专利名称：：注射用重组人血管内皮抑制素多孔缓释微球及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种注射用重组人血管内皮抑制素多孔缓释微球及其制备方法，具体涉及一种以可生物降解乳酸-羟基乙酸聚合物为基质，包括重组人血管内皮抑制素和致孔剂的注射用多孔缓释微球及其制备方法。
背景技术：
：美国哈佛医学院的Folkman教授在20世纪60年代提出"肿瘤生长依赖血管生长"学说，即实体瘤在生长和转移过程中，血管的生成起到了至关重要的作用，此时肿瘤细胞会发出一些促进血管向肿瘤组织增生的细胞因子(aFGF，bFGF，VEGF等)。另有研究发现，一些内源性血管生成抑制因子如Angiostatin、Endostatin能够阻碍血管在肿瘤组织中的生长，使肿瘤的生长和转移处于停滞(O'Relly，M.S.,Wa/.Ce//.79:315-328,1994;O，Relly，M.S.,Wa/.Ce〃.88:277-285,1997);组织中血管生成表型的开放与关闭将取决于组织局部区域血管生成刺激因子和抑制因子之间的动态平衡(Folkman,J.TVa,.M￡D.1:27-31,1995;Hanahan,D.,eM/.Ce〃.86:353-364,1996)。Folkman教授在上世纪七十年代提出了用血管内皮抑素(Endostatin)来抑制肿瘤生长的"饿死肿瘤疗法"理论。但由于Endostatin在表达制备过程中存在着易于沉淀和复性困难等问题，限制了其在肿瘤患者中的大规模应用。罗永章教授等人通过修饰人血管内皮抑制素的核苷酸编码序列，生产出N末端带有9个附加氨基酸序列的重组人血管内皮抑制素(取名为Endostar,中文名恩度⑧)(ZL00107569.1)，其氨基酸序列为(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLODLYSIVRRADRAAW画LKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK,其中当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除。重组的人血管内皮抑制素Endostar保持内源性Endostatin的所有生物活性，同时解决了Endostatin在生产过程中的难题，表达水平更高，疗效更强，并且没有因为附加N端序列而导致体内免疫原性，其注射液已经获得国家药品食品监督管理局的批准上市销售，临床上联合NP化疗方案用于非小细胞肺癌患者。但是作为外源性蛋白，重组的人血管内皮抑制素在体内很容易被免疫系统识别，进而被降解，因此体内半衰期很短，患者需要频繁注射，临床顺应性很差。同时近期有研究发现动物体内小剂量持续给予Endostatin的药效要优于间歇性给药(MinoruKuroiwa，"a/.■//W她38:1499-1505,2003;OliverKisker，Oj"cwM61:7669-7674,2001)。以乳酸-羟基乙酸聚合物为基质的生物可降解微球在上世纪八十年代已经被利用于多肽药物的注射用缓释制剂，例如Takeda公司的LupronDepot,Debiopharm公司的TrelstarDepot和Novartis公司的SandostatinDepot等。多肽药物在肌肉或皮下随着聚合物材料不断的生物降解缓慢释放到体内，在较长时间里维持体内有效的血药浓度，释放周期从一周到6个月不等，效果显著，对于需要长期或终身给药的疾病，病人的顺应性大大提高。随着分子生物学的发展，越来越多的大分子蛋白质药物也需要借助这一缓释平台来克服药物本身的缺陷。可降解缓释微球制剂一般由药物和可降解聚合物基质组成，釆用溶剂挥发法或者液中干燥法制备，微球表面光滑或者有少量溶剂挥发留下的极微小的气孔。由于Endostar分子量大(21kD)，微球制备过程中又可能形成多聚体；在体内注射后，微球内部的药物很难在突释以后维持释放，由于微球表面降解的速度低于内部材料降解的速度，只有在释放后期材料发生严重降解和崩散的情况下才能最终释放完全，这对于保持体内恒定的血药浓度非常不利。
