黑骨藤的多糖提取物、含有它的药物组合物及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：：黑骨藤的多糖提取物、含有它的药物组合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及从植物黑骨藤中提取得到的多糖提取物、其提取方法、含有该多糖提取物的药物组合物以及该多糖提取物或其药物组合物作为免疫抑制剂或抗炎、镇痛药物的用途。
背景技术：
：黑骨藤学名为西南杠柳(Periplocaforrestii5Wi/化)，是萝摩科(/^'c7e/7/tff/"(^"e)杠柳属(尸^7》/oc")植物，在我国西南地区称之为黑骨藤。黑骨藤全林供药用，可舒筋活络、祛风除湿，治疗风湿性关节炎、跌打损伤、胃痛、消化不良、闭经、痢疾等111。根据民间用药经验，其根或全林药用，具有通经络、祛风湿、活血、消炎等功能，可用于治疗跌打损伤、风湿关节痛、月经不调、口腔炎、乳腺炎等疾病121。既可单独使用，也可入复方。在苗药爹拉枪中，黑骨藤与大风藤、追风伞配伍，主治风寒湿痹，肩臂腰腿疼痛。杠柳属植物为藤状灌木，具乳汁，分布于亚洲温带地区、欧洲南部和非洲热带地区。全世界约有12种，我国产4种，分布于东北、华北、西北、西南及广西、湖南、湖北、河南和江西等省区。我国产杠柳属植物大部分为药用植物，例如杠柳(Pc//7/tfcflw尸/w附的根皮为著名的"北五加皮"，能祛风湿、壮筋骨、强腰膝，治风湿关节炎、筋骨痛等。青蛇藤l尸eW/7/oc'fl('tf/o/7/y;〃fl("W/g/^jF"/c.l茎药用，治腰痛、风湿麻木、跌打损伤及蛇咬伤等111。对杠柳属植物的研究始于19世纪末，1896年俄国学者对希腊杠柳进行了研究，从中得到强心苷periplocin并经药理实验证明它有强心作用。据文献报道，到目前为止，杠柳属植物中共发现38个C2,甾类成分，其中苷28个，苷元10个，均为孕甾蹄醇类化合物；18个强心苷类成分，其中苷元10个，苷8个|31;此外还有薛类成分如3|5,601-二羟基羽扇豆-20(29)-烯，6a-羟基羽扇豆-20(29)-烯-3(i-十八烷酸酯，羽扇烷醇141，p-香树脂醇，a-香树脂醇乙酸酯，Pl、P2、P3(均为三萜类化合物)15、periplocadiol161，熊果酸|7|,以及由2-去氧糖组成的低聚糖如4-0-(2-0-乙基-(3-D-毛地黄糖基)-D-磁麻糖，曱基4-0-(2-0-乙基-p-D-毛地黄糖基)-D-磁麻糖苷181，d、D2、F,、F2(均为低聚糖)|9|,(J-谷甾醇，胡萝卜苷等間。药理研究表明，杠柳1111、黑骨藤1121及青蛇藤|131茎皮或根皮中的总皂苷均具有强心作用；杠柳皮的氯仿提取物有抗癌活性|14|;除此之外，从杠柳属植物中分得的单体cx-和(3-香树酯醇乙酸酯具有抗炎作用同；甾体苷GlyocosideK、H。112具有神经生长因子促进剂的作用1161;从杠柳根皮曱醇提取物中分得的两类9个单体化合物均具有细胞分化诱导剂的作用，且强心苷的诱导活性小于C21甾体苷1]7'。根据文献调研结果，目前尚无杠柳属植物中多糖类化学成分的研究报道，更未见有关于其免疫抑制活性的研究报道。
发明内容本发明的一个目的是提供从黑骨藤中提取得到的多糖提取物，该多糖提取物具有多种生物活性。本发明的另一个目的是提供该多糖提取物的制备方法。在免疫抑制和抗炎、镇痛活性的导向下，本发明人通过一系列深入研究，发现并提取得到了黑骨藤的活性部位一多糖部位，即多糖提取物，并对其进行了系统的化学研究，得到了系列均一分子量的多糖，从而实现了上述目的。在上述基础上，我们对所述多糖部位的制备工艺、质量控制和生物活性进行了深入研究。一方面，本发明提供从黑骨藤中提取得到的多糖提取物，其主要成分为由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸以不同摩尔比组成的多种均一分子量多糖，其分子量分布为4x1032.7x105,包括0.41xl04、1.06x104、0.64x104、0.56xl04、1.36x104和1.54x104的多糖。根据本发明的黑骨藤多糖提取物，其中通过联用间羟基联苯法与苯酚-硫酸法测定时，所述多糖以葡萄糖计占该提取物重量的47.0549.23%。另一方面，本发明提供一种药物组合物，它包含本发明的多糖提取物及药用载体。药物制剂领域中普通技术人员可以使用已知的技术，根据需要选择所述的药用栽体，并将本发明的药物组合物配制成适合的剂型，例如片剂、胶嚢和颗粒剂等。