然后在室温下再搅拌反应24 30 hr后，去除未反应的Gd3+，得到Gd-DTPA-BSA。
较佳地，根据本发明上述制备方法制得的Gd-DTPA-BSA中， 一分子BSA 上载带有20 30个Gd"。
根据本发明，所述的PsL-EGFmAb可以是ZL200310108522.5中公开的 由保藏号为CCTCC-C2003012的杂交瘤细胞株产生的鼠源单抗，也可以是本 申请人:在2006年11月17日递交的申请号为CN200610118483.0的专利申请 中所述的由保藏号为CCTCC NO: C200634的杂交瘤细胞株产生的人源单 抗。这些针对P-选择素lectin-EGF功能域的单克隆抗体，较全长单抗具有较 小的分子量和较低的免疫原性及更强的靶向性等优点。因此本发明将其通过 BSA与Gd-DTPA相连接，利用单抗与P-选择素的高亲和力结合特性实现靶 向显影，并利用BSA等血清白蛋白的氨基反应可连接多个Gd"离子和抗体， 以提高结合率，使靶组织局部处于Gc^+离子较高浓度状态，从而增强对比剂 效果。
从实验结果看，合成的大分子多聚体在免疫活性测定中，具有与抗体相 似的免疫活性曲线，说明该多聚体具有与P-选择素高亲和力结合的特性。每 分子多聚体载有70-100个Gd"离子，使核磁共振的信号得到增强。
在进一步的犬股静脉血栓模型的实验中，本发明血栓靶向对比剂特异性 聚集于血栓局部，实现MR靶向显影。从实验结果看，血栓信号值在注射本 发明核磁共振血栓靶向对比剂后，较普通对比剂增强成像出现早且增强效果 更为明显。
本发明核磁共振血栓靶向对比剂选择有效磁矩高的GdS+作为顺磁中心， 且与大分子偶联提高配合物旋转相关时间，两者都能提高其驰豫率。它在体
内的有效期内为稳定的配合物，不易出现金属离子GdS+和稀土离子的置换效 应，减低了对比剂的毒副作用。又因为其是大分子物质，故在体内代谢较慢， 有充分的时间可以与耙点结合。所以可以考虑将本发明对比剂作为一种MRI 诊断各类血栓性疾病的靶向对比剂。此外由于本发明的抗P-选择素 lectin-EGF功能域的单克隆抗体同时具有抑制靶分子表达效应，故除了可应 用为诊断试剂，尚具有抗黏附治疗作用，可以早期干预血栓的形成并影响疾 病的转归。


图1为本发明核磁共振血栓靶向对比剂(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb 的免疫活性测定，结果得到与原单抗PsL-EGFmAb类似的竞争性曲线。
图2显示犬股静脉血栓体内靶向对比剂增强MR成像，本发明靶向对比 剂可以增强血栓成像；其中，A、 B、 C分别为注入Gd-DTPA后0.5hr、 lhr、 3hr， D、 E、 F分别为注入本发明靶向对比剂后0.5hr、 lhr、 3hr。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。 实施例1
① DTPA-BSA制备
称量BSA (分子质量67000， Sigma化学公司)50mg，溶解于2.5ml的 0.2mol/LNaHCCVNa2C03缓冲液(pH=9.6)中，在冰浴中边不停地搅拌边加 入DTPA双酸酐(CaDTPA)溶液(复旦大学放射药学研究所)，其中BSA: CaDTPA-l:50 (摩尔比)，室温下再搅拌反应20hr后结束反应。取出反应混 合液，用SephadexG-25柱(Sigma化学公司)，O.Olmol/L PBS， pH7.4缓冲 液洗脱纯化，溶液经过减压浓縮后用于后续实验。
② Gd-DTPA-BSA制备加入GdCl3溶液(分析纯，Sigma化学公司)到上述经过减压浓縮的 DTPA-BSA溶液中，其中Gd3+与DTPA-BSA中连接的DTPA等摩尔，然后 在室温下再搅拌反应24 30hr后，用Sephadex-25柱，0.01mol/L PBS， pH7.4 缓冲液洗脱纯化除去游离的Gd3+。
③(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb制备(单抗与Gd-DTPA-BSA的偶联)
