使用抗人il-22抗体的方法

专利名称：使用抗人il-22抗体的方法
技术领域：
本发明涉及结合白介素-22(IL-22)，特别是结合人IL-22的抗体(例如人抗体)及其抗原结合片段，还涉及所述抗体及其抗原结合片段在调节与IL-22相关的活性中的用途。文中所公开的抗体用于诊断、预防和/或治疗与IL-22相关的病症，例如包括关节炎的自身免疫病。

背景技术：
抗原引发免疫应答并激活两类最大的淋巴细胞群体T细胞及B细胞。接触抗原后，T细胞增生并分化成效应细胞，而B细胞增生且分化成分泌抗体的浆细胞。这些效应细胞分泌细胞因子和/或对细胞因子应答，该细胞因子是由淋巴细胞及其它细胞类型分泌的小蛋白质(<约30kDa)。
白介素-22(IL-22)为显示出与IL-10序列同源的II类细胞因子。其在T细胞内的表达通过IL-9或ConA而上调(Dumoutier L.等人，(2000)Proc NatlAcad Sci USA 97(18)10144-9)。进一步研究已证明响应于LPS投药，IL-22mRNA的表达在体内被诱导，且已证明IL-22调节预示急性期反应的参数(Dumoutier L.等人，(2000)；Pittman D.等人，(2001)Genes and Immunity 2172)。此外，IL-22增强与宿主防御有关的抗微生物肽(其包括β-防卫素、S100A7、S100A8及S100A)的表达。Wolk等人，Immunity，21241-54(2004)；Boniface等人，J.Immunol.1743695-3702(2005)；Liang等人，J.Exp.Med.，203(10)2271-79(2006)。总之，这些观察资料显示IL-22在炎症中发挥作用(Kotenko S.V.(2002)Cytokine & Growth Factor Reviews13(3)223-40)。
据信IL-22结合至由IL-22R及IL-10R2(II型细胞因子受体家族(CRF2)的两成员)组成的受体复合物(Xie M.H.等人(2000)J Biol Chem 275(40)31335-9；Kotenko S.V.等人(2001)JBiol Chem 276(4)2725-32)。该IL-22受体的这两条链在许多器官中组成型表达。衍生自这些器官的上皮细胞系体外响应IL-22(Kotenko S.V.(2002)Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3)223-40)。IL-22诱导JAK/STAT3及ERK途径的激活，以及诱导其它MAPK途径的中间物的激活(Dumoutier L.等人(2000)，同上；Xie M.H.等人(2000)，同上；Dumoutier L.等人(2000)J Immunol 164(4)1814-9；Kotenko S.V.等人(2001)J Biol Chem 276(4)2725-32；Lejeune，D.等人(2002)J Biol Chem277(37)33676-82)。
CRF2成员为以下因子的受体INFα/β、IFNγ、凝血因子(coagulationfactor)VIIa、IL-10及该IL-10相关蛋白质IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26，以及最近鉴定的IFN样细胞因子IL-28及IL-29(Kotenko S.V.(2002)Cytokine& Growth Factor Reviews 13(3)223-40；Kotenko，S.V.等人(2000)Oncogene19(21)2557-65；Sheppard，P.等人(2003)Nature Immunology 4(1)63-8；Kotenko，S.V.等人(2003)Nature Immunology 4(1)69-77)。除这些膜受体外，CRF2家族也包括对IL-22具有特异性且可阻断IL-22活性的可溶性蛋白质，IL-22结合蛋白(IL-22BP)(Dumoutier，L.等人(2001)J Immunol 166(12)7090-5；Kotenko，S.V.等人(2001)JImmunol 166(12)7096-103；Xu，W.等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98(17)9511-6；Gruenberg，B.H.等人(2001)Genes & Immunity 2(6)329-34；Wei C-C等人(2003)Gene & Immunity4204-211)。虽然IL-22受体复合物对IL-22是唯一的，但是各条链(亦即IL-22R及IL-10R2)与其它CRF2成员参与定义其它细胞因子(包括IL-20、IL-24(IL-22R/IL-20R2)、IL-28、IL-29(IFN-λR1/IL-10R2)及IL-10(IL-10R1/IL-10R2))的功能性受体(Dumoutier，L.等人(2001)J.Immunol.167(7)3545-9；Wang，M.等人(2002)J Biol Chem 277(9)7341-7；Parrish-Novak，J.等人(2002)J Biol Chem 277(49)47517-23；Kotenko，S.V.等人(1997)EMBO J.16(19)5894-903；Spencer，S.D.等人(1998)J Exp Med187(4)571-8)。
由CRF2组成的受体的两条链均为信号转导所必需。组成的受体的其中一条链根据其对该细胞因子的高亲和性，传统上已被定义为配体结合链(例如IFNγR1)。另一链(例如IFNγR2)已描述为辅助链或副链，且其单独对细胞因子仅具有极微亲和性(Kotenko，S.V.等人(2000)Oncogene19(21)2557-65)。就IL-22而言，IL-22R为高亲和性受体亚基，且随后IL-10R2结合至IL-22/IL-22R复合物(Li，J.等人(2004)Int.Immunopharmacol.4(5)673-708；Logsdon，N.J.等人(2002)J.Interferon Cytokine Res 22(11)1099-1112)。


发明内容
本申请至少部分地提供了结合至白介素-22(“IL-22”)，特别是结合至人IL-22的具有高亲和性及特异性的IL-22结合剂，诸如抗体及其抗原结合片段。本发明抗体及其抗原结合片段在文中也分别称为“抗IL-22抗体”及“其片段”。在一个实施方案中，抗体或其片段减少、抑制或拮抗IL-22活性。此类抗体可通过拮抗IL-22活性而用以调节免疫应答或与IL-22相关的病症。在其它实施方案中，可诊断性地使用抗IL-22抗体或该抗IL-22抗体可作为靶标抗体以将治疗或细胞毒剂递送至表达IL-22的细胞。因此，本发明抗IL-22抗体适用于诊断、治疗和/或预防与IL-22相关的病症，例如自身免疫病症，例如关节炎(其包括类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎，与狼疮有关的关节炎或强直性脊椎炎)、硬皮病、系统性红斑狼疮、HIV、舍格伦综合征、血管炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(其包括特应性皮炎及湿疹性皮炎)、重症肌无力、炎症性肠病(IBD)、节段性回肠炎、结肠炎、糖尿病(I型)；炎症例如皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统的炎症(例如阿尔茨海默病)、肝的炎症(例如肝炎)、肾的炎症(例如肾炎)及胰脏的炎症(例如胰腺炎)；心血管疾病，例如胆固醇代谢病、氧自由基损伤、局部缺血；与创伤愈合相关的病症；呼吸系统病症，例如哮喘及COPD(例如囊性纤维化)；急性炎症(例如内毒素血症、脓毒症及败血症、中毒性休克综合征及感染性疾病)；移植排斥及过敏。在一个实施方案中，与IL-22相关的病症为关节炎的病症，例如选自以下一种或多种的病症类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎或强直性脊椎炎；呼吸系统病症(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD))；或例如皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统的炎症(例如阿尔茨海默病)、肝的炎症(例如肝炎)、肾的炎症(例如肾炎)、胰脏的炎症(例如胰腺炎)，及胃肠器官的炎症，例如结肠炎、节段性回肠炎及IBD。
因此，一方面，本发明的特征是结合至IL-22，特别是结合至人IL-22的分离的抗体。在特定实施方案中，抗IL-22抗体可具有至少一种以下特征(1)其是单克隆或单特异性抗体；(2)其是人抗体；(3)其是体外产生的抗体；(4)其是体内产生的抗体(例如转基因系统)；(5)其以至少1012M-1的结合常数与IL-22结合；(6)其以至少1011M-1的结合常数结合至IL-22；(7)其以至少1010M-1的结合常数结合至IL-22；(8)其以至少109M-1的结合常数结合至IL-22；(9)其以至少106M-1的结合常数结合至IL-22；(10)其以500nM或较低的解离常数结合至IL-22；(11)其以10nM或较低的解离常数结合至IL-22；(12)其以150pM或较低的解离常数结合至IL-22；(13)其以60pM或较低的解离常数结合至IL-22；(14)其以10nM或较低的IC50抑制IL-22结合至IL-22R或IL-22R及IL-10R2的受体复合物；(15)在一个实施方案中，其以1nM或较低的IC50，在另一个实施方案中，其以150pM或较低的IC50，在另一个实施方案中，其以100pM或较低的IC50，且在另一个实施方案中，其以10pM或较低的IC50阻断IL-22受体改造的BaF3细胞经IL-22调节的增生；及(16)在一个实施方案中，其以1nM或较低的IC50，在另一个实施方案中，其以150pM或较低的IC50，且在另一个实施方案中，其以10pM或较低的IC50阻断IL-22调节的自HT29细胞分泌GROa。可以如以下实施例中所述测定IL-22调节的BaF3细胞增生及IL-22调节的自HT29细胞分泌的GROa。
本发明抗体非限制性的说明性实施例在文中称为“GIL01”、“GIL16”、“GIL45”、“GIL60”、“GIL68”、“GIL92”、“097D09”、“062A09”、“062G05”、“087B03”、“367D04”、“368D04”、“166B06”、“166G05”、“375G06”、“376B10”、“354A08”、“355B06”、“355E04”及“356A11”。这些抗体可以被种系化(germlined)或非种系化。在另一个实施方案中，该抗体选自356A11、354A08、087B03及368D04。本发明抗体可特异性结合至GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11所结合的相同IL-22表位或类似表位(例如重叠表位)。在其它实施方案中，抗体特异性结合至IL-22的片段，例如SEQ ID NO1所示氨基酸序列的具有至少10、20、50、75、100、150或200个氨基酸的连续片段或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。在另一个实施方案中，该抗体竞争性地抑制GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11中的至少一种结合至其靶表位。
在一个实施方案中，本发明抗体包括GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的FV片段的VH结构域、VL结构域或其组合。例如抗体包括的VH和/或VL结构域，该的VH和/或VL结构域具有如表1及7(就VH而言，SEQ ID NO5、23、41、59、77、95、113、131、149、167、185、203、221、239、257、275、293、311、329、347、365、383、401、419、437、455、473、491、509、527、545、563、581、599或617；及就VL而言，SEQ ID NO6、24、42、60、78、96、114、132、150、168、186、204、222、240、258、276、294、312、330、348、366、384、402、420、438、456、474、492、510、528、546、564、582、600或618)中所示的氨基酸序列或实质上与其相同的序列(例如至少与其具有约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列或与SEQ ID NO5、6、23、24、41、42、59、60、77、78、95、96、113、114、131、132、149、150、167、168、185、186、203、204、221、222、239、240、257、258、275、276、293、294、311、312、329、330、347、348、365、366、383、384、401、402、419、420、437、438、455、456、473、474、491、492、509、510、527、528、545、546、563、564、581、582、599、600、617或618的差异不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的序列)。
在另一个实施方案中，本发明抗体包括选自356A11、354A08、087B03及368D04的抗体的FV片段的VH结构域、VL结构域或其组合。在本实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包括 含SEQ ID NO167或491中所示氨基酸序列的VH结构域和/或含SEQ IDNO168及492中所示氨基酸序列的VL结构域(087B03)； 含SEQ ID NO293或545中所示氨基酸序列的VH结构域和/或含SEQ IDNO294或546所示氨基酸序列的VL结构域(354A08)； 含SEQ ID NO203或617中所示氨基酸序列的VH结构域和/或含SEQ IDNO204或618中所示氨基酸序列的VL结构域(368D04)；或 含SEQ ID NO347或599中所示氨基酸序列的VH结构域和/或含SEQ IDNO348或600中所示氨基酸序列的VL结构域(356A11)。
在另一个实施方案中，抗体包括由下述核酸编码的VH和/或VL结构域，该核酸具有如表1及7(就VH而言，SEQ ID NO14、32、50、68、86、104、122、140、158、176、194、212、230、248、266、284、302、320、338、356、374、392、410、428、446、464、482、500、518、536、554、572、590、608或626，且就VL而言，SEQ ID NO15、33、51、69、87、105、123、141、159、177、195、213、231、249、267、285、303、321、339、357、375、393、411、429、447、465、483、501、519、537、555、573、591、609或627)中所示核苷酸序列或实质上与其相同的核苷酸序列(例如与其具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列或与SEQ ID NO14、15、32、33、50、51、68、69、86、87、104、105、122、123、140、141、158、159、176、177、194、195、212、213、230、231、248、249、266、267、284、285、302、303、320、321、338、339、356、357、374、375、392、393、410、411、428、429、446、447、464、465、482、483、500、501、518、519、536、537、554、555、572、573、590、591、608、609、626或627的差异不超过1、2、3、6、15、30或45个核苷酸的核苷酸序列)。
在其它实施方案中，抗体包括FV结构域，其具有如表1及7(SEQ IDNO7、25、43、61、79、97、115、133、151、169、187、205、223、241、259、277、295、313、331、349、367、385、403、421、439、457、475、493、511、529、547、565、583、601或619)中所示氨基酸序列或实质上与其相同的氨基酸序列(例如与其具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列或与SEQ ID NO7、25、43、61、79、97、115、133、151、169、187、205、223、241、259、277、295、313、331、349、367、385、403、421、439、457、475、493、511、529、547、565、583、601或619的差异不超过1、2、5、10、15、20、30或35个氨基酸残基的序列)。在另一个实施方案中，本发明抗体包括选自356A11(SEQ IDNO349或601)、354A08(SEQ ID NO295或547)、087B03(SEQ ID NO169或493)及368D04(SEQ ID NO205或619)的抗体的FV结构域。在另一个实施方案中，抗体包括由下述核酸编码的FV结构域，即该核酸具有如表1及7(SEQ ID NO16、34、52、70、88、106、124、142、160、178、196、214、232、250、268、286、304、322、340、358、376、394、412、430、448、466、484、502、520、538、556、574、592、610或628)中所示核苷酸序列或实质上与其相同的核苷酸序列(例如与其具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列或与SEQ ID NO16、34、52、70、88、106、124、142、160、178、196、214、232、250、268、286、304、322、340、358、376、394、412、430、448、466、484、502、520、538、556、574、592、610或628的差异不超过1、2、3、6、15、30、45、60、90或105个核苷酸的序列)。在又一个实施方案中，该抗体包含这些VH及VL结构域中的至少一个互补决定区(CDR)。例如抗体可包括VH结构域的1、2或3个CDR，该VH结构域具有如表1及7(SEQ ID NO5、7、8、9、10、23、25、26、27、28、41、43、44、45、46、59、61、62、63、64、77、79、80、81、82、95、97、98、99、100、113、115、116、117、118、131、133、134、135、136、149、151、152、153、154、167、169、170、171、172、185、187、188、189、190、203、205、206、207、208、221、223、224、225、226、239、241、242、243、244、257、259、260、261、262、275、277、278、279、280、293、295、296、297、298、311、313、314、315、316、329、331、332、333、334、347、349、350、351、352、365、367、368、369、370、383、385、386、387、388、401、403、404、405、406、419、421、422、423、424、437、439、440、441、442、455、457、458、459、460、473、475、476、477、478、491、493、494、495、496、509、511、512、513、514、527、529、530、531、532、545、547、548、549、550、563、565、566、567、568、581、583、584、585、586、599、601、602、603、604、617、619、620、621或622)中所公开或表1及7中这些序列所包含的氨基酸序列或实质上与其同源的氨基酸序列(例如与其具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)。在另一个实施方案中，本发明抗体包括选自356A11、354A08、087B03及368D04的抗体的VH结构域的1、2或3个CDR。在本实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含 a)SEQ ID NO170或494；b)SEQ ID NO171或495；和/或c)SEQ IDNO172或496(087B03)； a)SEQ ID NO296或548；b)SEQ ID NO297或549；和/或c)SEQ IDNO298或550(354A08)； a)SEQ ID NO206或620；b)SEQ ID NO207或621；和/或c)SEQ IDNO208或622(368D04)；或 a)SEQ ID NO350或602；b)SEQ ID NO351或603；和/或c)SEQ IDNO352或604(356A11)。
在另一个实施方案中，该抗体可包括VL结构域的1、2或3个CDR，该VL结构域具有如表1及7(SEQ ID NO6、7、11、12、13、24、25、29、30、31、42、43、47、48、49、60、61、65、66、67、78、79、83、84、85、96、97、101、102、103、114、115、119、120、121、132、133、137、138、139、150、151、155、156、157、168、169、173、174、175、186、187、191、192、193、204、205、209、210、211、222、223、227、228、229、240、241、245、246、247、258、259、263、264、265、276、277、281、282、283、294、295、299、300、301、312、313、317、318、319、330、331、335、336、337、348、349、353、354、355、366、367、371、372、373、384、385、389、390、391、402、403、407、408、409、420、421、425、426、427、438、439、443、444、445、456、457、461、462、463、474、475、479、480、481、492、493、497、498、499、510、511、515、516、517、528、529、533、534、535、546、547、551、552、553、564、565、569、570、571、582、583、587、588、589、600、601、605、606、607、618、619、623、624或625)中所公开或表1及7中的这些序列所包含的氨基酸序列或实质上与其相同的氨基酸序列(例如与其具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)。在另一个实施方案中，本发明抗体包括一种选自356A11、354A08、087B03及368D04的抗体的VL结构域的1、2或3个CDR。在本实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其包含 a)SEQ ID NO173或497；b)SEQ ID NO174或498；和/或c)SEQ IDNO175或499(087B03)； a)SEQ ID NO299或551；b)SEQ ID NO300或552；和/或c)SEQ IDNO301或553(354A08)； a)SEQ ID NO209或623；b)SEQ ID NO210或624；和/或c)SEQ IDNO211或625(368D04)；或 a)SEQ ID NO353或605；b)SEQ ID NO354或606；和/或c)SEQ ID NO355或607(356A11)。
在另外的实施方案中，抗体包含GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的VH结构域的H3片段，例如具有如表1及7(SEQ ID NO10、28、46、64、82、100、118、136、154、172、190、208、226、244、262、280、298、316、334、352、370、388、406、424、442、460、478、496、514、532、550、568、586、604或622)中所示氨基酸序列或实质上与其相同的氨基酸序列(例如与其具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)的H3片段。