再一方面，本发明提供一种制备黑骨藤多糖提取物的方法，它包括如下步骤i)将黑骨藤药材用低级醇提取一次或多次；ii)在所得药渣中加水，例如蒸馏水提取一次或多次；iii)将所得水提液(上述步骤进行多次时，合并所有的水提液)浓缩至适当体积后釆用低级醇沉淀一次或多次；并且iv)将沉淀部分加水溶解并浓缩除醇，冷冻干燥即得到本发明的多糖提取物。还可以根据需要，在上述步骤iv)后再用低级醇沉淀处理所得多糖提取物。更具体地说，本发明的黑骨藤多糖提取物可按说明书附图7所示的工艺流程提取得到。将新鲜采集的黑骨藤晾干，破碎。该破碎药材用低级醇提取，过滤，所得药渣用水提取，合并水提液并且浓缩后冷冻干燥，所得棕黄色粉末再经低级醇沉淀处理，将沉淀物加水溶解并浓缩除醇后冷冻干燥，即得到本发明的黑骨藤多糖提取物。上述提取制备方法中提取所用的低级醇可为任何适合的低级链烷醇，例如甲醇、乙醇等，其中醇的浓度范围为60%-100v/v%;沉淀所用的低级醇可为任何低级链烷醇，其中醇的浓度范围为60%-100v/v%。所用醇及其浓度的选择完全在所属领域普通技术人员的知识范围内。所得到的黑骨藤多糖提取物经DEAE纤维素柱层析及SephadexG-100凝胶柱层析分离后可以得到均一分子量的多糖。本发明多糖提取物的主要成分为由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸以不同摩尔比组成的多种均一分子量的多糖，其分子量分布为4xl032.7xl05,包括分子量0.41xio4、1.06xl04、0.64xl04、0.56x104、1.36x104和1.54xl04。其中，所述多糖含量以葡萄糖计占多糖提取物重量的48.14±1，09%,即47.0549.23。本发明人经过广泛深入的研究发现，通过本文中描述的方法得到的黑骨藤多糖提取物，体外应用可以明显降低脾淋巴细胞增殖反应，降低脾细胞分泌IgG水平；体内应用对巴豆油诱发的小鼠急性耳肿胀及2,4-二硝基氯苯(DNCB)谦导的迟发型变态反应(DTH)均有明显的抑制作用；对佐剂性关节炎(AA)模型大鼠具有明显的治疗作用，显示出良好的抗炎和免疫抑制作用，具有广阔的治疗自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疳、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病以及炎性疾病)的潜在应用前景。因此，预期本发明的多糖提取物或其药物组合物可以用于治疗炎性疾病、疼痛或自身免疫性疾病。根据本发明的这一方面，本发明还提供所述的多糖提取物或其药物组合物在制备用于治疗炎性疾病、疼痛或自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、白塞氏病、自身免疫性肝炎或免疫性血管病的药物中的用途。本发明的黑骨藤多糖提取物可单独或以药物組合物形式使用，其给药方式可根据具体情况而定，可通过口服、非肠道或局部给药，给药剂型可以是例如片剂，胶嚢，骨剂，贴剂，注射剂等。图1为黑骨藤多糖提取物的纤维素薄层层析图谦。图2为黑骨藤多糖提取物的"C-NMR谱。图3为由黑骨藤多糖提取物中分离得到的各均一分子量多糖的常压凝胶色镨图(左侧依次为HPl-l、HPl-3、HPl-4，右侧依次为HP2-2、HP2-3、HP2醫4)。图4为由黑骨藤多糖提取物中分离得到的各均一分子量多糖的乙酰化衍生物气相色语图(左侧依次为HP1-1、HPl-3、HPl-4，右侧依次为HP2-2、HP2-3、HP2-4)。图5为由黑骨藤多糖提取物中分离得到的均一分子量多糖的红外光语图(横向依次为HP1-1、HP2-2、HP2-3)。图6为由黑骨藤多糖提取物中分离得到的均一分子量多糖的'H-NMR谱(依次为HP1-1、HP2-2)。图7为提取黑骨藤多糖提取物的工艺流程图。具体实施例方式下面的实施例和生物活性实验，是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。实施例l:黑骨藤多糖提取物的制备将黑骨藤(购自云南省大理州巍山县医药有限责任公司)晾干，破碎。该黑骨藤破碎物30公斤，加8倍量95%乙醇回流提取，过滤，同法再提取一次，将所得药渣加8倍量蒸馏水提取两次，合并提取液，浓缩后冷冻干燥，得到2.1公斤棕黄色粉末，再经过两次80。/。乙醇沉淀处理后，将沉淀加水溶解并除醇后冷冻干燥，得到840克棕黄色粉末，即为黑骨藤多糖提取物。其具有下述的定性反应特征。按按照下述方法测定本实施例所得提取物中多糖含量以葡萄糖计为(48.14±1.09)%(n=3)。实施例2:黑骨藤多糖提取物的定性鉴别按照如下方法，定性鉴别本发明的黑骨藤多糖提取物。