专利名称：：土霉素在制备治疗水生动物螺原体病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及土霉素的新用途，具体是涉及土霉素在制备治疗水生动物螺原体病的药物中的应用。
背景技术：
：水生动物螺原体病，是指由螺原体侵染而引起的水生动物疾病，如中华绒螯蟹颤抖病，南美白对虾的暴发流行病及克氏原螯虾流行病。中华绒螯蟹(五n'oc/z"y又称河蟹，是我国的特种水产养殖品种，具有极高的经济价值。"颤抖病"是威胁我国河蟹养殖业可持续发展的严重流行病，颤抖病属于爆发性疾病，死亡率很高，有的地方发病率高达70%以上，死亡率达90%以上，发病严重的水体甚至导致绝产，给河蟹养殖造成了极大损失。发明人经过8年不懈研究，开展了中华绒螯蟹颤抖病病原体的分离、培养、人工回感，分子鉴定等方面的研究，不仅获取到致病病原体，而且明确其为螺原体类(spir叩lasma)微生物(WenWang,LiwenRong,WeiGu,KaiheDuandJianxiuChen.StudyonexperimentalinfectionsofTDAfromtheChinesemittencrabincrayfish,miceandembryonatedchickens.RESMICROBIOL2003,154(10》677-680;WenWang*,BohaiWen,GailE.Gasparich,NingningZhu,LiwenRong,JianxiuChenandZaikuanXu.AspiroplasmaassociatedwithtremordiseaseintheChinesemittencrab(Eriocheirsinensis)Microbiology2004,150:3035—3040;^VenWang*,JianxiuChen,KaiheDu,ZaikuanXu.MorphologyofspiroplasmasintheChinesemittencrabEriocheirsinensisassociatedwithtremordisease.RESMICROBIOL2004,155(8):630-635)。这是国际上首次在水生甲壳类动物体内发现螺原体类微生物，受到国际上同行的广泛关注和高度评价。近年来发现螺原体还可以引起其它水产动物重大疾病，如南美洲南美白对虾的暴发流行病等(NunanLM,LightnerDV,OduoriMA,GasparichGE(2005)5^/rop/ayma/ewae/sp.nov.,associatedwithmortalitiesinPenaeusvannamei,Pacificwhiteshrimp.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.55:2317-2322;Nunan,L.M.,Pantoja,C.R.,Salazar,M.,Aranguren,F.&Lightner,D.V.(2004).Characterizationandmolecularmethodsfordetectionofanovelspiroplasmapathogenictova朋fifwef.DisAquatOrgan62，255—264)，克氏原螯虾流行病(WangW,GuW,DingZF,RenYL,ChenJX,HouYY(2005)AnovelSpiroplasmaPathogenCausingSystemicInfectionintheCrayfishiVocam6a/"iC/arfe7(Crustacea:Decapod),inChina,FEMSMicrobiolLett.249:131-137.)，这些病害都给水产业造成了重大危害。3由于螺原体是一种新型水生动物病原体，目前还没有治疗螺原体引起的疾病的特效药物。基于此，发明人通过药敏试验、急性毒理试验和回感治疗实验进行了针对螺原体引起的疾病的防治研究，这不仅对生产实际中水生动物螺原体病的防治具有重要的意义，还可以减少病害带来的巨大经济损失。