专利名称：：胰高血糖素样肽-2及其治疗应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及胰高血糖素相关性肽，这些肽具有促进胃肠组织生长的特性。本发明还涉及这些肽的治疗应用，用于治疗由于胃肠组织特别是肠组织和胰腺组织生长不良或丢失所引起的各种疾病。技术背景胰高血糖素基因的表达产生组织特异性不同的多种肽产物，这些肽产物来自于160个残基的胰高血糖素原产物的加工过程。自格锵、大鼠、仓鼠和牛的胰腺制备前胰高血糖素原cDNA,并对其进行分子克隆，已经阐明这些肽在胰高血糖素原前体中的结构组成。这些分析显示，前胰高血糖素原不仅含有胰高血糖素和肠高糖素的序列，而且还含有另外两种胰高血糖素样肽(GLP-1和GLP-2)，两个间隔或插入肽(IP-I和1P-II)将这两种胰高血糖素样肽相互隔离并将它们与胰高血糖素分开。这些肽的两側为数对碱性氨基酸，具有典型的激素原裂解部位的特征，这表明胰高血糖素原在经翻译后加工之后，可将这些肽游离出来(Drucker，《胰腺》(Pancreas)，1990，5巻4期484页)。例如，对从朗罕氏胰岛中胰高血糖素原游离出来的肽进行分析，表明游离的胰腺肽主要是29个氨基酸的胰高血糖素，而肠高糖素、泌酸调节素、IP-II和胰高血糖素样肽更多见于小肠和大肠。在肠内发现胰高血糖素样肽促使人们对这些新发现的肠肽的精确结构和假定功能进行了研究。大多数研究集中在GLP-1,因为几个方面的证据都表明GLP-1可能是一种新的重要的调节肽。确实，已经证实GLP-1是已知最强的刺激胰岛素释放的肽能刺激物，其通过与胰腺(3细胞上的受体相互作用以葡萄糖依赖方式发挥作用。对GLP-1及其衍生物在糖尿病治疗方面应用的开发正在进行之中。肠高糖素和泌酸调节素，即所谓的"肠道胰高血糖素，，的生理作用，特别是在酸分泌调节和肠细胞生长方面的作用，也正在研究之中。泌酸调节素能抑制五肽胃泌素刺激的胃酸分泌，这种作用呈剂量依赖性。对于肠高糖素在引致肠适应性改变及肠粘膜生长方面的作用已进行了研究，在1994年8月31日出版的EP612，531上Matsuno等报道了肠高糖素的肠营养效应及其治疗应用。与GLP-1和其它胰高血糖素相关性肽相比，尽管已人人类、大鼠、牛、猪、豚鼠、仓鼠和八齿鼠等种系动物中分离到多种GLP-2同源物并弄清了它们的序列，但对于胰高血糖素样肽(GLP-2)的生理作用仍知之甚少。以人工合成的GLP-2制备抗血清，多个研究组用这种GLP-2抗血清检测，已经证明GLP-2主要存在于肠提取物中，而不是胰腺提取物(参见Mojsov等，《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem.),1986,261巻25期:11880页;Orskov等，《内分泌学》(Endocrinology),1986，U9巻4期:1467页及《糖尿病学》(Diabetologia)，1987，30巻874页及《FEBS通讯》(FEBSLetters),1989，247巻2期193页；George等,《FEBS通讯》(FEBSLetters),1985,192巻2期:275页)。关于GLP-2的生物学作用，Hoosein等报道(《FEBS通讯》(FEBSLetters),1984,178巻1期83页)GLP-2既不与胰高血糖素竟争结合到大鼠肝组织和脑组织，也不刺激肝脏质膜腺苷酸环化酶的产生；但难以理解的是，当GLP-2浓度在30-50pM时就能刺激下丘脑膜和垂体膜的腺苷酸环化酶。因此，阐明GLP-2的生理作用显得很有必要。
发明内容目前已证实，GLP-2作为一种营养剂，促进胃肠组织的生长。GLP-2的效应尤以促进小肠生长为明显，因此，本发明将这种效应称之为"肠营养，，效应。值得注意的是，GLP-2的生长促进效应也表现在促进胰岛生长，特别是引起胰岛的增大和增殖。据此，本发明总的目的是，开发GLP-2及GLP-2类似物在治疗及其它相关方面的应用。更具体地，根椐本发明之一方面，提供了一种符合药用剂型的GLP-2或GLP-2类似物，这种剂型适合于处方配药以及随后给病人用药。另一方面，本发明提供了一种药用组合物，该组合物包含GLP-2或GLP-2类似物和一种药用栽体。再另一方面，本发明还提供了一种促进胃肠组织包括小肠和胰岛组织生长和增殖的方法，这种方法用于治疗有这方面需要的病人，该方法包括给病人施以促进胃肠组织生长剂量之GLP-2或GLP-2类似物的步骤。本发明之另一方面，提供了一种用于鉴定新的肠营养性GLP-2类似物的方法，包括以下步骤1)获取一种肠营养性GLP-2的类似物，该类似物至少有一个氨基酸替换、缺失、增加，或一个含封闭基团的氨基酸；2)以该类似物治疗一种哺乳动物，所用治疗方案能引起如同大鼠GLP-2产生的肠营养效应；以及3)与模拟治疗对照哺乳动物相比较，确定该类似物对小肠重量和/或腺管加绒毛高度和/或胰岛大小的影响，由此，肠营养性肽即可视为一种类似物，其能引起上述重量和/或髙度和/或大小的增加。另一方面，本发明提供了新的GLP-2类似物，这些类似物的类型为脊推动物GLP-2的肠营养性类似物。这些GLP-2类似物促进胃肠组织包括小肠组织和胰岛组织的生长和增殖。本发明之另一方面，提供了一种方法，用该方法治疗病人以修复胃肠组织，治疗包括以下步骤(1)以促进组织生长剂量的GLP-2或GLP-2类似物培养上述组织或细胞，而后(2)将该组织或细胞植入待治病人体内。在另一相关方面，本发明提供了一种培养胃肠组织或细胞的方法，其包括将该组织或细胞置于培养液中进行培养的步骤，培养液中添加有促进生长剂量的GLP-2或GLP-2类似物。图1示出GLP-2剂量-效应结果。给动物注射大鼠GLP-2，检测其对小肠重量(BW-A图)、近端空肠腺管加绒毛高度(PJ-B图)、远端空肠腺管加绒毛高度(DJ-C图)及远端回肠腺管加绒毛高度(DI-D图)的影响，以检测结果与大鼠GLP-2剂量的关系制图。图2示出配药用赋形剂对GLP-2肠营养活性的影响。以大鼠GLP-2溶于明胶(G)或盐水(PBS)给药，分别检测小肠重量(BW)、近端空肠腺管加绒毛高度(PJ)、远端空肠腺管加绒毛高度(DJ)及远端回肠腺管加绒毛高度(DI)。不含大鼠GLP-2的明胶溶液作为对照组(c)。图3示出给药途径对GLP-2肠营养活性的影响。以皮下(SC)、肌内(IM)或腹腔(IP)注射大鼠GLP-2后，检测小肠重量改变的百分率。标以T的矩形条表示样品来自用GLP-2治疗的大鼠，C表示样品来自用盐水注射的对照组大鼠。图4示出给药频率对GLP-2活性的影响。如图中X轴所示，给动物皮下注射PBS每12小时一次、2.5|ng大鼠GLP-2每12小时一次(ql2h)、5pg大鼠GLP-2每天一次(qd)或10pg大鼠GLP-2隔天一次(qod)。对于每一给药方案，检测小肠重量(BW)、近端空肠腺管加绒毛高度(PJ)、远端空肠腺管加绒毛高度(DJ)及远端回肠腺管加绒毛高度(DI)。图5示出GLP-2用药时间长短对活性的影响。给动物注射5pg溶于10。/。明胶的大鼠GLP-2或单纯注射10%明胶，每天一次，连用4周(A图)、8周(B图)或12周(C图)，然后将动物处死。检测小肠重量(BW)、近端空肠腺管加绒毛高度(PJ)、远端空肠腺管加绒毛高度(DJ)及远端回肠腺管加绒毛高度(DI)，通过与对照组比较判定GLP-2的治疗效果。