(1)a-萘酚反应(Molish反应)黑骨藤多糖提取物以适量水溶解，加10。/。a-萘酚乙醇溶液三滴，然后沿试管壁緩緩加入浓硫酸，使形成上下两层，稍后在两层界面处可见紫色环，表示有多糖存在。(2)纤维素薄层层析取黑骨藤多糖提取物，经三氟乙酸水解后，与标准单糖共薄层，以吡啶乙酸乙酯乙酸水(5:5:i:3)系统展开，以苯胺-邻苯二曱酸显色剂显色，提取物水解液中含多种单糖，表示有多糖存在，结果见图i。(3)'H-NMR及13C-NMR镨取黑骨藤多糖提取物，加重水溶解后，测定其'H-NMR及。C-NMR谱，端基氢、端基碳信号以及糖上的其他氩和碳信号均显示出多糖的特征，表明此部位为多糖部位，结果见图2。(4)由黑骨藤多糖提取物中分离得到的各均一分子量多糖的纯度检测及分子量测定黑骨藤多糖提取物经DEAE纤维素柱层析及SephadexG-100凝胶柱层析分离后得到系列均一分子量多糖，采用常压凝胶色谱法测定其纯度及分子量。色镨条件填料SephacryiS-300HR流动相0.15mol/LNaCl溶液上样量2毫克流速1毫升/20分钟，每毫升收集一个流份。结果见图3及表1。表l、黑骨藤多糖提取物中分离得到的各均一分子量多糖的分子量均一老f量多糖HP1-1HP1誦3HP1-4HP2-2HP2-3HP2-4分子量(x104)0.411.060.640.561.361.54(5)由黑骨藤多糖提取物中分离得到的各均一分子量多糖的糖组成取各均一分子量多糖分别制备糖醇乙酸酯，GC检测。仪器岛津GC-17A型气相色谱仪，SHC-II型高纯氬气发生器，GCsolution数据处理软件色傳条件色谱柱EC-5(30mx0.25mmx0.25nm)进样口温度250°C检测器温度280°C氮气流速0.6毫升/分钟升温程序200。C保持2分钟，以3。C/分钟的速率升至245。C，保持4分钟，再以10。C/分钟的速率升至270。C，保持2分钟。结果见图4及表2。表2、由黑骨藤多糖提取物中分离得到的各均一分子量多糖中所含各种单糖的摩尔比趕一—3f3manglugalglu-AHP1-10.182.541.001.584.381.39\0.45HP1-31.9315.411.001.913.1011,580.552.12HP1-40.5610.231.001.623.956.412.490.46HP2-22.442.751.001.045.832.041.0227.31HP2-311.1214.021.000.953.969.351.9117.20HP2-47.6212.811.000.612.169.091.4211.39(6)由黑骨藤多糖提取物中分离得到的均一分子量多糖的红外光镨KBr压片，红外扫描，结果见图5。(7)由黑骨藤多糖提取物中分离得到的均一多糖的^-NMR语取均一分子量多糖，加重水溶解后，测定其iH-NMR,结果见图6。实施例3:黑骨藤多糖提取物的定量鉴别按照如下方法，定量鉴别本发明的黑骨藤多糖提取物。一.仪器与试剂1.试剂间羟基联苯(AR.)，以0.5%氬氧化钠配制成质量比为0.15%的溶液，冰箱保存一月内有效；四硼酸钠(AR.)-硫酸试液，0.0125mol/L四硼酸钠的浓硫酸溶液；半乳糖醛酸(GalA)标准液，Sigma公司，8(TC干燥至恒重后配制成浓度为60ng/mL的溶液，冰箱保存备用；硫酸为分析纯；苯酚为分析纯，重蒸后水箱保存，用前加水配制成5%的水溶液；葡萄糖(Glu，AR.)备用液，105。C干燥至恒重后配成浓度为0.3mg/mL的溶液，冰箱保存备用。2.仪器cintra-20(澳大利亚)紫外分光光度仪二.实验方法1.间羟基联苯法1.1标准曲线的制备精密吸取GalA标准液O,0.3，0.6，0.9,1.2，1.5mL分别置于6个25mL的容量瓶中，各补加水至1.5mL,摇匀，冰浴冷却，迅速加入四硼酸钠-浓硫酸9.0mL摇匀，沸水浴5分钟，取出水浴冷却，加入间羟联苯溶液0,15mL，摇匀，放置半小时后，于525nm下测定吸收值。1.2精密度实验精密吸取GalA标准液0.9mL共6份，余操作同上，在同样条件下考察仪器的精密度。1.3稳定性实验称取样品配制一定浓度的溶液，吸取l.OmL,余按第一项下操作，在0,20分钟，40分钟，1小时，3小时，5小时，8h测定吸光度值，考察样品及与反应试剂生成有色物的稳定性。1.4样品重复性实验按工艺处理方法在同样条件下同时制备黑骨藤多糖提取物3份，按样品测定项下配制溶液，吸取1.0mL，同上操作，测定吸光度，考察此制备方法的稳定性。1.5样品测定称取同一样品6份，配制成浓度为0.4mg/mL的水溶液，吸取1.0mL，将其分为两组，按第一项操作，第一组加显色剂，第二组加同等量的0.5。