专利名称：：具有抗肿瘤活性的香菇发酵粗蛋白、提取方法及其制剂的制作方法
技术领域：
：本发明属于抗肿瘤药物领域，涉及来源于高级真菌经发酵后提取的蛋白产物。
背景技术：
：真菌作为药物来源已有多年历史，以真菌为材料所生产的药齐U在我国很早就应用于临床。香菇是世界名贵的食用兼药用真菌之一,具有很高的营养及药用价值。香菇化学成分复杂、药理活性强、临床应用范围广，其抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能引起国内外学者广泛关注(景军，等.中国食品卫生杂志.2001:13(2):46-47;ChiharaG，etal.CancerRes.1970:30:2776)。现代医学研究认为，多糖类作为生物应答调节剂(BRM)在香燕的抗肿瘤活性中起主要作用，香恭多糖的分离纯化,结构及药理作用都得到了深入的研究，并用于临床肿瘤的治疗，其疗效得到广泛的肯定。香菇多糖是通过刺激免疫细胞成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡从而使免疫状态由低下恢复到接近于正常能力，使肿瘤受抑制来实现其抗肿瘤的功能，但其无直接的抗肿瘤作用[RuanZheng,etal.InternationalI咖unopharaacology5(2005)811_820]。除多糖外，香菇中含有大量蛋白质、氨基酸和多种微量元素。对香菇中其他生物学活性物质的研究水平去发掘其抗肿瘤活性的本质却鲜有报道。黄敏等在研究香菇C91一3菌株发酵液的抗肿瘤活性中，首次发现并证实了香菇的菌丝体发酵液具有体内抑制肿瘤生长作用，同时还具有显著的体外直接杀伤肿瘤细胞的作用，提示除了香菇多糖外还有其他重要的直接抗肿瘤活性物质，国内外还未见报道(黄敏，等.中国微生态学杂志.1996年8(3):38-40)。香菇菌株发酵后的抗肿瘤的成分尤其是蛋白亦未见报道，黄敏等在继续研究中又发现并证实了香菇的菌丝体发酵液提取的蛋白具有体内抑制肿瘤生长作用还具有显著的体外直接杀伤肿瘤细胞的作用(戴兵，黄敏等.浙江医学,2004年26(9):656-658)。
发明内容本发明的目的是提供一种新的具有抗肿瘤活性的香菇发酵粗蛋白、提取方法及其在抗肿瘤中的应用的制剂。本发明公开的具抗肿瘤活性的香菇发酵粗蛋白是以香菇C91-3菌株为发酵原料，采用深层发酵的技术，过滤后再经盐析、透析等一系列技术加工而成。本发明的香菇发酵提取蛋白的制备方法包括以下述步骤l.香菇发酵液的制备(1)香菇发酵液培养基的制备由如下重量份原料构成的培养基<table><row><column>葡萄糖</column><column>0.515</column><column>新鲜啤酒酵母</column><column>116</column></row><row><column></column><column>蔗糖</column><column>0.515</column><column>全脂奶粉</column><column>0.510</column></row><row><column></column><column>蛋白胨</column><column>0.510</column><column>磷酸二氢钾</column><column>0.15</column></row><row><column></column><column>维生素B1</column><column>0.001－1</column><column>维生素B2</column><column>0.001－1</column></row><table>将上述物品加到1000重量份蒸馏水中，混合后放入2060°C水浴中，使其完全溶解，调节pH5.08.0，分装至300ml三角烧瓶中，每瓶250ml，用4层纱布外盖一层牛皮纸封口，消毒灭菌1520分钟，冷却后备用。