图6提供了GLP-2肠营养效应的时间曲线。给雌性小鼠注射2.5)ag溶于PBS的大鼠GLP-2，每天二次，在治疗开始后不同天数处死小鼠，检测小肠重量。同时用单純注射PBS的动物作对照。图7示出受试动物年龄和性别对GLP-2肠营养活性的影响。A图~H图中，4~16周龄性别匹配的GLP-2治疗动物(CD1小鼠)经用大鼠GLP-2治疗后，与它们各自的对照组比较小肠重量(BW)、近端空肠腺管加绒毛高度(PJ)、远端空肠腺管加绒毛高度(DJ)及远端回肠腺管加绒毛高度(DI)。图8示出多种不同GLP-2和GLP-2类似物与对照组相比的肠营养效应。A、C、E、和G图代表小肠重量(BW)变化；B、D和F图代表近端空肠腺管加绒毛高度(PJ)的变化。类似物的缩写词分别是N-acetyl(以乙酰基封闭了氨基端的大鼠GLP-2肽)、Arg+1(在氨基端多含一个精氨酸残基的大鼠GLP-2)、Arg+34(在羧基端多加了一个精氨酸残基的大鼠GLP-2)、C-amido(以酰胺基封闭羧基端的大鼠GLP-2)、Arg+1+2(在氨基端多加了两个精氨酸残基)。此外，还检测了八齿鼠GLP-2(degu)对于小鼠的肠营养效应。图9示出大鼠GLP-2对小肠长度的肠营养效应。在用GLP-2治疗10天后，检测相对于对照动物的小肠长度的增加值。具体实施方式本发明涉及GLP-2和GLP类似物在治疗及相关方面的应用，特别是用于促进胃肠组织的生长和增殖，更特别的是小肠组织或胰岛。对于小肠组织，这种生长可以很方便地检测，即GLP-2引起相对于未经治疗对照组小肠在重量和长度上的增加。正如这里提供的结果所显示的那样，GLP-2对小肠的影响还表现在腺管加上绒毛长轴高度的增加。这种活性在此称之为"肠营养"活性。另外还可检测到的对GLP-2的反应是腺管细胞的增殖和/或小肠上皮凋亡的减少。这些细胞效应在空肠表现得最为明显，包括远端空肠，而近端空肠尤为明显，这些细胞效应也见于远端回肠。如果一种化合物符合以下条件，即认为这种化合物具有"肠营养效应"，这些条件是，当以该化合物治疗动物时(或通过遗传工程使动物本身表达这种化合物)，对参照GLP-2肽有反应的脊稚动物类的实验动物中至少有一种动物明显表现出小肠重量增加、腺管加绒毛轴高度增加或腺管细胞增殖加强或小肠上皮凋亡减少。Matsuno等(参考文献出处见上)描述了一种适用于确定这种胃肠生长的模型，这一模型在以下实例1中举例说明。GLP-2和GLP-2类似物对于小肠中腺管加绒毛轴高度的细胞效应的形态测定分析在以下实例2中描迷。对于胰岛，这种生长是通过GLP-2介导的相对于未治疗对照组胰岛增大和/或增殖来显示。在以下实例1中举例说明一种确定化合物的肠营养效应的方法，该方法是检测待测化合物对胰岛细胞生长的影响，包括胰腺细胞的体积增大和数量增加两方面。术语"GLP-2肽"在此统指脊推动物中天然存在的GLP-2和GLP-2天然型的类似物。GLP-2类似物能引致肠营养效应，而在结构上与某一特定脊推动物GLP-2比较有了改变，包括至少一个氨基酸的增加、缺失、替换或引入一个或多个带有封闭基团的氨基酸。例如，不同脊推动物类型的GLP-2包括大鼠GLP-2及其同源物，包括牛GLP-2、猪GLP-2、八齿鼠GLP-2、牛GLP-2、豚鼠GLP-2、仓鼠GLP-2、人GLP-2、虹鳟GLP-2和鸡GLP-2。多位作者已经报道了这些GLP-2的序列，包括Buhl等《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem),1988，263巻18期8621页，Nishi和Steiner,《分子内分泌学》(Mol.Endocrinol.),1990，4巻1192页-1198页，以及Irwin和Wong，《分子内分泌学》(Mol.Endocrinol.),1995，9巻3期267页-277页。这些作者报道的序列在此收入，以资参照。根据本发明所提供的操作指导，脊推动物GLP-2的类似物可用肽化学标准方法制备并对其肠营养活性进行分析。本发明特别优选的类似物是那些根椐人GLP-2序列制备的类似物，序列如下组-丙-天冬-甘-丝-苯丙-丝-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-苏-异亮-亮-天冬-天冬酰胺-亮-丙-丙-精-天冬-苯丙-异亮-天冬酰胺-色-亮-异亮-谷氨酰胺-苏-赖-异亮-苏-天冬其中一个或多个氨基酸残基可以被另一个氨基酸残基保守地替换，只要所产生的类似物仍然保持肠营养活性，例如脊稚动物中的小肠生长、胰岛生长和/或腺管/绒毛高度增加。任何天然存在的GLP-2中的保守性替换，优选人GLP-2序列的保守性替换，指的是以下五组中任一组内部氨基酸残基的交换I:丙，丝，苏(脯，甘)II:天冬酰胺，天冬，谷，谷氨酰胺III:组，精，赖IV:蛋，亮，异亮，缬(半胱)V:苯丙，酪，色本发明还包括任何脊推动物GLP-2序列氨基酸的非保守性替换，只要这些非保守性替换发生在这样一些氨基酸位置，这些位置的氨基酸在不同种系动物的GLP-2是各不相同的。将所有已知的脊推动物GLP-2序列排列起来即可很容易确定非保守残基位置。例如，Buhl等在《生物学和化学杂志》(J,Biol.Chem),1988，263巻18期8621页比较了人、猪、大鼠、仓鼠、豚鼠和牛GLP-2序列，发现13、16、19、27和28位是非保守位置(位置数目参照人GLP-2序列中的类似位置)。Nishi和Steiner在《分子内分泌学》(Mol.Endocrinol.),1990，4巻:1192页-1198页报道，在编码GLP-2的序列内另外一个位置即上迷人GLP-2序列中的第20位残基，在八齿鼠中也不同，八齿鼠是原产于南非的啮齿类动物。因此，根据这个标准，在哺乳动物中有差异而可优选地被非保守性残基替换的氨基酸位置是13、16、19、20、27和28位。出现在位置2、5、7、8、9、10、12、17、21、22、23、24、26、29、30、31、32和33。或者，非保守性替换可以在任一位置进行，只要丙氨酸扫描突变法显示这个位置对突变具有一定的耐受性，即用丙氨酸替换这个位置的氨基酸残基并不完全破坏肠营养活性。丙氨酸扫描突变技术由Cunningham和Wells在《科学》(Science),1989，244巻:1081页描述，在此完整地收入以资参照。由于绝大多数GLP-2序列仅由大约33个氨基酸组成(而在人GLP-2,丙氨酸已经出现在4个位置上)，因此，正如以下实例所指导的那样，本领域的技术人员可以很容易测定各剩下位置以丙氨酸替换而形成的丙氨酸类似物的肠营养效应。将脊推动物GLP-2的已知序列排列起来，可以建立一个通用公式，该公式既考虑了这些种类GLP-2之间已知有差异的残基，也考虑了它们有意义的序列同源性。这个公式可用于指导选择特别优选的非保守性残基进行替换、插入、缺失或加上氨基酸封闭基团修饰。