/。氢氧化钠溶液，第一组测得吸光度值扣除第二组后，计算酸性多糖的含量。1.6加样回收率精密称取样品五份，每份依次精密加入GalA标准液l.O，2.0，3.0，4.0，5.0mL，加水定容，摇匀后，吸取l.OmL按第一项下操作，测定吸光度值，计算回收率，考察此定量方法的准确度。2.苯酚-硫酸法2,1标准曲线的制备分别吸取Glu备用液l.O，2.0,3.0，4.0，5.0，6.0mL置于50mL的容量瓶中，加水定容至刻度摇匀，配成Glu标准系列溶液。分别吸取标准系列溶液各2.0mL置于25mL量瓶中，加入5%(g/v)苯酚溶液1.8mL，混勻，迅速加入浓硫酸7.5mL(10~20s)，混匀，置沸水浴中加热20分钟，取出后冷水浴中冷却30分钟，另以2.0mL蒸馏水同上平行操作为空白对照，于490nm下测定吸光度值。2.2校正曲线的制备精密称取80。C烘干至恒重的半乳糖醛酸60mg置于100mL的容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀后，从中分别取出1.0，2.0，3.0，4.0，5.0,6.0mL置于6个50mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀后，分别从中取2.0mL，置于6个25mL容量瓶中，余操作同第一项。2.3精密度实验精密吸取同一Glu标准溶液2.0mL共6份，按第一项下操作，测定吸收值A，在同样条件下考察仪器的精密度。2.4稳定性实验精密吸取样品溶液2.0mL,按第一项下操作，在0，10分4中，30分4中，1.0小时，1.5小时，2.5小时，4.0h时间点测吸收值，考察样品及与反应试剂生成有色物的稳定性。2.5才羊品测定称、取同一冲羊品3份，配制成浓度为0.4mg/mL的溶液，从中吸取溶液2.0mL,置于25mL容量瓶中定容，再从稀释液中吸取溶液2.0mL,置于25mL容量瓶中，余操作按第一项，测定吸光度值，计算中性多糖的含量。2.6样品重复性实验按工艺处理方法在同样条件下同时制备黑骨藤多糖提取物3份，按样品测定项下配制溶液，吸取2.0mL置于25mL容量瓶，余同上操作，测定吸光度，考察此制备方法的稳定性。2.7加样回收率实验精密称取样品5份，每份依次精密加入同一Glu标准溶液l.O，2.0，3.0,4.0，5.0mL，加水定容，摇匀后，分别吸取2.0mL按第一项下操作，测定吸光度值，计算回收率，考察此定量方法的准确度。三.实验结果采用间羟基联苯法与苯酚-硫酸法联用，测定黑骨藤多糖部位中多糖的含量。先用间羟基联苯法测定糖醛酸的含量，可靠准确；然后用苯酚-硫酸法测定糖的含量，同时将糖醛酸做对照品，按此法做校正曲线，将第一步测得的糖醛酸含量带入校正曲线进行校正，得到计算吸光度值。从该法测得的吸光度值中扣除计算值后，带入该法标准曲线中计算得到中性糖的含量，中性糖与酸性糖醛酸加和即得总多糖的含量，再根据原样品的重量折算出总多糖在样品中的含量。测定结果表明，提取物中总多糖的含量以葡萄糖计在(47.0549.23)%范围之间。表3、间羟基联苯法重复性实验结果样品NO.123样品质量(g)0.01040.01050.0104吸光度值(A)0.60780.62540.6126含量(％)19.1319.6919.29平均含量19.37%RSD1.49%表4、苯酚-石充酸法重复性实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例4:黑骨藤多糖提取物的生物活性实验一.黑骨藤多糖提取物对细胞和体液免疫功能的影响1、对小鼠脾细胞增殖反应的影响Balb/c小鼠麻醉后断头处死，无菌取脾脏，盛于100目滤网中，采用玻璃棒碾磨的方法制备脾细胞悬液，并用含20%FBS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为5xl06cells/mL。实验用黑骨藤多糖提取物为棕黄色粉末，用RPMI-1640培养液溶解后过滤除菌，调整为l、10、50、100、250、500ng/mL浓度后采用3H-TdR掺入法观察其对经ConA和LPS刺激脾细胞增殖反应的影响(181。表5所示结果表明，黑骨藤多糖提取物对未经ConA刺激的脾细胞增殖没有明显影响，经ConA和LPS刺激后，黑骨藤多糖提取物在l500ng/mL范围内可以浓度依赖性的抑制脾细胞增殖反应，在50(nig/mL时几乎全部抑制了脾细胞增殖。结果提示其对细胞和体液免疫功能均有明显抑制作用。