(2)取710天生长良好的香菇C91-3的菌丝体，接种到上述的培养基中，每瓶接种菌丝体0.515g。(3)置室温摇床上培养，前两天50100转/分，第三天开始逐渐加转速至100150转/分。每天观察生长情况，无菌取少量培养物观察孢子数，如果孢子数达到1051010/ml时停止培养，即可收集发酵液备用。(4)将发酵液在08°C、3，000g/min离心10min，收集上清液，然后以单层滤纸过滤上清液(08°C)除去其中悬浮的杂质，并将所得的上清液放入08'C的环境中保存。该上清液为不透明的淡褐色或土黄色的液体，pH5.08.0，其中主要含有18种氨基酸和人体所必需的8种氨基酸，其中天门冬氨酸ASP>40mg/ml，苏氨酸THR>20mg/ml，丝氨酸SER>20mg/ml，谷氨酸GLU>100mg/ml，甘氨酸GLY>50mg/ml，丙氨酸ALA>30mg/ml，胱氨酸CYS>lmg/ml，缬氨酸VAL>30mg/ml，蛋氨酸MET>5mg/ml，异亮氨酸ILE>20mg/ml，亮氨酸LEU>40mg/ml，酪氨酸TYR>40mg/ml,苯丙氨酸PHE>20mg/ml，赖氨酸LYS>30mg/ml，氨NH3〉3mg/ml，组氨酸HIS>9mg/ml，精氨酸ARG>20mg/ml，脯氨酸PRO>40mg/mI，色氨酸TRP>lmg/ml;多糖>50mg/ml2.香菇发酵粗蛋白的制备(1)在08℃缓慢盐析发酵液，同时以磁力搅拌器搅拌，直到过饱和时停止。静置20min后，低温离心机(2，0006，000g/min，08℃)离心30min。弃去上清液，收集沉淀。(2)将上述所得的沉淀置于透析袋中，以去离子水作为透析缓冲液，08℃下透析。每30min更换一次缓冲液，直至除去全部的盐。(3)将脱盐后的蛋白质溶液于-20℃冰箱保存(4)将脱盐后的蛋白质溶液经过真空冷冻干燥机浓縮冻干得香菇C91-3发酵液的固体冻干原粉，并于一208℃冰箱保存。此冻干原粉为淡褐色或土黄色的粉末，可溶于水，有特定的香味，含有多种蛋白质，分子量为1KD90KD。3.香菇发酵粗蛋白制剂的制备(2)称取冻干原粉与赋形剂按比例制成各种口服剂型如速溶颗粒剂、片剂、胶囊及口服液等。①香菇发酵粗蛋白胶囊的制备取香菇粗蛋白冻干原粉100g，低聚糖或乳糖400600g，硬脂酸钙或硬脂酸镁1030g，经充分混捏、混合均匀后分装口服用胶囊，每胶囊含香菇粗蛋白冻干原粉0.10.5mg.。②香菇发酵粗蛋白速溶颗粒的制备取香菇粗蛋白冻干原粉100g，低聚糖或乳糖100300g，糊精3001000g，混合均匀后造粒、装袋，每袋含香菇粗蛋白冻干原粉0.10.5mg③香菇发酵粗蛋白片剂的制备取香菇粗蛋白冻干原粉100g，淀粉10000g，硬脂酸钙或硬脂酸镁1030g，低聚糖或乳糖400600g,混合均匀后压片，每片含香菇粗蛋白冻干原粉0.10.5mg。④香菇发酵粗蛋白口服液的制备由原料香菇粗蛋白冻干原粉100g，吐温一8025g,甘露醇510g，加无菌水搅拌稀释至香菇粗蛋白含量为0.10.5mg/ml。本发明的实验证明在体外抗肿瘤试验中，香菇C91-3发酵粗蛋白对H22(小鼠腹水型肝癌细胞株)、U14(小鼠腹水型宫颈癌细胞株)及S180(小鼠腹水型肉瘤细胞株)有明显的抑杀作用，其作用强度依赖于其浓度和时间。表明该菌株发酵粗蛋白具有有较强的直接杀伤肿瘤细胞的作用。在体内抗肿瘤试验中，香菇C91-3发酵粗蛋白有治疗肿瘤作用。对H22、U14荷瘤鼠能明显延长荷瘤小鼠的生存期，并对H22实体肿瘤有明显抑制作用。动物毒性实验急性毒性实验和长期毒性实验证明无毒副作用，安全可靠。以下结合实施例对本发明作进一步说明。图1为各组的实体瘤的大小，由上往下是NS、CY、LFP91-3I、LFP91-3II、LFP91-3III图-2为生理盐水组图3为可见染色质边集图-4可见凋亡小体图-5可见细胞坏死具体实施例方式实施例l:香菇发酵粗蛋白的制备l.