抗vrgf受体单克隆抗体及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：抗vrgf受体单克隆抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，特别是涉及一种单克隆抗体。
技术背景血管新生(angiogenesis)是指从己经存在的血管上生长出新的血管的过 程。对绝大多数成年个体的器官来说，正常情况下并无血管的新生。血管新 生在正常生理状况下只见于极少数的组织器官，例如月经周期中的子宫内膜 等。但在某些病理状态下，例如肿瘤和创伤修复等过程中，可发生血管新生。 业己证明，在肿瘤等疾病，血管新生是疾病发展过程中的重要步骤。如果能 抑制血管新生，便可阻止肿瘤等疾病的病情发展，从而达到治疗疾病之目的 (Folkman， 2002， Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis, Semin Oncol. 29(6 Suppl 16): 15-8; Witmer et al,， 2003, Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease, Prog Retin Eye Res. 22:1-29。血管新生受多种因子的调控，其中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)是诱导血管新生的关键因子(Leung et al,， 1989, Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen, Science, 246: 1306-1309; Ferrara et al.， 2003， The biology of VEGF and its receptors, Nature Medicine 9: 669-676)。 VEGF是一禾中多 肽，可由多种细胞分泌产生，在肿瘤细胞VEGF的表达量尤其高。且其表达量与肿瘤的恶性程度成正比。VEGF与位于血管内皮细胞的特异受体相结合， 经受体信号传递系统刺激血管内皮细胞的分裂增生，形成新的血管。VEGF 可与两个受体结合，它们分别是VEGF受体I (VEGFR1)和VEGF受体II (VEGFR2)。其中VEGFR2是传导VEGF信号，促进血管形成的关键受体 (Neufeld et al,， 1999, Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its rec印tors, The FASEB Journal, 13:9-22)。 VEGFR2蛋白分子由细胞外区， 跨膜区和胞质区三部分组成。VEGF能与VEGFR2的细胞外区相结合，这一 结合可诱发VEGFR2胞质区酪氨酸激酶基团的磷酸化，从而启动细胞内的信 号传递，引起血管内皮细胞的增生、迁移和血管形成，并阻止血管内皮细胞 的凋亡。鉴于VEGFR2在促进血管新生信号传递过程中的关键性作用，抑制 VEGF与VEGF2的结合便可达到阻止血管新生，冶疗疾病的作用。具有阻断 VEGFR2功能的药物便可用来治疗肿瘤等血新生疾病。单克隆抗体由于特异性强，体内半衰期长，毒副作用小而成为了新一代 的药物形式。尤其近年来开发的人源化或全人源单克隆抗体避免了早期鼠源 抗体的免疫反应问题，是一种理想的药物形式。在人体内存在有成千上万分 泌不同抗体的淋巴细胞。每一个淋巴细胞只表达一种抗特定抗原决定簇的单 克隆抗体。因此每一个人体内都存在一个庞大的单克隆抗体库。在不同的个 体中，由于接受到刺激的抗原不同，所分泌的抗体亦不尽相同。在某些个体， 由于自身生理或病理状况的特殊状态，亦可产生抗自身蛋白质的抗体。因此 分离能分泌特异性抗体的人淋巴细胞是制备人源抗体的一个可行途径。另外 也可以用其他方法制备全人源单抗，例如用人噬菌体抗体文库筛选法或利用 人lg转基因鼠等。中国专利申请00805856.3公开了一种与KDR (即VEGFR2)结合的，亲和性和人类VEGF可比的，能够中和KDR的激活的免疫球蛋白分子，并公开了其氨基酸序列。目前尚没有与本发明相同或相近的 氨基酸序列的全人源抗VEGFR2单克隆抗体，用于抑制血管增生、治疗血管增生性疾病的报道。 发明内容所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种抗VRGF受体单克隆抗体及其制 备方法和用途，以填补目前在抗VRGF受体单克隆抗体种类上的空白，克服 现有抗血管新生药物特异性和人源化等方面的缺陷。技术方案本发明的技术方案之一是提供一种VEGFR2的单克隆抗体，具有SEQ ID No. 1所示的免疫球蛋白重链氨基酸序列和SEQ ID NO 2所述的免疫球蛋白 轻链氨基酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序 列，或其等位基因及其衍生序列所对应的氨基酸序列。