因此，根据本发明诸方面之一，本发明包括的脊推动物GLP-2特别的类似物是符合于通用公式的脊推动物GLP-2和GLP-2类似物，该通用公式作为1#序列表示如下Rl-[Y]m_组-丙_天冬_甘-丝-苯丙-丝-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-苏-aal-亮-天冬-aa2-亮-丙-aa3-aa4一天冬-苯丙-异亮-天冬酰胺-色-亮-aa5-aa6-苏-赖-异亮-苏-天冬-[X]n-R2其中aa表示任何氨基酸残基，aal~aa6是从不同种类所获得的GLP-2序列中已知有差异的那些残基位置，而X是选自III组的一个或两个氨基酸，如精、赖或精-精Y是选自III组的一个或两个氨基酸，如精、赖或精-精m是0或l;n是0或1;Rl是H或一个N-端封闭基团；而R2是OH或一个C-端封闭基团。在本发明的数个实施方案中，aalaa6定义如下aal选自IV组;aa2选自I或II组;aa3选自I组；aa4选自III组;'aa5选自IV组；aa6选自II或m组。在本发明的特别优选实施方案中，aal~aa6选自一组残基，已知该组残基出现在从不同种系分离的GLP-2的相应位置上，所示如下aal是异亮或缬；aa2是天冬酰胺或丝；aa3是丙或苏；aa4是赖或津奮；aa5是异亮或亮；而aa6是谷氨酰胺或组。人和大鼠GLP-2之间只在19位氨基酸残基上有差别。在人的序列，该位残基是丙氨酸；而在大鼠GLP-2,19位是苏氨酸。因此，本发明所包括的特别的GLP-2或GLP-2类似物在19位含有一个可变残基。在本发明的这些实施方案中，GLP-2肽符合以下所示的2#序列Rl-[Y]m-組-丙-天冬-甘-丝-苯丙-丝-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-苏-异亮-亮-天冬—天冬酰胺-亮-丙-aa3-精-天冬-苯丙-异亮_天冬酰胺-色-亮-异亮-谷氨酰胺-苏-赖-异亮-苏-天冬-[X]n-R2。其中aa3、Y、m、X、n、R1和R2的定义同上述。在本发明的具体实施方案中，GLP-2肽选自1)大鼠GLP-2，如下所示的3#序列组-丙-天冬-甘-丝-苯丙-丝-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-苏-异亮-亮_天冬-天冬酰胺-亮-丙-苏-精-天冬-苯丙-异亮-天冬酰胺-色-亮_异亮-谷氨酰胺-苏-赖-异亮-苏-天冬；2)人GLP-2，它是大鼠GLP-2苏19变为丙19的等同物，如下所示组-丙-天冬-甘-丝-苯丙-丝-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-苏-异亮-亮-天冬-天冬酰胺-亮-丙-丙-精-天冬-笨丙-异亮_天冬酰胺-色-亮-异亮-谷氨酰胺-苏-赖-异亮-苏-天冬；3)八齿鼠GLP-2，它是大鼠GLP-2[异亮13变缬13、天冬酰胺16变组"、赖"变精"]的等同物；和4)GLP-2和GLP-2类似物，其加上了一个N-端封闭基团和/或N-端残基延伸如精或精-精；和/或加上了一个C-端封闭基团和/或C-端残基延伸如精或精-精。"封闭基团"以R1和R2表示，它们是肽化学领域常规应用的化学基团，其赋予肽生化稳定性和对外源肽酶消化的抗性。例如，合适的N-端保护基团包括C卜s链烷酰基如乙酰基。失去了氨基功能的氨基酸类似物也适于作为N-端保护基团。合适的C-端保护基团包括能在C-端羧基的碳原子上形成酮或酰胺的基团，或者在羧基的氧原子上形成酯的基团。酮和酯形成基团包括烷基基团，特别是分支或不分支d-5烷基基团，例如，甲基、乙基和丙基。而酰胺形成基团包括氨基官能团如初级胺，或烷氨基功能团，例如单C卜5烷氨基和双C卜5烷氨基基团如甲氨基、乙氨基、二曱氨基、二乙氨基、曱基乙基氨基等。氨基酸类似物也适于保护本化合物的C-末端，例如脱羧氨基酸类似物如胍丁胺。选作促进胃肠组织生长特殊形式的GLP-2可以通过熟知的制备肽产物的各种技术进行制备。当然，脊推动物各形式的GLP-2的获得，可以运用蛋白质分离技术的适当組合，从天然来源中提取。如Buhl等(参考文献出处见上述)描述的那样，猪GLP-2可以从回肠粘膜的酸-乙醇提取物中分离和纯化，采用体积筛选和基于HPLC的分馏方法的組合，并用针对人工合成胰高血糖素原126-159的抗体监测分馏产物。作为GLP-2提取法的一种替代方法，应用重组DNA技术可以制备商业量的这些形式的GLP-2，这些GLP-2不管是脊推动物GLP-2还是其类似物，均只含L-氨基酸。为此目的，将编码所需GLP-2或GLP-2类似物的DNA插入一种表达载体，并转化微生物(如酵母)或其它细胞宿主，然后在适合于GLP-2表达的条件下培养。多种基因表达系统已经改造以适应此目的，典型的是，通过所选宿主天然采用的表达调控来驱动所需基因的表达。因为GLP-2不需翻译后糖基化即已具有活性，因此其制备可以很方便地在细菌宿主如大肠杆菌中完成。对于这种制备，编码选定GLP-2肽的DNA由大肠杆菌的乳糖、色氨酸或PL基因的表达调控区进行有效调控。除了编码GLP-2本身的DNA表达外，另一可供选择的方式是，对宿主进行改造，使其表达的GLP-2肽是一种融合蛋白，此融合蛋白为GLP-2连接上一种栽体蛋白，栽体蛋白使表达产物易于分离并且增加产物的稳定性，GLP-2还能从融合蛋白中游离出来。在一种普遍适用于制备选定GLP-2或GLP-2类似物的方法和一种用于制备含非遗传编码氨基酸及N-端和C-端修饰形式的GLP-2肽的方法中，所采用的是很成熟的自动肽合成技术，其详细描述见于J.M.Stewart和J.D.Young,《固相肽合成》(SolidPhasePeptideSynthesis)，第2版，1984，PierceChemicalCompany,Rockford，Illinois;以及M.Bodanszky和A.Bodanszky，《肽合成实践〉XThePracticeofPeptideSynthesis),1984，Springer-Verlag,NewYork;和《应用生物系统430A肽合成仪用户手册》(AppliedBiosystems430AUsersManual),1987,ABIInc.,FosterCity,California,在这些技术中，GLP-2肽自其C-端延伸，即C-端残基结合在树脂上，顺次加入用Fmoc或tBoc方案适当保护的氨基酸，如同Orskov等，989(参考文献出处同上述)所描述的那样。为了掺入N-端和/或C-端封闭基团，采用了固相肽合成方法的常规方案。例如，为了掺入C-端封闭基团，典型的方案是，先将作为固相的支持树脂进行化学修饰，再进行所需肽的合成，这样从树脂上裂解下来的便是具有所需C-端封闭基团的GLP-2。例如，为获得C-端带初级氨基封闭基团的肽，用对甲苄基羟胺(p-methylbenzhydrylamineMBHA)树脂进行肽合成，如此，当肽合成完成时，用氢氟酸处理即释放出所需C-端酰胺化的肽。类似地，用N-甲氨基乙基修饰的DVB树脂可以在C-端掺入N-甲胺封闭基团，经HF处理释放出带有N-甲酰胺化C-端的肽。运用常规方法也可以达到通过酯化作用保护C-端的目的，这需要应用树脂/封闭基团的组合，这种组合允许側链保护的肽自树脂上释放下来，允许用所需的醇进行随后的反应，形成酯官能团。FMOC保护基团与经甲氧烷氧苯基醇或同类连接剂修饰的DVB树脂的組合，可用于此目的，通过以二氯甲烷配制的TFA处理使肽自支持物上裂解出来。对于经适当活化的羧基官能团的酯化作用，如用DCC，可以通过加入所需的醇来进行，然后去保护并分离酯化的GLP-2肽。