香菇发酵液的制备(1)香菇发酵液培养基的制备葡萄糖lg新鲜啤酒酵母8g蔗糖6g全脂奶粉lg蛋白胨lg磷酸二氢钾0.3g维生素B1O.Olg维生素B2O.Olg将上述物品加到1000ml蒸馏水中，混合后放入50。C水中水浴，使其完全溶解，调节PH7.5，分装至300ml三角烧瓶中，每瓶250ml，用4层纱布外盖一层牛皮纸封口，消毒灭菌15分钟，冷却后备用。(2)取第7天生长良好的香菇C91-3的菌丝体，接种到上述的培养基中，每瓶接种菌丝体lg。(3)置室温摇床上培养，前两天75转/分，第三天开始逐渐加转速至100转/分。每天观察生长情况,无菌取少量培养物观察孢子数，如果孢子数达到107/ml时停止培养，收集发酵液备用。(4)将发酵液在40℃、3，000g/min离心10min，收集上清液，然后以单层滤纸过滤上清液(4'C)除去其中悬浮的杂质，并将所得的上清液放入4℃的环境中保存。2.香菇发酵粗蛋白的制备(1)在4'C向发酵液中缓慢加入硫酸铵粉末，同时以磁力搅拌器搅拌，直到硫酸铵过饱和时停止加入。静置20min后，低温离心机(5,000g/min，4°C)离心30min。弃去上清液，收集沉淀。(2)将上述所得的沉淀置于透析袋中，以去离子水作为透析缓冲液，4℃下透析除去残留的硫酸铵。纳氏试剂检验是否有NH4+残留，加入纳氏试剂后溶液呈黄色则有NH4+残留，反之无色。每30min更换一次缓冲液，直至除去全部NH4+。(3)将脱盐后的蛋白质(即粗蛋白)溶液于-20'C冰箱保存3.香燕发酵粗蛋白冻干原粉的制备将上清液经过真空冷冻干燥机浓縮、冻干即得香菇C91-3发酵粗蛋白的冻干原粉，并于-20℃冰箱保存。此冻干原粉为土黄色粉末，可溶于水，有特定的香味，含有多种蛋白质，分子量为1KD90KD。实施例2:香菇发酵粗蛋白胶囊的制备取香菇粗蛋白冻干原粉100g，低聚糖或乳糖400g，硬脂酸钙或硬脂酸镁30g，经充分混捏、混合均匀后分装口服用胶囊，每胶囊含香菇粗蛋白冻干原粉0.5mg.。实施例3:..香菇发酵粗蛋白速溶颗粒的制备取香菇粗蛋白冻干原粉100g，低聚糖或乳糖300g，糊精1000g，混合均匀后造粒、装袋，每袋含菇粗蛋白冻干原粉0.5mg实施例4:香燕发酵粗蛋白片剂的制备取香菇粗蛋白冻干原粉100g，淀粉10000g，硬脂酸钙或硬脂酸镁30g，低聚糖或乳糖400g，混合均匀后压片，每片含香菇粗蛋白冻干原粉0.5mg。实施例5:香菇发酵粗蛋白口服液的制备由原料香菇粗蛋白冻干原粉lOOg,吐温一805g,甘露醇10g，加无菌水搅拌稀释至香菇粗蛋白含量为0.5mg/ml。实施例6:香菇发酵粗蛋白对腹水型荷瘤小鼠生存期的影响H22、U14肿瘤细胞分别连续在BALB/C小鼠腹腔传代两代以上，选传代后67天的小鼠，腹腔抽取腹水瘤细胞，Hank's液洗两次，调整细胞数至2.5X107/ml，0.2ml/只于小鼠腹腔接种肿瘤细胞，各造模50只。分别于24小时后随机分成5组NS对照组、CY组、LFP91-3I组、LFP91-3II组、LFP91-3III组。NS对照组每次腹腔注射无菌生理盐水lml/只，每日一次，连续5日；CY组予环磷酰胺0.4mg/只；LFP91-3I组予LFP91-350ug/只；LFP91-3II组予LFP91-3100ug/只；LFP91-3III组予LFP91-3150ug/只，剂量、途径、方法、次数同NS组。分别观察H22、U14荷瘤小鼠各组别的生存期，其结果见表l。表-1香菇发酵粗蛋白对H22、U14腹水型荷瘤小鼠生存期的影响<table>seeoriginaltablepage9</column></row><table>☆与NS组比较P〈0.05★与CY组比较P〈0.05结果表明LFP91-3各组和CY组均能显著延长由H22和U14肿瘤细胞所致腹水型荷瘤小鼠的存活时间，与NS组比较P0.05。