以前市场上出现过治疗中华绒螯蟹颤抖病的药物，但这些药物都是在颤抖病病原还没有准确确定的情况下，按照病毒和细菌的广谱抗菌药物组合的。如蟹抖灵(主要成分为板蓝根、金银花等)，蟹宁、蟹必康、克抖威、蟹安III号等，这些药物都没有査到公开的成份。由于没有对症下药，这些药物的治疗效果并不明显。土霉素是广谱抗菌药，对许多立克次体属、支原体属、衣原体属、螺旋体都很敏感。作用机制为药物能特异性与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。土霉素在水产养殖领域得到了广泛应用，是2006年美国FDA核准可用于水产养殖药物中的6种之一，可用于治疗鱼类的弧菌病和肠炎等，但还没有报道用于治疗由螺原体引起的疾病。
发明内容本发明的目的是提供一种土霉素的新的应用。本发明所说的土霉素的新的应用是土霉素在制备治疗水生动物螺原体病的药物中的应用。所说的水生动物螺原体病，是指由螺原体侵染而引起的水生动物疾病；具体可以是中华绒螯蟹颤抖病、南美白对虾的暴发流行病及克氏原螯虾流行病。土霉素在用于上述用途时，可以单独使用，也可以和其它成份配合制成组合物。用土霉素治疗水生动物螺原体病，效果显著，治愈率达到80%以上。不仅对生产实际中水生动物螺原体病的防治具有重要的意义，还可以减少病害带来的巨大经济损失。图l土霉素的急性毒性实验结果，显示土霉素浓度与中华绒螯蟹在24h和48h平均死亡率的关系。图2螺原体回感治疗试验结果具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。实施例l:药敏试验(O药液的配置生石灰溶液的配制称取2克Cao溶解于100ml灭菌双蒸水，配制成20000mg/L悬浊药液，用灭菌自来水按倍稀释法进行梯度稀释，配成各系列浓度组药液。清塘净、敌杀死、硫酸铜、溴氯海因、高锰酸钾的溶液配置同生石灰的配置方法。青霉素和土霉素药液的配制分别称取100mg溶解100mL无水乙醇中，配制成1000mg/L药液，用R2培养基按倍稀释法进行梯度稀释，配成各系列浓度组含药物培养基。五倍子、黄莲药液的配制分别称取五倍子、黄莲各5g，置于烧杯中倒入蒸馏水lOOmL,浸lh后再煮40min左右,当药液约剩15mL时，用纱布过滤去固形物，最终通过再煮或加蒸馏水定容到25mL,使药物浓度为0.2g/mL，用R2培养基按二倍稀释法进行梯度稀释，配成各系列浓度组含药物培养基，以上所有药物现配现用，使用前均用0.22pm细菌滤器过滤。其中R2液体培养基PPLO15g/L、蔗糖80g/L、胎牛血清150mlZL、青霉素100万单位/L。(2)试验步骤在995^L生石灰、清塘净、敌杀死、硫酸铜、溴氯海因和高锰酸钾药液各浓度组中分别接种5pL螺原体菌液，使药液中菌量达到106CFU/ml，30'C下恒温杀菌24h，后分别吸取5pL药菌混合液接种500ii1灭菌R2培养基，经3(TC恒温培养168h。在995pL土霉素、青霉素、五倍子和黄莲药液各浓度组中分别接种5tU螺原体菌液，使药液中菌量达到106CFU/ml，30'C恒温培养48h，后分别吸取5n1药菌混合液接种500pL灭菌R2培养基，经30。C恒温培养168h。以上每一种药物设三组平行，重复试验三次，每次试验每一药物均设阳性和阴性对照。最小抑菌浓度(MIC)的测定在各药物中，当菌药混合液重新接入灭菌R2培养基，经3(TC恒温培养48h后，根据培养基中的酚红指示剂颜色变化判断阳性对照已经呈现阳性时，此时呈现阴性的最小药物浓度定为该药物对螺原体的最小抑菌浓度。最小杀菌浓度(MBC)的测定在生石灰、清塘净、敌杀死、硫酸铜、溴氯海因和高锰酸钾药物中，当菌药混合液重新接入灭菌R2培养基，经3(TC恒温培养168h后，仍呈阴性的最小药物浓度定为该药物对螺原体的最小杀菌浓度。在土霉素、青霉素、五倍子和黄莲的菌药混合液中，3CTC恒温培养48h后分别吸取5pL药菌混合液接种50(^L灭菌R2培养基，再在30°C恒温培养168h后，仍呈阴性的最小药物浓度定为该药物对螺原体的最小杀菌浓度，判定为最小杀菌浓度的培养基均用相差显微镜观察有无螺原体加以辅证。