本发明的技术方案之二是提供一种编码上述VEGFR2单克隆抗体的 DNA序列。优选所述的DNA序列为cDNA。本发明的技术方案之三是提供一种含有上述VEGFR2单克隆抗体的 DNA序列的核酸载体序列。所述核酸载体序列是指质粒、病毒序列等携带有 所述DNA序列的核酸。本发明的技术方案之四是提供一种携带上述VEGFR2单克隆抗体DNA序列的宿主细胞。本发明的技术方案之五是提供上述全人源抗血管内皮生长因子受体II的 单克隆抗体的制备方法，依次包括如下步骤(1) 通过细胞移植在免疫缺陷的小鼠体内扩增人源的分泌特异性抗VEGFR2抗体的淋巴细胞；(2) 用歩骤(1)所述的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，制备分 泌单克隆抗体的杂交瘤细胞；(3) 筛选分离获得抗VEGFR2的杂交瘤细胞株； 或者，依次包括如下步骤-(1) 逆转录宿主细胞的总RNA,获得cDNA;(2) 利用SEQIDNo. 3或SEQIDNo. 4为反向引物，以步骤(1) 所述的cDNA为模板，通过PCR扩增获得VEGFR2抗体重链和 轻链的DNA序列；(3) 将步骤(2)所述的VEGFR2抗体重链和轻链的DNA序列分别 插入到哺乳动物表达质粒；(4) 将步骤(3)所述的质粒纯化，通过共转染CHO细胞得到从质粒 表达的重组抗体；或者，依次包括如下步骤(1)将带有VEGFR2单克隆抗体编码序列的cDNA插入到编码有二 氢叶酸还原酶(DHFR)的质粒，使重链和轻链的cDNA位于同一 质粒，并且分别由各自的CMV启动子驱动，DHFR基因由SV40 早期启动子驱动；(2) 提取步骤(1)所述的质粒并将质粒转人DHFR缺陷的CHO细 胞；(3) 选择性培养经过消化的步骤(2)所述的CHO细胞，筛选高表达 的细胞株；(4) 将步骤(3)获得的细胞株进行MTX梯度加压，MTX浓度最终加 至500-2000 nM，选择表达量最高的克隆。本发明的技术方案之六是提供一种用于制备抑制血管生长药物的组合 物，包含治疗有效浓度的上述单克隆抗体和药学上可接受的载体。优选地， 所述的治疗有效浓度范围为静脉注射每千克体重0.1~100 mg或眼内玻璃体 注射每眼0.01~100 mg。本发明的技术方案之七是提供一种中和VEGFR2的方法包括，对哺乳动 物细胞施用有效浓度的上述的抗体使之中和VEGFR2。本发明的技术方案之八是提供一种抑制肿瘤或视网膜血管生长的方法包 括，对哺乳动物细胞施用有效浓度的上述的抗体使之中和VEGFR2。本发明是通过以下方式实现的为了制备人源的单克隆抗体，本发明首先筛选了大量病人的血清，从中 发现了一例呈抗VEGFR2阳性的样品。进一步用细胞移植的方法在免疫缺陷 的小鼠扩增特异性抗VEGFR2抗体的淋巴细胞，再用该淋巴细胞与小鼠骨髓 瘤细胞相融合制备分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用这一方法，本发明分 离到了若干抗VEGFR2的杂交瘤细胞株。通过进一步的实验，得到了一个能 阻断VEGFR2与其配体VEGF相结合的全人源抗人VEGFR2单克隆抗体。本发明提供了该抗VEGFR2单克隆抗体的氨基酸序列。该单克隆抗体重链的氨基酸序列如SEQ NO 1，其轻链的氨基酸序列如SEQ NO 2。该单克 隆抗体的DNA序列从该抗体的杂交瘤细胞的RNA经逆转录制备才DNA和 PCR扩增后直接获得。根据分子生物学的常识，同一氨基酸可由不同的DNA 序列所编码.因此，该单克隆抗体可以由不同的DNA序列所编码，这些序列 都属于本发明的内容之内。同时，根据抗体的结构知识，对抗体的氨基酸序 列作一定的改变后，仍能保持抗体的生物学活性，有时氨基酸序列的改变还 能增强抗体的生物学活性或改善原抗体的某些特牲。因此，可以利用基因工程 的方法改变该抗体的氨基酸序列，得到在生化或生物学特性上与原抗体类似或 有差别的抗体蛋白质。这些改变了氨基酸序列的抗体是本发明抗VEGFR2抗 体的变种，属于本发明的内容之内。在获得了抗体的DNA序列后，可以用基因工程的方法生产该单克隆抗 体。 一般而言，可以将编码有抗体重链和轻链的DNA插入到适当的载体(v e c t o r)内。本发明的实例中以细菌质粒(p 1 a s m i d)为载体。 但其他载体也可以用来表达或生产该单克隆抗体，例如病毒，DNA片段等。 在载体内，编码抗体的DNA阅读框位于启动子的下游。启动子驱动抗体阅 读框mRNA的转录。抗体阅读框包括含有起始密码和终止密码。重链和轻 链的D N A可以插入到同一载体中，也可以分别插入到两个独立的载体。带有抗体DNA序列的载体可以用适当的方法导入到宿主细胞中，用来 表达重组单克隆抗体。多种细胞可用来作为宿主细胞。然而，由于单克隆抗 体含有糖基化的氨基酸，用哺乳动物细胞表达的抗体具有与自然抗体较似的 糖基修饰，因此是比较理想的宿主细胞。常用的哺乳动物细胞包括中国仓鼠 卵巢细胞(CHO),小鼠骨髓瘤细胞，HEK293细胞，等等。除此以外，其他哺乳动物细胞也可用来表达该抗体，因此也包括在本发明的抗体所适用的宿 主细胞范围。