实验组对两种肿瘤细胞所致的荷瘤小鼠生存期的影响表现出相似的结果。LFP91-3I组与CY组存活时间比较均无显著差异(P>0.05),LFP91-3II组和LFP91-3III组存活时间均长于CY组(P0.05)，且荷瘤小鼠的存活时间随LFP91-3浓度的增大而延长，均存在一定的剂量依赖关系。实施例7香菇发酵粗蛋白对荷瘤小鼠实体肿瘤生长的影响将H22肿瘤细胞调整细胞数至2.5X107/ml，0.2ml/只右腋皮下注射小鼠50只，24小时后随机分成5组。NS组予无菌生理盐水lml/只；CY组予环磷酰胺0.4mg/只；LFP91-3I组予LFP91-350ug/只；LFP91-3II组予LFP91-3100ug/只；LFP91-3lII组予LFP91-3150ug/只，用药途径为右腋皮下注射，每日一次，连续十日。于接种肿瘤细胞后第13日处死小鼠，解剖剥离瘤体，称瘤重计算抑瘤率，其结果见表-2和图-l。抑瘤率=(l-T/C)X100%T=实验组平均瘤重C-对照组平均瘤重。表-2香菇发酵粗蛋白对荷瘤小鼠实体肿瘤的抑瘤率<table><row><column>组别</column><column>动物数量</column><column>瘤重</column><column>抑瘤率</column></row><row><column></column><column>NS</column><column>10</column><column>2.01±0.27</column><column>/</column></row><row><column></column><column>CY</column><column>10</column><column>1.22土0.28☆★</column><column>39.55</column></row><row><column></column><column>LFP91-3I</column><column>10</column><column>1.00土0.29☆★</column><column>50.37</column></row><row><column></column><column>LFP91-3II</column><column>10</column><column>0.91±0.28☆★</column><column>54.58</column></row><row><column></column><column>LFP91-3III</column><column>10</column><column>0.52士0.28☆★</column><column>74.13</column></row><table>☆与NS组比较P〈0.05★与CY组比较P〈0.05结果表明香菇发酵粗蛋白各组与CY组均能抑制肿瘤生长，其抑瘤率分别为39.55%、50.37%、、54.58%、74.13%，LFP91-3各组与CY组小鼠瘤重均显著低于NS组(P〈0.05);LFP91-3各组与CY组比较(P<0.05)，说明香菇发酵粗蛋白组抑瘤效果强于CY组。随香菇提取蛋白浓度的加大抑瘤作用也更加明显，存在一定的浓度依赖关系。实施例8香菇发酵粗蛋白体外对肿瘤细胞的作用(1)肿瘤细胞的制备体外培养的H22、U14、S180细胞经腹腔分别接种于46周龄的BALB/C小鼠，68天后取腹水中的肿瘤细胞，离心洗涤后用RPMI-1640完全培养基调整细胞数供实验使用。(2)对H22、U14、S180细胞的细胞毒作用(MTT法)选取对数生长期的H22、U14、S180细胞，调整细胞数至lX105/ml，加入96孔培养板中，每孔100ul,加入无菌生理盐水100ul作为对照组；分别加入不同浓度的菇发酵粗蛋白(5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml)100ul作为实验组。