(3)试验结果结果如表l，表明土霉素的MIC=0.04mg/L,MBC=0.62mg/L都是浓度最小的，从而也说明了土霉素对螺原体的抑杀效果最明显，五倍子和黄莲也有一定的抑杀效果。表1药敏试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>'一'表示该药物对螺原体无抑杀作用。实施例2:土霉素对中华绒螯蟹的急性毒性试验试验过程先将中华绒螯蟹在实验室暂养3天，平均体重为5.5g。温度设定在27'C。并利用随机抽样方法进行光镜检测确保为无螺原体感染的健康中华绒螯蟹。根据预试验找出24小时内死亡率为0~100%的浓度范围，按等间距设置6个浓度组(50mg/ml，20mg/ml,10mg/ml,5mg/ml,2.5mg/ml,0.5mg/ml)，1个空白对照组和一个阴性对照组.试验药液采用配制母液,再按要求逐步稀释，制成所需浓度药液。将中华绒螯蟹分为8组，每组40只，其中六组按照所选浓度依次进行注射，每只中华绒螯蟹注射药液50微升。阴性对照组每只注射50微升生理盐水，空白对照组不做任何处理。试验开始后进行8小时连续观察，然后分别记录24小时和48小时各浓度中华绒螯蟹死亡及存活数，计算死亡率。结果如图1所示。根据Bliss算法，利用SPSS13.0软件计算土霉素对中华绒螯蟹的24hLC50,48hLC50以及SC分别为24hLC50=365.6mg/kg蟹体重48hLC50=340.4mg/kg蟹体重SC=48hLC(50)X0.3/(24LC50/48hLC50)3=82.4mg/kg蟹体重结果显示，土霉素用于治疗螺原体引起的中华绒螯蟹颤抖病是很安全的。实施例3:土霉素的回感治疗试验先将中华绒螯蟹取回在实验室暂养3—4天。平均体重为50g/只。根据颤抖病发病规律，温度设定在27°C。利用随机抽样方法进行光镜检测确保为无螺原体的健康中华绒螯蟹。设置6个实验组，一个回感对照组和一个阴性对照组，每组20只。用纯培养的螺原体菌株回感实验组和回感对照组中华绒螯蟹，每只回感100微升菌液，阴性对照组回感同样体积的空白培养基。24小时后进行土霉素注射治疗。土霉素治疗浓度有高到低分别为50mg/mL，20mg/mL，10mg/mL，5mg/raL，2.5mg/mL。由于温度较高，要求每天换水并观察记录中华绒螯蟹死亡数。回感对照组全部死亡本次试验结束。结果如图2所示，表明当土霉素浓度是20mg/niL时，根据平均体重50g/只换算为体重比即40mg/kg蟹体重(附图2中系列4)时，治疗效果最好，治愈率达到80%以上。实施例4:用法与用量如下对患病的蟹塘所有存塘蟹，较准确的估计重量。然后估计饲喂量，以每100kg河蟹饵料中加入80mg土霉素为一个剂量，计算出这口蟹塘的总需药量。每剂药与100kg的河蟹饵料充分混合。七天一疗程。若病情严重第一天和第二天加倍投喂饵料，后五天按正常量投喂饵料。这样3—5天就能基本控制河蟹的死亡，经过一到两个疗程的治疗就能治愈河蟹的颤抖病。预防药在每年的4月上旬投喂，按80mg药物每100kg河蟹饵料投喂，连续投喂七天，这样可以有效预防河蟹的颤抖病。本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。权利要求1、土霉素用于制备治疗水生动物螺原体病的药物中的用途。2、根据权利要求1的用途，其中所说的水生动物螺原体病是中华绒螯蟹颤抖病。3、根据权利要求l的用途，其中所说的水生动物螺原体病是南美白对虾的暴发流行病。4、根据权利要求l的用途，其中所说的水生动物螺原体病是克氏原螯虾流行病。全文摘要本发明公开了土霉素用于制备治疗水生动物螺原体病的药物的用途。用土霉素来治疗螺原体引起的疾病，特别是中华绒螯蟹颤抖病，为此类水生动物疾病的防治提供一种有效途径，且效果显著，治愈率达到80％以上。文档编号A61P31/00GK101422469SQ20071013453公开日2009年5月6日申请日期2007年10月31日优先权日2007年10月31日发明者霆吴,琦封,梁廷明,文王,伟顾申请人:南京师范大学