本发明抗体可以是全长(例如包括至少一个完全的重链及至少一个完全的轻链)或可仅包括抗原结合片段(例如Fab、F(ab′)2、FV、单链FV片段、Fd片段或dAb片段)。该抗体可包括选自以下任一种的恒定区或其部分κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恒定区基因。例如可使用包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE的各种同种型的重链恒定区。轻链恒定区可选自κ或λ。抗体可以是IgG或其也可以是IgG1κ或IgG1λ。
文中所述抗IL-22抗体可被衍生或与另一种功能性分子(诸如另一个肽或蛋白质(例如Fab片段))连接。例如本发明的抗体可以与至少一种其它分子实体功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价联合或其它方法)，该其它分子实体诸如另一种抗体(例如双特异性或多重特异性抗体)、毒素、放射性同位素、细胞毒剂或细胞生长抑制剂等等。
本发明的另一方面提供含至少一种抗IL-22抗体及可药用载体的药物组合物。该药物组合物还可包括至少一种抗IL-22抗体及至少一种治疗剂(例如，如文中详述的细胞因子及生长因子抑制剂、免疫抑制剂、消炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞素剂、细胞生长抑制剂或其组合)的组合。抗IL-22抗体及治疗剂的组合也属于本发明的范围。本发明组合物及组合可用以调节与IL-22有关的炎症，例如通过位于除潜在活化及组织局限性免疫细胞之外的各种组织的上皮细胞(包括但不限于胰脏、皮肤、肺、肠、肝、肾、唾液腺及血管内皮的上皮细胞)上的其受体而调节IL-22的信号传送。
本发明的另一方面提供治疗罹患与IL-22相关的病症的受试者的方法。该方法包括向病患施用抗IL-22抗体，其施用量足以抑制免疫细胞的至少一种IL-22活性，从而治疗与IL-22相关的病症。
该抗IL-22抗体可单独或与如文中所述的其它治疗剂一起向受试者施用。该受试者可以是哺乳动物，例如人类。例如可使用该方法以治疗罹患与IL-22相关的病症的受试者，该与IL-22相关的病症诸如自身免疫病症，例如关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎，与狼疮有关的关节炎或强直性脊椎炎)、硬皮病、系统性红斑狼疮、HIV、舍格伦综合征、血管炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(其包括特应性皮炎及湿疹性皮炎)、重症肌无力、炎症性肠病(IBD)、节段性回肠炎、结肠炎、糖尿病(I型)；炎症例如皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统的炎症(例如阿尔茨海默病)、肝的炎症(例如肝炎)、肾的炎症(例如肾炎)及胰脏的炎症(例如胰腺炎)；心血管疾病，例如胆固醇代谢病、氧自由基损伤、局部缺血；与创伤愈合相关的病症；呼吸系统病症，例如哮喘及COPD(例如囊性纤维化)；急性炎症(例如内毒素血症、脓毒症及败血症、中毒性休克综合征及感染性疾病)；移植排斥及过敏。在一个实施方案中，与IL-22相关的病症为关节炎，例如选自以下一种或多种的关节炎病症类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎或强直性脊椎炎；呼吸系统病症(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD))；或炎症，例如皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统的炎症(例如阿尔茨海默病)、肝的炎症(例如肝炎)、肾的炎症(例如肾炎)、胰脏的炎症(例如胰腺炎)，及胃肠器官的炎症，例如结肠炎、节段性回肠炎及IBD。
本发明的另一方面提供降低、抑制或减少受试者体内的急性期反应的方法。该方法包括向受试者施用IL-22结合剂，例如IL-22拮抗剂(例如，如文中所述的抗IL-22抗体或其片段)，其施用量足以降低、抑制或减少受试者体内的急性期反应。在一个实施方案中，该受试者为哺乳动物，例如罹患与IL-22相关的病症(包括例如呼吸系统病症、炎症及自身免疫病症)的人类。在一个实施方案中，该IL-22结合剂是局部施用，例如局部，皮下或非用在全身循环中的其它投药法。
在另一方面中，可使用IL-22结合剂以改变免疫应答的类型和/或增加用于免疫受试者的疫苗制剂的效力。例如本发明抗IL-22抗体可以在免疫前、期间和/或其后施用以增加疫苗效力。在一个实施方案中，该疫苗制剂含有一或多种IL-22拮抗剂及抗原，也即免疫原，其包括例如病毒、细菌或肿瘤抗原。在另一个实施方案中，该IL-22拮抗剂及免疫原分别施用，例如相隔不到一小时、三小时、一天或两天。
本发明另一方面提供一种体外检测样品中存在IL-22的方法。样品可包括生物样品，诸如血清、血浆、组织及活组织检查物。该主题方法可用以诊断病症，诸如如文中所述的与IL-22相关的病症。该方法包括(1)将抗IL-22抗体接触该样品或对照物样品，及(2)检测该抗IL-22抗体与样品或对照物样品间的复合物形成，其中相对于对照物样品，样品内形成的复合物在统计学上的显著变化表示IL-22存在于该样品中。
本发明另一方面提供一种体内检测IL-22存在的方法(例如在受试者体内成像)。该方法可用以诊断病症，例如如文中所述的与IL-22相关的病症。该方法包括(1)于可以使抗体与IL-22结合的条件下，向受试者或对照受试者施用抗IL-22抗体，及(2)检测抗体及IL-22间的复合物形成，其中相对于对照(例如对照受试者)，复合物在受试者体内形成的统计学上的显著变化表示存在IL-22。
抗体可直接或间接经可检测物质标记以有利于结合或未结合抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料及放射性材料。
本发明另一方面提供一种体内将药剂，例如治疗剂或细胞毒剂递送或靶向至表达IL-22的细胞的方法。该方法包括于可以使该抗体与IL-22结合的条件下向受试者施用抗IL-22抗体。该抗体可以与诸如毒素的第二治疗部分偶联。
本公开内容提供得自GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11的VH及VL结构域的核酸序列。也提供含来自GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11的至少一个CDR的核酸序列。本公开内容也提供含此类核酸的载体及宿主细胞。
本公开内容进一步提供制备新VH及VL结构域及含衍生自GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的VH或VL结构域的此类结构域的所有及部分的功能性抗体的方法。
本发明的另外方面部分地公开于本说明书中，且部分地可根据本说明书而明了，或可通过实践本发明而了解。在权利要求中公开并特别指明本发明，且本公开内容不应被视为对权利要求的限制。以下详细说明包括本发明各实施方案的例证代表，如所申请，其并未非对本发明进行限制。以下附图构成本申请的一部分，且与本说明书一起仅用以阐明实施方案而非限制本发明。



图1.亲本抗IL-22scFv克隆在IL-22受体复合物试验(生物IL-22结合IL-22受体复合物DELFIA竞争性试验)中的效价。
图2A-G.在IL-22受体复合物试验(生物IL-22结合IL-22受体复合物DELFIA竞争性试验)中先导(lead)scFv克隆的分析图。(A)GIL1所衍生的。(B)GIL16所衍生的。(C)GIL16、GIL60及GIL68所衍生的。(D)GIL60所衍生的。(E)GIL68所衍生的。(F)GIL68所衍生的。(G)GIL92所衍生的。
图3.在基于GROa细胞的分析中IgG的效价。在hulL-22GROa分析中最优化的GIL-IgG。(A)种系化的IgG。(B)非种系化的IgG。
图4.通过ELISA分析的IL-22抗体的物种间反应性。最优化GIL-IgG特异性地与IL-22结合。(A)种系化的IgG。(B)非种系化的IgG。
图5.人IL-22的氨基酸及核苷酸序列。人IL-22的核苷酸序列为SEQ IDNO2且包括聚(A)尾。所公开核苷酸序列包括开放阅读框，且相应于前述核苷酸序列的全长IL-22蛋白质的氨基酸序列记录在SEQ ID NO1中。成熟IL-22的氨基酸序列相应于SEQ ID NO1的大约34-179位氨基酸。
图6.小鼠IL-22的氨基酸及核苷酸序列。
图7.非种系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11的氨基酸及核苷酸序列，其包括VH与VL结构域，以及CDR(H1、H2、H3、L1、L2及L3)。
图8.种系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04的氨基酸及核苷酸序列，其包括VH与VL结构域，以及CDR(H1、H2、H3、L1、L2及L3)。
图9.CDR(H1、H2、H3、L1、L2及L3)用下划线标出的非种系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11的scFv’s的氨基酸及核苷酸序列。
图10.具有CDR(H1、H2、H3、L1、L2及L3)用下划线标出的种系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04的scFv’s的氨基酸及核苷酸序列。
图11A-B.(A)356A11及(B)368D04的体内半衰期。
图12A-B.在鼠CIA模型中，每隔一天施用各种剂量的356A11的平均疾病严重性得分(A)或疾病严重性得分(B)。
图13A-D.在多次研究的鼠CIA模型中，每隔一天施用8mg/kg的356A11的平均疾病严重性得分。
图14A-B.在鼠CIA模型中，每周一次或两次施用8mg/kg的356A11的平均疾病严重性得分。
图15A-B.得自在鼠CIA模型中，每隔一天、每周两次或每周一次施用8mg/kg的356A11的两个分别研究的疾病严重性得分。
图16A-F.在鼠CIA模型中，使用(A)每隔一天施用8mg/kg的356A11或(B)每隔一天施用16mg/kg的356A11，(C)每隔一天、每周一次或每周两次施用8mg/kg的356A11，(D)每周一次施用8mg/kg的356A11，(E)每周两次施用8mg/kg的356A11或(F)每隔一天施用8mg/kg的356A11，治疗的小鼠在多次研究中进行疾病演变的组织学评估(脚爪)。
图17.在经356A11治疗的关节炎小鼠中进行体内IL-22(ng/mL)的检测及稳定性。
图18.在施用同种型对照抗体的关节炎小鼠中进行体内IL-22(ng/mL)的检测。
图19.IL-22及IL-22R蛋白质在人类牛皮癣性损害中的上调。
图20.在牛皮癣的鼠模型中，对经16mg/kg的356A11、368D04或对照抗体治疗的小鼠进行疾病评估。(A)进行10周的临床疾病演变。(B)10周的临床得分。
图21.在经16mg/kg的356A11、368D04或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠中进行体内IL-22血清含量(pg/mL)的检测。
图22.在经16mg/kg的356A11、368D04或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠中进行体内(A)IL-17A、(B)IL-17F、(C)IL-17A/F及(D)IL-6血清含量的检测。
图23.分离自经16mg/kg的356A11、368D04或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠，经PMA及离子霉素处理并对IL-22及IL-17A；IL-22及IL-17F；IL-17A及IL-17F；IL-22及TNFα；IL-22及INFγ或TNFα及IFNγ进行染色后的所汇集CD4+淋巴结细胞的流式细胞术分析。
图24.在16mg/kg的356A11、368D04或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠耳的细胞因子的基因表达。(A)IL-22。(B)IL-17。(C)IFNγ。(D)IL-17F。(E)IL-16。
图25.在从16mg/kg的356A11、368D04或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠分离的并采用或未采用平皿结合性(platebound)，抗CD3抗体离体刺激的所汇集淋巴结细胞的上清液中进行细胞因子检测。(A)IL-22。(B)IL-16。(C)IFNγ。(D)IL-17F。(E)IL-17A/F。(F)IL-17A。
图26.在从16mg/kg的356A11、368D04或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠分离，并经平皿结合性抗CD3抗体离体刺激所汇集淋巴结细胞中的细胞因子的基因表达。(A)IL-22。(B)IL-6。(C)IFNγ。(D)IL-17F。(E)IL-17A。
图27.在牛皮癣的鼠模型中，对16mg/kg的356A11或对照抗体治疗的小鼠进行疾病评估。于T细胞过继转移后第一天以IL-12及LPS处理小鼠。(A)以10周评估临床疾病演变。(B)10周的临床得分。
图28.在16mg/kg的356A11或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠中进行体内IL-22血清含量(ng/mL)的检测。于T细胞过继转移后第一天，以IL-12及LPS处理小鼠。
图29.在16mg/kg的356A11或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠中进行体内(A)IL-17A、(B)IL-17F、(C)IL-17A/F及(D)IL-6血清含量的检测。于T细胞过继转移后第一天以IL-12及LPS处理小鼠。
图30.在16mg/kg的356A11或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠耳的细胞因子的基因表达。(A)IL-17。(B)IL-22。(C)IL-17F。(D)IFNγ。(E)IL-6。于T细胞过继转移后第一天以IL-12及LPS处理小鼠。
图31.自16mg/kg的356A11或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠分离后，经PMA及离子霉素处理，并对IL-22及IL-17A；IL-22及IL-17F；IL-17A及IL-17F；IL-22及TNFα；IL-22及IFNγ或TNFα及IFNγ进行染色后的所汇集CD4+淋巴结细胞的流式细胞术分析。于T细胞过继转移后第一天以IL-12及LPS处理小鼠。
图32.在从16mg/kg的356A11或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠分离，并采用或未采用平皿结合性抗CD3抗体离体刺激所汇集淋巴结细胞上清液中进行细胞因子检测。(A)IL-22。(B)IL-6。(C)IFNγ。(D)IL-17A。(E)IL-17F。于T细胞过继转移后第一天以IL-12及LPS处理小鼠。
图33.在从16mg/kg的356A11或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠分离，并经平皿结合性抗CD3抗体离体刺激的所汇集淋巴结细胞内细胞因子的基因表达。(A)IL-22。(B)IL-6。(C)IFNγ。(D)IL-17A。(E)IL-17F。于T细胞过继转移后第一天以IL-12及LPS处理小鼠。
图34.在牛皮癣的鼠模型中，对16mg/kg的356A11或对照抗体治疗的小鼠进行疾病评估。(A)以10周评估临床疾病演变。(B)10周的临床得分。
图35.对16mg/kg的356A11或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠进行体内IL-22血清含量(ng/mL)的检测。
图36.在16mg/kg的356A11或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠耳的细胞因子基因表达。(A)IL-22、(B)IL-17、(C)IL-17F、(D)IL-1F6(IL-1家族成员6)、(E)IL-6、(F)IFNγ、(G)IL-22BP(IL-22结合蛋白质)或(H)IL-22R1(IL-22受体亚基)。
图37.在牛皮癣的鼠模型中，对16mg/kg的356A11或对照抗体治疗的小鼠进行疾病评估。(A)以10周评估疾病演变。(B)10周的临床得分。于T细胞过继转移后第一天以IL-12及LPS处理小鼠。
图38.对16mg/kg的356A11或对照抗体治疗的牛皮癣小鼠进行体内IL-22血清含量(ng/mL)检测。于T细胞过继转移后第一天以IL-12及LPS处理小鼠。
图39.对16mg/kg的356A11或对照抗体(未共施用IL-12及LPS)治疗的牛皮癣小鼠进行体内(A)IL-17A及(B)IL-6血清含量的检测及对经16mg/kg的356A11或对照抗体(于T细胞过继转移后第一天共施用IL-12及LPS)治疗的牛皮癣小鼠进行体内(C)IL-17A及(D)IL-6血清含量的检测。
图40.在鼠CIA模式中，每隔一天施用16mg/kg的356A11，第30天时的(A)平均疾病严重性得分或(B)疾病严重性得分。
图41.在鼠CIA模式中，每隔一天、每周一次或每周两次施用8mg/kg的356A11的平均疾病严重性得分。
图42.对经(A)每周一次施用8mg/kg的356A11，(B)每周两次施用8mg/kg的356A11或(C)每隔一天施用8mg/kg的356A11治疗的小鼠进行疾病演变的组织学评估(脚爪)。
图43.对经每周一次、每周两次或每隔一天施用8mg/kg的356A11治疗的小鼠进行疾病演变的组织学评估(平均脚爪严重性得分)。
图44A-B.在鼠CIA模式中，得自每周一次施用8mg/kg的356A11的两个分别研究的平均疾病严重性得分。
图45A-B.在鼠CIA模式中，得自每周一次施用8mg/kg356A11治疗的小鼠的两个分别研究的疾病演变的组织学评估(脚爪)。
图46A-C.在鼠CIA模式中，得自每周一次施用8mg/kg的368D04的3个分别研究的平均疾病严重性得分。
图47A-C.在鼠CIA模式中，得自每周一次施用8mg/kg 368D04治疗的小鼠的3个分别研究的疾病演变的组织学评估(脚爪)。
图48.在鼠CIA模式中，得自经356A11(每周8mpk)治疗的小鼠的(A)IL-6(pg/ml)及(B)CXCL1(ng/ml)的血清含量。

具体实施例方式 I.定义 为了使本发明更容易被理解，首先定义某些术语。其它定义在整个详细说明书中公开。
术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段，且包括含抗原结合片段或抗原结合结构域的任何多肽。该术语包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体及体外产生的抗体。除非词组“完整的”位于前面修饰，否则术语“抗体”包括抗体片段，诸如Fab、F(ab′)2、FV、scFV、Fd、dAb及仍保持抗原结合作用的其它抗体片段。通常此类片段包含抗原结合结构域。
术语“抗原结合结构域”及“抗原结合片段”是指含对抗体与抗原间特异性结合起作用的氨基酸的抗体分子的一部分。特异性地由抗体识别并结合的抗原部分称为“表位”。抗原结合结构域可包含抗体轻链可变区(VL)及抗体重链可变区(VH)；然而其不必要两种都包含。例如Fd片段具有两个VH区域且通常仍保留完整抗原结合结构域的部分抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)Fab片段，其是具有VL、VH、CL及CH1结构域的单价片段；(2)F(ab′)2片段，其是具有由铰链区内二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(3)具有两个VH及CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL及VH结构域的FV片段；(5)具有VH结构域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)，及及(7)单链FV(scFV)。虽然FV片段的两个结构域，VL及VH，是由分别的基因编码，但是使用重组方法，其可通过能够使其以单一蛋白质链而制备的合成接头将其连接(其中VL及VH区域配对以形成单价分子，亦即单链FV(scFV)；参见例如Bird等人(1988)Science 242423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的技术而获得，且以如同完整抗体的方式评估这些片段的功能。
术语“有效量”是指足以调节IL-22活性以减轻临床症状或获得所期望生物结果(例如降低的T细胞和/或B细胞活性、自体免疫抑制、移植排斥抑制等)的剂量或含量。
术语“人抗体”包括具有实质上相当于本领域已知的人类种系免疫球蛋白序列的可变及恒定区域，其包括例如由Kabat等人所述的序列(见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。本发明的人抗体可包括未由例如CDR(且尤其CDR3)中的人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外的随机或位点特异性突变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。该人抗体可具有至少1、2、3、4、5或更多个由非人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基取代的位置。
用语“抑制”或“拮抗”IL-22活性及其同源词是指由于结合抗IL-22抗体而减少、抑制或降低IL-22的至少一种活性，其中该减少是相对于在无相同抗体存在下的IL-22活性而言。可使用本领域中已知的任何技术(包括例如实施例7及9中所述的技术)测定该活性。抑制或拮抗作用未必显示IL-22多肽生物活性的全部消除。活性的减少量可以是约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
术语“白介素-22”或“IL-22”指可结合至IL-22R和/或IL-22R与IL-10R2的受体复合物且具有至少一种以下特征的第II类细胞因子(其可以是哺乳动物的细胞因子)(1)天然发生的哺乳动物IL-22多肽(全长或成熟形式)或其片段的氨基酸序列，例如以SEQ ID NO1(人类)或SEQ ID NO3(鼠)表示的氨基酸序列或其片段；(2)实质上与如SEQ ID NO1或其氨基酸34-179(人类)或SEQ ID NO3(鼠)或其片段所示的氨基酸序列相同，例如具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；(3)由天然发生的哺乳动物IL-22核苷酸序列或片段(例如SEQ ID NO2或核苷酸71至610(人类)或SEQ ID NO4(鼠)或其片段)编码的氨基酸序列；(4)由实质上与如SEQ ID NO2或其核苷酸71至610(人类)或SEQ ID NO4(鼠)或其片段所示的核苷酸序列相同(例如具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(5)由天然发生的IL-22核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO2(人类)或SEQ ID NO4(鼠)或其片段)的简并核苷酸序列编码的氨基酸序列；或(6)于严谨条件(例如高度严谨条件)下，与前述核苷酸序列中的一种杂交的核苷酸序列。该IL-22可以与哺乳动物来源(例如人类或小鼠)的IL-22R和/或IL-22R与IL-10R2的受体复合物结合。
人IL-22的核苷酸序列及预测氨基酸序列分别在SEQ ID NO2及SEQID NO1中表示。人成熟的IL-22的氨基酸序列相当于SEQ ID NO1的氨基酸34-179。重组人IL-22的分析显示许多结构域(Nagem等人(2002)Structure，101051-62；美国专利申请US 2002/0187512A1)。