将PsL-EGFmAb (由保藏号为CCTCC-C2003012的杂交瘤细胞株产生 的单抗)(10mg/5ml)溶解在O.lmol/L NaHC(VNa2C03缓冲液(pH=9.6)， 然后加人EDC (2mg/200ul)(碳化二亚胺，分析纯，Sigma化学公司产品) 和Gd-DTPA-BSA(8mg/2ml)，在室温下再搅拌反应24~30 hr后，用Sepharose CL-4B层析柱(1 X25cm， Sigma化学公司)除去没连接上的单抗(0.01mol/L PBS， pH7.4缓冲液)，收集单抗与Gd-DTPA-BSA的连接体，经0.2um针式 滤器(上海安谱科学仪器有限公司)除菌过滤后冷冻浓縮，4"C保存。
(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb体外表征
1) Gc^+含量测定采用高频电感藕合等离子体发射光谱法(ICP-AES) 测量。计算所得到的每分子Gd-DTPA-BSA中Gc^+含量在20~30个范围内； 每个抗体大约连接有70-100个Gd3+。本发明对比剂的分子量为30，000~50，000
道尔顿。
2) 大分子的纯度测定使用高效液相色谱(HPLC)分析，显示其纯度 >98%。
3) 活性测定采用竞争性ELISA检测方法证明本发明核磁共振血栓靶 向对比剂(Gd-DTPA)。-BSA-PsL-EGFmAb的活性。具体步骤为P-选择素标 准蛋白(R&D公司)0.1ug/ml， 100ul/孔包被，包被液用0.01mol/L PBS
(pH=7.4)， 4"C过夜放置后甩干;用lXBSA在37。C30min封闭后，300u1/ 孔洗涤液洗涤、甩干3次；加入100ul/孔的不同量抗体(PsL-EGFmAb)或 相应本发明对比剂后，再加入100ul/孔生物素Biotin标记的抗体
(PsL-EGFmAb)进行抗体竞争结合反应(Biotin标记各相应抗体取自复旦
大学放射药学研究所)；37X:放置lhr后取出，300ul/孔洗涤液洗涤、甩干3 次；加入100ul/孔Avidin-HRPO (生物素-辣根过氧化物酶，Sigma) (1:2000 稀释)，37'C恒温下放置60分钟后，用300ul/孔洗涤液洗涤、甩干3次；加 入100ul/孔ABTS显色液，室温下发色20min或更长时间，在波长人二405nm 情况下，测量每孔的OD值。结果如图l所示，本发明对比剂可得到与单抗 未连接前类似的竞争曲线，说明靶向对比剂通过大分子连接的方式，可以连 接70-100个Gd-DTPA而基本不影响单抗的免疫活性，即保持了单抗与P-选择素的高亲和力结合的特性。
试验实施例1本发明核磁共振血栓靶向对比剂对犬静脉血栓的体内增 强试验
1) 犬静脉血栓模型的制备
家犬适应性饲养后，随机分为实验组和对照组。家犬称重麻醉(0.3%戊 巴比妥钠腹腔注射，lml/kg体重)后，固定、备皮、消毒，于腹股沟区沿股 动、静脉走行切开皮肤8cm左右，钝性分离皮下及肌肉组织，充分暴露股静 脉，于静脉两端放置动脉夹后切开股静脉，向心方向采用表面刮出毛刺心脏 导管(新洁尔灭浸泡消毒)反复抽拉，使静脉血管内膜充分损伤。然后取出 导管，使用显微手术器械缝合股静脉，去除两端动脉夹，使血液恢复流动。 经观察，犬静脉血栓模型均在造模后1天即出现肉眼可见的静脉血栓，2 3 天后血栓逐渐纤维机化。
2) 犬静脉血栓MR成像
于造模后尚未除去动脉夹恢复血流前，实验组犬静脉损伤局部注射本发 明磁共振血栓靶向对比剂(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb (1.5mg/ml) 600ul， 对照组注射相同Gd浓度的Gd-DTPA (马根维显，469mg/ml， Schering公司， 用PBS稀释)600ul， 20min后除去动脉夹，使血流通畅，创面开放，便于 观察血栓形成状况。将实验犬下肢采用绷带和胶布固定于木板上，分别在注 射后30min、 lhr、 3hr进行MRT1W1增强成像。线圈与犬下肢表面平行，3
平面定位扫描TE = 20ms, TR = 500ms， FOV = 12cmxl2cm， 256x256像素 分辨率，3mm层厚，垂直3个方向共15层；标本的横截面与纵截面FSE Tl WI