在合成的GLP-2肽还仍然连接在树脂上的时候，就可以掺入N-端封闭基团，例如用合适的酑和腈进行处理。例如，为了在N-端掺入乙酰封闭基团，偶联于树脂的肽可用以乙腈配制的20%乙酸酐进行处理。然后，将N-端封闭的GLP-2肽从树脂上裂解下来、去保护以及随后进行分离。一旦所需的GLP-2肽合成完毕，从树脂上裂解下来并经充分去保护，即可对该肽进行纯化以保证回收到一条具有选定氨基酸序列的单一寡肽。可用标准方法之任一种进行纯化，包括反相高压液相层析(RP-HLPC),所用柱子为烷化的二氧化硅柱，如C4-、Cs-或d8-二氧化硅。这种柱分馏通常用线性梯度洗脱，例如10%~90%逐渐增加有机溶剂如乙腈，有机溶剂以水緩冲液配制，通常含少量(如0.1%)的緩冲配对剂如TFA或TEA。另一种純化方法是基于不同的肽种类所带电荷性质不同，用离子交换HPLC将它们分离。收集层析的各组份，将那些含有所需/要求純度肽的组份任选地合并。本发明的一个实施方案中，随后GLP-2肽的处理按既定方式进行，即裂解酸(如TFA)换成符合药用要求的酸如乙酸、盐酸、磷酸、顺丁烯二酸、酒石酸、琥珀酸等，以制备符合药用的肽的酸性盐制剂。作为病人用药，本发明之一方面提供了符合药用型的GLP-2肽或其盐类，例如作为一种无菌过滤(如通过0.22p滤膜)制剂并基本上无致热原。在HPLC上迁移成单一或单独的峰，经分析显示为均一正确的氨基酸组成和顺序，而且还符合各个国家药用产品质量管理部门所制定的标准，这才是合乎要求的可用作处方配药的GLP-2肽。作为治疗应用，所选择的GLP-2或GLP-2类似物以栽体配制，所用栽体符合药用要求并适合于通过所选择的给药途径运送并释放肽。合适的符合药用的载体是那些常规用于肽类药物的栽体，如稀释剂、赋形剂等。对于药物配制的一般性指南，参见《雷明顿药物科学》("Remington'sPharmaceuticalSciences"),第17版，MackPublishingCompany,Eastern,Penn.,1985。在本发明的一个实施方案中，这些化合物被配制作为输注给药，例如用作胃肠外全营养治疗病人的液体营养添加剂；或者作为注射给药，例如皮下、肌内或静脉注射。相应地这些化合物配制成无菌无致热原的水溶液，并有选择地将酸碱度调至生理可耐受的pH值，如微酸或生理性pH。因此，这些化合物可以用以下载体配制后给药，例如蒸馏水，或者更为合乎要求地，用盐水、磷酸盐緩冲盐水或5%葡萄糖溶液配制。如果必要，通过加入一种溶解度增加剂如乙酸可以提高GLP-2或GLP-2类似物的水溶性。在水性栽体或媒介物中加入一定量的明胶作为注射剂，可使GLP-2或GLP-2类似物在注射部分或附近蓄积，因而使其緩慢释放至所需的作用部位。达到蓄积效应的有效明胶浓度要求在10-20%的范围。其它的胶化剂如透明质酸也可用作蓄积剂。本发明的各种GLP-2和GLP-2类似物也可以配制成緩慢释放的植入性制剂，如此达到GLP-2持续给药和延长给药时间的目的。这种持续释放制剂的例子包括生物相容性多聚体的混合物，例如多聚乳酸、多聚乳糖合羟基乙酸、甲基纤维素、透明质酸、胶原等。数篇发表的文章对作为药物传递栽体的可降解多聚体的结构、选择和应用都作了综述，包括A.Domb等的《用于先进工艺的多聚体》(PolymersforAdvancedTechnologies)，3巻:279页-292页(1992)。另外，在药物制备中选择和应用多聚体的指南还见于刊登于M.Chasin和R.Langer编的《药物和制药矛+学》("DrugsandthePharmaceuticalSciences")45巻的文章《作为药物传递系统的生物可降解多聚体》("BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystems),M.Dakker，NewYork,1990。脂质体也可用于GLP-2或GLP-2类似物的持续性释放用药，有关如何应用和制备所感兴趣药物的脂质体制剂的细节见于以下其它专利美国专利4，944,948号；美国专利5,008,050号；美国专利4,921,706号；美国专利4,927,637号；美国专利4,452,747号；美国专利4，016,100号；美国专利4，311,712号；美国专利4,370,349号；美国专利4，372,949号；美国专利4,529，561号；美国专利5,009,956号；美国专利4,725，442号；美国专利4，737,323号；美国专利4,920，016号。当需要提供局部高浓度的GLP-2或GLP-2类似物时，例如在胰腺附近高浓度GLP-2或GLP-2类似物以促进胰腺生长用于治疗糖尿病等，这种情况下应用持续释放制剂具有特别重要意义。为了用于剌激哺乳动物包括人类小肠生长或胰岛细胞的增殖和增多，本发明在其多个方面之一方面提供了一种包装，这种包装为无菌封装的小瓶或安瓿，含有单位剂量或多剂量的促进組织生长剂量的GLP-2或GLP-2类似物，该包装还附有一张标鉴说明其内容物用于促进上迷组织的生长。在本发明的一个实施方案中，作为即用型制剂，该包装含有GLP-2或GLP-2类似物和所要求的栽体。而根据本发明的另一个实施方案，该包装提供的是需进一步配制的GLP-2或GLP-2类似物剂型，例如冻干剂型，其需用适当的栽体如磷酸盐緩冲盐水现配药物。在一个实施方案中，该包装是无菌封装的小瓶或安瓿，含有一种注射用溶液，该溶液包含一种溶于水性栽剂的有效肠营养剂量GLP-2或GLP-2类似物。除了注射用制剂，GLP-2或GLP-2类似物还可制备成其它途径用药的制剂。口服剂型如片剂、胶嚢等可按照标准的制药常规制备。根据本发明，GLP-2或GLP-2类似物用于治疗那些会获益于胃肠组织生长的病人。一方面，治疗候选者是那些会获益于小肠组织生长的病人。正如本发明的实施例结果表明的那样，GLP-2对这种组织的效应非常显著，《艮显然这对于那些患有以小肠粘膜异常为特征的疾病或疾病状态的病人大有益处，这些疾病或疾病状态包H溃疡和炎症性疾病；先天性或获得性消化和吸收疾病包括吸收不良综合征；以及由于肠粘膜功能丧失所导致的疾病和疾病状态，特别是接受长期胃肠外给养的病人或者那些因接受肠切除外科手术而患了短肠综合征和盲管综合征的病人。对这些伴有肠道粘膜功能降低的病人实施GLP-2肽治疗，目的是减轻或消除疾病的症状。例如，GLP-2或GLP-2类似物用于患肠道炎症的病人，所用剂量应足以改善因炎症状态所致的肠道不适和腹泻。此外，GLP-2或GLP-2类似物可以用于吸收不良症病人，以促进营养吸收，从而改善这些病人的营养状况。一般来说，那些会获益于小肠量的增加而小肠粘膜功能随之增强的病人是应用GLP-2或GLP-2类似物治疗的候选者。可以用GLP-2治疗的特殊疾病状态包括各种类型的口炎性腹泻，这些类型包括小麦中a-麦胶蛋白所致毒性反应引起的腹泻，其特点是肠道绒毛大量丢失；感染引起的热带口炎性腹泻，其特点是绒毛部分变平；低丙种球蛋白性腹泻，这种腹泻常见于患常见的可变型免疫缺陷病或低丙种球蛋白血症的病人，其特点是绒毛高度明显降低。GLP-2治疗效果的检验可通过肠活检检查绒毛形态学、生化检测营养吸收状况、病人体重增加或这些疾病状态相关症状的改善。其它可以用GLP-2或GLP-2类似物治疗或者GLP-2或GLP-2类似物可能起到预防作用的疾病状态，包括放射性肠17类、感染或感染后肠炎、局限性肠炎(Crohn's病)、毒物或其它化疗制剂所致的小肠损伤，以及患肠短综合征的病人。