术语“IL-22活性”是指由于IL-22结合至由细胞上的IL-22R及IL-10R2所组成的受体复合物，而引发或阻断至少一种细胞过程。IL-22活性包括以下的至少一种，但不限于此(1)结合IL-22R或IL-22R及IL-10R2的受体复合物(例如具有或不具有人IL-10R2的人IL-22R)；(2)与信号转导分子(例如JAK-1)联系；(3)激发STAT蛋白(例如STAT5、STAT3或其组合)的磷酸化作用；(4)活化STAT蛋白；及(5)调节(例如增加或降低)上皮细胞、成纤维细胞或免疫细胞的增殖、分化、效应细胞功能、细胞溶解活性、细胞因子分泌、存活或其组合。上皮细胞包括，但不限于皮肤细胞、肠细胞、肝细胞、肾细胞以及内皮细胞。成纤维细胞包括但不限于滑膜成纤维细胞。免疫细胞可包括CD8+及CD4+T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞及巨核细胞。IL-22活性可在体外测定，例如使用如实施例2及6所述的IL-22受体抑制试验、实施例9所述的GROa分泌试验或实施例7所述的BAF3增生试验。IL-22活性也可在体内测定，例如如实施例13所述通过对免疫应答或病症的演变过程进行打分而测定。
如文中使用，“体外产生的抗体”是指其中所有或部分该可变区(例如至少一个CDR)是在非免疫细胞选择(例如体外噬菌体展示、蛋白质芯片或可测试候选序列与抗原结合的能力的任何其它方法)中产生的抗体。该术语不包括免疫细胞内的基因组重排而产生的序列。
术语“分离的”是指实质上无天然环境的分子。例如分离蛋白质为实质上无细胞物质或无来自其所衍生的细胞或组织源的其它蛋白质。该术语也指就药物组合物而言，该分离蛋白质具充分纯度或至少70-80％(w/w)纯度；或至少80-90％(w/w)纯度；或至少90-95％纯度或至少95％、96％、97％、98％、99％，或100％(w/w)纯度的制剂。
用语“相同％”或“同一性％”是指至少两种不同序列间的相似度。该同一性％可通过以下标准比对算法而测定例如由Altshul等人所述的theBasic Local Alignment Tool(BLAST)((1990)J.Mol.Biol.，215403-410)；Needleman等人的算法((1970)J.Mol.Biol.，48444-453)；或Meyers等人的算法((1988)Comput.Appl.Biosci.，411-17)。一组参数可以是具有缺口罚分为12、缺口扩大罚分为4，及移码缺口罚分为5的Blosum 62计分矩阵。也可使用已并入ALIGN程序(第2.0版)内的E.Meyers及W.Miller的算法((1989)CABIOS，411-17)，利用PAM120加权残基表、缺口长度罚分为12及缺口罚分为4以测定两种氨基酸或核苷酸序列间的同一性％。同一性％通常是通过比较具类似长度的序列而计算。
该术语“谱(repertoire)”是指全部或部分衍生自至少一种编码至少一种免疫球蛋白的序列的至少一种核苷酸序列。可通过重链的V、D、J片段，及轻链的V与J片段的体内重排而产生该序列(群)。或者，可自对重排的发生(例如体外刺激)应答的细胞产生该序列(群)。或者，部分或所有该序列(群)可通过DNA拼接、核苷酸合成、诱变及其它方法(参见例如美国专利5,565,332)而获得。谱可仅包括一种序列或可包括数个序列，其包括在遗传上多样标本收藏中的一类。
术语“特异性结合”是指形成在生理条件下相对稳定的复合物的两个分子。特异性结合与非特异性结合(其通常具有低亲和性及中至高能量(capacity))不同之处在于具有高亲和性及低至中能量的特征。通常，当结合常数KA高于106M-1时，结合被视为具特异性。如果必要，在不会实质上影响特异性结合的情况下，通过改变结合条件，可减少非特异性结合。熟练的技术人员可通过使用常规技术而最优化合适的结合条件，诸如抗体浓度、溶液的离子强度、进行结合的温度及时间、阻断剂(例如血清白蛋白、牛奶酪蛋白)的浓度等。说明性条件公开在实施例3中，但是本领域普通技术人员已知的其它条件皆属于本发明范围。
如文中使用，该术语“严谨的”用于描述杂交及洗涤条件。严谨条件为本领域技术人员所知且可在以下资料中找到Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。水性及非水性方法描述于该参考资料中且任一种皆可使用。严谨杂交条件的一个实例为于约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行杂交，继而于50℃下在0.2×SSC、0.1％ SDS中进行至少一次洗涤。严谨杂交条件的第二个实例为于约45℃下在6×SSC中进行杂交，继而于55℃下在0.2×SSC、0.1％ SDS中进行至少一次洗涤。严谨杂交条件的另一个实例为于约45℃下在6×SSC中进行杂交，继而于60℃下在0.2×SSC、0.1％ SDS中进行至少一次洗涤。严谨杂交条件的另一个实例为于约45℃下在6×SSC中进行杂交，继而于65℃下在0.2×SSC、0.1％ SDS中进行至少一次洗涤。高度严谨条件包括于65℃下在0.5M碳酸钠、7％SDS中进行杂交，继而于65℃下，在0.2×SSC、1％ SDS中进行至少一次洗涤。
用语“实质上如所陈述的”、“实质上相同”或“实质上同源”意指相关氨基酸或核苷酸序列(例如CDR、VH或VL结构域)与所陈述的序列相同或无实质差异(通过保守性氨基酸取代)。无实质差异包括较少的氨基酸变化，诸如在特定区域的5个氨基酸序列中1个或2个个取代。就抗体而言，第二种抗体具有相同特异性且其亲和性为第一种抗体亲和性的至少50％。
实质上与文中所公开的序列相同或同源的序列(例如至少约85％序列同一性)也为本申请的一部分。在某些实施方案中，序列的同一性可以是约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。或者，当于选择的杂交条件(例如高度严谨杂交条件)下，核酸片段杂交至互补链时，存在实质同一性或同源性。核酸可存在于全细胞内、细胞溶解产物内或以部分纯化或实质上纯的形式存在。
该术语“治疗剂”为治疗或协助治疗病症的物质。治疗剂可包括，但不限于以补充抗IL-22抗体的IL-22活性的方式调节免疫细胞或免疫应答的物质。治疗剂的非限制性实施方案及用途描述于文中。
如文中使用，抗IL-22抗体的“治疗有效量”是指通过对受试者(诸如人类病患)进行单一或多重剂量施用，而有效处理、预防、治疗、延缓、减少病症或复发病症的严重性，和/或改善病症或复发病症的至少一种症状或延长病患的存活时间，使受试者的生命超越无此治疗时所预期的存活时间的有效抗体量。
术语“治疗”是指治疗或预防措施。对罹患病症的受试者或最终会罹患该病症的受试者施用该治疗以预防、治疗、延缓、减少病症或复发病症的严重性，和/或改善病症或复发病症的一种或多种症状或延长受试者的存活时间，使病患的生命超过无此治疗时所预期的存活时间。
II.抗IL-22抗体 本公开内容提供包含新的抗原结合片段的新的抗IL-22抗体。
本领域技术人员已知许多方法皆适用于获得抗体或其抗原结合片段。例如可使用重组DNA方法以制备抗体(美国专利4,816,567)。也可根据已知方法通过产生杂交瘤而制备单克隆抗体(参见例如Kohler和Milstein(1975)Nature，256495-499)。然后使用标准方法，诸如酶联免疫吸附分析(ELISA)及表面等离振子共振(BIACORETM)分析，筛选该方法所形成的杂交瘤，以鉴定产生与特定抗原特异性结合的抗体的一或多种杂交瘤。任何形式的特定抗原皆可作为免疫原，例如重组抗原、天然形式、其任何变体或片段，以及其抗原性肽。
制备抗体的一个代表性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示技术描述在例如以下资料中Ladner等人，美国专利5,223,409；Smith(1985)Science 2281315-1317；Clackson等人(1991)Nature，352624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.，222581-597；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690及WO 90/02809。
除展示文库的使用外，可使用特定抗原免疫非人类动物(例如啮齿目动物，诸如小鼠、仓鼠或大鼠)。在一个实施方案中，非人类动物包括人类免疫球蛋白基因的至少一部分。例如可使用人类免疫球蛋白基因座的大片段改造而产生小鼠抗体生成缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可制备并选择衍生自具有所期望特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见例如XENOMOUSETM，Gree等人(1994)Nature Genetics 713-21、美国专利2003-0070185、1996年10月31日公开的WO 96/34096及1996年4月29日申请的PCT申请PCT/US 96/05928。
在另一个实施方案中，单克隆抗体得自非人类动物，然后可使用本领域中已知的重组DNA技术对其产生修饰，例如人源化、去免疫化、嵌合化。制备嵌合抗体的多种方法已经公开。参见例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.816851，1985；Takeda等人，Nature 314452，1985；Cabilly等人，美国专利4,816,567；Boss等人，美国专利4,816,397；Traaguchi等人，欧洲专利公开EP 171496；欧洲专利公开0173494；英国专利GB 2177096B。也可使用，例如表达人类重链及轻链基因但是不能表达内源性小鼠免疫球蛋白重链及轻链基因的转基因小鼠以产生人源化抗体。Winter描述可用以制备文中所述人源化抗体的代表性CDR移植方法(美国专利5,225,539)。特定人抗体的所有CDR可被非人CDR的至少一部分取代，或仅部分CDR可被非人类CDR取代。仅必需取代使人源化抗体与预定抗原结合所需的CDR数。
可通过得自人类FV可变结构域的同等序列取代未直接涉及抗原结合的FV可变结构域的序列而产生人源化抗体或其片段。产生人源化抗体或其片段的代表性方法通过以下而提供Morrison(1985)Science 2291202-1207；Oi等人(1986)Bio Techniques 4214；及美国专利5,585,089；美国专利5,693,761；美国专利5,693,762；美国专利5,859,205；美国专利6,407,213。这些方法包括分离、操作及表达编码得自重链或轻链中的至少一种的所有或部分免疫球蛋白FV可变结构域的核酸序列。如上述，此类核酸得自能产生抗预定目标抗体的杂交瘤，以及其它来源。然后可将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆入合适的表达载体内。
在特定实施方案中，通过保守取代、共有序列取代、种系取代和/或回复突变的导入而使人源化抗体最优化。通过本领域已知的几种技术中的任一种而制成此类改变的免疫球蛋白分子(参见例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，807308-7312，1983；Kozbor等人，Immunology Today，47279，1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.，923-16，1982)，且可根据PCT公开WO 92/06193或EP 0239400的教导而制成。
也可通过WO 98/52976及WO 00/34317中所公开的人类T细胞表位的特定删除或“去免疫化”方法而修饰抗体或其片段。简言之，可分析抗体重链及轻链可变结构域的结合II类MHC的肽；这些肽代表潜在的T细胞表位(如WO 98/52976及WO 00/34317中所定义)。就潜在的T细胞表位的检测而言，可应用称为“肽结构预测线索法(peptide threading)”的电脑模拟方法，此外如WO 95/52976及WO 00/34317所述，可检索人类II类MHC结合肽数据库而寻求存在于VH及VL序列中的模序。这些模序结合至18种主要II类MHC的DR同种异型中的任一种，因此构成潜在的T细胞表位。可通过取代可变结构域中的少数氨基酸残基或优选通过单一氨基酸取代而去除所检测到的潜在T细胞表位。通常进行保守取代。通常，但并非绝对，可使用与人类种系抗体序列中的位置常见的氨基酸。人类种系序列公开在以下资料中例如Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.，227776-798；Cook，G.P.等人(1995)Immunol.Today Vol.16(5)237-242；Chothia，D.等人(1992)J.Mol.Biol.227799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J.144628-4638。该V BASE目录提供人类免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson，I.A.等人汇编，MRC Centre for Protein Engeneering，Cambridge，UK)。这些序列可作为人类序列(例如架构区及CDR)的来源。也可使用共有人类架构区，例如美国专利6,300,064中所述的。
在特定实施方案中，抗体可含有改变的免疫球蛋白恒定或FC区。例如根据文中教导所制备的抗体可以更强或更具特异性地结合至效应分子(诸如补体和/或FC受体)，该效应分子可控制抗体的几种免疫功能，诸如效应细胞活性、细胞裂解、补体介导的活性、抗体清除率及抗体半衰期。结合至抗体(例如IgG抗体)FC区的典型FC受体包括，但不限于以下的受体FCγR I、FCγR II及RCγR III与FCRn亚类的受体，其包括这些受体的等位基因变体或可变剪接形式。FC受体在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9457-92，1991；Capel等人，Immunomethods 425-34，1994；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126330-41，1995中评论。
就另外的抗体制备技术而言，见AntibodiesA Laboratory Manual，Harlow等人编著，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。本发明不受限于抗体的任何特定来源、制法或其它特别特征。
抗体，也称为免疫球蛋白，通常为由各约25kDa的两条轻(L)链及各约50kDa的两条重(H)链所组成的四聚合糖基化蛋白质。在抗体内可找到两种类型的轻链，即λ及κ。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分成5种主要的种类A、D、E、G及M，且其中一些可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。各轻链包括一个N-末端可变(V)结构域(VL)及一个恒定(C)结构域(CL)。各重链包括一个N-末端V结构域(VH)、3或4个C结构域(CH)及一个铰链区。最接近VH的CH结构域称为CH1。VH及VL结构域由4个相对保守的序列区域(称为构架区，即FR1、FR2、FR3及FR4)所组成，该构架区可形成3个高变序列区域(互补决定区，CDR)所需的构架。该CDR含有大部分进行抗体与抗原间特异性相互作用的残基。CDR称为CDR1、CDR2及CDR3。因此，在重链上的CDR组分称为H1、H2及H3，而在轻链上的CDR组分称为L1、L2及L3。
CDR3通常为抗体结合部分内的最大分子多样性的来源。例如H3可以短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。不同免疫球蛋白种类的亚基结构及立体构型为本领域所熟知。就抗体结构的综述而言，见AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow等人编著，1988。本领域技术人员了解各亚基结构(例如CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构)包含与抗原结合的活性片段，例如与抗原结合的VH、VL或CDR亚基的部分，亦即抗原结合片段，或例如结合至例如FC受体和/或补体和/或将其活化的CH亚基的部分。如Kabat等人在Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Department of Health and Human Services(1991)编著中所述，CDR通常是指Kabat CDR。描述抗原结合部分特征的另一标准是指如通过Chothia所述的高变环。参见例如Chothia，D.等人(1992)J.Mol.Biol.227799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J.144628-4638。另外又一个标准为由Oxford Molecular’s AbM抗体模型软件所使用的AbM定义。一般而言，参见例如Antibody Engineering Lab Manual中的Protein Sequenceand Structure Analysis of Antibody Variable Domains.(Duebel，S.和Kontermann，R.，编著Springer-Verlag，Heidelberg)。或者可使用有关Chothia高变环或AbM所定义环的类似描述关系实施有关Kabat CDR的描述的具体实施例。
Fab片段(抗原结合片段Fragment antigen-binding)由VH-CH1及VL-CL结构域组成，所述结构域通过恒定区间的二硫键而共价连接。FV片段较小且由非共价连接的VH及VL结构域组成。为了克服非共价连接结构域解离的趋势，可构建单链FV片段(scFV)。scFV含有使(1)VH的C-末端与VL的N-末端连接或使(2)VL的C-末端与VH的N-末端连接的柔性多肽。15-mer(Gly4Ser)3肽可作为接头，但是其它接头在本领域中已知。
组装及体细胞突变后的抗体基因的序列具高变化性，且这些变化的基因估计可编码1010个不同抗体分子(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等人编著，Academic Press，San Diego，CA，1995)。
“双特异性”或“双功能性抗体”为具有两种不同重/轻链对及两种不同结合部分的人造杂种抗体。双特异性抗体可通过各种方法制备，其包括杂交瘤的融合或Fab’片段的连接。参见例如Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。在一个实施方案中，双特异性抗体包含通过免疫球蛋白恒定区而与第二结合结构域多肽连接的第一结合结构域多肽，诸如Fab’片段。
小模块免疫药物(Small Modular ImmunoPharmaceuticals，即SMIPTM)提供含结合结构域多肽的变体分子的实例。SMIP及其用途与应用公开在以下专利申请中例如美国公开专利申请2003/0118592、2003/0133939、2004/0058445、2005/0136049、2005/0175614、2005/0180970、2005/0186216、2005/0202012、2005/0202023、2005/0202028、2005/0202534、2005/0238646及其相关的专利族，这些专利申请的全文在此皆并入本申请以作为参考资料。
SMIPTM通常指结合性结构域-免疫球蛋白融合蛋白质，其包括融合至或连接至免疫球蛋白铰链或铰链作用区多肽的结合性结构域多肽，其接着融合至或连接至含一或多种来自免疫球蛋白重链的非CH1的天然或改造的恒定区的区域(例如IgG及IgA的CH2及CH3区或IgE的CH3及CH4区)(参见例如颁予Ledbetter，J.等人的美国专利2005/0136049，为更完全地说明，其在此并入本申请以作为参考资料)。结合性结构域免疫球蛋白融合蛋白质可进一步包括这样的区域，其包含融合至或连接至铰链区多肽的天然或改造的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽(或就全部或局部衍生自IgE的结构而言是CH3)，以及融合至或连接至该CH2恒定区多肽(或就全部或局部衍生自IgE的结构而言是CH3)的天然或改造的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽(或就全部或局部衍生自IgE的结构而言是CH4)。通常，此类结合性结构域免疫球蛋白融合蛋白质可具有至少一种选自以下的免疫活性依赖抗体的细胞毒性、补体结合，和/或结合至靶标，例如靶标抗原(诸如人IL-22)。
治疗型蛋白质，即对其起作用的身体区域或对其通过中间物而远距离地起作用的身体区域有生物学效应的蛋白质或肽，也可用于实践本发明。治疗型蛋白质可包括肽模拟物。模拟物为模拟蛋白质二级结构元件的含肽分子。参见例如Johnson等人，BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY中的“Peptide Turn Mimetics”，Pezzuto等人编著，Chapman and Hall，New York(1993)，其在此并入本申请以作为参考资料。该肽模拟物使用背后的基本原因为蛋白质的肽骨架存在的主要功能为将氨基酸侧链以促进分子相互作用的方式定向，诸如抗体与抗原的分子相互作用。已预期肽模拟物可以进行与天然分子类似的分子相互作用。可使用这些原理以改造不仅具有文中所公开靶肽的许多天然性质且具有改变的且潜在性被改良特征的二代分子。
治疗型蛋白质的其它实施方案包括融合蛋白质。这些分子通常具有在其N-或C-末端与所有或一部分第二多肽或蛋白质连接的所有或大部分靶标肽，例如IL-22或抗IL-22抗体。例如融合作用可使用得自其它物种的前导序列以使蛋白质在异源宿主内重组表达。另一有用的融合作用包括添加免疫活性结构域，诸如抗体表位，以促进融合蛋白质的纯化。包含于或接近该融合接合处的剪切位点可促进纯化后该外来多肽的移除。其它有用的融合包括连接功能性结构域，诸如酶的活性位点、糖基化结构域、细胞靶标信号或跨膜区。可并入融合蛋白内的蛋白质或肽实例包括细胞生长抑制性蛋白质、杀细胞性蛋白质、促细胞凋亡剂、抗血管生成剂、激素、细胞因子、生长因子、肽药物、抗体、抗体的Fab片段、抗原、受体蛋白质、酶、凝集素、MHC蛋白质、细胞黏连蛋白质及结合性蛋白质。产生融合蛋白的方法为本领域技术人员所熟知。例如可通过使用双功能交联剂的化学附着法，通过完整融合蛋白的从新合成法或通过将编码靶标肽的DNA序列与编码第二肽或蛋白质的DNA序列连接，继而表达完整的融合蛋白而制备此类蛋白质。
在一个实施方案中，该靶标肽(例如IL-22或抗IL-22抗体)与含两个恒定区结构域及铰链区，但无可变区的免疫球蛋白重链恒定区(诸如FC片段)融合(参见例如美国专利6,018,026及5,750,375，其皆在此并入本申请以作为参考资料)。该FC区可以是天然发生的FC区或可以经改造以改良特定性质，诸如治疗特性、循环时间、减少的凝集性等的FC区。与FC区融合的肽及蛋白质的体内半衰期大于未经融合的对应物。而且与FC区融合的作用可以使该融合多肽进行二聚化作用/多聚化作用。
如为技术人员所知的VHH分子(或纳米抗体(nanobodies))是衍生自天然缺乏轻链的免疫球蛋白的重链可变结构域，诸如衍生自如WO 9404678(其在此并入本申请以作为参考资料)中所述骆驼科动物的重链可变结构域。此种VHH分子可衍生自在骆驼科物种(例如骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼及南美野生羊驼)中所取得的抗体且有时称为骆驼科动物或骆驼科动物化可变结构域。参见例如Muyldermans.，J.Biotechnology(2001)74(4)277-302。其在此并入本申请以作为参考资料。除骆驼科动物外，其它物种可产生天然无轻链的重链抗体。VHH分子比IgG分子大约小10倍。其是单一多肽且很稳定，可以抗极端pH及温度条件。而且，其可抗蛋白酶的作用，已知抗体并无此作用。而且，VHH的体外表达可产生高产率、正确折叠的功能VHH。此外，骆驼科动物中产生的抗体识别不同于通过体外使用抗体文库或通过免疫非骆驼科动物的哺乳动物而产生抗体所识别的表位(见WO9749805，其在此并入本申请以作为参考资料)。
本发明一方面包括结合IL-22的抗体及抗原结合片段。本公开内容提供衍生自人类免疫球蛋白文库的新的CDR。用于携带CDR的结构通常为抗体重链或轻链或其一部分，其中该CDR是位于天然发生的CDR区内。可以如Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest，No.91-3242，National Institutes of Health Publications，Bethesda，MD(1991)中所述的方法测定可变结构域的结构及位置。
本发明抗IL-22抗体的说明性实施方案的DNA及氨基酸(AA)序列，包括其scFV片段、VH及VL结构域及CDR，公开在图7至10中且在表1及7中列举。非种系化抗体的20种具体实例称为GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11。在非种系化抗体的VH及VL结构域中CDR位置示于表2中。种系化抗体的15种具体实例称为GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04。