表5、黑骨藤多糖提,体外应用对小E^细I^歹JL^的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本实验数据采用单因素多水平一元方差分析，*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较；均值土标准差，n=4。ConA，刀豆蛋白A;LPS,脂多糖。2、对小鼠脾细胞培养上清IgG水平的影响同上制备好脾细胞悬液备用。采用间接ELISA法观察黑骨藤多糖提取物对LPS刺激的脾脏淋巴细胞分泌IgG的影响。实验用黑骨藤多糖提取物形式及配置方法同上。表6所示结果表明，经LPS刺激后，黑骨藤多糖提取物l100ng/mL对脾细胞培养上清中的IgG水平没有明显影响，在200500ng/mL浓度依赖性的降低脾细胞培养上清中的IgG水平，表明黑骨藤多糖提取物体外应用可抑制脾细胞IgG的生成。提示其对体液免疫功能有明显抑制作用。表6、黑骨藤多糖提取物体外应用对小鼠脾细胞培养上清IgG的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*0.028±0.020*本实验数据采用单因素多水平一元方差分析，*P<0.05，**P<0.01与对照组比较；均值士标准差，n=6。3、黑骨藤多糖提取物对DNCB诱导的小鼠耳DTH的影响1191雄性Balb/c小鼠，(18士2)g，实验第1天按体重随机分组，腹部剃毛发，用配好的浓度为5%的DNCB-丙酮-花生油溶液20nL涂小鼠腹部皮肤以诱导DTH反应；实验第8天，再次用浓度为2.5%的DNCB-丙酮-花生油溶液lOpL攻击小鼠右侧耳部双侧，对侧涂相同剂量丙酮-花生油溶液；实验第11天处死小鼠，用直径为7mm的打孔器于固体石蜡板上取耳片并称重。实验用黑骨藤多糖提取物为棕黄色粉末，用纯净水液溶解后，调整剂量为10、50、100、250、500mg/kg后备用。表7所示结果表明，模型组小鼠耳肿胀度较正常对照组小鼠明显增加，黑骨藤多糖提取物灌胃给药8天后，在50mg/kg剂量时具有明显的抑制的作用，在100mg/kg剂量时作用也较明显。该结果说明黑骨藤多糖提取物具有抑制细胞免疫反应的作用。表7、黑骨藤多糖提取物对DNCB诱导小鼠耳DTH的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本实验数据采用成组设计T检验及单因素多水平一元方差分析，**P<0.01，与正常对^、纟且t匕较；#P<0.05，##P<0.01，与才莫型对^、纟且t匕较；均数±标准差，n=10。肺胀抑制率=(模型组肿胀度均值-给药组肿胀度均值)/模型组肿胀度均值《100%。二.黑骨藤多糖提取物对急性炎症反应的影响,雄性KM小鼠，(18±2)g，按体重随机分组，自由取食、水，后连续三天灌胃给药，1次/天；末次给药后l小时，于小鼠右耳两侧分别涂浓度为1%的丙酮巴豆油溶液1OnL致炎，对侧涂相同剂量的丙酮溶液；致炎后4小时脱臼处死小鼠并剪下双侧耳片，后用直径为7mm的打孔器于固体石蜡板上取耳片并称重。实验用黑骨藤多糖提取物为棕黄色粉末，用纯净水液溶解后，调整剂量为10、50、100、250、500mg/kg后备用。表8所示结杲表明，模型组小鼠耳肺胀度较正常对照组小鼠明显增加，黑骨藤多糖提取物灌胃给药3天后，在100mg/kg剂量时即具有明显的抑制作用，在500mg/kg剂量时其抑制作用更明显，且呈剂量依赖性。该结果表明其对急性炎症反应有明显抑制作用。表8、黑骨藤多糖提取物对巴豆油诱导小鼠耳急性炎症反应的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本实验数据采用成组设计T检验及单因素多水平一元方差分析，**P<0.01，与正常对照组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型对照组比较；均数士标准差，n=10。肿胀抑制率=(模型组肿胀度均值-给药组肺胀度均值)/模型组肿胀度均值xl00。/。。三.黑骨藤多糖提取物的镇痛作用选择醋酸扭体实验观察黑骨藤多糖提取物的镇痛作用1211。雄性KM小鼠，(18士2)g，按体重随机分组，自由取食、水，连续三天灌胃给药，1次/天；末次给药45分钟后腹腔注射0.6%冰醋酸，0.2mL/只，并控制室温在2426。C范围内。注射醋酸5分钟后开始观察扭体次数，连续观察15分钟。实验用黑骨藤多糖提取物为棕黄色粉末，用生理盐水液溶解后，调整剂量为50、100、250mg/kg后备用。