同时，也可以用非哺乳动物细胞表达或生产本发明所描述的抗 体。适用的非哺乳动物细胞包括其他真核生物的细胞，例如植物细胞，昆虫 细胞，酵母细胞等任何真核细胞。适用的非哺乳动物细胞还包括细菌，真菌 等任何原核生物的细胞。因此，表达本发明单克隆抗体的宿主细胞可以是任 何真核或原核细胞。将含有抗体序列的载体转入宿主细胞的方法包括分子生 物学中所用的方法。对于质粒来说，常用的方法有电钻孔转染法和脂质体转 染法等。本发明采用电钻孔转染法，但其他许多方法都可以用来达到同样的 目的。除了用细胞培养的方法外，还可以用其他方法生产本发明的单克隆抗体。 根据生物技术的知识，单克隆抗体可以用转基因的方法在动物的器官内表达， 例如通过转基因在动物的乳腺，肌肉和卵等表达。此外，该单克隆抗体还可 以用转基因的方法在植物的器官表达，例如转基因植物的叶子等。本发明还提供了该抗体的从细胞培养上请液纯化的初步工艺。纯化后的 单克隆抗体蛋白与制剂辅料相混合，得到最终的单克隆抗体药物。本发明还进一步用实施例揭示了该抗体的生物学活性。有益效果本发明的实验证明该抗体在蛋白质水平上能阻断VEGF受体II与VEGF 的结合，在细胞水平上能抑制血管内皮细胞的增生，因此该抗体具有抑制血 管新生的作用，可用于治疗肿瘤，视网膜病变，老年性黄斑变性等血管新生 疾病。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授 的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形 式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆操作手册Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook，et al.， Cold Spring Harbor Laboratory Press)禾口 Antibodies: A Laboratory Manual, (Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press),等等，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1.人源抗VEGFR2单克隆抗体的制备为了制备全人源抗VEGFR2抗体，本发明首先对病人血清用ELISA法 筛选抗VEGF受体II抗件阳性的病人。该方法首先用VEGFR2重组蛋白质包 被96孔板，用2%牛血清白蛋白封闭，加入浠释的病人血清，再与HRP际 记的羊抗人抗体反应，并用过氧化物酶底物显色，用酶标仪读取OD值。利 用该方法，筛选到了一个抗VEGF受体II抗件阳牲的病人。取该病人外周血， 用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，然后将人PBMC移 植入SCID小鼠。用纯化的VEGFR2重组蛋白质对己植入人PBMC的SCID 小鼠进行多次免疫。用ELISA确定小鼠血清内抗VEGFR2的含量。待小鼠血 清获得高效抗VEGFR2滴度后，取小鼠脾脏，分离脾脏细胞，然后按照杂交瘤技术的常规方法将脾脏细胞与小鼠骨髓细胞相融合。将融合的细胞在96孔 板用选择性培养基培养，得到杂交瘤细胞克隆。实例2.抗VEGFR2单抗能有效地与VEGFR2结合在获得杂交瘤细胞株后，将杂交瘤细胞用RPMI-1640完全培养基培养 在96孔细胞培养板。取各杂交瘤细胞株的细胞培养上清液，用ELISA法检 测特异性抗体。该方法用可溶性VEGFR2重组蛋白质包被ELISA板，245/。 BSA 封闭，加入杂交瘤细胞培养上清液。清洗后加入HRP标记的羊抗人IgG抗 体。过氧化物酶底物显色后，用酶标阅读仪在650纳米波长读取OD值。用 该法筛选到了若干分泌抗VEGFR2抗体的杂交瘤细胞株。将分泌抗VEGFR2 特异性抗体的杂交瘤细胞株在六孔细胞培养板及T175培养瓶扩大培养。收集 杂交瘤细胞培养上请液。用IgG亚型ELISA试剂盒(lnvitrogen公司)确定各 杂交瘤细胞株分泌抗体的亚型，以相应亚型的纯化IgG作标淮曲线用ELISA 方法确定细胞培养上请液中抗体的含量。将各上清液的抗体调节至相同浓度， 并进行梯度稀释，用ELISA方法比较各单抗与VEGFR2的结合能力，确定 具高亲和力的抗体克隆。用这一方法，本发明获得若干株对VEGFR2具高亲 和力的单克隆抗体克隆。实例3.抗VEGFR2单抗能完全阻断VEGFR2与VEGF的结合经初筛得到具有高亲和力的抗VEGFR2抗体杂交瘤后，本发明进一步 确定了这些抗体对VEGF与VEGFR2的结合的阻断能力。将96孔酶标板用 VEGF包被，加BSA封闭酶标板。同时，在另一酶标板将待测的单克隆抗体与VEGFR2重组蛋白相混合，置37°。反应1小时，将单抗和VEGFR2的混 合物加入到上述封闭洗涤后的ELISA板内。孵育并洗涤后，加入HRP标记 山羊抗人lgGFc。孵育并洗漆。