表2CDR在VH及VL结构域的非种系化抗体的氨基酸序列内的位置 本发明抗IL-22抗体可任选地包含抗体恒定区或其部分。例如VL结构域可以以其C-末端与轻链恒定结构域(如Cκ或Cλ)连接。类似地，VH结构域或其部分可以与所有或部分重链(例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)，及任何同种型亚类连接。恒定区在本领域中是已知(参见例如Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，No.91-3242，National Institutes of HealthPublications，Bethesda，MD(1991))。因此，属于本发明范围的抗体包括与本领域已知的恒定区联合的VH及VL结构域或其部分。
特定实施方案包括得自GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的FV片段的VH结构域、VL结构域或其组合。另一个实施方案包括选自356A11、354A08、087B03及368D04的抗体的FV片段的VH结构域、VL结构域或其组合。其它实施方案包含1、2、3、4、5或6个得自VH及VL结构域的互补决定区(CDR)。其CDR序列包括在SEQ ID NO5-13、23-31、41-49、59-67、77-85、95-103、113-121、131-139、149-157、167-175、185-193、203-211、221-229、239-247、257-265、275-283、293-301、311-319、329-337、347-355、365-373、383-391、401-409、419-427、437-445、455-463、473-481、491-499、509-517、527-535、545-553、563-571、581-589、599-607或617-625内的抗体属于本发明范围。例如在一个实施方案中，抗体包含种系化或非种系化GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11或选自356A11、354A08、087B03及368D04抗体的VH结构域的H3片段。
在特定实施方案中，VH和/或VL结构域可被种系化，亦即使用已知分子生物学技术使这些结构域的构架区(FR)突变以匹配通过种系细胞所产生的那些构架区。在其它实施方案中，FR序列保持偏离共有种系序列。在本发明一个实施方案中，种系化的抗体示于表7中。
在一个实施方案中，本发明提供种系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的氨基酸及核酸序列。种系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04的VH结构域的氨基酸及核苷酸系列公开在表7及图8中。种系化的GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04的VL结构域的氨基酸及核苷酸系列公开在表7及图8中。
在一个实施方案中，使用诱变以制备更类似一或多种种系序列的抗体。优选通过体细胞诱变或通过易错PCR将突变导入抗体的架构区内。可通过对VBASE数据库(MRC Center for Protein Engineering，UK)进行氨基酸及核酸序列比对而确认VH及VL结构域的种系序列。VBASE为汇编自超过一千种已公开序列(其包括Genbank和EMBL数据库最近发布的序列)的所有人类种系可变区序列的综合目录。在某些实施方案中，以与VBASE数据库中最接近的匹配物一致的形式突变scFV的FR区域，且保持CDR部分完整。
在特定实施方案中，本发明抗体特异性地与GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11所识别的相同表位进行反应，通过此其可竞争性地抑制GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11结合至人IL-22。可以在竞争性结合试验中测定此类抗体。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合至368D04所识别的IL-22表位，以此抗体竞争性地抑制368D04结合至人IL-22。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可结合至356A11所识别的IL-22表位，以此抗体竞争性地抑制356A11结合至人IL-22。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合至354A08所识别的IL-22表位，以此抗体竞争性地抑制354A08结合至人IL-22。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合至087B03所识别的IL-22表位，以此抗体竞争性地抑制087B03结合至人IL-22。在一个实施方案中，这些抗体对人IL-22的结合常数(KA)为至少106M-1。在另一个实施方案中，这些抗体对人IL-22的结合常数为至少109M-1。在其它实施方案中，这些抗体对人IL-22的结合常数为至少1010M-1、至少1011M-1或至少1012M-1。可使用本领域中已知的技术测定结合亲和性，诸如ELISA、生物传感器技术(诸如生物特异性相互作用分析)或其它技术(包括本申请中所述技术)。
已预期本发明抗体可结合其它蛋白质，诸如含所有或部分IL-22的重组蛋白。
本领域普通技术人员了解可使用所公开抗体以检测、测定和/或抑制稍不同于IL-22的蛋白质。例如这些蛋白质可以是IL-22的同源物。已预期抗IL-22抗体可结合的蛋白质所包含的序列与SEQ ID NO1中所示序列内的至少100、80、60、40或20个连续氨基酸的任何序列具至少约60％、70％、80％、90％、95％或更高同一性。
除了序列同源性分析，可进行表位作图(参见例如Epitope MappingProtocols，Morris编著，Humana Press，1996)，及二级与三级结构分析以鉴定目前公开的抗体及其与抗原的复合物所假设的特定3D结构。此类方法包括但不限于X射线结晶学(Engstem(1974)Biochem.Exp.Biol.，117-13)及现有抗体实际表征的电脑模拟(Fletterick等人(1986)Computer Graphics andMolecular Modeling，in Current Communications in Molecular Biology，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
本公开内容提供一种获得抗IL-抗体的方法，其包括产生具有表1VH和/或VL序列改变的抗体。熟练的技术人员使用本领域已知技术可衍生出此类抗体。例如可将氨基酸取代、缺失或添加导入FR和/或CDR区中。设计FR改变通常用以改良抗体的稳定性及免疫原性，而设计CDR改变通常用以增加抗体对其抗原的亲和性。可通过改变CDR序列并测定抗体对其靶标的亲和性而测试增加亲和性的变化(见Antibody Engineering，第2版，OxfordUniversity Press，Borrebaeck编著，1995)。
其CDR序列实质上与SEQ ID NO5-13、23-31、41-49、59-67、77-85、95-103、113-121、131-139、149-157、167-175、185-193、203-211、221-229、239-247、257-265、275-283、293-301、311-319、329-337、347-355、365-373、383-391、401-409、419-427、437-445、455-463、473-481、491-499、509-517、527-535、545-553、563-571、581-589、599-607或617-625的序列所包含的CDR序列相同的抗体属于本发明范围。通常包括以具有类似电荷、疏水或立体化学特性的氨基酸进行氨基酸取代。与CDR区域不同，也可进行FR区内的更大程度的取代，其限制条件为该取代不对抗体的结合性质产生不利影响(例如与未取代的抗体比较，降低了超过50％的亲和性)。可进行取代以将该抗体种系化或将抗原结合位点稳定化。
保守修饰可制备具有类似于得到此类修饰的分子的功能及化学特征的分子。反之，可通过选择氨基酸序列中的取代而实质修饰分子的功能和/或化学特征，该取代在对于维持以下内容的功能上存在显著差异的氨基酸序列中进行(1)取代区域中分子骨架的结构，例如折叠或螺旋构型，(2)于靶标部位的分子的电荷或疏水性或(3)该分子的大小。
例如“保守氨基酸取代”可包括以非天然残基取代天然氨基酸残基，以此对于该位置的氨基酸残基的极性或电荷几乎没有或没有影响(参见例如MacLennan等人，1998，Acta Physiol.Scand.Suppl.64355-67；Sasaki等人，1998，Adv.Biophys.351-24)。
在取代为所期望的情况下，可通过本领域技术人员决定所期望氨基酸取代基(不论保守或非保守)。例如可使用氨基酸取代以鉴定分子序列的重要残基或增加或降低文中所述分子的亲和性。代表性氨基酸取代包括，但不限于表3中所示取代。
表3氨基酸取代 在特定实施方案中，保守氨基酸取代基也包括通常通过化学肽合成(而非在生物系统中进行的合成)而加入的非天然发生的氨基酸残基。
在一个实施方案中，制备变体VH结构域的方法包括添加、缺失或取代所公开VH结构域中的至少一个氨基酸或组合所公开VH结构域与至少一个VL结构域，并测试变体VH结构域的IL-22结合性或IL-22活性的调节作用。
一种制备变体VL结构域的类似方法包括添加、缺失或取代所公开VL结构域中至少一个氨基酸或使所公开的VL结构域与至少一个VH结构域组合，并测试变体VL结构域的IL-22结合性或IL-22活性的调节作用。
本公开内容的另一方面提供一种制备特异性结合至IL-22的抗体或抗原结合片段的方法。该方法包括 (a)提供编码缺少至少一个CDR或含有至少一个待取代CDR的VH结构域的核酸的起始谱； (b)以至少一个编码实质上如同文中公开的VH CDR的氨基酸序列的供体核酸插入或取代起始谱的CDR区域以得到产物谱； (c)表达产物谱的核酸； (d)选择结合至IL-22的特异性抗原结合片段；及 (e)回收特异性抗原结合片段或编码其的核酸。
在一个类似方法中，本发明至少一个VL CDR与编码缺少至少一种CDR或含有至少一种待取代CDR的VL结构域的核酸谱组合。至少一种VH或VLCDR可以是CDR1、CDR2、CDR3或其组合，其包括VH CDR与VL CDR的组合，诸如表1或7中所示那些，其包括以下SEQ ID NO所示那些SEQ IDNO8、9、11、12、13、26、27、28、29、30、31、44、45、46、47、48、49、62、63、64、65、66、67、80、81、82、83、84、85、98、99、100、101、102、103、116、117、118、119、120、121、134、135、136、137、138、139、152、153、154、155、156、157、170、171、172、173、174、175、188、189、190、191、192、193、206、207、208、209、210、211、224、225、226、227、228、229、242、243、244、245、246、247、260、261、262、263、264、265、278、279、280、281、282、283、296、297、298、299、300、301、314、315、316、317、318、319、332、333、334、335、336、337、350、351、352、353、354、355、368、369、370、371、372、373、386、387、388、389、390、391、404、405、406、407、408、409、422、423、424、425、426、427、440、441、442、443、444、445、458、459、460、461、462、463、476、477、478、479、480、481、494、495、496、497、498、499、512、513、514、515、516、517、530、531、532、533、534、535、548、549、550、551、552、553、566、567、568、569、570、571、584、585、586、587、588、589、602、603、604、605、606、607、620、621、622、623、624或625。
在一个实施方案中，该可变结构域包括待取代的CDR3或无CDR3编码区，且至少一种供体核酸编码实质上如以下SEQ ID NO所示氨基酸SEQ IDNO10、13、28、31、46、49、64、67、82、85、100、103、118、121、136、139、154、157、172、175、190、193、208、211、226、229、244、247、262、265、280、283、298、301、316、319、334、337、352、355、370、373、388、391、406、409、424、427、442、445、460、463、478、481、496、499、514、517、532、535、550、553、568、571、586、589、604、607、622或625。
在另一个实施方案中，可变结构域包括待取代的CDR1或无CDR1编码区，且至少一种供体核酸编码实质上如以下SEQ ID NO所示氨基酸序列SEQ ID NO8、11、26、29、44、47、62、65、80、83、98、101、116、119、134、137、152、155、170、173、188、191、206、209、224、227、242、245、260、263、278、281、296、299、314、317、332、335、350、353、368、371、386、389、404、407、422、425、440、443、458、461、476、479、494、497、512、515、530、533、548、551、566、569、584、587、602、605、620或623。
在另一个实施方案中，可变结构域包括待取代的CDR2或无CDR2编码区，且至少一种供体核酸编码实质上如以下SEQ ID NO所示氨基酸序列SEQ ID NO9、12、27、30、45、48、63、66、81、84、99、102、117、120、135、138、153、156、171、174、189、192、207、210、225、228、243、246、261、264、279、282、297、300、315、318、333、336、351、354、369、372、387、390、405、408、423、426、441、444、459、462、477、480、495、498、513、516、531、534、549、552、567、570、585、588、603、606、621或624。
在另一个实施方案中，可变结构域包括待取代的CDR3或无CDR3编码区，且进一步包含待取代的CDR1或无CDR1编码区，其中至少一种供体核酸编码实质上如表1或7所示氨基酸序列。
在另一个实施方案中，可变结构域包括待取代的CDR3或无CDR3编码区，且进一步包含待取代的CDR2或无CDR2编码区，其中至少一种供体核酸编码实质上如表1或7中所示氨基酸序列。
在另一个实施方案中，可变结构域包括待取代的CDR3或无CDR3编码区，且进一步包含待取代的CDR1与CDR2或无CDR1及CDR2编码区，其中至少一种供体核酸编码实质上如表1或7中所示氨基酸序列。
使用重组DNA方法，可将所公开CDR序列导入缺少各自CDR的VH或VL结构域谱内(Marks等人，Bio Technology(1992)10779-783)。例如使用邻接可变结构域的5′末端的引物及邻接第三FR的引物以产生无CDR3的可变结构域序列的谱。该谱可以与所公开抗体的CDR3组合。使用类似技术，部分所公开的CDR序列可经得自其它抗体的CDR序列的一部分改组以得到结合IL-22的抗原结合片段的谱。任一种谱可在宿主系统，诸如噬菌体展示技术(描述在WO 92/01047及其对应美国专利5,969,108中)中表达，因此可选择能结合IL-22的合适抗原结合片段。
另一种使用所公开VH或VL序列的随机诱变以产生仍可结合IL-22的变体VH或VL结构域。使用易错PCR的技术由Gram等人描述在Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1992)893576-3580中。
另一种方法使用所公开VH或VL序列的定点诱变。此类技术由Barbas等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1994)913809-3813中)及Schier等人(J.Mol.Biol.(1996)263551-567)公开。
可变结构域的一部分包含至少一种实质上如文中公开的CDR区及视需要选用的得自如文中所公开VH或VL结构域的间插构架区。该部分可包括FRI的C末端半部和/或FR4的N末端半部。该可变结构域N末端或C末端的其它残基可以不同于在天然发生抗体中所发现的残基。例如通过重组DNA技术而构建的抗体通常自使用的接头导入N-或C-末端残基。可使用某些接头以使可变结构域与其它可变结构域(例如双抗体)、恒定结构域或蛋白质标记连接。
虽然在下文实施例中所阐明的实施方案包含VH及VL结构域的“配”对，熟练的技术人员知道另外实施方案可包括仅含得自VL或VH结构域的单一CDR的抗原结合片段。可使用单链特异性抗原结合结构域中的任一种以筛选可形成能结合例如IL-22的双结构域特异性抗原结合片段的互补结构域。可通过噬菌体展示筛选方法，使用WO 92/01047中所公开的所谓阶层双组合方式以进行筛选。在该方法中，使用含H或L链克隆的个别菌落以感染编码另一链(L或H)的克隆的完整文库，且根据如所述噬菌体展示技术选择形成的双链特异性抗原结合结构域。
在某些另外实施方案中，可通过化学交联法或重组法而使抗IL-22抗体与蛋白质(例如白蛋白)连接。也可以使用美国专利4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所公开的方式使所公开的抗体与各种非蛋白质聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯烃)连接。抗体可通过与聚合物共价缀合而被化学修饰，例如以增加其在血液循环中的半衰期。代表性聚合物及连接方法示于美国专利4,766,106、4,179,337、4,495,285；及4,609,546中。
所公开抗体可经修饰以改变其糖基化作用；亦即至少一种碳水化合物部分可被缺失或添加至抗体内。可通过改变氨基酸序列以缺失或产生本领域中已熟知的糖基化作用共有位点而进行糖基化作用位点的缺失或添加。添加碳水化合物部分的另一种方法为糖苷与抗体氨基酸残基的化学或酶促耦合(见WO 87/05330及Aplin等人(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.，22259-306)。也可使用化学或酶促方法进行碳水化合物部分的移除(见Hakimuddin等人(1987)Arch.Biochem.Biophys.，25952；Edge等人(1981)Anal.Biochem.，118131；Thotakura等人(1987)Meth.Enzymol.，138350)。
改变抗体恒定区的方法在本领域中已知。可通过以不同残基取代抗体恒定区内的至少一种氨基酸残基而制成具有不同功能(例如对于效应配体，诸如细胞上的FCR或补体的C1组分的不同亲和性)的抗体(参见例如EP388,151A1、US 5,624,821及US 5,648,260)。可描述类似的改变类型，若其应用鼠或其它物种抗体将减少或去除类似功能。
例如可改变抗体(例如IgG，诸如人IgG)的FC区对FCR(例如FCγR1)或Clq的亲和性。可通过以至少一种其侧链具有合适功能的残基取代至少一种特定残基或通过导入带电荷功能基团，诸如谷氨酸根或天冬氨酸根，或也许是芳香族非极性残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸而改变该亲和性(参见例如US 5,624,821)。
例如在该IgG恒定区内以丙氨酸取代残基297(天冬酰氨)可显著抑制效应细胞的募集，且仅稍微减少(约弱3倍)对Clq的亲和性(参见例如US5,624,821)。这类残基在重链中的编号为EU索引的编号(见上文，Kabat等人，1991)。此改变破坏糖基化位点且据信碳水化合物的存在为FC受体结合作用所需。据信于该位点的破坏糖基化作用的任何其它取代会导致溶解活性的类似降低。也已知，例如残基318(Glu)、320(Lys)及322(Lys)的任一种改变为Ala的其它氨基酸取代可破坏Clq与IgG抗体的FC区的结合(参见例如US5,624,821)。
可制备与FC受体的相互作用较低的修饰的抗体。例如已经证明结合至人类FCγR1受体的人类IgG3中的Leu 235改变为Glu将破坏其与受体的相互作用。抗体铰链连接区的邻接或接近位点上的突变可用于影响抗体对FCγR1受体的亲和性。该残基在重链内的编号是根据EU索引(见上述Kabat等人，1991)。
改变抗体溶解活性的另外方法，例如改变CH2结构域的N末端区域内的至少一种氨基酸的方法描述在WO 94/29351(颁予Morgan等人)及US5,624,821。
本发明抗体可用可检测或功能性标签标记。这些标签包括放射性标记(例如131I或99Tc)、酶促的标记(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)，及其它化学部分(例如生物素)。
本发明的特征也为结合至IL-22，特别是结合至人IL-22的分离抗体。在特定实施方案中，抗IL-22抗体可具有至少一种以下特征(1)其是单克隆或单一特异性抗体；(2)其是人抗体；(3)其是体外产生的抗体；(4)其是体内产生的抗体(例如转基因小鼠系统)；(5)其结合至IL-22，且结合常数为至少1012M-1；(6)其结合至IL-22，且结合常数为至少1011M-1；(7)其结合至IL-22，且结合常数为至少1010M-1；(8)其结合至IL-22，且结合常数为至少109M-1；(9)其结合至IL-22，且结合常数为至少106M-1；(10)其结合至IL-22，且解离常数为500nM或较少；(11)其结合至IL-22，且解离常数为10nM或较少；(12)其结合至IL-22，且解离常数为150pM或较少；(13)其结合至IL-22，且解离常数为60pM或较少；(14)以IC50为10nM或较少下，其抑制IL-22结合至IL-22R或IL-22R及IL-10R2的受体复合物；(15)在一个实施方案中，在IC50为1nM或较少下；在另一个实施方案中，在IC50为150pM或较少下；在另一个实施方案中，在IC50为100pM或较少下；在另一个实施方案中，在IC50为10pM或较少下，其阻断IL-22受体改造的BaF3细胞的经IL-22调节的增殖；及(16)在一个实施方案中，在IC50为1nM或较少下；在另一个实施方案中，在IC50为150pM或较少下；且在另一个实施方案中，在IC50为10pM或较少下，其阻断IL-22调节的自HT29分泌GROa。
本领域技术人员可知上述修饰并非穷举的，且根据本公开内容的教导，许多其它修饰为熟练的技术人员所知。
III.核酸、克隆及表达系统 本公开内容提供编码所公开抗体的分离核酸。核酸可包含DNA或RNA，且其可以是合成(完全或局部)或重组(完全或局部)的。如文中公开的核苷酸序列包括具有特定序列的DNA分子，且包括具有其中以U取代T的特定序列的RNA分子。
也提供的核酸包含编码如文中公开的1、2或3个CDR、VH结构域、VL结构域或其组合的序列或实质上与其相同的序列(例如与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列或于严谨条件下可与所公开序列杂交的序列)。
在一个实施方案中，分离核酸具有编码具有至少一个选自下述氨基酸序列的CDR的抗IL-22抗体的重链及轻链可变区的核苷酸序列SEQ IDNO8-13、26-31、44-49、62-67、80-85、98-103、116-121、134-139、152-157、170-175、188-193、206-211、224-229、242-247、260-265、278-283、296-301、314-319、332-337、350-355、368-373、386-391、404-409、422-427、440-445、458-463、476-481、494-499、512-517、530-535、548-553、566-571、584-589、602-607或620-625的氨基酸序列；或具有编码与文中所述的序列相差1或2个氨基酸的CDR的序列。