每组设3个复孔，置于37°C、5。/。C02孵箱中培养24、48、72小时后，加入MTT(lmg/ml)100ul,再继续培养4小时，离心弃上清，每孔加100ul溶解液，震荡器震荡，至甲臢颗粒完全溶解，用酶标仪测定各孔吸光度值，(检测波长570nm，参考波长630nm)计算抑瘤率，其结果见表-3。抑瘤率=(l-OD实验组/OD对照组)X100%表-3香菇发酵粗蛋白对不同肿瘤细胞在不同时间抑瘤率的比较<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(3)对肿瘤细胞周期的作用选取对数生长期的H22、U14细胞，调整细胞数至5X10S/ml，在培养液中加入无菌生理盐水作为对照组，实验组加入香菇发酵粗蛋白至终浓度为100ug/ml，分别培养24、48、72小时后收集细胞，生理盐水洗涤三次，收集细胞，每份样品细胞数l2Xl(^/ml,4。C、70-75%乙醇固定4小时以上，然后进行PI染色，上流式细胞分析仪进行分析，结果见表-4。表-4香菇发酵粗蛋白作用不同时间对U14、H22凋亡及细胞周期的影响<table>complextableseeorginaldocumentpage9</column></row><table>(4)形态学观察选对数生长期的H22细胞，调整细胞数至5X105/ml。在培养液中加入无菌生理盐水作为对照，实验组加入LFP91-3至终浓度为150ug/ml，培养24、48、72小时后收集细胞，用PBS洗涤一次，2.5%戊二醛固定，按电镜制片的常规方法脱水、包埋、超薄切片、染色，并拍照记录，结果见图-2、图-3、图-4和图-5。结果表明香菇发酵粗蛋白可以抑制H22、U14、S180细胞的生长，其作用强度在一定范围内呈现出浓度和时间的依赖性。H22、U14细胞在香菇发酵粗蛋白作用下随时间的延长，两株细胞G0/G1期比率逐渐下降，S期比率逐渐升高，均形成S期细胞的堆积，且存在时间依赖性。提示香菇发酵粗蛋白作用后凋亡的发生可能与周期阻滞有关，通过细胞周期阻滞诱导肿瘤细胞凋亡可能是香菇发酵粗蛋白抗肿瘤作用的机制之一。电镜下可见NS组的肿瘤细胞体积较大，染色质均匀，有微绒毛。经LFP91-3作用后72h动态观察可见:微绒毛消失，细胞体积变小，染色质浓集并靠近核膜，随着时间的推移，细胞核染色质进一步固縮并可裂解为一个或多个致密小体，与一定的细胞器形成具有完整膜结构的凋亡小体。实施例9:动物毒性实验(1)急性毒性实验取昆明小鼠40只(雌雄各半)，体重2022g，于24小时内灌胃3次，使累计的服用量为上述用药的225倍，连续观察小鼠14天，无死亡现象及不良反应，说明此制剂无毒副作用。(2)长期毒性实验取体重适宜的大鼠40只(雌雄各半)，随机分为两组，一组为香菇发酵粗蛋白实验组，以上述实验剂量的IOO倍连续灌胃60天；另一组为加等量蒸馏水对照组，结果发现，在此期间两组动物均无死亡及不良反应，两组动物食欲、大小便及体重在统计学上均无显著性差异(p>0.05);血液白细胞、红细胞及血小板等血常规指标两组间无显著性差异(p>0.05);两组动物脏器解剖病理观察均无异常病理现象，说明此制剂长期服用安全可靠。权利要求1.具有抗肿瘤活性的香菇发酵粗蛋白，是以香菇C91-3的菌丝体经发酵、盐析、透析、干燥而得；为淡褐色或土黄色的粉末，可溶于水，有特定的香味，水溶液pH5.0～8.0，分子量为1KD～90KD，含有18种氨基酸和多种蛋白质。2、具有抗肿瘤活性的香菇发酵粗蛋白的提取方法，其特征在于工艺步骤为I.