另一方面，应用GLP-2或GLP-2类似物治疗的候选者是那些会获益于胰岛生长，特别是胰岛增大或增殖或再生的病人。这些病人包括患了以胰岛缺乏或减少或者胰岛功能降低为特点的疾病或疾病状态的病人。特别的治疗候选者是那些患1型或2型糖尿病的病人，以及由于胰腺浸润、炎症或破坏引起继发型糖尿病的病人。用于治疗这些病人的GLP-2或GLP-2类似物的剂量应足以恢复至少部分胰腺功能、增高内源性胰岛素水平和改善病人症状。用于病人治疗最合适的治疗剂量和方案当然因所治疾病或疾病状态而异，而且应根据病人体重和其它参数进行调整。本发明下面提供的结果显示，GLP-2或GLP-2类似物的剂量相当于约2.5mg/kg(或更低，参见下迷)、每天用药两次、疗程超过IO天可以明显增加小肠重量及腺管/绒毛高度特别是近端空肠腺管/绒毛高度。可以预料，更低剂量如在pg/kg范围和更短或更长疗程或治疗次数增多，也将获得有效的治疗结果，即小肠重量的增加具有统计学意义。作为人用的最适剂量大小和给药方案可以本发明提供的结果作指导，并经严格设计的临床试验进一步确定》有效的剂量和治疗方案可用经典方法来确定，在实验动物从低剂量开始，然后在监测治疗效果的同时逐渐加大剂量，以及全面变更剂量方案。当临床医生为某一特定病人确定最佳剂量时，他要充分考虑许多因素，其中最主要的因素是血浆中正常循环的GLP-2量，静止状态下GLP-2正常值在151pmol/ml左右，而健康成人在摄入营养物后，该正常值升高至225pmol/ml。Orskow,C.和Helst，J.J.，1987,《斯堪的纳维亚临床和实验研究杂志》(Seand.J.Clin.Lav.Invest.)47巻165页。其它因素包括病人高矮、年龄、一般状况，正在治疗的特殊疾病，疾病的严重性，是否正在用着其它药物，GLP-2肽的体内活性，等等。在考虑了动物研究结果和临床文献资料后，选定一个试验剂量。本领域的普通技术人员在计算剂量时还应考虑象GLP-2结合常数和Ki值这样一些资料，这些资料是从体外GLP-2竟争结合试验中获得的。GLP-2肽典型的人用剂量是约10(ag/kg体重/天约10mg/kg/天，优选约50jxg/kg/天~约5mg/kg/天，最优逸约100ng/kg/天~约lmg/kg/天。另一方面，本发明提供了一种用于已确定为候选病人的治疗方法，这种治疗采用细胞植入法，待植入的细胞首先在体外或体内经GLP-2或GLP-2类似物孵育或处理作适应性培养，或者待植入的细胞经基因工程操作使其自身产生GLP-2或GLP-2类似物。离体细胞的适应性培养可以简单地将待移植的细胞或组织培养在已经添加有促进生长量的GLP-2或GLP-2类似物的培养基中，另外这种培养基要适合于培养这些细胞。在经过适当时间的适应性培养后，这些细胞被直接植入病人体内，或者用已经成熟的细胞包嚢技术将这些细胞包入胶嚢后再植入病人体内本发明还有一个方面，包括体内应用GLP-2肽治疗动物，以促进小肠组织生长或增加胰岛细胞的大小或数目。在小肠和/或胰岛增大后，这些组织可用作异种移植。因为在将非人动物组织移植到人的异种移植中，移植器官或组织的大小往往是移植成功的限制因素，因此，在进行异种组织移植之前对动物进行这样的GLP-2肽治疗很有益处。例如，用GLP-2肽治疗供体动物猪，以增加小肠体积，之后，将猪的小肠组织移植到需要这种器官的人身上。另外，待移植的这些细胞可以在体外从一个细胞扩增培养起来，这个细胞先经遗传工程操作使其表达或高表达胰高血糖素基团，或更直接地，表达仅编码GLP-2的DNA。从逸定的GLP-2的氨基酸序列很容易确定这种DNA的序列，但其局限性是这种方式只能产生含遗传编码氨基酸的GLP-2类型。多种适合于将遗传信息导入人类细胞的病毒栽体可以采用，将编码GLP-2的DNA插入病毒栽体中使其处于表达调控区的调节下，这些表达调控能在宿主细胞中发挥功能。一旦经过遗传改变，便可应用本领域已建立的方法将这些遗传工程细胞移植至病人体内。实例1在第一个实验中研究了肠高糖素对小肠生长的影响，两組小鼠(8周龄，CD1雌性，获自CharlesRiver实验室)，每組6只鼠，按以下方法进行治疗给每只小鼠皮下注射0.5cc含41.5pg肽的16%明胶溶液，每12小时一次，连续10天。肠高糖素(大鼠)易溶于10ml水。对照組小鼠只注射0,5cc16%明胶溶液，不含肽，每12小时一次。小鼠以标准的大鼠饲料喂养，给小鼠自由进食和饮水，小鼠处死前12小时开始撤出食物而仅给饮水。为称取小肠重量，切下全部小肠，然后除去胃(近端)和阑尾/盲肠/大肠(远端)。剩下的小肠用盐水清洗以除去粪便，然后称重。结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>以上结果表明，肠高糖素的肠营养效应不明显，为此进行了第二个实验，用同样的方案研究其它胰高血糖素原基因编码产物的效果，包括GLP-l和GLP-2。为此目的，采用基于tBoc的固相方法人工合成3弁序列的大鼠GLP-2和人GLP-1(7-36酰胺)。分析显示大鼠GLP-2純度为95%,分析方法用分析性HLPC(1.0mg/ml的样品20fil;VydacCl8柱5(^1;0.1%TFA/20-60%CH3CN洗脱超过20分钟，洗脱速率1.5m1/分)。用作注射的GLP-2制剂按下法配制明胶溶于温水中使其重量比浓度为16%,50ml这种溶液经高压蒸汽灭菌并冷却至室温。另外单独制备肽溶液，即5mgGLP-2于稍少于10ml的水中混匀，然后加入1N乙酸(10~20|ia)使肽完全溶解。之后，加入等量的INNaOHU0~20^1)将pH调至约7.0,再加入蒸馏水将溶液的体积补足lOrnl。为配制用作注射的制剂，将10ml肽溶液和50ml16%明胶溶液混匀，用0.5ml胰岛素用小注射器抽取注射所用量。同样的方法用于配制GLP-1，不同的是由于GLP-1在水中的溶解度相对较高，因此无需酸/碱调节。以不含或含肽(62.5ing/剂量)的0.5ml16%明胶，给小鼠注射，4组每组4只(8周龄，CD1雌性，获自CharlesRiver实验室)，每天注射2次，连续10天。结果列表如下<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>以上结果表明，与不用肽的对照组比较，以及与用另一种胰高血糖素相关肽GLP-1治疗的实验组比较，GLP-2组在剂量约2.5mg/kg(640nmole/kg)，每天治疗2次连续IO天后，显示小肠重量的增加具有统计学意义(p<0.05)。与这里提供的肠高糖素的结果比较，也很清楚GLP-2是其中一个主要的肠组织生长因子。对4只GLP-2治疗小鼠和4只对照组小鼠的胃肠器官作切片检查，以进一步研究GLP-2用药对这些小鼠的效果，所用方法为石蜡包埋切片和标准的组织病理技术。通过形态测定分析法测量胰岛面积。苏木素和伊红染色切片用作定量分析。对每张切片均测量其总的胰腺面积和总的胰岛面积。所得资料显示，在对照组胰岛面积平均是总胰腺面积的0.31%。相比之下，GLP-2治疗组的胰岛面积占总胰腺面积的0,70%，表明在GLP-2治疗组胰岛面积增加了2倍多。除了胰岛的大小外，还观察到胰岛的数目也增多。