加入底物液，用酶标阅读仪在650纳米波长 读取OD值。经此法获得了一株能完全阻断VEGFR2与VEGF结合的抗 VEGFR2单克隆抗体克隆AC88。用人单克隆亚型抗体检测，确定AC88抗 体是人IgG1亚型。实例4.抗VEGFR2单抗能完全阻断VEGF诱导的HUVEC细胞分裂增生为了证明这一新的抗VEGFR2单抗的抗血管新生作用，本发明进一步 检测了其对血管内皮细胞增生的作用。人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)是 血管新生研究中最常用的体外细胞培养模形。由于HUVEC表面具有VEGF 受体，HUVEC细胞可在VEGF刺激下发生分裂增生，因此可以利用这一体 外细胞培养模型确定抗体对VEGF受体的中和能力。在此实验中，将HUVEC 细胞接种于24孔细胞培养板，24小时后，换含有每毫升5-20 ng VEGF的基 础培养基，加入不同浓度(0.1-5 )Lig/ml)的AC88抗体，在37摄氏度10% 的二氧化碳培养箱继续培养。48小时后消化细胞并计数。对照组加入不同浓 度的正常lgG。结果显示，在加入了每毫升1微克的抗VEGFR2单抗的培养 孔中，HUVEC细胞分裂受到完全抑制，而在加入了同浓度正常IgG的对照组 中，HUVEC细胞分裂没有受到影响。因此，本发明所获得的抗VEGFR2单 抗能抑制血管内皮细胞的增生，从而能抑制血管的新生。进一步的实验发现 克隆AC88抗体对鼠VEGFR2无结合能力，因此不宜用小鼠实验评估该抗体 在体内的生物学活性。实例5.抗VEGFR2单克隆抗体的基因克隆及重组抗体蛋白质在细胞培养系 统中的表达杂交瘤细胞不适于单克隆抗体的大规模工业化生产。为了表达重组单克 隆抗体，本发明利用分子生物学方法克隆了 AC88的DNA序列。由于抗体的 可变区是未知序列，本发明用cDNA末端快速扩增法(Rapid amplification of cDNAends, RACE)获得重链和轻链的DNA序列。取培养的AC88杂交瘤细 胞，用总RNA试剂盒(Promega公司)提取细胞总RNA，再用逆转录酶(BD Biosciences公司)制备cDNA。用PCR从AC88的cDNA用RACE cDNA 扩增试剂盒(BD Biosciences公司)扩增抗体重链和轻链的DNA序列。PCR反 应的正向引物来自试剂盒，反向引物为lgG1重链恒定区末端序列(SEQID NO 3)或kappa轻链末端序列(SEQID NO 4)。 PCR反应条件为根据试剂 盒说明书设定。PCR产物经1%琼脂糖电泳监定。然后，将PCR产物插入 TA cloning载体(lnvitrogen公司)。用限制性内切酶消化确定含插入片断的 克隆。所得质粒经DNA测序确定插入片断的DNA序列，从而获得了 AC88的 重链和轻链的DNA序列。进一步的序列分析显示所获得的抗体重链序列中含 有IgG可变区和恒定区，轻链序列含kappa轻链的可变区和恒定区。AC88 的重链恒定区序列与人IgG1相一致。将确证后的抗体重链或轻链DNA用内 切酶消化，分别插入到哺乳动物表达质粒pcDNA3.1。将含有抗体重链或轻链 cDNA的pcDNA3.1质粒纯化，用lipofectamine试剂盒(lnvitrogen公司)将 重链和轻链质粒DNA共转染入CHO细胞，转染后48-72小时后用ELISA法 检测上清液中抗体的含量。经此法本发明得到了从质粒表达的AC88重组抗体，说明AC88可用基因工程的方法生产。实例6.抗VEGFR2单克隆抗体高效表达细胞株的建立为了高效表达单克隆抗体，本发明制备了稳定转染AC88序列的CHO细 胞系，并进行基因扩增，得到高效表达的CHO细胞株。首先将AC88重链和 轻链插入到编码有二氢叶酸还原酶的质粒。重链和轻链位于同一质粒，但分 别由各自的CMV启动子驱动。DHFR基因由SV40早期启动子驱动。将编 码有AC88抗体的质粒用Maxi质粒提取盒(Qiagen公司)提取。用电钻孔 (eletroporation)将质粒转人DHFR缺陷的CHO细胞(ATCC)。三天后将转 染的CHO用胰酶消化，将细胞稀释后置细胞培养皿在选择性培养基培养。三 周后，挑取单克隆细胞集落，转移到96孔培养板中，用ELISA法检测抗体 含量。挑选表达量高的克隆，转移到六孔板中扩大培养，待细胞汇集后，收 集上清并用ELISA确定抗体表达浓度，并作细胞计数，计算单细胞抗体的表 达量。选择其中高表达的细胞株种到10cm培养皿中进行MTX梯度加压。MTX 浓度最终加至500-2000 nM。计算单细胞抗体表达量，选择表达量最高的克 隆。本发明用此方法获得了高效表达AC88的CHO细胞株，单细胞产量达 到每天每细胞30pg以上。且细胞株稳定性好，适合用于AC88的大规模生 产。实例7.抗VEGFR2单克隆抗体抗体的分离纯化本发明用实例证明AC88单克隆抗体可以用A蛋白亲和层析进行初步纯 化。收集AC88单克隆抗体CHO细胞株细胞培养上清液，将上清液用0.45微米滤膜过滤。A蛋白树脂(GE公司)按厂家说明处理并装柱。