(TE = minimums, TR=500ms)扫描FOV 6cmx6m, 314x256像素分辨率， lmm层厚，0mm间隔，NEX=3。
结果发现，实验组犬在注入(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb 30min后进 行MR成像，可以看到股静脉血管周围信号增强，高于周围肌肉信号(如图 2的D所示)，而对照组则无血管周围信号增强(如图2的A所示)；lhr后 实验组股静脉MR成像可看到血栓增强信号，高于周围肌肉信号(如图2的 E所示)，而对照组则可以观察到股静脉中有低于肌肉信号的血栓信号(如 图2的B所示)；3hr后的MR增强成像，可以看到实验组的血栓范围增大
(如图2的F所示)，而对照组血栓因纤维蛋白沉积等原因，信号较之前增 强(如图2的C所示)。
可见，本发明对比剂可早期显影和定位血栓，且能明显提高血栓的MR 信号强度和信噪比，为早期诊断血栓性疾病提供了一种可行的方法。
权利要求
1、一种核磁共振血栓靶向对比剂，其是由抗人P-选择素凝集素-表皮生长因子功能域单克隆抗体与二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白偶联而成。
2、 如权利要求1所述的核磁共振血栓靶向对比剂，其特征在于所述的 二乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白为二乙三胺五乙酸钆-牛血清白蛋白，得到的 对比剂为(Gd-DTPA)n-BSA-PsL-EGFmAb，其中n=70 100。
3、 一种如权利要求1所述的核磁共振血栓靶向对比剂的制备方法，其 包括将抗人P-选择素凝集素-表皮生长因子功能域单克隆抗体PsL-EGFmAb 溶解在pH=9.6、 O.lmol/L的NaHC03/Na2C03缓冲液中，然后加入EDC和二 乙三胺五乙酸钆-血清白蛋白，在室温下搅拌反应24 30hr后，利用Sepharose CL-4B层析柱除去未反应的抗体。
4、 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的二乙三胺五乙酸 钆-血清白蛋白为二乙三胺五乙酸钆-牛血清白蛋白Gd-DTPA-BSA。
5、 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于在所述的Gd-DTPA-BSA 中一分子BSA上带有20~30个Gd离子。
6、 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的Gd-DTPA-BSA 的制备方法包括下列步骤① 将BSA溶于pH=9.6、 O.lmol/L的NaHC03/Na2C03缓冲液中，在冰浴 中加入DTPA双酸酐溶液，其中BSA:DTPA双酸酐的摩尔比4:50，室温下 再搅拌反应20hr后结束反应，除去未反应的BSA，减压浓縮，得到 DTPA-BSA;② 在步骤①经过减压浓縮的DTPA-BSA溶液中加入GdCl3溶液，其中 Gcf"与DTPA-BSA中连接的DTPA等摩尔，然后在室温下再搅拌反应24 30 hr后，去除未反应的Gd3+，得到Gd-DTPA-BSA。
全文摘要
本发明公开了一种核磁共振血栓靶向对比剂及其制备方法，该对比剂是由抗人P-选择素凝集素-表皮生长因子功能域单克隆抗体(PsL-EGFmAb)与二乙三胺五乙酸钆(Gd-DTPA)-血清白蛋白偶联成的大分子多聚体。该对比剂中一分子单抗可带有70～100个Gd³⁺。本发明靶向对比剂可特异性聚集于血栓局部，实现靶向显影，其血栓信号值较普通对比剂增强成像出现早、且增强效果更为明显，可用于血栓形成的早期诊断。
文档编号A61K49/06GK101347625SQ20071004404
公开日2009年1月21日 申请日期2007年7月20日 优先权日2007年7月20日
发明者同 周, 王学锋, 钟高仁 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院