表9所示结果表明，腹腔给予醋酸后小鼠出现明显的扭体反应；给予100mg/kg阿司匹林后小鼠扭体反应受到明显抑制，与对照组相比，扭体次数明显减少(P<0,01);黑骨藤多糖提取低、中、高(50，100,250mg/kg)三个剂量对小鼠扭体反应均具有明显抑制作用，其中100mg/kg剂量时作用最为明显。该结果表明其具有一定镇痛作用。表9、黑骨藤多糖提取物对小鼠醋酸扭体反应的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本实验数据采用单因素多水平一元方差分析，与模型对照组比较；*P<0.05，**P<0.01;均数士标准差，n=10。四.黑骨藤多糖提取物对AA(佐剂型关节炎)模型大鼠足爪肺胀的影响采用Wistar大鼠右足垫内注射CFA的方法(O.lmL/只)致敏大鼠，原发病变表现为致炎侧的关节肿胀，致敏后即可出现，继发病变一般于致炎后1218天出现，表现为非致炎侧及双前肢的关节肿胀[221。实验动物致炎后1周开始给药，连续给药23周，末次给药后l小时测量足爪肿胀体积。实验用黑骨藤多糖提取物为棕黄色粉末，用纯净水液溶解后，调整剂量为15、30、60mg/kg后备用。表10所示结果表明，模型组AA大鼠原发侧足爪体积随时间的延长明显增加；雷公藤多苷在30mg/kg剂量时对AA大鼠原发足爪肺胀有明显的抑制作用；黑骨藤多糖提取物15mg/kg、30mg/kg剂量连续给药lw后对AA大鼠原发足爪肿胀即具有明显抑制作用，连续给药2周后抑制作用更为明显；黑骨藤多糖提取物60mg/kg剂量连续给药1周后对AA大鼠原发足爪肿胀抑制作用不明显，连续给药2周后具有明显的抑制作用。表U所示结杲表明，模型组AA大鼠继发侧足爪体积在造模2周后随时间的延长明显增加；雷公藤多苷在30mg/kg剂量时对AA大鼠继发足爪肿胀抑制作用不明显；黑骨藤多糖提取物15mg/kg、60mg/kg剂量连续给药2周对AA大鼠继发足爪肿胀抑制作用不明显，而黑骨藤多糖提取物在30mg/kg剂量时连续给药2周后对AA大鼠继发足爪肺胀抑制作用明显，说明黑骨藤多糖提取物30mg/kg剂量对AA大鼠继发足爪肿胀具有明显的抑制作用。该部分结果提示其可能具有明显抗风湿作用。表10、黑骨藤多糖提取物对AA模型大鼠原发侧足爪肺胀的影响剂量造模前足造模后足爪体积(mL)组别(mg/爪体积kg)(mL)1周2周3周4周正常对照组\1.59±0.121.66±0.101.59±0.261.87±0.181.86±0.07模型对照组\1.52士0.063.02±0.92**3.16±0.53"3.36±0.57**3.73±0.67**雷公藤多香301.69±0.122.92±0.402.64±0.402.84士0.55#3.08±0.70##黑骨藤多糖151.54±0.063.06±0.362.70±0.423.07±0.65#3.01±1.雨#提取物301.63±0.053.08±0.202.54±0.272.66±0.28##2.86±0.37##601.61±0.043.16±0.412.66±0.333.15±0.673.38±0.78##本实验数据采用具有一个重复测量的三因素定量资料的一元协方差分析，**P<0.01，与正常对照组比较；#P<0.05,##P<0.01，与模型对照组比较；均数士标准差，n=6。表11、黑骨藤多糖提取物对AA冲莫型大鼠继发侧足爪肿胀的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>本实验数据釆用具有一个重复测量的三因素定量资料的一元协方差分析，**P<0.01，与正常对照组比较；#P<0.05，##P<0.01,与模型对照组比较；均数±标准差，n=6。五.黑骨藤多糖提取物对II型胶原诱导关节炎(CIA)小鼠踝关节直径的影响采用DBA/1小鼠皮内多点注射的方法造模。将ClI溶于0.02mol/L的醋酸中，浓度为2mg/mL，过夜，将溶解的CII与CFA等体积混和充分乳化，于DBA/1小鼠皮内多点注射100nLCn与CFA的混合乳剂(含CII0.1pg)免疫1231。继发病变于免疫后第20-28天出现，表现为关节及尾、耳、鼻的肿胀，免疫后第20天开始给药，连续给药40天，每次给药后l小时测量左、右侧踝关节直径。实验用黑骨藤多糖提取物为棕黄色粉末，用纯净水液溶解后，调整剂量为50、100、250mg/kg后备用。表12所示结果表明，模型组DBA/1小鼠左侧足爪体积随时间的延长明显增加；来氟米特在15mg/kg剂量时连续给药20天即对DBA/1小鼠左侧足爪肿胀有明显的抑制作用；黑骨藤多糖提取物在250mg/kg剂量连续给药20天后对左側足爪肿胀具有明显抑制作用，而连续给药40天后，黑骨藤多糖提取物50mg/kg、100mg/kg、250mg/kg各剂量均具有明显抑制左侧踝关节直径的作用。