发明内容本发明的目的是为了解决上述常规可降解缓释微球及制备方法中存在的问题，提供一种表面布满均匀小孔的生物可降解微球及其制备方法，所得到的重组的人血管内皮抑制素多孔微球包封产率高，突释小，在释放初期Endostar可以通过孔洞均匀地释放；释放后期，多孔的结构还能促进释放介质向微球内部的流动，加速微球的降解和溶蚀，使蛋白质释放完全。本发明中的重组的人血管内皮抑制素多孔缓释微球制剂可以用于可皮下注射、肌肉注射或瘤内注射。该制剂适合在制备用于持续释放重组人血管内皮抑制素的可注射药物中的用途。本发明包括一种注射用重组人血管内皮抑制素多孔缓释微球，其特征在于包括重组人血管内皮抑制素、可生物降解辅料乳酸-羟基乙酸聚合物和致孔剂。其中中各组分重量百分比重组人血管内皮抑制素占1。/。wt至30。/()Wt、致孔剂占1。/。wt至20。/。Wt、乳酸-羟基乙酸聚合物占50%wt至98%wt，缓释微球体积平均粒径在O.lpm至30(Him之间，优选10pm至200nm之间。表面小孔均匀分布，孔径大小在O.Olnm至4pm之间。本发明中所述乳酸-羟基乙酸聚合物由羟基乙酸和乳酸通过聚合作用形成；聚合物可以是乳酸和羟基乙酸酸的共聚或均聚物，也可以指单一的聚乳酸；聚合作用可以是无规、嵌段或接枝型；聚合物的末端可以是酯基或羧基，它们可以具有D-，L-或者DL的光学构型。本发明中作为多孔缓释微球基质的乳酸-羟基乙酸聚合物可以是一种或多种分子量及单体比值不同的乳酸-羟基乙酸聚合物的混合物。当所用聚合物是乳酸-羟基乙酸的共聚物或均聚物时，乳酸/羟基乙酸的摩尔比为40:60至100:0，优选50:50至85:15;聚合物重均分子量大小为5000至150000道尔顿，优选为5000至100000道尔顿。聚合物重均分子量应该根据凝胶透析色谱法测得(GPC)。分子量的大小决定了聚合物在体内的降解速度，进而决定了药物的释放周期，释放周期可选择一周至六个月，优选一周至三个月。本发明中所述致孔剂可以在微球形成中分散或迁移至外相中产生均匀的孔洞，包括糖及多元醇类(如甘露醇、海藻糖、壳聚糖、蔗糖、葡萄糖等)，无机盐类(如氯化钠、氯化钾、醋酸钠、磷酸钠等)，氨基酸类(如L-精氨酸、L-赖氨酸等含有碱基的氨基酸及其盐)，高分子聚合物类(如泊洛沙姆188、聚乙二醇PEG、聚乙烯吡咯烷酮PVP等)，脂肪酸甘油酯类(如豆油、玉米油、中链甘油三酯MCT)中的一种或几种。其中所述聚乙二醇分子量范围在1000至8000道尔顿；聚乙烯吡咯烷酮分子量范围在2000至20000道尔顿。其中所述中链甘油三酯MCT是由含量高于95。/。的辛酸(C8H^02)和癸酸(doH2()02)两种饱和脂肪酸的甘油三酯组成的混合物，包括由以下列通式描述的C8和C10饱和脂肪酸甘油三酯的六种化合物(1、2、3、4、5、6)。其中C8和C10可以是直链或支链的烷基。MCT可以使用的商业产品有ABITEC公司的Captex355、Gattefosse公司的LABRAFCCC、Lipoid公司的LIPOIDMCT。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明中所述重组人血管内皮抑制素为重组人血管内皮抑制素Endostar。