核酸可仅编码轻链或重链可变区或也编码有效地与对应可变区连接的抗体轻或重链恒定区。在一个实施方案中，轻链可变区与选自κ或λ恒定区的恒定区连接。该轻链恒定区也可以是人类κ或λ类型。在另一个实施方案中，重链可变区与选自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgD，及IgE的抗体同种型的重链恒定区连接。
本发明核酸组合物(虽然除了经修饰的限制位点及诸如此类外，其通常为cDNA或基因组DNA或其混合物的天然序列)可根据标准技术而经突变以得到基因序列。就编码序列而言，如所期望的这些突变作用可影响氨基酸序列。更详细地涵盖实质上与天然V、D、J、恒定的、转换的、及文中所述的其它此类序列相同或自其衍生的核苷酸序列，其中“衍生”表示与另一序列相同或自其修饰的序列。
在一个实施方案中，核酸与所提供的序列的核酸不同，例如由于取代、插入或缺失不同而产生差异，例如相差至少一个但小于10、20、30或40个核苷酸；至少一个但小于该实验对象核酸中核苷酸的1％、5％、10％或20％。就分析而言，若必要，应对序列进行比对以获得最大同源性。自缺失或插入或错配而“圈出(loop out)”的序列被认为有差异。该差异可以是编码非必需残基的核苷酸或该差异可以是保守取代。
该公开内容也提供质粒、载体、转录或表达盒形式的核酸构建体，其包含至少一种如文中所述的核酸。
该公开内容进一步提供一种宿主细胞，其包含至少一种文中所述的核酸构建体。
也提供自含文中所述序列的核酸制备所编码的蛋白质的方法。该方法包括于合适条件下培养宿主细胞以使其自核酸表达蛋白质。在表达及制备后，可使用任何合适技术分离和/或纯化VH或VL结构域或特定结合部分，然后使用。方法也可包括以下步骤融合编码scFv的核酸与编码抗体Fc部分的核酸，并在细胞内表达该融合核酸。该方法也可包括进行种系化的步骤。
抗原结合片段、VH和/或VL结构域，及编码核酸分子与载体可自其天然环境以实质上纯或均质形式(或就核酸而言，无或实质上无不同于编码所期望功能的多肽的序列来源的核酸或基因)而分离和/或纯化。
用于在各种宿主细胞内克隆或表达多肽的系统在本领域中是已知。适于产生抗体的细胞描述在例如Fernandez等人(1999)Gene ExpressionSystems，Academic Press编著中。简言之，合适的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞或原核性细胞，例如大肠杆菌(E.coli)。适用于本领域进行异源多肽表达的哺乳动物细胞包括淋巴细胞系(例如NSO)、HEK 293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、卵母细胞，及得自转基因动物的细胞，例如乳腺上皮细胞。在一个实施方案中，GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11抗体在HEK293或CHO细胞内表达。在另一个实施方案中，选自365A11、354A08、087B03及368D04的抗体在HEK293或CHO细胞内表达。在其它实施方案中，编码本发明抗体的核酸受组织特异性启动子(例如乳腺特异性启动子)的调控，且抗体在转基因动物体内产生。例如抗体是分泌入该转基因动物(诸如转基因牛、猪、马、绵羊、山羊或啮齿目动物)的奶内。
可选用或构成以含有合适调控序列的合适载体，调控序列包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记序列及其它序列。载体亦可含有质粒或病毒骨架。就细节而言，见Sambrook等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，Gold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。使用载体的许多已确认技术(包括DNA操作、制备、诱变、测序及转染)描述在Current Protocols in Molecular Biology，第2版，Ausubel等人编著，John Wiley & Sons(1992)中。
本公开内容的另一方面是提供一种将核酸导入宿主细胞内的方法。就真核细胞而言，合适的转染技术可包括磷酸钙、DEAD-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染，及使用反转录病毒或其它病毒(例如牛痘或杆状病毒)的转导。就细菌细胞而言，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔及使用噬菌体的转染。DNA导入后可进行选择方法(例如抗药性)以选择含有该核酸的细胞。
IV.抗IL-22抗体的用途 可使用作为IL-22拮抗剂的抗IL-22抗体以调节至少一种IL-22介导的免疫应答，诸如在实体组织内的上皮细胞上作用，且间接地调节下游免疫应答，诸如阻断T细胞亚群(包括例如TH17T细胞)的扩张。在一个实施方案中，本发明抗体用于调节免疫应答的方法中，该方法包括使IL-22接触本发明抗体，由此调节免疫应答。在一个实施方案中，免疫应答包括细胞增殖、细胞溶解活性、细胞因子分泌或趋化因子分泌。
因此，本发明抗体可用以直接或间接抑制免疫或造血细胞(例如脊髓、淋巴或红细胞谱系的细胞或其前体细胞)的活性(例如增生、分化和/或存活)，且因此可用以治疗各种免疫病症及过度增生性病症。可治疗的免疫病症的非限制性实例包括但不限于自身免疫病症，例如关节炎(其包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎，与狼疮有关的关节炎或强直性脊椎炎)、硬皮病、系统性红斑狼疮、HIV、舍格伦综合征、血管炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(其包括特应性皮炎及湿疹性皮炎)、重症肌无力、炎症性肠病(IBD)、节段性回肠炎、结肠炎、糖尿病(I型)；炎症例如皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统的炎症(例如阿尔茨海默病)、肝的炎症(例如肝炎)、肾的炎症(例如肾炎)及胰脏的炎症(例如胰腺炎)；心血管疾病，例如胆固醇代谢病、氧自由基损伤、局部缺血；与创伤愈合相关的病症；呼吸系统病症，例如哮喘及COPD(例如囊性纤维化)；急性炎症(例如内毒素血症、脓毒症及败血症、中毒性休克综合征及感染性疾病)；移植排斥及过敏。在一个实施方案中，与IL-22相关的病症为关节炎的病症，例如选自以下的一或多种的关节炎类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎或强直性脊椎炎；呼吸系统病症(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD))；或例如以下的炎症皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统(例如阿尔茨海默病)、肝的炎症(例如肝炎)、肾的炎症(例如肾炎)、胰脏的炎症(例如胰腺炎)，及胃肠器官的炎症(例如结肠炎)、节段性回肠炎及IBD；急性炎症，例如内毒素血症、脓毒症及败血症、中毒型休克综合征及感染疾病；多器官衰竭；呼吸性疾病(ARD)；淀粉样变性病；肾病，诸如肾小球硬化、膜状神经病变、肾动脉硬化、肾小球肾炎、肾的纤维增生疾病，以及其它肾机能异常及肾肿瘤。由于IL-22对上皮细胞有影响，所以可使用抗IL-22抗体以治疗上皮癌，例如癌、黑素瘤及其它。就在这些及其它病症中IL-22抑制作用的理论说明而言，见WO 03/083062(第58至75页)。
多发性硬化为中枢神经系疾病，其特征为髓鞘(其是保护神经且为合适神经机能所需的脂肪物质)的发炎及损失。起因于依赖IL-22的免疫应答的发炎可用本发明抗体及组合物治疗。在适于多发性硬化的实验性自身免疫性脑炎(EAE)的小鼠模型(Tuohy等人(J.Immunol.(1988)1411126-1130)、Sobel等人(J.Immunol.(1984)1322393-2401)，及Traugott(Cell Immunol.(1989)119114-129))中，在EAE诱导前注射GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11以治疗小鼠可显著地延缓疾病的发作。其可作为确认本发明抗体用途的模型。同样可使用本发明抗体以治疗人类的多发性硬化。
关节炎的特征为关节的炎症。类风湿性关节炎(RA)为关节炎的最常发形式，其包括结缔组织及滑膜(其是沿关节排列的膜)的发炎。发炎的滑膜通常可浸润关节并损害关节软骨及骨组织。IL-22及IL-22蛋白和/或转录物与这两种人类的疾病有关联。在RA滑液活检物中，IL-22蛋白在波形蛋白+(vimentin+)滑液成纤维细胞及一些CD68+巨噬细胞内检测到，而IL-22R是在滑液成纤维细胞内检测到。以IL-22治疗滑液成纤维细胞诱发单核细胞化学诱质蛋白质-1(MCP-1)的产生，以及一般的代谢活性(Ikeuchi，H.，等人(2005)Arthritis Rheum.521037-46)。IL-22的抑制剂改善类风湿性关节炎的症状(WO 2005/000897 A2；美国专利6,939,545)。可以使用本发明抗体治疗炎性细胞因子及趋化因子分泌的增加，且更重要的是，可治疗增加的起因于依赖IL-22的免疫应答疾病。类似地，本发明抗体及组合物可用以治疗人类RA及其它关节炎疾病。
移植非斥为其中得自供体的组织受宿主免疫细胞特异性地“攻击”的免疫学现象。主要“攻击”细胞为T细胞，其T细胞受体把供体的MHC分子认为是“外来者”。此识别作用活化T细胞，使其增殖并分泌最后破坏移植物的各种细胞因子及细胞溶解的蛋白质。MLR及移植模型已经在以下参考文献说明Current Protocols in Immunology，第2版，Coligan等人编著，JohnWiley & Sons，1994；Kasaian等人(Immunity(2002)16559-569)；Fulmer等人(Am.J.Anat.(1963)113273-285)，及Lenschow等人(Science(1992)257789-792)。本发明抗体及组合物可用以减少MLR并治疗依赖IL-22的人类的移植排斥及相关疾病(例如移植物抗宿主病)。
本发明抗体也可用以治疗与IL-22-反应性细胞及IL-22R/IL-10R2-反应性细胞的异常活性有关的过度增生性病症，其是通过施用足量的抗体以抑制或减少受试者体内IL-22和/或IL-22R和/或IL-10R2-反应性细胞的过度增生，因而使得抗体治疗或预防病症。IL-22及IL-22R在许多组织(包括胰脏、肺、皮肤、肠、肝脏、肾)的上皮细胞中组成型表达(Kotenko，S.V.等人(2001)J.Biol.Chem.2762725-32；Xie，M.H.等人(2000)J.Biol.Chem.27531335-9；Wolk，K.等人(2004)Immunity 21241-54)。此外，IL-22受体复合物也在得自已生病关节及正常肠的成纤维细胞的表面上表达(Ikeuchi，H.等人(2005)Arthritis Rheum.521037-46；Andoh，A.等人(2005)Gastroenterology 129969-84)。这些细胞类型的瘤性衍生物可以对IL-22具高反应性，因此可调节这些细胞在生物内的存活能力。所以可使用IL-22的抗体以抑制此类赘生物，例如鳞状细胞癌、基底细胞癌、移行细胞乳头状瘤及癌、腺瘤、腺癌、皮革状胃、胰岛腺瘤、胰升糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性肠多肽瘤、胆管癌、肝细胞癌、囊腺癌、阑尾类癌瘤、催乳素瘤、嗜酸粒细胞瘤、胡尔特尔细胞腺瘤、肾细胞癌、格拉韦茨瘤、多发性内分泌腺瘤、子宫内膜样腺瘤(endometroid adenoma)、子宫附件及皮肤附件瘤、黏液上皮瘤、囊状的，黏液蛋白状的及浆液状瘤、囊腺瘤、腹膜假黏液瘤、导管状，小叶状及髓状瘤、腺泡细胞瘤、复合上皮瘤、沃辛瘤、胸腺瘤、特殊的性腺瘤、生殖索基质瘤、泡膜细胞瘤、粒层细胞瘤、男性细胞瘤、塞-莱细胞瘤、嗜铬细胞瘤、嗜铬细胞瘤、血管球肿瘤、黑素细胞痣、恶性黑素瘤、黑素瘤、结节型黑素瘤、发育不良的痣、恶性雀斑样痣、表浅蔓延型黑素瘤或肢端色斑样黑素瘤。虽然在离体天然或活化免疫细胞上并末检测出IL-22受体，但是受体的失调可能使此类衍生性瘤性细胞对IL-22有反应且因此通过IL-22的抗体而抑制。
本发明另一方面的特征为降低、抑制或减少受试者的急性期反应的方法。该方法包括向受试者施用如文中所述的抗IL-22抗体或其片段，其施用量足以降低、抑制或减少该受试者的急性期反应。在一个实施方案中，该受试者为哺乳动物，例如罹患如文中所述与IL-22相关的病症(包括例如呼吸系统病症、炎症及自体免疫病)的人类。在一个实施方案中，以口服例如局部、皮下或非用在全身循环中的其它投药方法施用IL-22结合剂。
据信IL-22可局部性地发挥其发炎作用，例如与直接全身性作用不同，其通过以组织炎症的调节剂或调整剂的形式作用(例如直接作用)。因此使用，例如本发明抗IL-22抗体以抑制IL-22活性可得到比全身性消炎用药方式更有效(例如低毒性)的组织特异性消炎剂。而且，使用例如文中所述的抗IL-22抗体或其片段以抑制局部IL-22可得到适于与全身性消炎用药方式联合使用的有用候选物。
V.联合治疗 在一个实施方案中，在联合治疗中施用包含至少一种抗IL-22抗体及至少一种治疗剂的药物组合物。该治疗用于治疗病理症状或病症，诸如免疫及炎症。本文的术语“联合使用”意指实质上同时期(同时或连续)施用抗体组合物及治疗剂。在一个实施方案中，若连续施用，则于第二种化合物开始施用时，于治疗的位点仍可检测到有效浓度的这两种化合物中的第一种化合物。在另一个实施方案中，若连续施用，则于第二种化合物开始施用时，于治疗的位点并未检测到有效浓度的这两种化合物中的第一种化合物。
例如联合治疗可包括与至少一种其他其它治疗剂共配制，和/或共施用的至少一种抗IL-22抗体。其它药剂可包括如下文更详述的至少一种细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、消炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒剂及细胞生长抑制剂。在一个实施方案中，该其它药剂为用于治疗关节炎的标准药剂，其包括但不限于非类固醇类消炎剂(NSAID)；皮质类甾醇，其包括泼尼松龙、泼尼松、可的松及去炎松；及疾病改进的抗风湿病药剂(DMARD)，诸如氨甲蝶呤、羟氯喹(硫酸羟氯喹)及柳氮磺吡啶、来氟米特(来氟米特(Arava))；肿瘤坏死因子抑制剂，其包括伊那西普(etanercept)(Enbrel)、英夫单抗(Remicade)(具或未具有氨甲蝶呤)，及阿达木单抗(adalimumab)(Humira)抗Cd20抗体(例如灵吐忍(Rituxan))；可溶性白介素-1受体，诸如阿那白滞素(anakinra)(Kineret)、金、二甲胺四环素(盐酸二甲胺四环素)、青霉胺，及细胞毒剂，包括硫唑嘌呤、环磷酰胺及环孢霉素。此类联合治疗可有利地使用较低剂量的所施用治疗剂，因此可避免与各种单一疗法有关的毒性或并发症。而且，文中所公开的其它治疗剂可在IL-22/IL-22R/IL-10R2途径之外或与其不同的途径上作用，因此已预期增强抗IL-22抗体的作用和/或与其产生协同作用。
与抗IL-22抗体一起使用的治疗剂可以是于自体免疫的不同阶段及后续发炎反应中进行干涉的药剂。在一个实施方案中，至少一种文中所述的抗IL-22抗体可以与至少一种细胞因子和/或生长因子拮抗剂共配制，和/或共施用。拮抗剂可包括可溶性受体、肽抑制剂、小分子、配体融合物、抗体及其结合片段(其结合细胞因子或生长因子或其受体或其它细胞表面分子)，及“消炎细胞因子”及其激动剂。
可与文中所述的抗IL-22抗体联合使用的药剂的非限制性实例包括，但不限于以下至少一种的拮抗剂白介素(例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12(或其亚基p35或p40之一)、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A-F(包括其异源二聚体，例如IL-17A/IL-17F异源二聚体)、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21及IL-23(或其亚基p19或p40之一))；细胞因子(例如TNFα、LT、EMAP-II及GM-CSF)；及生长因子(例如FGF及PDGF)。药剂也可包括，但不限于白介素、细胞因子及生长因子的至少一种受体的拮抗剂。抗IL-22抗体也可与以下细胞表面分子的抑制剂(例如抗体或其结合片段)诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD20(例如灵吐忍)、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或其配体(例如CD154(gp39、CD40L))，或LFA-1/ICAM-1及VLA-4/VCAM-1联合使用(Yusuf-Makagiansar等人(2002)Med Res Rev22(2)146-67)。在特定实施方案中，可以与文中所述的抗IL-22抗体联合使用的拮抗剂可包括以下的拮抗剂IL-1、IL-12(或其亚基p35或p40之一)、TNFα、IL-15、IL-17A-F(包括其异源二聚体，例如IL-17A/IL-17F异源二聚体)、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21及IL-23(或其亚基p19或p40之一)及其受体。
此类药剂的实例包括IL-22拮抗剂(诸如结合IL-22的抗体(参见例如WO00/56772)或其亚基p35或p40之一)；IL-12受体抑制剂(诸如IL-12受体的抗体)；及可溶性IL-12受体及其片段。IL-15拮抗剂的实例包括抗IL-15或其受体的抗体、IL-15受体的可溶性片段及IL-15结合蛋白质。IL-18拮抗剂的实例包括IL-18的抗体、IL-18受体的可溶性片段，及IL-18结合蛋白质(IL-18BP，Mallet等人(2001)Ci rc.Res.28)。IL-1拮抗剂的实例包括白介素-1-转化酶(ICE)抑制剂(诸如Vx740)、IL-1拮抗剂(例如IL-1RA(ANIKINRA(或Kineret)、AMGEN))、sIL-1R II(Immunex)及抗IL-1受体抗体。
在一个实施方案中，联合治疗包括至少一种与抗IL-22抗体共配制，和/或共施用的拮抗剂，诸如IL-17A、IL-17F、IL-17A/IL-17F异源二聚体或IL-23(或其亚基p19或p40之一)的至少一种的抗体或其抗原结合片段或可溶性受体。
TNF拮抗剂的实例包括TNF(例如人TNFα)的抗体，诸如D2E7(人类抗TNFα抗体，美国专利6,258,562，HumiraTM，BASF)；CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗体，Celltech/Pharmacia)；cA2(嵌合型抗TNF抗体，RemicadeTM，Centocor)；及抗TNF抗体片段(例如CPD870)。其它实例包括可溶性TNF受体(例如人类p55或p75)片段及衍生物，诸如p55kd TNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白，LenerceptTM)及75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM，Immunex，参见例如Arthritis & Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med.(1996)第44卷，235A)。其它实例包括酶拮抗剂(例如TNFα转化酶抑制剂(TACE)，诸如α-磺酰基氧肟酸衍生物(WO 01/55112)或N-羟基甲酰胺抑制剂(GW3333、-005或-022))及TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白质，参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增补)，S284；及Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.(1995)第268卷，pp37-42)。TNF拮抗剂可以是可溶性TNF受体(例如人类p55或p75)片段及衍生物，诸如75kd TNFR-IgG；及TNFα转化酶(TACE)抑制剂。
在其它实施方案中，文中所述的抗IL-22抗体可以与下述的至少一种一起施用IL-13拮抗剂，诸如可溶性IL-13受体和/或抗IL-13抗体；及IL-2拮抗剂，诸如IL-2融合蛋白(例如DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2，Seragen，参见例如Arthritis & Rheumatism(1993)第36卷，1223)及抗IL-2R抗体(例如抗Tac(人源化抗体，Protein Design Labs，见Cancer Res.1990 Mar 1；50(5)1495-502))。另一种联合包括抗IL-22抗体与非耗尽性抗CD4抗体，诸如IDEC-CE 9.1/SB 210396(抗CD4抗体，IDEC/Smithkline)的组合。又一个其它组合包括抗IL-22抗体与共刺激性分子(诸如CD80(B7.1)及CD86(B7.2))的拮抗剂(诸如抗体、可溶性受体或拮抗性配体)；ICOSL、ICOS、CD28及CTLA4(例如CTLA4-Ig(atabacept))；P-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)；及消炎性细胞因子及其激动剂(例如抗体)的组合。消炎性细胞因子可包括IL-4(DNAX/Schering)；IL-10(SCH52000、重组IL-10、DNAX/Schering)；IL-13；及TGF。
在其它实施方案中，至少一种抗IL-22抗体可以与至少一种消炎药、免疫抑制剂、代谢抑制剂及酶抑制剂共配制，和/或共施用。可与文中所述的IL-22拮抗剂联合使用的药物或抑制剂的非限制性实例包括，但不限于以下的至少一种非类固醇类消炎药(NSAID)(诸如异丁苯丙酸(ibuprofen)、替尼达普(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增补)，S280))、萘普森(参见例如Neuro Report(1996)第7卷，pp.1209-1213)、美洛昔康、吡罗昔康、双氯酚酸钠，及吲哚美辛；柳氮磺吡啶(参见例如Arthritis& Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增补)，S281)；皮质类甾醇(诸如泼尼松龙)；细胞因子抑制性消炎药(CSAID)；及核苷酸生物合成的抑制剂(诸如嘌呤生物合成的抑制剂(例如叶酸盐拮抗剂，诸如氨甲蝶呤)及嘧啶生物合成的抑制剂(例如二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂，诸如来氟米特(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增补)，S131；InflammationResearch(1996)第45卷，pp.103-107))。适用于与IL-22/IL-22R或IL-22/IL-10R2拮抗剂联合使用的治疗剂可包括NSAID、CSAID、DHODH抑制剂(诸如来氟米特)，及叶酸盐拮抗剂(诸如氨甲蝶呤)。
其它抑制剂的实例包括以下的至少一种皮质类甾醇(口服、吸入及局部注射)；免疫抑制剂(诸如环孢霉素)及他克莫司(tacrolimus)(FK-506))；mTOR抑制剂(诸如西罗莫司(瑞帕霉素)或瑞帕霉素衍生物(例如酯类瑞帕霉素衍生物，诸如CCI-779(Elit.L.(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(8)1249-53；Huang，S.等人(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(2)295-304)))；可干扰促炎细胞因子信号传送(诸如TNFα及IL-1)的药剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)；COX2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib)及其变体(MK-966)，参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增补)，S81)；磷酸二酯酶抑制剂(例如R973401，参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增补)，S282)；磷脂酶抑制剂(例如胞质磷脂酶2(cPLA2)，诸如三氟甲基酮类似物(U.S.6,350,892))；血管内皮细胞生长因子(VEGF)的抑制剂；VEGF受体的抑制剂；及血管发生的抑制剂。适于与抗IL-22抗体联合使用的治疗剂可包括免疫抑制剂(诸如环孢霉素及他克莫司(FK-506))；及mTOR抑制剂(诸如西罗莫司(瑞帕霉素)或瑞帕霉素衍生物(例如酯瑞帕霉素衍生物，诸如CCI-779))；COX2抑制剂(诸如塞来昔布及其变体)；及磷脂酶抑制剂(诸如胞质磷脂酶2(cPLA2)的抑制剂(例如三氟甲基酮类似物))。