实例2GLP-2肽对小肠生长的影响被进一步研究，特別是评价组织反应与剂量、时间、给药途径和给药频率、制剂类型以及受治者性别年龄之间的关系。这些效应的检测不仅通过小肠重量的增加来反映，还通过腺管和绒毛高度的增加来反映。为了这些目的，大鼠GLP-2的制备如实例3所迷。这种大鼠GLP-2以磷酸盐緩冲盐水配制，或者配制为含明胶的蓄积制剂。用磷酸盐緩沖盐水配制GLP-2肽的方法如下首先配制10xPBS贮存液，即称取80gNaCl(BDHACS783)、2gKC1(BDHACS645)、11.5gNa2HP04(AnachemiaAC-8460)和2gKH2P04(MalinckrodtAR7100),这些试剂溶于无菌蒸馏水，总体积为1升。最终工作液的配制是用无菌蒸馏水将贮存液作10:1稀释，如有必要再用数毫升10NNaOH(氢氧化钠)调节pH至7.3-7.4。然后将工作液高压蒸汽灭菌30分钟。最终的PBS工作液中，各种试剂的浓度为137mMNaCl、2.7mMKC1、4.3mMNa2HP04.7H20和I.4mMKH2P04。PBS配制GLP-2肽的制备方法是，按所需配制的肽浓度将肽的粉剂加入BPS工作液。例如，要配制浓度为130mg/L肽的PBS溶液，4.2mgGLP-2溶于40mlPBS中即得到GLP-2浓度为130pg/ml。一只小鼠的给药剂量是2.5mg/kg的话，大约注射这种溶液0.5ml，一天2次。明胶制剂的制备方法是，首先配制明胶溶液，即将12克明胶(Sigma,G-8150批号#54H。7241A型从猪皮肤制备[9000-70-8]00Bloom)溶于100ml蒸馏水。而后将明胶溶液高压蒸汽灭菌，保温于37。C，然后将GLP-2肽加入而得到含所需特定肽浓度的溶液，其中GLP-2肽按上述方法预先溶于磷酸盐缓冲盐水。将GLP-2的PBS制剂与按刚才所述方法配制的明胶溶液混合，即制备成所需GLP-2浓度的GLP-2明胶制剂。例如，要配制浓度为130mg/LGLP-2的明胶制剂，用4.2毫克GLP-2制备10mlGLP-2的PBS溶液，将此溶液以30ml按上法配制的20%明胶工作液稀释。通过用吸液管轻轻抽吸将溶液混匀，便得到GLP-2终浓度为130mg/L含15%明胶的PBS溶液。同实例1，受试者是CD1小鼠，获自CharlesRiver实验室(Ontario,22Canada)。除非特别指明，CD1小鼠是年龄匹配的雌鼠(每组n-3~4),在注射药物时的年龄为6周龄。在开始每次实验之前，先让动物有一段适应实验室环境的时间，这段适应时间不少于24小时。用耳朵打孔法给动物标号。在整个实验过程中，不限制小鼠的饮食或活动。光/黑循环为12小时，在晚6点~早6点之间。绝大多数注射用12。/。明胶或PBS作为栽剂对照组为年龄和性别匹配的动物(n=3~4),仅注射单純PBS或明胶制剂。每种肽配制成特定浓度，溶于0.5cc栽剂中。肽通过皮下注射给药，小鼠被每日照管在实验室。药物注射开始后14天处死动物，处死前20~24小时让动物禁食。小鼠以C02麻醉并通过心脏穿刺放血。血液收集于75|tilTED(Trasyool;EDTA(5000KIU/ml:1.2mg/ml;Diprotin-A),血液于14kxg离心5分钟，吸取血浆置-70'C保存待分析。从腹腔中切取小肠，部位为自幽门至盲肠，清洗切下的小肠，称重并测量长度。为便于比较，各只动物的组织切片均取自同一解剖部位。从距离幽门8±2cm、18±2cm、32±2cm处切取1.52.0cm长的肠段分别代表近端空肠、远端空肠和远端回肠，用于组织形态学检查。将各小肠肠段置于组织台上，沿其肠系膜缘纵向切开，然后放入10%福尔马林(体积/体积)过夜，之后转移至70%乙醇。为做显微测量和形态测定分析，特别是评价GLP-2对腺管/绒毛高度的影响，组织切片切成5pm厚并以苏木素和伊红染色。用带摄象机的显微镜(Leitz，Wetzar，Germany)进行肠的显微测量，显微镜的摄象机与计算机显示器连接。显微镜的放大倍率校到4x、10x、25x，用同一显微镜进行所有显微测定。为测量腺管加绒毛高度，每张近端空肠、远端空肠和远端回肠的切片至少检查20条纵向绒毛，测量自腺管基底至绒毛顶端的距离，结果以pm士S.E.M表示。各项分析结果示于所附图1~7和图9，参照这些图，现将结果概述剂量反应:图1示大鼠GLP-2皮下给药剂量与治疗反应的关系。大鼠GLP-2配成12%明胶制剂(即GLP-2在PBS中)，检测指标为小肠重量(BW-A图)、近端空肠腺管加绒毛高度(PJ-B图)、远端空肠腺管加绒毛高度(DJ-C图)和远端回肠腺管加绒毛高度(DI-D图)大鼠GLP-2肽通过皮下注射给药。结果以相对于对照组的变化百分率表示，对照组仅接受12%明胶栽剂注射。星号表示与对照组比较具有统计学意义的差别(*=p<0.005，**=p<0.01,***=p<0.001)。从图l所示结果可以看出，GLP-2肽注射的剂量为1.0-5.0pg时所引起小肠重量的增加有统计学意义。而对于腺管/绒毛高度，剂量低至0.25iiig时仍能获得所需要的效果。制型的影响:图2示用GLP-2的明胶制剂(G)或PBS制剂(PBS)给药的结果，GLP-2的剂量为2.5|Lig，皮下给药，每天2次。A图示对于小肠重量(以克计)影响的差别，B图示对于近端空肠(PJ)、远端空肠(DJ)和远端回肠(DI)的腺管/绒毛高度(以jam表示)影响的差别。可以看出两种剂型引起以上检测指标的增加均具有统计学意义。可能由于明胶制剂能使GLP-2从注射部位以一种更持续的方式释放，其引起的反应要比PBS制剂稍微强些。给药途径的影响:图3示大鼠GLP-2以皮下注射(SC)、肌内注射(IM)或腹腔内注射(IP)给药引起肠重量(BW)增加的百分率，大鼠GLP-2以磷酸盐緩沖盐水栽剂配制，剂量为2.5ng，每天2次。可以看出，与只接受PBS栽剂皮下注射的对照组比较，不管选捧何种给药途径，GLP-2肽均能引起明显反应。皮下注射引致的反应最强。给药频率的影响:图4示评价小肠重量和腺管/绒毛高度与GLP-2给药频率之间关系的结果。GLP-2按所标示剂量皮下给药，每12小时一次(ql2h)、每天一次(qd)或隔天一次(qod)。从所示结果可以看出，与只接受单纯PBS的对照组比较，所有的给药频率均引起小肠重量变化百分率明显增加。对小肠重量和腺管/绒毛高度增加最多的是最频繁的给药方式，即每12小时一次。长期用药的影响:大鼠GLP-2以10%明胶配制，皮下给药，每天一次单一剂量5^g，连续用药4周(A图)、8周(B图)或12周(C图)。图5示与只接受10。/。明胶的对照组(C)比较，治疗组(T)GLP-2介导的对小肠重量(BW)及腺管加绒毛高度(PJ、DJ和DI)的效应。小肠重量结果表明，GLP-2介导的小肠重量增加可以出现在用药期间内并持续存在于所检查的整个用药期，近端空肠腺管/绒毛高度的结果也是如此。类似的反应也见于远端空肠。对所有动物在处死时进行了彻底的尸检，没有发现任何一只动物有组织学异常。时间曲线评价:图6示CD1雌性小鼠经单纯PBS(对照组)或2.5fig大鼠GLP-2PBS制剂皮下给药治疗小肠重量变化百分率。给药方式为每天2次，按图中所标示天数连续用药。结果清楚表明，经用药4天后即可获得明显效果，随着继续用药这种效果持续存在。另外的研究还清楚表明，GLP-2用药所获得的小肠重量增加在停止治疗约IO天后退回原水平。