本发明所述的重组人血管内皮抑制素多孔缓释微球制剂的制备方法，它包括(1)制备含有致孔剂的油包水的乳剂，其中内水相为含有重组人血管内皮抑制素的缓冲液，油相为含有乳酸-羟基乙酸聚合物的有机溶剂；致孔剂可以分散在内水相或油相中；(2)将两相混合分散成乳后加入到含有亲水性乳化剂的外水相中搅拌，使油包水乳剂中的有机溶剂挥发，聚合物发生相分离形成微球；挥发过程控制的温度范围在0至40摄氏度；压力控制在0.01至101kpa;(3)将所得微球洗涤干燥，得缓释微球制剂成品。在步骤(2)中，为了控制微球的粒径，可以采用4000转/分钟至20000转/分钟的高速机械分散(如均质机、胶体磨、螺旋桨搅拌器)，或者采用50W至200W功率的探针超声，分散或超声的时间控制在10秒至10分钟。由于重组人血管内皮抑制素只在一定pH值下稳定，上述的制备方法中重组人血管内皮抑制素溶解在缓冲液中，其中缓冲液可以是醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液中的一种。缓冲液的pH值在2至9之间；优选在3至8之间。重组人血管内皮抑制素在缓冲液中的浓度为1至500mg/ml，优选10至300mg/ml。。本发明制备方法中有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇中的一种或两种混合。混合体积比例为0.1:9.9至9.9:0.1;两种溶剂混合的组成可以是二氯甲烷+乙酸乙酯、二氯甲烷+乙腈、二氯甲垸+甲醇、乙酸乙酯+乙腈、乙酸乙酯+甲醇；乳酸-羟基乙酸聚合物在有机溶剂中的浓度为1至500mg/ml。在溶剂挥发，微球形成的过程中，水包油包水的三相系统需要保持相对稳定的状态。首先，为了最终能形成复乳，三相之间必须保持一定的比例，本发明制备方法中所述油包水的乳剂中油相与内水相的体积比为99:1至51:49;优选95:5至60:40。油包水的乳剂与外水相的体积比为0.1:99.9至30:70。优选0.1:99.9至20:80。其次，为了使乳剂的表面能降低，外水相中应该添加一定的亲水性乳化剂；本发明制备方法中所述亲水性乳化剂为聚乙烯醇、tween20、tween60、tween80中的一种或多种，其中聚乙烯醇聚合度范围在100至3000道尔顿，醇解度范围在85至89%。亲水性乳化剂所占外水相的重量百分数范围在0.01。/。wt至5。/。wt,优选0.05%wt至3°/。wt。第三，在溶剂挥发过程中，可以采用通常所用的任何常规方法分散多相系统，所述方法包括使用叶片式机械搅拌器、磁力搅拌器或者旋转蒸发器，在常压或者减压的条件下蒸发溶剂，压力控制在O.Ol-lOlkpa。挥发过程中控制温度范围在0至40摄氏度，可以全过程恒温，也可以采用程序升温的方式，以縮短溶剂挥发的时间。搅拌时间控制在2至24小时。本发明中的微球收集后，需要进行必要的干燥处理，除去水或其它挥发性物质如二氯甲烷。干燥步骤可以采用冷冻干燥处理或真空干燥处理，干燥阶段的持续时间可以为例如2小时至5天。本发明的优点有一本发明制备的重组人血管内皮抑制素多孔缓释微球制剂可以在体内长期缓慢释放重组人血管内皮抑制素，大大减少病人给药次数，提高病人的顺应性。通过选择或混合使用不同载体聚合物材料的分子量可以方便调节药物的释放周期。二表面多孔的结构可以使微球中大分子蛋白质均匀的释放出来，避免出现常规缓释微球的三相释放。同时在释放后期，多孔结构有利于释放介质向微球内部渗透，加速微球的溶蚀和降解，使药物释放完全；整个释放过程更加接近于恒速。在临床应用时，有利于减小药物在体内不规则释放造成的血药波动，在释放周期内获得更加稳定的治疗效果。三制孔剂中使用的多元醇可以有效防止蛋白的聚集，减少无活性大体积的多聚体的产生；也有利于蛋白质的释放。图1多孔微球与无孔微球的SEM扫描电镜照片对比图2多孔微球和无孔微球的体外释放行为曲线。