可以与至少一种抗IL-22抗体共施用和/或共配制的治疗剂实例包括，但不限于以下的至少一种TNF拮抗剂(诸如抗TNF抗体)；TNF受体(例如人类p55及p75)的可溶性片段及其衍生物(诸如p55kd TNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白，LenerceptTM)及75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM))；TNF酶拮抗剂(诸如TACE抑制剂)；IL-12(或其亚基p35或p40之一)、IL-15、IL-17A-F(包括其异源二聚体，例如IL-17A/IL-17F异源二聚体)、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22及IL-23(或其亚基p19或p40之一)的拮抗剂；T细胞及B细胞清除剂(depleting angent)(诸如抗CD4或抗CD22抗体)；小分子抑制剂(诸如氨甲蝶呤及来氟米特)；西罗莫司(瑞帕霉素)及其类似物(诸如CCI-779)Cox-2及cPLA2抑制剂；p38、TPL-2、Mk-2及MFκB抑制剂；RAGE及可溶性RAGE；P-选择蛋白及PSGL-1抑制剂(诸如其抗体及小分子抑制剂)；及雌激素受体β(ERB)激动剂及ERB-NFkb拮抗剂。可以与至少一种抗IL-22抗体共施用和/或共配制的治疗剂可包括以下的至少一种TNF受体(例如人类p55或p75)的可溶性片段，诸如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM)；氨甲蝶呤；来氟米特；及西罗莫司(瑞帕霉素)及其类似物(诸如CCI-779)。
文中公开的IL-22抗体可以与其它治疗剂联合使用以治疗如下文更详细讨论的特异性免疫病症。
可与抗IL-22抗体联合使用以治疗关节炎病症(例如类风湿性关节炎、发炎性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎及银屑病关节炎)的药剂的非限制性实例包括以下的至少一种TNF拮抗剂(诸如抗TNF抗体)；TNF受体(例如人类p55及p75)的可溶性片段及其衍生物(诸如p55kd TNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白，LenerceptTM)及75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM))；TNF酶拮抗剂(诸如TACE抑制剂)；以下的拮抗剂IL-12(或其亚基p35或p40之一)、IL-15、IL-17A-F(包括其异源二聚体，例如IL-17A/IL-17F异源二聚体)、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23(或其亚基p19或p40之一)及IL-24；T细胞及B细胞清除剂(诸如抗CD4、抗CD20或抗CD22抗体)；小分子抑制剂(诸如氨甲蝶呤及来氟米特)；西罗莫司(瑞帕霉素)及其类似物(例如CCI-779)；Cox-2及cPLA2抑制剂；NSAID；p38、TPL-2、Mk-2及NFκB抑制剂；RAGE或可溶性RAGE；P-选择蛋白或PSGL-1抑制剂(诸如小分子抑制剂及其抗体)；雌激素受体β(ERB)激动剂及ERB-NFκB拮抗剂。可以与至少一种IL-22/IL-22R/IL-10R2拮抗剂共施用和/或共配制的治疗剂可包括以下的至少一种TNF受体(例如人类p55或p75)的可溶性片段，诸如75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM)；氨甲蝶呤；来氟米特；及西罗莫司(瑞帕霉素)或其类似物(例如CCI-779)。
可与抗IL-22抗体联合使用以治疗多发性硬化的药剂的非限制性实例包括干扰素-β(例如IFN β-1a及IFN β-1b)、格拉太咪尔(copaxone)、皮质类甾醇、IL-1抑制剂、TNF抑制剂、CD40配体的抗体、CD80的抗体及IL-12拮抗剂，其包括结合IL-12(或其亚基p35或p40之一)的抗体。
可与抗IL-22抗体联合使用以治疗炎症性肠病或节段性回肠炎的药剂的非限制性实例包括布地萘德(budenoside)；上皮细胞生长因子；皮质类甾醇；环孢霉素；柳氮磺吡啶；对氨水杨酸烟肼；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂肪加氧酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉嗪；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化剂；凝血(thromboxane)抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基咪唑化合物；如文中所述的TNF拮抗剂；IL-4、IL-10、IL-13，和/或TGFβ或其激动剂(例如激动剂抗体)；IL-11；泼尼松龙、地塞米松或布地萘德的葡糖苷酸-或聚葡萄糖-缀合前药；ICAM-1反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(ISIS 2302；IsisPharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；慢释放的美沙拉秦(mesalazine)；氨甲蝶呤；血小板活化因子(PAF)的拮抗剂；环丙沙星；及利多卡因。
在其它实施例中，抗IL-22抗体可与至少一种针对涉及调节免疫应答(例如移植排斥或移植物抗宿主病)的其它靶标抗体联用。可与本发明IL-22/IL-22R/IL-10R2拮抗剂联合使用以治疗免疫应答的药剂的非限制性实例包括以下抗细胞表面分子的抗体，其包括但不限于CD25(IL-2受体α)、CD11a(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)或其组合。在另一个实施方案中，抗IL-22抗体与至少一种常用免疫抑制剂(诸如环孢霉素A或FK506)一起使用。
因此，本发明另一方面涉及实现抗IL-22抗体与其它治疗剂联合给药的药盒。在一个实施方案中，该药盒包含至少一种配制于药学载体中的抗IL-22抗体，及至少一种适当地配制于一或多种不同药学制剂中的治疗剂。
VI.诊断用途 抗体也可用以检测IL-22在生物样品中的存在。通过使这些蛋白质的含量与病况的相互关联，本领域技术人员可诊断有关的病症。例如IL-22诱发与通过发炎性细胞因子(诸如IL-1及TNFα)而导致的病症有关的变化，且IL-22的抑制剂可改善类风湿性关节炎的症状(WO 2005/000897A2)。可通过本发明抗体而诊断的代表性病症包括多发性硬化、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病、胰腺炎及移植排斥。
在本领域中已熟知基于抗体的检测方法，且包括ELISA、放射免疫分析、免疫印迹法、西方印迹法(Western blot)、流式细胞术法、免疫荧光、免疫沉淀及其它相关技术。可在包含至少一种这些方法的诊断试剂盒中提供抗体以检测IL-22。该试剂盒可含有其它组分、包装材料、说明书或有助于检测该蛋白质及试剂盒使用的其它材料。
抗体可被可检测标记(包括配体基团(例如生物素)、荧光团及发色团、放射性同位素、电子稠密剂(electron-dense reagents)或酶修饰。酶是通过其活性而检测。例如辣根过氧化物酶是通过其将四甲基联苯胺(TMB)转化成蓝色颜料的能力而检测，使用分光光度计定量。其它合适的结合配偶体包括生物素及抗生物素蛋白、IgG及蛋白质A，及本领域中已知的其它受体-配体对。
抗体也可以与至少一种其它分子实体(包括诸如另一种抗体(例如双特异性或多特异性抗体)、毒素、放射性同位素、细胞毒剂或细胞生长抑制剂)功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方法)。其它置换法及可能使用的方法为一般技术人员所知，且这些方法被视为属于本发明范围的同等物。
VII.药物组合物及给药方法 本发明特定实施方案包括含所公开抗体的组合物。组合物可适于药学用途及向病患施用。组合物包含本发明的抗体及药学辅药。如文中使用，“药学辅药”包括溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗压剂及吸收延缓剂等，这些辅药皆可以与药学给药相容。本领域技术人员已熟知这些适用于药学活性物质的试剂。组合物也可含有提供补充性、其它的或增强治疗功能的其它活性化合物。药物组合物也可包含具有给药说明的容器、小包或配药器中。
本发明药物组合物是经配制而适合其计划的给药方式。进行给药的方法为本领域普通技术人员所知。可局部或以口服方式或能够通过黏膜输送的方式而施用药物组合物。药物组合物的给药实例包括口服或吸入。也可进行静脉、腹膜内、肌内、腔内、皮下、皮肤或经皮给药。
用于皮内或皮下给药的溶液或悬浮液通常包括以下组分的至少一种无菌稀释剂，诸如水、盐水溶液、不挥发油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；及渗性剂(tonicity agents)，诸如氯化钠或右旋糖。该pH可经酸或碱调整。此类制剂可包封在小玻璃管、一次性注射器或多剂量小玻瓶 用于静脉给药的溶液或悬浮液包括载体，诸如生理盐水、制菌剂、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)、乙醇或多元醇。就一切情况而言，该组合物必需无菌且为容易注射的流体。通常可使用卵磷脂或表面活化剂以获得合适流动性。在制备及贮存的条件下，组合物也必需具稳定性。可使用抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等)以防止微生物。在许多情况下，组合物可包含等渗剂(糖)、多元醇(甘露糖醇及山梨糖醇)或氯化钠。可通过添加能延缓吸收的药剂(例如单硬脂酸铝及明胶)而延长组合物的吸收。
口服组合物包括惰性稀释剂及食用载体。可将组合物包封在明胶内或压制在片剂内。就口服而言，抗体可与辅药合并，然后放入片剂、含片或胶囊内。组合物可包含药学上相容的结合剂或佐剂物质。片剂、含片及胶囊可含有(1)结合剂，诸如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；(2)辅药，诸如淀粉或乳糖；(3)崩解剂，诸如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；(4)润滑剂，诸如硬脂酸镁；(5)助流剂，诸如胶态二氧化硅；或(6)甜味剂或调味剂。
也可通过经黏膜或经皮方式而施用组合物。例如含Fc部分的抗体可穿越肠、口或肺(通过Fc受体)内的黏膜。可通过使用锭剂、鼻腔喷雾剂、吸入器或栓剂而进行经黏膜给药。也可通过使用含本领域已知的油膏、软膏、凝胶或乳膏的组合物而进行经皮给药。就经黏膜或经皮给药而言，使用适于待渗透屏障的渗透剂。就吸入给药而言，自含有推进剂(例如液体或气体)或雾化器的加压容器或分配器以喷雾剂形式递送抗体。
在特定实施方案中，使用保护抗体免于自身体快速消除的载体制备本发明抗体。通常使用生物可分解的聚合物(例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚乳酸)。此类配方的制法为本领域技术人员所知。脂质体悬浮液也可作为可药用载体。可根据本领域中已确定的方法制备脂质体(美国专利4,522,811)。
本发明抗体或抗体组合物以如所述的治疗有效量施用。治疗有效量可根据病患年龄、病况、性别，及病情的严重性而不同。医生根据临床指征而决定合适剂量。可以以团注剂量提供抗体或组合物而使最长时间下的抗体的循环量最大化。该团注剂量后，也可使用连续输注。
如文中使用，该术语“病患”是有意包括人类及非人类动物。病患可包括罹患以表达IL-22的细胞(例如癌细胞或免疫细胞)为特征的病症的人类病患。本发明术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，诸如非人类的灵长类、棉羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
可向病患施用的剂量范围的实例可选自1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至100μg/kg、100μg/kg至1mg/kg、250μg/kg至2mg/kg、250μg/kg至1mg/kg、500μg/kg至2mg/kg、500μg/kg至1mg/kg、1mg/kg至2mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至20mg/kg、15mg/kg至20mg/kg、10mg/kg至25mg/kg、15mg/kg至25mg/kg、20mg/kg至25mg/kg及20mg/kg至30mg/kg(或更高)。根据剂量、给药方法、欲治疗的病症或症状及个别病患的特征，这些剂量可每日、每周、双周、每月或较低频率，例如一年两次施用。也可通过连续输注(诸如通过泵)而施用剂量。所施用剂量也可取决于给药途径。例如皮下给药所需的剂量高于静脉给药。
在特定情况下，最好可以以剂量单位形式配制组合物以容易给药及获得该剂量的均匀性。如文中使用的剂量单立形式是指适于病患的实际上各别的单位。各剂量单位含有经计算可产生治疗作用的预定量抗体与载体。该剂量单位取决于抗体的特征及欲获得的特定治疗作用。
可在细胞培养物或实验动物中通过标准药学方法而测定组合物的毒性及治疗效力，例如测定LD50(50％群体致死的剂量)及ED50(50％群体有治疗效果的剂量)。毒性作用与治疗作用间的剂量比为治疗指数且其可以以LD50/ED50的比率表示。具有大治疗指数的抗体可以具低毒性和/或更具治疗上有效性。
可使用得自细胞培养物分析及动物研究的资料以配制适用于人类的剂量范围。这些化合物的剂量在于血液内循环抗体浓度的范围内，其包括几乎没有或无毒性的ED50。根据所使用剂量组合物形式及给药途径，剂量在该范围内可不同。就用于本发明的任何抗体而言，可首先使用细胞培养物分析法以估计治疗有效剂量。可以在动物模型中调配剂量以获得包括IC50(即获得症状的最大抑制作用半数的抗体浓度)的循环血浆浓度。通过合适生物分析法而监测任何特定剂量的效用。合适的生物分析法的实例包括DNA复制分析、基于转录的分析、IL-22/IL-22R结合分析、IL-22/IL-10R2结合分析、IL-22/IL-22R/IL-10R2及其它免疫学分析法。
实施例 实施例1抗IL-22scFv’s的选择 亲本GIL01及GIL68的选择 通过在IL-22上进行可溶性选择而自scFv文库分离GIL01及GIL68。使用生物素酰化的IL-22及N-末端His/FLAG标记的蛋白质(bio.IL-22H/F)进行可溶性选择。首先使用100nM浓度的Bio.IL-22H/F。使用scFv噬菌粒文库，其是所述该1.38×1010文库(Vaughan等人，1996)的扩增版，以选择对IL-22具特异性的抗体。在100μl 3％ MPBS(3％奶粉的PBS溶液)内封闭纯化scFv噬菌体(1012转导单位(tu))30分钟，然后添加bio.IL-22H/F并于室温下培育1小时。添加噬菌体/抗原至50μl Dynal M280链霉抗生物素(Streptavidin)磁珠(其已经于37℃下在1ml 3％ MPBS中封闭一小时)，然后于室温下再培育15分钟。使用磁性装置架捕获磁珠并在1ml 3％ MPBS/0.1％(v/v)Tween 20内洗涤4次，继而在PBS中洗涤3次。最后一次洗涤后，使磁珠再悬浮于100μl PBS内，并用以感染5ml指数生长期的大肠杆菌TG-1细胞。于37℃下培育磁珠上的细胞及噬菌体一小时(30分钟静止，于250转/分钟下摇动30分钟)，然后涂布在2TYAG平皿上。于30℃下过夜培育平皿，并于隔天可视菌落。并将平板上菌落刮落移入10ml 2TY肉汤内并添加15％甘油以方便于-70℃下贮存。
使得自第一轮淘选的甘油储备培养物经辅助噬菌体超感染并复苏以得到适用于第二轮选择的scFv抗体表达噬菌体颗粒。如上述进行第2及第3轮可溶性选择，使bio.IL-22H/F的浓度降至50nM。
亲本GIL16、GIL45、GIL60及GIL92的分离 通过在IL-22融合蛋白进行淘选及在bio.IL-22H/F上进行可溶性选择的组合而自scFv文库分离GIL16、GIL45、GIL60及GIL92。以10μg/ml(Dulbecco氏PBS，pH 7.4)人IL-22融合蛋白包被微量滴定板的各孔并于4℃下培育过夜。在PBS内洗涤各孔并于37℃下在3％ MPBS中封闭2小时。添加纯化噬菌体(1012tu)的100μl 3％MPBS溶液至封闭的各孔并于室温下培育一小时。以PBST(含0.1％v/v Tween 20的PBS)洗涤各孔共10次，然后以PBS洗涤10次。于37℃下以100μl胰蛋白酶溶液(在50mM Tris pH8、1mM CaCl2内的0.5μg/ml胰蛋白酶)洗脱结合的噬菌体颗粒30分钟。使用该洗脱的噬菌体感染10ml指数期生长的大肠杆菌TG1。如上述，于37℃下使感染的细胞在2TY肉汤内生长一小时，然后在2TYAG平皿上划线接种并于30℃下培育一夜。自平皿刮落长出菌落并如上述复苏噬菌体。使用100nM bio.IL-22H/F，如上述进行第二轮可溶性选择。
实施例2ScFv阻断IL-22与IL-22R的结合 在亲本抗体GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68及GIL92上进行抑制试验以鉴定阻断或改变IL-22结合至IL-22R和/或IL-22受体复合物的抗体。筛选含scFv的胞质粗提物的抑制bio.IL-22H/F结合至人IL-22受体蛋白质(hIL-22R)的能力。将自选择法长出的菌落挑取入含100μl 2TYAG的96孔平皿内。通过添加1mM IPTG至指数生长期的培养物内并于30℃下培育一夜而诱发ScFv的产生。在50mM MOPS(pH 7.4)/0.5mM EDTA/0.5M山梨糖醇内制备胞质提取物(Griffiths等人，1993)。
于室温下以1.25μg/ml的IL-22受体蛋白质抗体(在PBS中)包被微量滴定板1.5小时。然后在PBS中洗涤板共3次，并于室温下用含2％奶粉的PBS(2％MPBS)封闭一小时。再洗涤3次后，添加含IL-22受体蛋白质的50μl25％细胞条件培养基至各孔，并于4℃下培养一夜。隔天，添加25μl样品及25μl bio.IL-22H/F(在PBS/0.05％ BSA/0.05％ Tween中54ng/ml)至该洗涤的板内，并于室温下培养1.5小时。在PBST中洗涤3次后，以铕-链霉抗生物素检测bio.IL-22H/F的结合作用，并以

试剂试剂盒及Victor 2TMPlate Reader(Perkin Elmer)检测TRF。
如纯化的scFv，再测试显示抑制IL-22结合的克隆。使用该IL-22/IL-22R结合分析(如上述)及IL-22/IL-22受体复合物分析(如下述)。用滴定法测定ScFv浓度以确认如通过分析IC50值所测定的克隆效价。使用GraphPad Prism软件及四参数逻辑方程曲线拟合法以测定这些效价。得自IL-22受体复合物分析的试样结果示于图1中。
实施例3通过噬菌体ELISA而证实IL-22的结合作用 为确定scFv’s对IL-22的特异性，使用IL-22融合蛋白、IL-22H/F及非相关蛋白质进行噬菌体ELISA。在每孔含100μl 2TYAG培养基的96孔板内接种含噬菌粒的单个大肠杆菌菌落。添加M13K07辅助噬菌体至指数生长期的培养物内，使感染复数(moi)达到10，并于37℃下再培育板一小时。在台式离心机内以2000转/分钟离心处理板10分钟。移除上清液并使细胞沉淀再悬浮于100μl 2TYAK中，然后在摇动下，于30℃培育一夜。隔天，以2000转/分钟离心处理板10分钟，并将得自各孔的100μl含噬菌体的上清液移至新的96孔板内。于室温下在最终浓度为3％MPBS内封闭噬菌体样品一小时。
以1μg/ml IL-22融合蛋白、IL-22H/F或不相关蛋白质包被微量滴定板并于40℃下培养一夜。包被后，自各孔移除溶液，并于室温下在3％ MPBS中封闭板一小时。以PBS冲洗板，然后添加50μl预封闭的噬菌体至各孔内。于室温下培育板一小时，然后先后经3种改变的PBST及3种改变的PBS洗涤。添加50μl抗M13-HRP缀合物(Pharmacia)的1:5000稀释液至各孔内，并于室温下培育该板一小时。将板用PBST洗涤3次，然后用PBS洗涤3次。添加50μlTMB底物至各孔内并进行培育，直到显色为止。通过添加25μl的0.5M H2SO4而中止该反应，且测定于450nm下的吸光度。这些实验确认scFv克隆对IL-22的特异性结合作用。
实施例4scFv转化成IgG 以克隆特异性引物扩增得自scFv克隆的重及轻链V区。以合适限制酶消化PCR产物并亚克隆入含有人类IgG4重链恒定结构域(就VH结构域而言)的载体内或若合适，克隆入含有人类λ或κ轻链恒定结构域(就VL结构域而言)的载体内。测定VH及VL片段最接近的人类种系化物并使用该数据以表明是使用κ还是λ轻链恒定结构域(表4)。通过将得自个别大肠杆菌菌落的质粒DNA测序而证实V区域结构域正确地插入质粒内。通过标准技术从大肠杆菌培养物制备质粒，并使用标准技术将重及轻链构建体共转染入HEK 293EBNA细胞内。使用蛋白质A琼脂糖(Pharmacia)并将缓冲剂换成PBS而纯化分泌的IgG。
表4IL-22中和克隆的VH及VL种系化物 在如下述的生物化学IL-22受体复合物抑制试验中证实纯化IgG的效价。以滴定法测定IgG浓度以获得效价值。样品效价数据示于表5内。
表5IL-22scFv及IgG在IL-22受体复合物抑制作用试验中的效价 实施例5最优化IL-22抗体 基本上如Hanes等人(2000)所述，产生并筛选大核糖体展示文库的特异性识别重组人IL-22的scFv’s。首先使5种亲本克隆(GIL01、GIL16、GIL60、GIL68及GIL92)转化成核糖体展示格式，接着使用该模板产生文库。在DNA水平，添加T7启动子于5′-端以有效转录为mRNA。在mRNA水平，为了获得mRNA稳定性构建体而包含原核性核糖体结合位点(Shine-Dalgarno序列)及5′&3′茎环。在单链的3′末端处，移除终止密码子并添加一部分gIII以作为间隔物以允许离开核糖体管道的scFv折叠(Hanes等人，2000)。
衍生自前导克隆的核糖体展示文库通过使用具有非校正读码Taq DNA聚合酶的PCR进行该单链互补决定区的诱变而产生。进行基于亲和性的选择法，其中文库是先后与bio.IL-22H/F及链霉抗生物素包被的顺磁性小珠(Dynal M280)培育。通过磁性分离法而回收三聚复合物(mRNA-核糖体-scFv)，并洗掉未结合复合物。然后通过如所述的RT-PCR而救回编码结合scFvs的mRNA(Hanes等人，2000)，并在减少bio.IL-22H/F的浓度(在5轮操作内自100nM减至10pM)下，重复选择方法。
引入易错PCR以进一步增加文库大小。根据Cadwell及Joyce的方法(1992)，所使用的错误率在标准PCR反应后产生每1,000bp平均7.2次突变。在第一及第二轮选择间进行初次易错PCR反应。
在进行第二或第四轮选择后，自VH及VL CDR核糖体展示技术产物制备各亲本克隆的VH/VL重组文库。使用克隆特异性引物使特定谱系的VH CDR选择产物的VH部分经PCR特异性扩增。分别扩增相同谱系的VL CDR选择产物的VL部分。通过重叠PCR反应而重组这两种PCR产物。其可产生含所有再进行核糖体展示技术选择所需组分的scFv产物的完整文库。
就某些克隆而言，也使用噬菌体展示文库。使用具合适引物的PCR反应通过单链CDR的诱变而产生噬菌体文库，并如上述进行选择。这些产物也与核糖体展示技术选择产物组合以产生VH/VL重组文库。得自第四轮核糖体展示技术的VH选择产物及得自第三轮噬菌体展示技术的产物与得自相同谱系的VL产物重组。使用克隆特异性引物及重叠PCR以产生VH/VL重组文库。如上所述，在核糖体展示格式中持续进行使用可溶性bio.IL-22H/F的选择。将选择产物的scFv区定向插入pCANTAB6中以产生适于生物化学高通量筛选的scFv产物。