将过滤后的 细胞培养上清液以适当流速通过A蛋白亲和层析柱。PBS洗柱后用低pH甘 氨酸缓冲液洗脱抗体。纯化后的蛋白产物在变性条件下的SDS—聚丙烯酰胺 凝胶电泳电泳呈两条蛋白带，分子量约为55 kD和22 kD，与抗体的重链和 轻链的分子量相吻合。因此，用A蛋白亲和层析柱可以有效纯化AC88单克 隆抗体。在此基础上可进一步利用其他层析柱得到纯度更高的抗体。纯化后 抗体蛋白的浓度用Bradford试剂(Bio-Rad公司)测定。适当浓度的抗体蛋 白与药物制剂辅料相混合，得到最终的单克隆抗体药物。核苷酸序列表SEQUENCE LISTING<110>澳赛尔斯(上海)生物技术有限公司"20抗VRGF受体单克隆抗体及其制备方法和应用<160>4<210>1<211>467<212>PRT<213>人工序列<400>115 10 15 20GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGlySerLeuArgLeu 21 25 30 35 40SerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyrSerMetThrTrpValArgGlnAla 41 45 50 55 60ProGlyLysGlyLeuGluTrpValSerSerlleSerSerSerSerSerTyrlleTyrTyr 61 65 70 75 80AlaAspSerValLysGlyArgPheTMleSerArgAspAsnAlaLysAsnSerLeuTyr81859095100LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysAlaThr 101 105 110 115 120SerGlyTyrMetAspValTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerThr 121 125 130 135 140141 145150155160161165170175181185190195180 200201 205210215220221 225230235240241 245250255260PheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlleSerArgThrProGluValThr 261 265 270 275 280281 285290295300GlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyr301305310315320ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLys321325330335340341345350355360GlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLys361365370375380AsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGlu381385390395400401405410415420AspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGly421425430435440AsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSer441445450455460LeuSerLeuSerProGlyLys461465 467<210>2<211>236<212>PRT<213>人工序列 <400>2MetAspMetArgLeuProAlaGlnLeuLeuGlyLeuLeuLeuLeuTrpLeuProGlyAla 1 5 10 15 20ArgCysAspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArg 21 25 30 35 40ValThrlleThrCysGlnAlaSerGlnAspIleAsnAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGln 41 45 50 55 60LysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIleTyrAspAlaSerAsnLeuGluThrGlyVal 61 65 70 75 80ProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuTMleSerSerLeu 81 85 卯 95 100101 105 110 115 120GlyGlyGlyThrLysValGluIleLysArgThrValAlaAlaProSerValPhellePhe 