香燕发酵液的制备(1)将含有以下重量分的原料葡萄糖0.515、蔗糖0.515、蛋白胨0.510、VB10.0011、新鲜啤酒酵母116、全脂奶粉O.510、磷酸二氢钾0.15、VB20.0011和1000重量份蒸馏水中混合在206(TC水浴中，使其完全溶解，调节pH5.08.0，分装至300ml三角烧瓶中，每瓶250ml，用4层纱布外盖一层牛皮纸封口，消毒灭菌1520min，冷却后备用；(2)取710天生长良好的香菇C91-3的菌丝体，接种到上述的培养基中，每瓶接种菌丝体0.515g;(3)置室温摇床上培养，前两天50100转/分，第三天开始逐渐加转速至100150转/分。每天观察生长情况，无菌取少量培养物观察孢子数，如果孢子数达到105101Q/ml时停止培养，收集发酵液备用；(4)将发酵液在08'C、3，000g/min离心10min，收集上清液，然后在08'C下以单层滤纸过滤上清液除去其中悬浮的杂质，并将所得的上清液为不透明的淡褐色或土黄色，在08'C的下保存；n.香菇发酵粗蛋白的制备(1)在08'C缓慢盐析发酵液，搅拌下直到过饱和时为止，静置20min后，08'C下离心30min，收集沉淀；(2)将沉淀置于透析袋中，以去离子水作为透析缓冲液，08'C下透析，每30min更换一次缓冲液，直至除去全部的盐，于-20'C冰箱保存；(3)将脱盐后的蛋白质溶液经过真空冷冻干燥机浓縮冻干得香菇发酵粗蛋白固体原粉。3、具有抗肿瘤活性的香菇发酵粗蛋白制剂，其特征在于将香菇发酵粗蛋白冻干原粉与赋形剂按比例制成成各种口服剂型。4、根据权利要求3所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵粗蛋白制剂，其特征在于是口服胶囊，由香菇发酵粗蛋白冻干原粉100g，低聚糖或乳糖400600g，硬脂酸钙或硬脂酸镁1030g，经充分混捏、混合均匀后分装口服用胶囊，每胶囊含香菇粗蛋白冻干原粉(U0.5mg.。5、根据权利要求3所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵粗蛋白制剂，其特征在于是速溶颗粒，由香菇发酵粗蛋白冻干原粉100g，低聚糖或乳糖100300g，糊精3001000g，混合均匀后造粒、装袋，每袋含香菇粗蛋白冻干原粉0.10.5mg。6、根据权利要求3所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵粗蛋白制剂，其特征在于是片剂，，由香菇发酵粗蛋白冻干原粉100g，淀粉10000g，硬脂酸钙或硬脂酸镁1030g，低聚糖或乳糖400600g，混合均匀后压片，每片含香菇粗蛋白冻干原粉0.10.5mg。7、根据权利要求3所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵粗蛋白制剂，其特征在于是口服液，由香菇发酵粗蛋白冻干原粉100g，吐温一8025g，甘露醇510g，加无菌水搅拌稀释至香菇粗蛋白含量为0.10.5mg/ml。全文摘要具有抗肿瘤活性的香菇发酵粗蛋白、提取方法及其制剂。是以香菇C91-3的菌丝体经发酵、盐析、透析、干燥而得；为淡褐色或土黄色粉末，溶于水，有特定香味，水溶液pH5.0～8.0，分子量为1KD～90KD，含有18种氨基酸和多种蛋白质。实验证明体外抗肿瘤试验中，对H22、U14及S180有明显的抑杀作用，其作用强度依赖于其浓度和时间。表明该菌株发酵粗蛋白具有较强的直接杀伤肿瘤细胞的作用。在体内抗肿瘤试验中，香菇C91-3发酵粗蛋白有治疗肿瘤作用。对H22、U14荷瘤鼠能明显延长荷瘤小鼠的生存期，并对H22实体肿瘤有明显抑制作用。动物急性毒性实验和长期毒性实验证明无毒副作用，安全可靠。文档编号A61P35/00GK101343652SQ200810013120公开日2009年1月14日申请日期2008年9月8日优先权日2008年9月8日发明者宁安红,李星云,王晓丽,越赵,钟民涛,敏黄申请人:大连医科大学