实施例6最优化克隆的鉴定 使用两种分析法以进行选择产物的高通量筛选。在均相性时间分辨荧光分析法(homogeneous time resolved fluorescence assay)

CisBiointernational)中筛选衍生自GIL01、GIL16及GIL68的产物，而在

(Perkin Elmer)分析法中筛选GIL60及GIL92产物。
HTRF

表位竞争分析法 如上述制备含得自GIL01、GIL16及GIL68产物克隆的粗scFv培养物上清液，并在HTRF分析中筛选bio.IL-22H/F结合GIL68的抑制作用。
在分析缓冲剂(PBS/0.4M KF/0.05％ BSA/0.05％ Tween)中将Cryptate标记的GIL68 IgG(得自Cis Biointernational的标记试剂盒)稀释400倍，继而添加7.5nM链霉抗生物素XL665(Xlent，Cis Biointernational)。使溶液在Packardblack 384 well Optiplate(Perkin Elmer)中与粗scFv样品(稀释125倍)，及bio.IL-22H/F混合。于室温下培育板一小时，然后使用Victor 2TM板测读机(PerkinElmer)读取。使用665nM/620nM发射光比以计算各孔中特异性结合的百分比。


时间分辨的荧光分析法 筛选GIL60及GIL92产物克隆对bio.IL-22H/F与IL-22受体复合物结合的抑制。
以IL-22受体复合物抗体(在PBS中1μg/ml)包被微量滴定板，并于室温下培养1.5小时。在PBST中洗涤板共3次，并于室温下用2％ MPBS封闭一小时。再进行3次洗涤后，添加含IL-22受体复合物的稀释的细胞条件培养基并于4℃下培育一夜。如上述制备粗ScFv上清液。隔天，添加25μl稀释的scFv样品及25μl bio.IL-22H/F(6ng/ml)至洗涤的板内，并于室温下培育1.5小时。在PBST中洗涤板共3次，然后使用铕-链霉抗生物素及

试剂试剂盒(Perkin Elmer)以检测bio.IL-22H/F与IL-22受体复合物的结合作用。使用Victor 2TM板式测读机(Perkin Elmer)测定时间分辨的荧光。
在如上述的

IL-22受体复合物竞争试验中测试得自经筛选所确认的阳性克隆的纯化scFv。使用scFv浓度的滴定测量法以确认如通过试验中的IC50值而测定的克隆效价。样品结果示于图2中。14种最优化克隆被称为097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11。
实施例7最优化克隆在BAF3-IL-22增殖试验中的分级 进行增殖试验以评估抗体阻断IL-22介导的BaF3细胞增殖的能力。通过用hIL-22R-GFP及hIL10R2-YFR共转染BaF3细胞而产生表达hIL22R/hIL10R2的BaF3细胞。通过FACS分选并收集表达hIL22R及hIL10R2(BaF3-IL-22受体细胞)的BaF3细胞。
在具有10％FBS及1ng/ml鼠IL-3的RPMI1640内常规维持BaF3-IL-22受体细胞。试验开始前不久，在试验培养基(具有10％ FBS、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI 1640)中洗涤细胞共4次，悬浮在试验培养基内并于37℃、5％CO2下培育6至8小时。为了制备试验板，添加100μl细胞(在试验培养基中1×105个/ml)至96孔平底组织培养板(Costar)的中央60孔内。通过在试验培养基内稀释储备样品，继而通过0.22μM滤器过滤而制备测试scFv或IgG样品。在分别的稀释板中制备连续5倍的样品稀释液。先后以50μl样品及50μl人IL-22(在试验培养基内40ng/ml)处理含细胞的各孔，然后于37℃在5％CO2下培育40小时。对照孔仅包含培养基及仅包含细胞或在10ng/ml人IL-22的存在下包含细胞。
添加20μlAlamar蓝(Serotec)至各孔中，继而于37℃在5％CO2下培育5小时±30分钟而检测细胞增殖。在进行荧光测定(激发光＝560nm，发射光＝590nm)前，温和轻拍而混合板以确保信号均匀地遍及各孔。使用4参数逻辑曲线拟合法(Graphpad Prism 2软件)以估计EC50及IC50值，并使用该值对抗体评定分级。最优化的scFv及IgG的样品效价数据示于表6中。
表6.在BaF3-IL-22增殖试验中的scFv及IgG克隆的IC50值 ★GIL92衍生的克隆如种系化IgG而检测。
实施例8种系化 使用6种亲本克隆的序列数据以确认各克隆重链及轻链的最接近种系序列。使用标准定点诱变以合适诱变引物进行合适的突变。通过测序而确认序列的突变。种系化克隆及其scFV与VH及VL结构域的序列示于表7中。在如先前所述的生物素酰化的IL-22结合IL-22受体复合物竞争试验中测试得自种系化亲本克隆的纯化scFv，以确立如通过在试验中的IC50值而测定的克隆效价。结果总结在表8内。
表7A种系化抗体(GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09及087B03)的VH及VL结构域、Fv及CDR的氨基酸及核苷酸序列 表7B种系化抗体(166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04)的VH及VL结构域、Fv及CDR的氨基酸与核苷酸序列 表8在IL-22受体竞争试验中非种系化及种系化亲本克隆的ScFv效价
如上述将9种最优化抗体种系化。在如上述的BaF3-IL-22增殖试验中测试8种种系化IgG。得自代表性实验的抗体IC50值示于表9中。
然后将抗体序列送至GENEART North America(28 Kirk Bradden Rd.East，Toronto，ON，Canada M8Y2E6)，在那里使用GENEART的专利最优化算法合成用于在CHO细胞中最优化表达的抗体。
表9在BaF3-IL-22R增殖试验中，种系化的最优化克隆的IgG效价 ★样品含有沉淀物 ND＝未测定 实施例9抗体抑制IL-22诱导的HT29细胞分泌GROa 进行GRO试验以评估抗体阻断IL-22诱导的HT29细胞分泌GRO的能力。将HT29细胞接种在含DMEM培养基(DMEM+10％ FBS+100U/ml青霉素及链霉素+2mM谷氨酰胺)的96孔平底组织培养板(Corning Inc.Cat.#3595)内(5×104个/孔)。在DMEM培养基内使10ng/ml IL-22与经系列稀释的抗体混合并于37℃下培育30分钟。接种后24小时，自HT29细胞移除培养基，并添加预混的IL-22及抗体到96孔板的细胞内。
于37℃在5％ CO2下培育48小时后，收集培养基并使用人GROa免疫分析试剂盒(R&D Systems，Cat.DGR 00)，根据厂商的指示以测试分泌的GROa。结果示于图3中。
实施例10抗体结合并抑制不同物种的IL-22 测定种系化及非种系化的最优化抗体的跨物种反应性的方法如下以1μg/ml大鼠、小鼠或人IL-22或人IL-26在PBS缓冲剂中的溶液包被ELISA板(Costar，Cat.#3590)一夜。将板用PBST缓冲剂(PBS中含0.05％ Tween 20)洗涤3次，然后于室温下用1％ BSA(Sigma A8918)/PBST封闭一小时。以1μg/ml的浓度添加抗体，于25℃下培育一小时。洗涤板，然后添加HRP缀合的山羊抗人IgG抗体(Southern Biotech Association，Cat.#2040-05)。于25℃下培育板一小时，然后用PBST洗涤，并用TMB(KPL，Cat.#50-76-04)显色。以0.18M H2SO4中止反应。于OD 450nm下读取板。结果示于图4中。
也在GROa细胞试验及BaF3-22增殖试验中评估这些抗体。如表10(a)及10(b)中所示，抗体阻断人类、猴子、大鼠及小鼠IL-22通过人IL-22受体的信号传送活性。如实施例11中进一步所讨论，使用实时生物特异性相互作用试验(BIA)，也证明356A11及368D04对鼠、大鼠及猴子IL-22具跨物种反应性。
表10(a).如在基于GROa细胞的分析系统中所示，IL-22抗体能强有力地阻断其它物种的IL-22。所示数值代表以pM表示的IC50值。
表10(b).如在基于BaF3细胞的分析系统中所示，IL-22抗体能强有力地阻断其它物种的IL-22。所示数值代表以pM表示的IC50值。
实施例11比较大鼠抗IL-22单克隆抗体与人抗IL-22单克隆抗体的结合动力学 通过实时生物特异性相互作用试验(BIA)，使用表面等离振子共振技术以评估人类单克隆抗IL-22抗体(356A11及368D04)及大鼠单克隆抗IL-22抗体(得自WO 2005/000897及WO 02/068476的P3/3(Ab-02)与P3/2(Ab-04))对人IL-22的结合动力学。
为了制备适于大鼠单克隆抗体的生物传感器表面，使用胺偶合法将蛋白质A/G(Pierce #21186，Rockford，IL)固定在研究级羧甲基葡聚糖芯片(CM5)上。以EDC/NHS活化该表面。以50μg/ml的浓度注入蛋白质A/G乙酸钠缓冲剂(pH 4.0)。以蛋白质A/G的3000(RUs)为目的，使用精灵工具(wizardtools)进行固定化作用。以1.0M乙醇胺(pH 8.0)封闭剩下的活化基团。使用第一个流动细胞作为参考表面以校正整体折射率、基质效应及非特异性结合。以捕获分子包被第2、第3及第4个流动细胞。通过注入30μl的1μg/ml溶液而在蛋白质A/G表面上捕获结合蛋白质A/G的大鼠单克隆抗体Ab-02及Ab-04。完成Ab-02或Ab-04注入后，基线与约90秒的时间点间的净差异代表配体结合的量。
为了制备适于人类单克隆抗体的生物传感器表面，使用标准胺偶合法将人单克隆抗体(356A11或368D04)或对照抗体固定在研究级羧甲基葡聚糖芯片(CM5)上。以EDC/NHS活化该表面。以1μg/ml的浓度将捕获抗体乙酸钠缓冲剂(pH 5.5)注入。以1.0M乙醇胺(pH 8.0)封闭剩下的活化基团。使用第一个流动细胞作为参考表面以校正整体折射率、基质效应，及非特异性结合。以捕获分子包被第2、第3及第4个流动细胞。
就Ab-02及Ab-4而言，于每分钟30μl的流速一份三次，注入300、100、50、25、12.5、6.4、3.2、1.6及0nM浓度的人IL-22溶液，费时3分钟，且记录作为时间函数的结合物质的量以作为感应图。于相同的流速下在HBS/EP缓冲剂中监测解离相10分钟，继而注射5μl的0.1％ TFA及5μl的甘氨酸(pH 1.5)以再生完全活性的捕获表面。
就356A11及368D04而言，于每分钟100μl的流速(高流量可避免非特异性结合)下以一份三次，注入400、200、100、50、25、12.5、6.25及0nM浓度的人IL-22溶液，费时3分钟，并记录以时间为函数的结合物质的量以作为感应图。于相同的流速下在HBS/EP缓冲剂中监测解离相60分钟，继而注射5μl甘氨酸(pH 1.5)共两次以再生完全性的捕获表面。
于22.5℃下在HBS/EP缓冲剂内进行所有动力学实验。使用双参考分析，自各感应图减掉空白及缓冲剂效应。在对照实验中，第一次注射包含缓冲剂。
使用适用1:1模型的BIA评估软件3.0.2分析动力学数据。使用整体分析，自感应图的合适区域计算出表观解离(Kd)及结合(Ka)率常数。通过以下公式而自动力速率常数计算出抗体与分析物相互作用的亲和性常数KD＝Kd/Ka，其中KD为解离常数，且KA＝Ka/Kd，其中KA为结合常数，Ab-02及Ab-04的结合数据总结在表11A及11B中。356A11及368D04的结合数据总结在表12中。
表11A.人IL-22与抗IL-22抗体Ab-02及Ab-4的相互作用的动力学参数 表11B.用于人IL-22的大鼠单克隆抗体的动力学数据 表12.用于人IL-22的人类单克隆抗体的动力学数据 这些结果显示本发明人单克隆抗IL-22抗体对人IL-22的亲和性显著高于如WO 2005/000897及WO 02/068476中所述可中和人IL-22的大鼠单克隆抗IL-22抗体，Ab-02及Ab-04。更明确地，356A11对人IL-22的解离常数(KD＝5.40×10-11M或0.054nM)分别比Ab-02(KD＝5.22×10-8M或52nM)及Ab-04(KD＝2.38×10-9M或2.38nM)大约1000倍或超过40倍。类似地，368D04(KD＝1.32×10-10M或0.132nM)对人IL-22的亲和性分别比Ab-02及Ab-04强约400倍及18倍。356A11及368D04对猴子、鼠及大鼠IL-22的结合特性与其对人IL-22的结合特性类似(未显示数据)。
也使用BIA评估356A11及368D04的结合特异性。任一种抗体皆无显示与人类IL-10、人类IL-19、人类IL-20、人类IL-24、人类IL-28A、人类IL-29、人类IFN-α2c或人类IFN-ω的交叉反应(未显示数据)。
实施例12抗人IL-22抗体的体内半衰期 本发明抗人IL-22抗体具有长的体内半衰期。例如356A11及368D04在DBA/1小鼠中的体内半衰期为8天。更明确地，对DBA/1小鼠以腹膜内注射的方式施用356A11或368D04的单一剂量(16mg/kg)。使用人类IgG1 ELISA，自小鼠的血清检测出356A11及368D04抗体。356A11及368D04血清浓度的时间过程示于图11A及11B中。356A11及368D04的PK参数总结在下表13中。
表13.356A11及368D04的PK参数 实施例13关节炎的治疗 关节炎的特征为关节发炎。类风湿性关节炎(RA)为最常见的关节炎形式，其包括结缔组织及滑膜(其是沿关节排列的膜)的炎症。已发炎的滑膜通常浸润关节并损害关节软骨及骨组织。IL-22及IL-22R蛋白质和/或转录物皆与人类疾病有关。在RA滑液活体组织检查中，在波形蛋白+滑液成纤维细胞及一些CD68+巨噬细胞中检测出IL-22蛋白，而在滑液成纤维细胞中检测出IL-22R。以IL-22治疗滑液成纤维细胞诱导了单核细胞化学诱质蛋白质-1(MCP-1)，以及一般的代谢活性产生(Ikeuchi，H等人(2005)Arthritis Rheum.521037-46)。
使用IL-22以研究其对得自滑膜(沿关节排列的膜)的细胞的影响。自进行关节手术的类风湿性关节炎病患的滑液组织分离人类成纤维细胞样的滑膜细胞(HFLS)(Cell Applications(San Diego，CA))。使HFLS与人IL-22培养48小时，移除上清液并通过ELISA而测试趋化因子及细胞因子。IL-22可增加HFLS分泌趋化因子(MCP-1、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)及IP-10)，及细胞因子(TNFα、IL-6及IL-8)。在本领域中已知这些趋化因子及细胞因子可通过许多活性而引起发炎，且由IL-22导致的关节内其浓度的增加将使炎症及RA恶化。
使用356A11及368D04抗体以检查人类抗IL-22抗体改善胶原诱导的关节炎(CIA)的症状的能力。CIA为用于研究类风湿性关节炎的标准小鼠及大鼠模型，参见例如Holmdahl等人，(2002)Ageing Res.Rev.，1135。第0天时，以皮下注射方式对雄性DBA/1(Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)小鼠尾的基部注射100μg在完全弗氏佐剂中的牛II型胶原(Chondrex，Redmond，WA)，并在第21天时，再对小鼠注射100μg在不完全弗氏佐剂中的牛II型胶原以用以加强。
至少每周两次监测小鼠的疾病演变过程。使用总爪评估将该疾病严重性评分如下0＝无肿胀，1＝1至2已肿胀趾或已肿胀踝，2＝超过2个已肿胀趾或轻度的爪肿胀，3＝严重(extensive)的爪肿胀，4＝爪关节强直。胶原注射后，注射同种型对照抗体的小鼠渐进性地发展出疾病。使用356A11或368D04进行治疗可显著减少疾病演变。以上为盲试验，因此研究者并不清楚哪组动物接受哪种抗体，直到研究结束为止。
评估不同剂量356A11及368D04。当治疗组中10％小鼠的疾病严重性评估为至少1时，开始进行356A11或368D04(或人类IgG1λ同种型对照抗体)的治疗。以各种频率施用抗体每隔一天，每周一次或每周两次，且监测小鼠的疾病演变。如在图12A-B、13及40-41中所示，在多项研究中，每隔一天施用8或16mg/kg的356A11可显著阻断CIA的演变。4个分别的CIA研究(图13A-D)，每隔一天以8mg/kg的356A11进行测试显示在鼠CIA模型中，356A11抗体可一致性地阻断疾病演变。令人惊讶的是，如图14-15、41及44A-B中所示，在多项研究中，每周两次且甚至每周一次施用8mg/kg的356A11也足以显著地阻断疾病演变。
在使用368D04(每隔一天施用16mg/kg)进行的第一次CIA研究中，几乎未或者没有发现有效性。然而，在如图46A-C中所示，在多项研究中，每周一次施用8mg/kg的368D04可显著地阻断疾病演变。
当在CIA模型中进行每周一次给药时，人类抗IL-22抗体可显著阻断疾病演变的能力表示当对人类施用时，可以以类似的给药频率或甚至更延长的给药频率，诸如每两周一次，施用抗体。
也通过爪的组织病理分析而评估抗IL-22抗体的疗效。于研究结束时，使动物安乐死，采取爪，并经10％福尔马林固定以进行组织研究，脱钙并包埋于石蜡中以进行切片及标准H&E染色。根据5级记分法(0至4)对该爪记分以表征关节炎的强度及程度。除了与诸如血管翳形成、滑膜的纤维状、关节软骨腐损和/或软骨下的骨质破坏的炎症有关的其它变化外，使用发炎性浸润物以进行评分。使用各爪的读数以决定组织学等级NAD＝0或未发现异常；1＝轻微至中度；2＝轻度至中度；3＝显著；4＝严重。抗IL-22抗体治疗性给药的组织效应示于图16A-F、42A-C、43及45A-B中。如图16A-F、42A-C、43及45A-B所示，在多项研究中，施用356A11改善了小鼠的胶原诱导的关节炎症状。类似地，在多项研究中，每隔一天施用8mg/kg的368D04改善了小鼠的胶原诱导的关节炎症状，见图47A-C。
除了组织病理评估外，也检查经治疗小鼠的骨质破坏。于研究结束时，将爪以侧位固定并使用Faxitron机器取得X射线照片。Faxitron提供高分辨X射线照片，且高放大能力提供增加的影像性能。Faxitron X射线照片与目测总爪评分相关联，且表明与使用同种型对照抗体(未显示数据)进行治疗比较，使用抗IL-22抗体进行治疗防止了骨质破坏。
实施例14通过ELISA进行血清IL-22的检测及使用356A11体内处理的血清IL-22的增加性检测 至今，IL-22基因表达的检测仅已经在RNA水平报告。使用下述的ELISA，在正常小鼠中并未能检测出IL-22。然而，我们已发现此ELISA可检测罹患关节炎小鼠的体内循环中的IL-22。而且，给药356A11抗体可检测含量高10倍的IL-22。于所示剂量下的356A11抗体螯合(sequestered)细胞因子，因此中和其如先前实施例中所示的活性。由于该抗体在血流内循环，所以使用此ELISA可检测较高含量的经抗体螯合的IL-22。其是起因于构成MIL-22 ELISA的捕获抗体与检测抗体的独特及不同表位。该ELISA可同等地检测IL-22/356A11、IL-22BP/IL-22、IL-22BP/356A11/IL-22及裸露IL-22。
就先前讨论的CIA研究(实施例13)而言，每隔一天以16mg/kg的356A11抗体治疗罹患关节炎的小鼠。于胶原加强后第30天时，在宰杀后，自小鼠收集血清。然后通过ELISA而测定IL-22在血清样品中的含量。
就ELISA方式而言，将1mGIL 19P3/1，其是大鼠IgG 1κ单克隆抗鼠IL-22抗体，包被在96孔微量滴定ELISA板上以作为捕获抗体。连续稀释得自罹患关节炎小鼠的血清样品，然后添加至包被的微量滴定板上。在微量滴定板内使样品与1mGIL 19P3/1培育后，洗涤板，并添加2hmGIL 19P3/5-bio(其是与生物素缀合的大鼠IgG2ak单克隆抗IL-22抗体)至板以作为检测抗体。经另一次培育及洗涤步骤后，添加缀合链霉抗生物素的辣根过氧化物酶(HRP)(其可将四甲基联苯胺(TMB)转化成蓝色色素且可经分光光度计定量)，培养并洗涤板。在经TMB最后培育，继而添加稀H2SO4以停止酶促的反应后，使用分光光度计测定450nm的吸光度。或者，且由于该检测抗体的同种型(大鼠IgG2ak)不同于包被的抗体同种型，所以也可使用与大鼠IgG2a结合的经HRP-缀合的二抗。使用该夹层ELISA，我们已证明添加增量的mIL-22BP和/或356A11并不会影响其检测固定浓度的鼠IL-22的能力。已使用此ELISA检测小鼠在i.p(腹膜内)LPS注射后的血清中的IL-22。
如上述，当对CIA小鼠施用356A11抗体时，在血清内检测出的IL-22含量范围为约1ng/ml至约9ng/ml。见图17。相反地，接受人类IgG1λ同种型对照抗体的对照治疗组中，罹患关节炎小鼠的IL-22的体内含量明显较低(小于1ng/ml)。见图17及18。因此，356A11抗体捕获体内IL-22以产生能循环的稳定的抗体/细胞因子复合物。如图16所示，其随后允许在增高的灵敏性下检测体内IL-22。与用于上述研究中的大量抗体不同，已提议也可施用相当低量的356A11且具有相同效果。
实施例15牛皮癣的治疗 使用定量PCR测定得自人牛皮癣病患的成对组织样品(损害对非损害)的IL-22及IL-22R的RNA含量。该研究证实在牛皮癣损害中，IL-22及IL-22R的含量被上调。见图19。其它证据表示IL-22与牛皮癣的形成有关。例如组成性表达IL-22的转基因小鼠会产生厚皮、单核免疫细胞浸润(其是牛皮癣损害的特征)并在出生后不久即死亡。见WO 03/083062。类似地，对小鼠施用IL-22可诱导皮肤的增厚及单核免疫细胞浸润。见WO 03/083062。IL-22也诱导人类角化细胞增生，表明IL-22在皮肤发炎过程中起重要作用。见Boniface等人，J.Immunol.，2005，1743695-3702。
SCID小鼠中的异种移植术为用于研究牛皮癣的公认模型，参见例如Boehncke等人，Br.J.Dermatol.2005，153(4)758-66。在局部麻醉下，自罹患慢性斑块期牛皮癣的病患切除损害性裂层皮(厚约0.5毫米)。将人类裂层移植物移植在6至8周岭的SCID小鼠的背部上。使小鼠接受该移植物并愈合，费时3周。移植法后第22天时，每隔一天对小鼠腹膜内注射8mg/kg的人类抗IL-22抗体，诸如种系化的087B03、368D04、354A08或356A11。作为阴性对照组，使小鼠每日接受胃内给药200μl PBS。作为阳性对照组，使小鼠每日接受胃内给药2mg/kg地塞米松的200μl PBS溶液。阴性对照组可形成牛皮癣的特征，其包括棘皮病、乳头状瘤病、角质化不全，及稠密单核浸润物。在移植后第50天时处死小鼠，并切除带有周围皮肤的移除物。将一半移植物固定在福尔马林中，且另一半冷冻在液态氮中。进行常规苏木精及曙红染色，并定性(表皮分化)及定量(表皮厚度、发炎性浸润)分析移植物的病理变化。使用目镜测微尺测定自表皮突的顶部至活性表皮的边缘的平均表皮厚度。通过计算在3处邻接放大视野中细胞数而计算发炎性浸润物的密度。使用组织分析测定牛皮癣的特征(诸如棘皮病、乳头状瘤病、角质化不全、发炎性浸润，及角膜与颗粒层的出现)以评估疾病的演变。
在移植物移植后，注射200μl PBS或同种型相配的对照抗体的阴性对照组小鼠渐进性地发展为牛皮癣。由于牛皮癣损害表达较高含量的IL-22，所以如以下报告的过继转移研究中所确认的，使用抗IL-22抗体(例如种系化的087B03、368D04、354A08或356A11)进行的治疗预期可抑制或延缓牛皮癣。
CD4+CD45rb高T细胞在scid/scid小鼠中的过继转移为研究小鼠牛皮癣的另一种公认模型。见Hong等人，J.Immunol.，162(1)7480-91(1999)。在该模型中，于CD4+CD45rb高T细胞过继转移后第一天对scid/scid小鼠共施用LPS及IL-12或葡萄球菌肠毒素B诱导了显示人类牛皮癣中所发现特征的皮肤损害。
使用稍作改进的本模型，于过继转移后第一天，在共施用或未共施用LPS及IL-12的情况下，使CD4+CD45rb高CD25-T细胞转移至scid/scid小鼠体内。当转移入scid/scid小鼠内时，甚至当在无LPS及IL-12施用时，CD4+CD45rb高CD25-T细胞可诱导牛皮癣损害。因此，在过继转移后，施用IL-12及LPS似乎不会改变抗IL-22抗体在此模型内的有效性。