图3含有不同致孔剂的多孔微球表面的SEM扫描电镜照片。图4实施例三中多孔微球在释放过程中的SEM扫描电镜照片。图5实施例四中多孔微球的体外释放行为曲线。说具体实施例方式本发明通过以下实施例作更详细的描述，但不能将其解释为限制本发明的保护范围。实施例一处方一_乳酸-羟基乙酸聚合物PLGA70g80g(Mw=20000，乳酸:羟基乙酸=50:50末端羧基)Endostar20g20gPEG400010g0g处方一和处方二采用相同的工艺精密称取Endostar溶于80mlpH8.0的磷酸盐缓冲液中形成水相。将PLGA和PEG4000溶于240ml二氯甲烷中形成有机相。将上述两相混合，均质机10000rpm高速分散5分钟，形成油包水的乳剂；然后将此初乳倾倒至3.2L含有3X聚乙烯醇1788(聚合度约为1700，醇解度88%)的外水相中，20摄氏度下，机械搅拌常压挥发溶剂2小时，使用0.8pm的微孔滤膜过滤得到微球，并用纯水洗涤三次，冷冻干燥24小时得到微球成品。分别精密称取两批微球成品20mg，用lml二氯甲烷溶解，再加入10mlPH:7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)萃取药物，将萃取后的PBS溶液用BCA的方法(试剂盒来自于ThermoScientific,名为BCATMProteinAssayKit)测定其中的蛋白浓度，计算载药量和包封产率。其中处方一的载药量为18.25%、包封产率为91.25%，处方二的载药量为18.69%、包封产率为93.45%。从结果可以看出，致孔剂对微球的包封率没有影响。其中载药量=载药微球中蛋白重+载药微球总重、包封产率=微球中实际蛋白含量+按照理论投料量计算的蛋白含量。将所得微球粘附在铜质小台上，用金/钯包裹，在扫描电镜(scanningelectronicmicroscopySEM)中观察形态，可见多孔微球的表面布满了均匀的小孔，而无孔微球表面光滑。两者在形态上有显著差异。(图l)精密称取各批微球成品50mg，平行3份，置于含有10ml磷酸盐缓冲液(0.1MpH7.0)的试管中，放入37度恒温水浴中振摇。分别在每个时间点取试管中上清液lml，同时补充相同体积新鲜的磷酸盐缓冲液。样品中Endostar的含量用BCA法测定。用药物的累计释放百分率与释药时间作图(图2)。从图中可以看出在35天的释放周期里，多孔微球的释放明显较无孔微球均匀(线性相关系数R^0.844vs0.464)，后期释放缓慢的现象得到改善，这与微球表面的多孔结构有关。在释放后期(35天)，多孔微球也较无孔微球累计释放完全(90.33%vs73.07%)。实施例二处方三四五乳酸-羟基乙酸聚合物PLGA7i^^^(Mw=50000，乳酸:羟基乙酸=65:35末端羧基)Endostar2g2g2g致孔剂__20g20g致孔剂种类泊洛沙姆188甘露醇氯化钠精密称取Endostar和不同致孔剂溶于100mlpH3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中得到水相。将PLGA溶于158ml二氯甲垸中形成有机相。将两相混合，200W探针超声10秒，形成油包水乳剂，然后将此初乳倾倒至1.032L含有0.1%tween80的外水相中，0摄氏度下，机械搅拌常压挥发溶剂24小时，使用0.8pm的微孔滤膜过滤得到微球，并用纯水洗涤三次，真空干燥5天，得到微球成品。精密称取微球成品20mg，按实施例一中方法测定微球中蛋白含量，计算载药量和包封产率，其中处方三的载药量为1.80%、包封产率为90.00%;处方四的载药量为1.75%、包封产率为87.50%;处方五的载药量为1.63%、包封产率为81.50%。