表13所示结果表明，模型组DBA/1小鼠右侧足爪体积也随时间的延长明显增加；来氟米特在15mg/kg剂量时连续给药40天时才对DBA/1小鼠右侧足爪肺胀有明显的抑制作用；而黑骨藤多糖提取物在250mg/kg剂量连续给药20天后即对右侧足爪胂胀具有明显抑制作用，连续给药40天后对右侧踝关节直径具有更明显抑制的作用。该部分结果进一步提示其可能具有明显抗风湿作用。表12、黑骨藤多糖提取物对CIA小鼠左侧踝关节直径的影响剂量造模前踝造模后踝关节直径(mm)组别关节直径(mg/kg)(mm)20天40天60天正常对照组\39.6±0.940.3±1.339.5±0.5化5±1.2模型对照组\40.5±1.040.4±0.944.4士1.6"50.0±5.3**来氣米特1540.4±1.540.5±0.840.2±0.6#43.0±4.5##黑骨藤多5040.2±0.640.6±0.944.1±4.945.3±4.0#糖提取物10040.2±0.840.4±0.642.0±3.945.2±4.8#25040.0±0.840.7±0.640.8±1.1#44.0±5.0##本实验数据采用具有一个重复测量的三因素定量资料的一元协方差分析，**P<0.01，与正常对照组比较；#P<0.05,##P<0.01,与模型对照组比较；均数士标准差，n=6。表13、黑骨藤多糖提取物对CIA小鼠右侧踝关节直径的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>本实验数据采用具有一个重复测量的三因素定量资料的一元协方差分析，*P<0.05，**P<0.01，与正常对照组比较；#P<0.05，##P<0.01,与模型对照组比较；均数士标准差，n=6。参考文献111中国科学院中国植物志编辑委员会编.中国植物志.北京科学出版社，1977,63:272|21江苏新医学院编.中药大辞典.上海科学出版社，1986，2388m张援虎，王锋鹏.杠柳属植物化学成分研究进展.天然产物研究与开发.2003，15(2):157-161|4jGhulamMustafa,ErumAnis，SaeedAhmed,etal.Lupene-TypeTriterpenesfrom/VW//oca/)/^〃fl,JNatProd,2000，63(10):881|5jOmp.Srivastava,AnakshiKhare，Mahesshwarip.khare.Triterpenoidsof尸m沙cflc"/o尸卸〃tf.JNatProd,1983，46(4):458|6|MoheddineAskri,ZineMighri.MedicinalplantsofTunisia.TheStructureofPeriploeadiol,ANewElemane-TypeSesquiterpeneIsolatedfromtheRootsof尸er1》/0cflZ^ev/ga,fl.JNatProd,1989，52(4):792邓士贤，王德成，王懋德，等.漆杠柳甙的强心作用.药学学报，1964，11(2):75|13j邓士贤，王德成，何功倍，等.美叶杠柳Periplocacalophylla(wight)falconer的强心作用.药学学报，1980，15(4):2414jHidejiItokawa,JunpingXu，KoichiTakeya,etal.StudiesonChemicalConstituentsofAntitumorFractionfromPeriplocasepium.II.StructuresofNewPregnaneGlycosides,PeriplocosidesA，BandC.ChemPharmBull,1998，36(3):982|15|王本祥.现代中药药理学.天津科学技术出版社，1997，436|16jSeiichiSakuma,SachikoKawanishi,JunzoShoh.ConstituentsoftheChineseCrudeDrug"wujiapi，，.IX.StructureofGlycosideH2，aPotentiatorofNGF-mediatedNerveFiberOutgrowth.ChemPharmBull,1980，28(1):163117jKaoruUmehara，NaomiSumn(neeshirasu)，HirokoSatoh,etal.StudiesonDifferentiationInducers.V.SteroidGlycosidesfromPeriplocaeRadicisCortex.ChemPharmBull,1995,43(9):15U8j丁雁，邢善田，周金黄.