但GLP-2对于绒毛的增生效应并不完全消退，特别是在老龄鼠(24月龄)，这表明在这些老龄受试者肠组织更新率比较慢。因此，在GLP-2治疗期间有必要给受试者以维持剂量的GLP-2。受试者性别和年龄评价:图7示4~16周龄性别匹配的CD1小鼠以2.5)igGLP-2每天给药2次治疗的结果，在小肠重量和组织学两方面与它们各自的对照组比较。从所示结果可以看出，GLP-2对小肠的效应与受试者的性别无关。在一个相关的实验中，以GLP-2治疗年龄为6月~2岁的C57BLK雌性小鼠(CharlesRiver,U.S,)，发现GLP-2对于6个月~2岁龄的小鼠均能有效地促进小肠生长。GLP-2对小肠长度影响的评价图9示GLP-2用药对小肠长度的影响。CDl小鼠以PBS(对照组)或大鼠GLP-2的PBS制剂治疗(2.5|ug,每天2次)10天，处死小鼠，测量自胃至回盲瓣间的小肠长度，以厘米表在GLP-2治疗中观察到的绒毛延长可能源自GLP-2对细胞增殖的促进效应或抑制细胞衰老。为检验这两种可能性，检查了刺激组和对照组小肠组织的石蜡切片，检测增殖细胞核抗原(PCNA)作为增殖指标，而用TUNEL法检测凋亡细胞以作凋亡分析。GLP-2治疗小鼠近端空肠的增值率高于对照小鼠(124%)(对照组为46.0±1.2%;治疗组为57土5.5%)。在对照组小鼠，增殖局限于小肠的腺管部；绒毛不含PCNA阳性细胞。在GLP-2治疗组，在绒毛和腺管-绒毛轴的交接处均可检测到增殖细胞。GLP-2治疗组小鼠近端空肠凋亡率比对照组小鼠低。在对照组小鼠凋亡细胞主要见于绒毛顶端或侧缘；肠的腺管部无凋亡细胞可见。在GLP-2治疗组小鼠，凋亡细胞的分布相似，但它们的数目少得多。实例3鉴于大鼠GLP-2用于受试小鼠所观察到的结果，推测各种脊推动物的大鼠GLP-2同源物和类似物也能介导肠营养效应。为此目的，人工合成了多种GLP-2和GLP-2类似物并对它们的活性进行评价，如下所述。在300毫升(ml)的容器中按3毫克分子(mmole)的规模手工进行固相肽合成(SPPS),所用固相为6克(g)氯甲基(Merrifield)树脂(用于C端游离酸的肽)，每克取代0.5毫当量(m叫)。在氨基端以叔丁氧羰基(tBoc)基团保护氨基酸。氨基酸侧链的保护采用节基(Bz,用于丝氨酸和苏氨酸)、千氧甲基(BOM,用于组氨酸)、2-溴节氧羰基(2-BrZ,用于酪氨酸)、2-氯苄氧羰基(2-C1Z,用于赖氨酸)、环己基(cHex,用于天冬氨酸和谷氨酸)，以及甲苯磺酸基(Ts,用于精氨酸)侧链保护基团和氯甲基(Merrifield)树脂。在含氟酸钾(KF)的条件下，通过保护氨基酸的酯化作用将第一个氨基酸与氯甲基树脂偶连。对于C-端酰胺肽的合成，固相栽体用4-曱千基羟胺(MBHA)树脂，即用6g树脂，每克取代0.5毫当量，按3mmo1的规模合成。按照下述肽延伸的方法将第一个氨基酸与MBHA树脂偶连。用以CH2Cl2配制的50%三氟乙酸(TFA)使氨基去保护，然后用CH2Cl2配制的10%三乙胺(Bt3N)洗涤2次进行中和。用CH2Cl2/二曱基甲酰胺(DMF)配制的N,N-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DCC/HOBt)使肽延伸。延长中的肽链在每一步延伸之后都用溶于二氯甲烷(CH2C12)的20%乙酐(Ac20)盖帽。在每个延伸、盖帽和去保护步骤之后，肽-树脂用异丙醇UPrOH)和甲醇(MeOH)洗涤。洗涤重复一次。N-端乙酰肽的制备是通过用溶于CH2Cl2的20。/。AC20使末端氨基乙酰化。树脂连接产物用含二甲基疏醚(DMS)和对甲苯酴作清洁剂的氟化氢通过由低到高的程序进行常规裂解。肽的粗制品经制备型高压液相层析(HPLC)纯化，用VydacC18、15反相二氧化硅柱，孔径20pm宽，2英寸xl2英寸，用乙腈修饰水配制的0.1%TFA进行梯度洗脱。以220毫微米(nm)波长监测洗脱过程。所收集的各组份用分析性HPLC进行纯度分析，即用VydacC18反相二氧化硅柱，5pm，4.6x254毫米(mm),用乙腈修饰水配制的0.1%TFA进行梯度洗脱并以215nm波长监测。純度大于95%的组份合在一起进行冷冻千燥。从肽的TFA盐制备肽的乙酸盐有以下步骤将冻干粉剂溶于水，必要时加入乙腈以助溶。溶液通过质子化的Bio-Rex70阳离子交换树脂。该树脂以5倍柱床体积的水洗涤，之后用以水配制的50%乙酸将树脂所结合的肽洗脱下来，洗脱物用水稀释并冷冻干燥。最终的冻干粉剂通过两次分析性反相HPLC方法分析其纯度，所用柱子为VydacC18反相二氧化硅柱，5pm，4.6x254mm。所用的两种溶剂系统是，以三乙胺磷酸盐调节pH至2,25的乙腈修饰水梯度和乙腈修饰并含0.1%TFA的水梯度。层析柱洗脱物在215nm波长处监测。各产物通过氨基酸分析和电喷雾质语分析证实。通过这种方法，本发明制备了以下GLP-2或GLP-2类似物的乙酸盐a)3弁序列的大鼠GLP-2;b)N-乙酰大鼠GLP-2，其中大鼠GLP-2的氨基端被乙酰基封闭；c)[Arg"]大鼠GLP-2,其为在氨基端额外加上一个精氨酸残基修饰的大鼠GLP-2;d)C-酰胺大鼠GLP-2，其为在羧基端加上一个酰胺基的大鼠GLP-2(溶解lmg需用1%乙酸(110|al)，再以450|al2NNaOH中和)；e)[Arg"，大鼠GLP-2,其为在氨基端额外加上两个精氨酸残基修饰的大鼠GLP-2;f)[Arg+34]AGLP-2，其为在33位残基之后加上一个精氨酸残基的人GLP-2;以及g)八齿鼠GLP-2。除另指明外，这些肽在室温下完全溶于水。按实例2所述的方法对这些GLP-2's和GLP-2类似物的肠营养效应进行了评价。特别地，肽以PBS配制，每次注射剂量0.5ml含2.^g，给CD1雌性小鼠皮下注射，每12小时一次，连用10天或14天。与模拟剂(单纯PBS)治疗小鼠比较肠重量和腺管绒毛高度。这些实验的结果示于图8。通过将化学基团加到氨基端对GLP-2进行修饰，特别是[N-乙酰]_GLP-2,或额外在N-端加上氨基酸，[Arg+1]-GLP-2,或者加到羧基端，如[Arg+34]-GLP-2，由此产生的GLP-2衍生物仍然在体内显示有小肠生长因子的特性，例如在小鼠H天的实验中(图8,A图F图)促进小肠生长和增加腺管加绒毛高度(与盐水治疗对照组比较)。此外，利用各种种系GLP-2样相关分子的序列信息，也可制备具有有效的小肠生长因子样特性的GLP-2相关分子。例如，八齿鼠GLP-2序列在小鼠的IO天实验中也显示小肠生长因子样活性，其对小肠重量的增加几乎与大鼠GLP-2的效果相当(两种肽均是皮下27给药，2.5|tig,每天2次)。这项资料表明，对GLP-2肽结构的这些修饰，如这里所示，产生的分子在体内仍显示天然GLP-2样特性。与此相反，当该分子的羧基端区域被加入氨基封闭基团修饰时，[c-酰胺]-GLP-2,所产生的肽在体内无明显的GLP-2生物学活性(图8C-D)上面所写就的说明书足以使本领域技术人员实施本发明。诚然，分子生物学、医学或相关领域的技术人员显然能对上述实施本发明的方法进行各种改良，但这些改良仍将属于下述权利要求的范围之内。序列表1)一般资料(i)申请人:Drucker,DanielJ.