使用稍微改进的前述方法，制备用于过继转移的细胞。自6至8周龄的BALB/cBy供体小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)收集脾脏并通过全脾脏的机械均质化而分离脾细胞。使用鼠CD4富集试剂盒(R&D)，根据厂商的指示选择CD4+T细胞。CD4富集的T细胞用抗CD4-PE(Pharmingen)、抗CD45RB-FITC及抗CD25-APC(Pharmingen)标记。使用Moflo(Becton Dickinson，San Jose，CA)细胞分选器分选细胞。收集CD4+CD45Rb高CD25-细胞，且其纯度>95％。以2×106个细胞/毫升使细胞再悬浮于盐水中并以i.p.法将4×105个细胞注射入C.B-17/Prkdc scid/scid小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)体内。在某些情况下，在第一天时，对接受CD4+CD45Rb高细胞的受体小鼠以i.p.方法施用10ng IL-12及20μgLPS，并在第3天时，再施用一剂量的IL-12。在过继转移的当天对小鼠施用16mg/kg的同种型对照抗体或抗IL-22抗体(356A11或368D04)，并在其后，每周一次给药，费时10周。一周两次监测小鼠的皮肤损害的临床症状。于该研究结束时，采集小鼠耳、皮肤、淋巴结及脾脏以进行进一步离体研究。
临床评估 在过继转移后10天开始，每周两次通过盲试的研究者评估小鼠。根据身体外观提供自0至6的半定量临床分数以记录疾病演变0＝无皮肤或耳症状；0.5＝在耳及眼睑上有轻微红斑；1＝具有耳轻度增厚(小于身体表面的2％)的耳或眼睑上有轻度、中度红斑；2＝在2至10％身体表面上有中度至严重的红斑，轻度鳞屑；3＝在10至20％身体表面上有严重的红斑及鳞屑；4＝在20至40％身体表面上有很严重、密集的红斑及鳞屑；5＝在40至60％身体表面上有很严重、密集的红斑及鳞屑；6＝在超过60％身体表面上有很严重、密集的红斑及干癣。根据毛皮状况、耳症状、眼睑外观，及四肢与尾上的炎症记录具体观察结果。
在未共施用LPS及IL-12的研究中，当与对照抗体治疗的小鼠比较时，抗体356A11及368D04可显著地抑制皮肤炎症，就356A11而言，其作用早在第21天时开始而就368D04而言，则在第35天开始(图20A-B)。于过继转移后的第一天时在共施用LPS及IL-12的研究中可发现类似结果，当与对照抗体比较时，356A11及368D04可显著抑制皮肤损害，其作用早在过继转移后第28天即开始(图27A及B)。于过继转移后第一天时在未进行(图34A-B)或进行(图37A-B)LPS及IL-12共施用的分别研究中，当与对照抗体治疗的小鼠比较时，356A11可显著抑制皮肤炎症，其作用早在第21天开始。
细胞因子检测 使用ELISA试剂盒(R&D系统)定量小鼠血清或得自细胞培养物上清液的IL-6、IFNγ及TNFα。用于IL-22、IL-17A、IL-17F及IL-17A/F异源二聚体的ELISA包括于4℃下以100μl的抗IL-22(Ab-01)、抗IL-17A(R&D)或抗IL-17F(RK015-01)抗体的2μg/ml的PBS溶液包被96孔平底板(Costar)一夜。然后以PBS/Tween(在PBS中的0.05％Tween-20)洗涤板，并于RT下用200μlPBS加1％BSA封闭一小时。通过如Li等人在Int.Immunopharmacol.4693-708(2004)中所述的方法而产生鼠IL-22的抗体(Ab-01、Ab-02及Ab-03)及鼠IL-17F的抗体(RK015-01)。在所有以下步骤之间，以PBS/Tween洗涤板。然后添加IL-22(R&D)、IL-17A(R&D)、IL-17F及IL-17A/F标准物、样品上清液及血清样品(经PBS 1:5稀释)。然后将1％ BSA/PBS溶液中的0.5μg/ml的抗IL-22(Ab-03)、抗IL-17A(R&D)及抗IL-17F(RK015-01)的生物素酰化的二抗添加至各板内，并于37℃下培育一小时。根据厂商的指示，添加聚HRP标记的链霉抗生物素(Pierce)培养15分钟。通过添加TMB底物而使该板显色15至30分钟。然后在Molecular Devices(Sunnyvale，CA)板式测读机上读取试验值并使用SOFTmax软件分析数据。
在未共施用LPS及IL-12的研究中，与对照抗体治疗的小鼠比较，356A11治疗的小鼠体内可检测出较高含量的血清IL-22，表明如实施例14中述，356A11捕获并稳定体内的IL-22(图21)。在过继转移后第一天时，在共施用LPS及IL-12的用356A11治疗的小鼠中也可发现类似结果(图28)。在过继转移后第一天时在未进行(图35)及进行(图38)LPS及IL-12共施用的分别研究中可复制这些结果。在368D04治疗的小鼠中并未在血清中检测出IL-22(图21)。
在未共施用LPS及IL-12的研究中，在356A11及368D04治疗的小鼠中检测出显著低血清含量的IL-17F、IL-17A、IL-17A/F(图22A-C)。也发现在356A11及368D04治疗的小鼠体内IL-6血清含量有渐减的趋势(图22D)。在得自对照抗体、356A11或368D04抗体治疗的小鼠血清中，IFNγ及TNFα的含量低于检测极限。在过继转移后于第一天进行共投LPS及IL-12的356A11治疗的小鼠体内也发现类似结果(图29A-D)。在过继转移后第一天的未进行(图39A-B)及进行(图39C-D)LPS及IL-12共施用的分别研究中，356A11治疗的小鼠体内也可发现明显较低的IL-17A及IL-6血清含量。
淋巴结细胞分离及刺激 本模型中的牛皮癣损害通常自耳、眼、脸及颈部发展至身体的其余部位。经治疗剂治疗的小鼠通常仅在眼及耳周围产生轻度的皮肤损害。因此，自各小鼠分离排泄脸废物的颈淋巴结以获得最高数量的活化细胞。通过机械均质化作用而回收淋巴结(LN)细胞。自每群约9至10只小鼠汇集LN细胞并以1×106个/毫升再悬浮于补充10％ FBS(HyClone)、5×10-5M 2-ME(Sigma)、2mM谷氨酰胺(Life Technologies，Gaithersburg，MD)、10U/ml青霉素、100μg链霉素(Life Technologies)及15mM HEPES的完全RPMI 1640培养基内。然后将总共200μg/孔的悬浮液放在96孔板内，并用抗CD3加抗CD28(各1μg/ml)刺激48小时。
细胞内细胞因子染色 为检查IL-22中和作用对效应T细胞群体的影响，在颈淋巴结细胞上进行细胞内细胞因子染色。以50ng/ml PMA(Sigma)、1μg/ml离子霉素(Sigma)及GolgiPlug(Pharmingen)刺激细胞12小时。首先对表面抗原(CD4)进行细胞染色，然后根据厂商指示，用Cytofix/Cytoperm(Pharmingen)处理。使用IFNγ、IL-22、IL-17A、IL-17F、TNFα及相关IgG同种型对照抗体进行细胞内细胞因子染色。根据厂商指示，使Alexa 647(Molecular Probes)标记抗IL-22(Ab-02)，并使FITC(Pierce Biotechnologies)标记抗IL-17F(RK015-01)。
在门控的CD4+群上进行细胞分析。FACS分析结果显示当与同种型对照处理的小鼠比较时，356A11及368D04(未共施用LPS及IL-12)处理的小鼠中，有较低百分比的CD4+T细胞产生IL-22、IL-17A及IL-22与IL-17F两者，但是有较高百分比的CD4+T细胞产生IFNγ(图23)。过继转移后第一天共施用LPS及IL-12的356A11处理的小鼠中也可发现类似结果(图31)。
细胞因子转录物的定量 使用Qiagen Rneasy试剂盒(Qiagen)自小鼠耳或LN细胞(刺激后)分离RNA。使用预限定的引物及探针(Applied Biosystems)进行细胞因子转录物的定量PCR。使用ΔΔCt方法以将转录物标准化为GAPDH，并相对于对照组小鼠，计算诱导倍率(fold induction)。
使用得自小鼠耳的RNA的定量PCR结果显示当与对照抗体处理的小鼠比较时，356A11及368D04处理的小鼠具有较低的IL-22、IL-17F、IL-17A及IL-6基因表达，但有增强的IFNγ表达(图24A-E)。过继转移后第一天进行共施用LPS及IL-12的356A11治疗的小鼠中也发现类似结果(图30A-E)。在使用356A11(未共施用LPS及IL-12)的分别研究中可复制这些结果，其中也发现与对照抗体处理的小鼠比较，356A11处理的小鼠具有较低IL-1家族6蛋白质(IL-1F6)基因表达及未改变的IL-22结合蛋白与IL-22受体亚基(IL-22R1)基因表达(图36A-H)。
使用得自如上述抗CD3及抗CD28刺激48小时的淋巴结细胞的RNA的定量PCR结果显示356A11及368D04抑制离体IL-22、IL-16、IL-17A及IL-17F基因表达，但是对IFNγ基因表达的影响并无显著变化(图26A-E)。过继转移后第一天，在共施用LPS及IL-12的356A11治疗的小鼠中发现类似结果(图33A-E)。
使用如前述的ELISA试剂盒(R&D系统)收集得自如上述抗CD3及抗CD28刺激的淋巴结细胞的上清液以进行细胞因子分析。反映LN基因表达数据的细胞因子ELISA结果显示356A11及368D04抑制IL-22、IL-6、IL-17A及IL-17F的离体分泌，但是对从刺激的细胞分泌IFNγ并无显著变化(图25A-F)。过继转移后第一天时，在共施用LPS及IL-12的356A11治疗的小鼠中发现类似结果(图32A-E)。
组织病理学分析 一旦体内研究结束时，在小鼠组织上进行尸检。收集得自耳、躯干皮肤的组织样品，并固定在10％福尔马林溶液内以作为切片标本及进行分析。为记录疾病严重性，根据炎症的严重性指定自0至5的半定量组织学得分。通过有合格证照的病理学家以盲式形式进行组织学评估。0＝在正常极限内；1＝最低；2＝轻度；3＝中度；4＝显著；5＝严重。
免疫组织化学分析 收集组织样品并包埋在Tissue Tek OCT(Miles，Elkhurt，IN)化合物中，经干冰冷冻以进行恒冷切片机切片。将组织切片(5μm)固定在100％丙酮内并用抗CD4、抗CD11b及抗嗜中性白细胞抗体(PharMingen)染色。根据可视荧光显微术检测，组织的评分如下阴性＝0、轻度＝1、中度＝2，且严重＝3。
组织学研究结果证明与同种型对照物处理比较，356A11及368D04处理的小鼠的皮肤罹患较少的角质化细胞增殖、表皮突及发炎性细胞浸润。另外，免疫组织化学研究结果显示356A11降低CD4+、CD11b+(巨噬细胞)及嗜中性白细胞在表皮、真皮，及皮下组织层中的数量。组织学研究结果反映了临床研究结果并支持使用IL-22拮抗剂(诸如本发明抗体)作为治疗剂以治疗牛皮癣及其它似牛皮癣皮肤病。
总的结果证明本发明抗体(诸如087B03、368D04、354A08或356A11)对该牛皮癣的鼠模型有效，且表明使用抗IL-22抗体(包括087B03、368D04、354A08或356A11)的治疗提供了人类牛皮癣的治疗性介入的有效策略。
实施例16病患的治疗 可用本发明抗体治疗的病患类型包括罹患自身免疫病症；呼吸系统病症；皮肤、心血管系统、神经系统、肾、肝脏及胰脏等炎症的病患或进行移植的病患。作为例证的治疗方法及预期结果如下文提供。也可使用非表14内所述的给药剂量或给药频率。若必要，熟练的技术人员可根据给药途径或其它已知变数，诸如待治疗病患的年龄、体重、病症、性别、病况的严重性等而调整治疗方式。
表14治疗方式 根据本专利说明书内所列举的参考文献的教导可最彻底了解本专利说明书。本专利说明书内的实施方案是供阐明本发明实施方案且不应被视为对本发明范围的限制。熟练的技术人员很容易了解本发明所包含的许多其它实施方案。本公开内容中所列举的所有公开申请及专利的全文在此并入本申请以作为参考资料。当并入本申请以作为参考资料的材料存在与本专利说明书抵触或不一致时，本专利说明书优先于这些材料。文中任何参考文献的引证并非承认此类参考文献为本发明的在先技术。
除非另有指定，表示用于本专利说明书(包括权利要求)中的成分、反应条件等的数量欲被理解为在所有情况下由术语“大约”所修饰。因此，除非另外相反指出，数字参数为近似值，且可根据欲通过本发明所获得的所期望性质而不同。至少，且并非作为限制权利要求范围等价物的原理的应用的尝试，各数值参数应该根据有效位数的数值及一般舍入方法而推断。
除非另有指定，在一系列元素前的术语“至少”应理解为意指该系列中的每一种元素。仅使用常规实验方法，本领域技术人员可了解或可确定文中所述本发明的特定实施方案的许多同等物。此类同等物也意欲涵盖在以下权利要求内。
序列表
<110>惠氏公司
<120>使用抗人IL-22抗体的方法
<130>8702.0203-00304
<140>
<141>
<150>60/774,595
<151>2006-02-21
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<170>PatentIn version 3.3
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<213>人
<400>63权利要求
1.一种治疗或者预防受试者的与IL-22相关的病症的方法，包括用足以抑制或降低受试者体内免疫细胞活性的量向受试者施用特异性结合至人IL-22的抗体或者其抗原结合片段，从而治疗或者预防该病症，其中该抗体或者其抗原结合片段包括含有至少一个重链可变区的VH结构域以及含有至少一个下述序列任何之一的轻链可变区的VL结构域SEQ ID NO11，12，13，29，30，31，47，48，49，65，66，67，83，84，85，101，102，103，119，120，121，137，138，139，155，156，157，173，174，175，191，192，193，209，210，211，227，228，229，245，246，247，263，264，265，281，282，283，299，300，301，317，318，319，335，336，337，371，372，373，389，390，391，407，408，409，425，426，427，443，444，445，461，462，463，479，480，481，497，498，499，515，516，517，533，534，535，551，552，553，569，570，571，587，588，589，605，606，607，623，624或625。
2.一种治疗或者预防受试者的与IL-22相关的病症的方法，包括用足以抑制或降低受试者体内免疫细胞活性的量向受试者施用特异性结合至人IL-22的抗体或者其抗原结合片段，从而治疗或者预防该病症，其中该抗体或者其抗原结合片段包括含有至少一个轻链可变区的VL结构域以及含有至少一个下述序列任何之一的重链可变区的VH结构域SEQ ID NO8、9、10、26、27、28、44、45、46、62、63、64、80、81、82、98、99、100、116、117、118、134、135、136、152、153、154、170、171、172、188、189、190、206、207、208、224、225、226、242、243、244、260、261、262、278、279、280、296、297、298、314、315、316、332、333、334、350、351、352、368、369、370、386、387、388、404、405、406、422、423、424、440、441、442、458、459、460、476、477、478、494、495、496、512、513、514、530、531、532、548、549、550、566、567、568、584、585、586、602、603、604、620、621或622。
3.权利要求1的方法，其中该至少一个重链可变区包括下述序列的任何之一SEQ ID NO8、9、10、26、27、28、44、45、46、62、63、64、80、81、82、98、99、100、116、117、118、134、135、136、152、153、154、170、171、172、188、189、190、206、207、208、224、225、226、242、243、244、260、261、262、278、279、280、296、297、298、314、315、316、332、333、334、350、351、352、368、369、370、386、387、388、404、405、406、422、423、424、440、441、442、458、459、460、476、477、478、494、495、496、512、513、514、530、531、532、548、549、550、566、567、568、584、585、586、602、603、604、620、621或622。
4.权利要求1-3中任意一项的方法，其中该VL结构域包括下述序列任何之一的氨基酸序列SEQ ID NO6、24、42、60、78、96、114、132、150、168、186、204、222、240、258、276、294、312、330、348、366、384、402、420、438、456、474、492、510、528、546、564、582、600或618。
5.权利要求1-4中任意一项的方法，其中该抗体或者其抗原结合片段包括具有下述序列任何之一的氨基酸序列的VH结构域SEQ ID NO5、23、41、59、77、95、113、131、149、167、85、203、221、239、257、275、293、331、329、347、365、383、401、419、437、455、473、491、509、527、545、563、581、599或617。
6.权利要求3的方法，其中该VH结构域包括SEQ ID NO5、23、41、59、77、95、113、131、149、185、221、239、257、275、331、329、365、383、401、419、437、455、473、509、527、563或581中任何之一的氨基酸序列，以及该VL结构域包括SEQ IDNO6、24、42、60、78、96、114、132、150、186、222、240、258、276、312、330、366、384、402、420、438、456、474、510、528、564或582中任何之一的氨基酸序列。
7.权利要求6的方法，其中该VH结构域包括SEQ ID NO167或491的氨基酸序列，以及该VL结构域包括SEQ ID NO168或492的序列。
8.权利要求6的方法，其中该VH结构域包括SEQ ID NO293或545的氨基酸序列，以及该VL结构域包括SEQ ID NO294或546的序列。
9.权利要求6的方法，其中该VH结构域包括SEQ ID NO203或617的氨基酸序列，以及该VL结构域包括SEQ ID NO204或618的序列。
10.权利要求6的方法，其中该VH结构域包括SEQ ID NO347或599的氨基酸序列，以及该VL结构域包括SEQ ID NO348或600的序列。
11.一种治疗或者预防受试者的与IL-22相关的病症的方法，包括用足以抑制或降低受试者体内免疫细胞活性的量向受试者施用特异性结合至人IL-22的抗体或者其抗原结合片段，从而治疗或者预防该病症，其中该抗体或者其抗原结合片段特异性结合至人IL-22，并对人IL-22具有至少为1010M-1的结合常数。
12.权利要求11的方法，其中对人IL-22的结合常数为至少1011M-1。
13.一种治疗或者预防受试者的与IL-22相关的病症的方法，包括用足以抑制或降低受试者体内免疫细胞活性的量向受试者施用特异性结合至人IL-22的抗体或者其抗原结合片段，从而治疗或者预防该病症，其中该抗体或者其抗原结合片段以150pM或较小的IC50阻断IL-22调节的BAF3细胞增殖，其中该BAF3细胞包含人IL-22受体。
14.权利要求13的方法，其中该抗体或者其抗原结合片段以100pM或较小的IC50阻断IL-22调节的BAF3细胞增殖。
15.一种治疗或者预防受试者的与IL-22相关的病症的方法，包括用足以抑制或降低受试者体内免疫细胞活性的量向受试者施用特异性结合至人IL-22的抗体或者其抗原结合片段，从而治疗或者预防该病症，其中该抗体或者其抗原结合片段以1nM或较小的IC50阻断IL-22调节的从HT29细胞分泌GROa。
16.权利要求15的方法，其中该抗体或者其抗原结合片段以150pM或较小的IC50阻断IL-22调节的从HT29细胞分泌GROa。
17.权利要求1-16中任意一项的方法，其中与IL-22相关的病症选自炎症性肠病、胰腺炎、多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、HIV、舍格伦综合征、幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、强直性脊椎炎、牛皮癣、移植排斥和节段性回肠炎。
18.权利要求1-17中任意一项的方法，还包括向受试者施用另一种治疗剂，该治疗剂选自细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、消炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒剂和细胞生长抑制剂。
19.权利要求18的方法，其中该治疗剂选自TNF拮抗剂、IL-12拮抗剂、IL-15拮抗剂、IL-17拮抗剂、IL-18拮抗剂、IL-19拮抗剂、IL-20拮抗剂、IL-21拮抗剂、IL-23拮抗剂、T细胞清除剂、B细胞清除剂、氨甲蝶呤、来氟米特、西罗莫司(瑞帕霉素)或其类似物、Cox-2抑制剂、cPLA2抑制剂、NSAID和p38抑制剂。
20.权利要求1-19中任意一项的方法，其中受试者是哺乳动物。
21.权利要求1-19中任意一项的方法，其中受试者是人。
22.权利要求1-19中任意一项的方法，其中该抗体以选自下列范围的量施用1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至100μg/kg、100μg至1mg/kg、250μg/kg至2mg/kg、250μg/kg至1mg/kg、500μg/kg至2mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至20mg/kg、10mg/kg至25mg/kg及20mg/kg至30mg/kg。
23.权利要求1-22中任意一项的方法，其中与IL-22相关的病症是关节炎，炎症性肠病或者牛皮癣。
24.权利要求23的方法，其中与IL-22相关的病症是类风湿关节炎。
25.权利要求23的方法，其中与IL-22相关的病症是牛皮癣。
26.一种治疗或者预防受试者的过度增生性病症的方法，包括用足以抑制或降低受试者体内IL-22-和/或IL-22R和/或IL-10R2响应细胞过度增生的量向受试者施用特异性结合至人IL-22的抗体或者其抗原结合片段，并使得抗体治疗或者预防该病症，其中抗体或者其抗原结合片段包括至少一个下述序列任意之一的重链可变区SEQ ID NO8、9、10、26、27、28、44、45、46、62、63、64、80、81、82、98、99、100、116、117、118、134、135、136、152、153、154、170、171、172、188、189、190、206、207、208、224、225、226、242、243、244、260、261、262、278、279、280、296、297、298、314、315、316、332、333、334、350、351、352、368、369、370、386、387、388、404、405、406、422、423、424、440、441、442、458、459、460、476、477、478、494、495、496、512、513、514、530、531、532、548、549、550、566、567、568、584、585、586、602、603、604、620、621或622。
27.一种治疗或者预防受试者的与IL-22相关病症的方法，包括用足以抑制或降低受试者体内免疫细胞活性的量向受试者施用抗体或者其抗原结合片段，该抗体或者其抗原结合片段特异性结合至由GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11所识别的IL-22表位，因此该抗体竞争性抑制GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11与人IL-22的结合，从而治疗或者预防该病症。
28.权利要求27的方法，其中该抗体特异性结合至由087B03所识别的IL-22表位，因此该抗体竞争性抑制087B03与人IL-22的结合。
29.权利要求27的方法，其中该抗体特异性结合至由354A08所识别的IL-22表位，因此该抗体竞争性抑制354A08与人IL-22的结合。
30.权利要求27的方法，其中该抗体特异性结合至由368D04所识别的IL-22表位，因此该抗体竞争性抑制368D04与人IL-22的结合。
31.权利要求27的方法，其中该抗体特异性结合至由356A11所识别的IL-22表位，因此该抗体竞争性抑制356A11与人IL-22的结合。
全文摘要
本申请提供可特异性结合至人白介素-22(IL-22)的人抗体及其抗原结合片段，及使用此类抗体以例如诊断、治疗或预防炎症、自体免疫疾病、过敏、败血症性休克、感染病、移植排斥、癌及其它免疫系统病症的方法。
文档编号A61P1/18GK101426528SQ200780013768
公开日2009年5月6日 申请日期2007年2月21日 优先权日2006年2月21日
发明者L·A·福瑟尔, M·黑根, D·P·拉克森伯格, M·奥图尔 申请人:惠氏公司