淫羊藿多糖促进小鼠T和B细胞3H-TdR参入和诱生干扰素作用的研究.中国免疫学杂志.1985，l(6):42-419]ZaloomY，WalshLP,McCullochP,etal.Enhancementofadelayedhypersensitivityreactiontoacontactallergen,bythesystemicadministrationofinterleukin-2.Immunology.1991，72(4):584-587120j李仪奎.中药药理实验方法学[MI.上海上海科学技术出版社1991，300[211陈奇.中药药理研究方法学Mj.北京人民卫生出版社，1993，446[22方鉴，张永祥，实祥斌，等.佐剂性关节炎大鼠免疫功能的实验研究.中国免疫学杂志.2000，16(10):525-528|23jHolmdahlR，JanssonL,GullbergD,etc.Incidenceofarthritisandautoreactivityofanti-collagenantibodiesafterimmunizationofDBA/1micewithheterologousandautologouscollagen11.ClinExpImmunol.1985,62(3):639-646.权利要求1.从黑骨藤中提取得到的多糖提取物，其主要成分为由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸以不同摩尔比组成的多种均一分子量多糖，其分子量分布为4×103～2.7×105，包括0.41×104、1.06×104、0.64×104、0.56×104、1.36×104和1.54×104的多糖。2.根据权利要求l的黑骨藤多糖提取物，其中通过联用间羟基联苯法与苯酚-疏酸法测定时，所述多糖以葡萄糖计占该多糖提取物重量的47.05~49.23%。3.根据权利要求1或2的黑骨藤多糖提取物，它是通过包括以下步骤的方法提取得到的i)将黑骨藤药材用低级醇提取一次或多次；ii)在所得药渣中加水提取一次或多次；iii)将所得全部水提液浓缩至适当体积后采用低级醇沉淀一次或多次；并且iv)将沉淀部分加水溶解并浓缩除醇，冷冻干燥即得到所述多糖提取物。4.根据权利要求3的黑骨藤多糖提取物，其中所述方法中使用的低级醇为低级链烷醇，并且浓度为60%至100v/v%。5.—种药物组合物，它包含权利要求1或2的黑骨藤多糖提取物和一种或多种药用载体。6.—种制备权利要求1或2的黑骨藤多糖提取物的方法，它包括如下步骤i)将黑骨藤药材用低级醇提取一次或多次；ii)在所得药渣中加水提取一次或多次；iii)将所得全部水提液浓缩至适当体积后采用低级醇沉淀一次或多次；iv)将沉淀部分加水溶解并浓缩除醇，冷冻干燥即得到所述多糖提取物。7.根据权利要求6的方法，它还包括在步骤iv)后再用低级醇沉淀处理所得多糖提取物的步骤。8.根据权利要求6或7的方法，其中所述低级醇为低级链烷醇，并且浓度为60%至100v/v%。9.权利要求1或2的黑骨藤多糖提取物在制备用于治疗炎性疾病、疼痛或自身免疫性疾病的药物中的用途。10.根据权利要求9的用途，其中所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、白塞氏病、自身免疫性肝炎或免疫性血管病。全文摘要本发明涉及黑骨藤的多糖提取物、含有它的药物组合物及其制备方法和用途。该黑骨藤多糖的主要成分为由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸以不同摩尔比组成的多种均一分子量多糖，其分子量分布为4×10³～2.7×10⁵，包括0.41×10⁴、1.06×10⁴、0.64×10⁴、0.56×10⁴、1.36×10⁴和1.54×10⁴的多糖。本发明的多糖、多糖提取物或含有它的药物组合物在治疗炎性疾病、疼痛或自身免疫性疾病中具有良好的应用前景。文档编号A61K36/27GK101480419SQ200710188099公开日2009年7月15日申请日期2007年11月23日优先权日2007年11月23日发明者乔善义,吴荣荣,周文霞,磊孙,张小锐,张永祥,赵毅民,齐春会申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所