(ii)发明题目胰高血糖素样肽-2及其治疗应用(iii)序列数目3(iv)通讯地址(A)收件人Pannie&Edmonds(B)街道1155AvenueoftheAmericas(C)城市NewYork(D)州N.Y.(E)国家U.S.A.(F)邮政编码10036-2711(v)计算机可读形式(A)栽体类型软盘(B)计算机IBM兼容的个人计算机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PetentlnRelease#1.0,version#1.25(vi)当前申请资料(A)申请号US(B)申请曰(C)分类(ix)电讯资料:(A)电话(202)638-5000(B)电传(202)638-4810(2)1#序列资料(i)序列特性(A)长度34个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关鍵词修饰部位(B)位置13(D)其它资料/注="一种中性/极性/大/非芳香族氨基酸，，(ix)特征(A)名称/关鍵词修饰部位(B)位置16(D)其它资料/注="一种中性/极性氨基酸"(ix)特征(A)名称/关鍵词修饰部位(B)位置19(D)其它资料/注-"一种中性氨基酸"(ix)特征(A)名称/关键词修饰部位(B)位置20(D)其它资料/注="一种中性氨基酸"(ix)特征(A)名称/关键词修饰部位(B)位置27(D)其它资料/注="一种中性/极性/大/非芳香族氨基酸"(ix)特征(A)名称/关键词修饰部位(B)位置28(D)其它资料/注="一种中性或碱性氨基酸""x)特征(A)名称/关键词修饰部位(B)位置34(D)其它资料/注-"一种选自精氨酸、赖氨酸或精-赖氨酸链的氨基酸"(xi)序列表述1#序列组丙天冬甘丝苯丙丝天冬谷蛋天冬酰胺苏1510Xaa亮天冬Xaa亮丙XaaXaa天冬苯丙异亮1520天冬酰胺色亮XaaXaa苏赖异亮苏天冬Xaa2530(2)2#序列资料(i)序列特性(A)长度34个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词修饰部位(B)位置19(D)其它资料'./注-"一种中性氨基酸"(ix)特征(A)名称/关键词修饰部位(B)位置34(D)其它资料/注-"一种选自精氨酸、赖氨酸或精-赖氨酸链的氨基酸"(xi)序列表述2#序列组丙天冬甘丝苯丙丝天冬谷蛋天冬酰胺苏1510异亮亮天冬天冬酰胺亮丙Xaa精天冬苯丙异亮1520天冬酰胺色亮异亮谷氨酰胺苏赖异亮苏天冬2530Xaa(2)3#序列资料(i)序列特性(A)长度'.33个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(ii)序列表述3#序列组丙天冬甘丝苯丙丝天冬谷蛋天冬酰胺苏1510异亮亮天冬天冬酰胺亮丙苏精天冬苯丙异亮1520天冬酰胺色亮异亮谷氨酰胺苏赖异亮苏天冬2530权利要求1.一种药用组合物，包含一种GLP-2肽和一种符合药用要求的载体，GLP-2肽选自脊椎动物GLP-2或脊椎动物GLP-2的肠营养性类似物，后者与脊椎动物GLP-2的不同之处在于其具有至少一个氨基酸的增加、缺失、替换或含N-端或C-端氨基酸封闭基团的氨基酸。2.根椐权利要求1的药用组合物，其中GLP-2肽符合公式Rl-[Y]m-组-丙-天冬-甘-丝-苯丙-丝-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-苏-aal-亮-天冬-aa2-亮-丙-aa3-aa4-天冬-苯丙-异亮-天冬酰胺-色-亮-aa5-aa6-苏-赖-异亮-苏-天冬-[X]n_R2其中aal、aa2、aa3、aa4、aa5或aa6指任一氨基酸残基，而X是选自III组的一个或两个氨基酸；Y是选自III组的一个或两个氨基酸；m是0或1;n是0或1;Rl是H或一个N-端封闭基团；而R2是OH或一个C-端封闭基团。3.权利要求2的药用组合物，其中aal选自IV组;aa2选自I或II组；aa3选自I组;aa4选自III组;aa5选自IV组;aa6选自II或III组。4.根椐权利要求3"药用組合物，其中GLP-2肽的氨基酸序列是Rl-[Y]m-组_丙-天冬-甘-丝-苯丙-丝-天冬-谷-蛋-天冬酰胺-苏-异亮-亮-天冬-天冬酰胺-亮-丙-aa3-精-天冬-苯丙-异亮-天冬酰胺-色-亮-异亮_谷氨酰胺-苏-赖-异亮-苏-天冬-["11-112。5.根椐权利要求1的药用组合物，其中GLP-2肽是一种脊推动物GLP-2。6.根据权利要求5的药用组合物，其中GLP-2肽是大鼠GLP-2。7.根据权利要求5的药用组合物，其中GLP-2肽是人GLP-2。8.根据权利要求1的药用组合物，其中GLP-2的用量能发挥肠营养效应。9.一种促进肠组织生长的方法，用于有这方面需要的病人，其包括给病人施以权利要求8的药用组合物的步骤。10.根据权利要求1的药用组合物，其中GLP-2肽的用量能有效地促进胰岛生长。11.一种促进胰岛生长的方法，用于有这方面需要的病人，其包括给病人施以权利要求10的药用组合物的步骤。12.—种符合药用要求的GLP-2肽的酸加成盐。13.根据权利要求12的符合药用要求的GLP-2肽酸加成盐，其中所说的GLP-2肽是一种脊推动物GLP-2肽。14.一种用于鉴定新的肠营养性肽的方法，包括以下步骤a)获取一种肠营养性脊推动物GLP-2肽的类似物，该类似物至少有一个氨基酸替换、缺失、增加，或一个含封闭基团的氛基酸；b)以该类似物治疗一种哺乳动物，所用治疗方案能引起如同大鼠GLP-2产生的肠营养效应；以及c)与模拟治疗对照组哺乳动物相比较，确定该类似物对小肠重量和/或腺管加绒毛高度和/或胰岛大小的效应，由此，该肠营养性肽即被鉴定为一种类似物，其能引起上述重量和/或高度和/或大小的增加。15.—种治疗病人以修复胃肠組织的方法，该胃肠组织取自胰岛和肠组织，该方法包括以下步骤细胞以含GLP-2肽的培养基进行适应性培养，之后，将细胞植入上述病人体内。16.—种治疗胃肠疾病的方法，其中胃肠疾病选自这样一组疾病，这组疾病是溃疡病、消化紊乱、吸收不良综合征、短肠综合征、盲管综合征、炎症性肠病、非热带性口炎性腹渴、热带口炎性腹泻、低丙种球蛋白血症性口炎性腹泻、肠炎、局限性肠炎(Crohn's病)、毒物或其它化疗制剂所致的小肠损伤以及肠短综合征，而且其中该方法包括给患胃肠疾病的病人施以治疗有效剂量的GLP-2或GLP-2类似物，以减轻胃肠疾病的病理影响或症状，GLP-2或GLP-2类似物与符合药用要求的栽体在一起用药。17.—种治疗糖尿病的方法，包括给患糖尿病的病人施以治疗有效剂量的GLP-2或GLP-2类似物，以增加病人的胰岛素水平，GLP-2或GLP-2类似物与符合药用要求的载体在一起用药。全文摘要本发明涉及胰高血糖素样肽-2及其治疗应用。具体地，胰高血糖素基因表达的一种产物胰高血糖素样肽-2和胰高血糖素样肽-2的类似物已被鉴定为胃肠组织生长因子。本文介绍了它们对小肠和胰岛生长的作用。本文也介绍了它们的药用制剂及它们在治疗肠紊乱方面的治疗应用。文档编号A61P1/18GK101254300SQ200810001290公开日2008年9月3日申请日期1996年4月12日优先权日1995年4月14日发明者D·J·德鲁克尔申请人:1149336安大略公司