121 125 130 135 140ProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsn 141 145 150 155 160PheTyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsn 161 165 170 175 180SerGlnGluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThr181 185 l卯 195 200LeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGIuLysHisLys vai j_yr/vm^ys*aiu vai i nrwis 201 205 210 215 220GlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys 221 225 230 235 236<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>35'-TCTTTTACCCGGAGACAGGG-3'<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>45'-CTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3'
权利要求
1.一种VEGFR2的单克隆抗体，具有SEQ ID No.1所示的免疫球蛋白重链氨基酸序列和SEQ ID NO 2所述的免疫球蛋白轻链氨基酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列，或其等位基因及其衍生序列所对应的氨基酸序列。
2. —种编码权利要求1所述单克隆抗体的DNA序列。
3. 根据权利要求2所述的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列为 cDNA。
4. 一种含有权利要求2所述DNA序列的核酸载体序列。
5. —种携带权利要求2所述DNA序列的宿主细胞。
6. 权利要求1所述单克隆抗体的制备方法，依次包括如下步骤(1) 通过细胞移植在免疫缺陷的小鼠体内扩增人源的分泌特异性抗 VEGFR2抗体的淋巴细胞；(2) 用步骤(1)所述的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，制备分 泌单克隆抗体的杂交瘤细胞；(3) 筛选分离获得抗VEGFR2的杂交瘤细胞株； 或者，依次包括如下步骤(1) 逆转录权利要求5所述的宿主细胞的总RNA，获得cDNA;(2) 利用SEQIDNo. 3或SEQIDNo. 4为反向引物，以步骤(1) 所述的cDNA为模板，通过PCR扩增获得VEGFR2抗体重链和 轻链的DNA序列；(3) 将步骤(2)所述的VEGFR2抗体重链和轻链的DNA序列分别 插入到哺乳动物表达质粒；(4)将步骤(3)所述的质粒纯化，通过共转染CHO细胞得到从质粒 表达的重组抗体； 或者，依次包括如下步骤(1) 将权利要求3所述的cDNA插入到编码有二氢叶酸还原酶的质 粒，使重链和轻链的cDNA位于同一质粒，并且分别由各自的 CMV启动子驱动，DHFR基因由SV40早期启动子驱动；(2) 提取步骤(1)所述的质粒并将质粒转人DHFR缺陷的CHO细 胞；(3) 选择性培养经过消化的步骤(2)所述的CHO细胞，筛选高表达 的细胞株；(4) 将步骤(3)获得的细胞株进行MTX梯度加压，MTX浓度最终加 至500-2000 nM,选择表达量最高的克隆。
7. —种用于制备抑制血管生长药物的组合物，包含治疗有效浓度的权利要 求1所述单克隆抗体和药学上可接受的载体。
8. 根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的治疗有效浓度范围 为静脉注射每千克体重0.1~100 mg或眼内玻璃体注射每眼0.01~100 mg。
9. 一种中和VEGFR2的方法包括，对哺乳动物细胞施用有效浓度的权利要 求1所述的抗体使之中和VEGFR2。
10. —种抑制肿瘤或视网膜血管生长的方法包括，对哺乳动物细胞施用有效 浓度的权利要求1所述的抗体使之中和VEGFR2。
全文摘要
本发明涉及一种人源抗VRGF受体II单克隆抗体。提供了单克隆抗体的免疫球蛋白重链和轻链氨基酸序列，该单克隆抗体的制备方法和在制备抑制血管生长药物中的应用。本发明的单克隆抗体适用于制备治疗肿瘤和视网膜病变的药物。
文档编号A61K39/395GK101245106SQ20071017176
公开日2008年8月20日 申请日期2007年12月4日 优先权日2007年12月4日
发明者吴文庆, 姜德胜, 滨 张 申请人:澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司