将上述三个处方所得微球粘附在铜质小台上，用金/钯包裹，在扫描电镜(scanningelectronicmicroscopySEM)中观察形态微球表面的孔径分布，可见三个处方微球表面均有小孔分布；不同类型的制孔剂形成的孔洞形状和大小不一样，孔径大小处方三<处方四<处方五(图3)，目测孔径分布在0.1至4pm范围内；随着孔径的增加，蛋白的包封率略有下降。实施例三处方_^_乳酸-羟基乙酸聚合物PLGA(Mw=7000，乳酸:羟基乙酸=50:50末端羧基)Endostar10gLIPOIDMCT_0.34g精密称取Endostar溶于100mlpH5.0的tris缓冲液中得到水相。将MCT和PLGA溶于1.9L混合溶剂中(体积比二氯甲垸:乙酸乙酯=1:1)中形成有机相。将上述两相混合，均质机4000rpm高速分散10分钟，形成油包水型乳剂，然后将此初乳倾倒至20L含有1XPVA0486(聚合度约为400，醇解度86%)的外水相中，从O'C开始按照rc/min的速度升温，最后保持在3(TC下，机械搅拌挥发溶剂6小时，全过程控制压力在20kpa。使用0.8pm的微孔滤膜过滤得到微球，并用纯水洗涤三次，真空干燥2小时得到微球成口精密称取微球成品20mg，按实施例一中方法测定微球中蛋白含量，计算载药量和包封产率，其中处方六的载药量为26.21%、包封产率为87.36%;使用马尔文的Mastersizer2000激光粒度仪测得微球体积平均粒径为25.827pm。精密称取微球成品50mg，共2份，置于含有10ml磷酸盐缓冲液(0.1MpH7.0)的试管中，放入37度恒温水浴中振摇。分别在7天和14天将样品取出，纯水洗涤三遍，真空干燥24小时。将所得微球与释放前的微球样品分别粘附在铜质小台上，用金/钯包裹，在扫描电镜(scanningelectronicmicroscopySEM)中观察释放过程中微球的形态(图4);从图中可见多孔微球的基质在释放过程中发生了由内向外的降解和溶蚀。在14天时，微球的溶蚀己经非常严重，微球表面形成了大块的空洞，有利于释放后期蛋白质的溶出(14天累积释放蛋白95.40%)。这是由于，1采用了低分子量PLGA，羟基乙酸的比例也有所增加，材料的降解速度较快。2多孔的结构增加了释放介质向微球内部的渗透，加速了微球内部的降解和溶蚀。实施例四_^_乳酸-羟基乙酸聚合物PLGA(Mw=100000，乳酸:羟基乙酸=75:25末端酯基)EndostarL-酪氨酸七3glglg10分别精密称取Endostar、海藻糖、L-酪氨酸溶于60mlpH5.0的醋酸钠缓冲液中得到水相。将PLGA溶于140ml的混合溶剂中(体积比二氯甲烷:乙腈=9:1)形成有机相。将上述两相混合，在密闭的条件下使用胶体磨循环均质2分钟，形成0/W型初乳，然后将此初乳倾倒至19.8L含有0.5%PVA0486(聚合度约为400，醇解度86%)的外水相中，20摄氏度下，机械搅拌常压挥发溶剂8小时，使用0.8pm的微孔滤膜过滤得到微球，并用纯水洗涤三次，冷冻干燥48小时得到微球成品。精密称取微球成品20mg，按实施例一中方法测定微球中蛋白含量，计算载药量和包封产率，其中处方七的载药量为24.03%、包封产率为80.10%。精密称取微球成品50mg，平行3份，置于含有10ml磷酸盐缓冲液(0.1MpH7.0)的试管中，放入37度恒温水浴中振摇。分别在每个时间点取试管中上清液同时补充相同体积新鲜的磷酸盐缓冲液。样品中Endostar的含量用BCA法测定。用药物的累计释放百分率与释药时间作图(图5)。从图中可以看出处方七在三个月的释放周期里，释放均匀(112=0.9401)，90天累积释放81.49%。权利要求1、一种注射用重组人血管内皮抑制素多孔缓释微球，其特征在于包括重组人血管内皮抑制素、可生物降解辅料乳酸-羟基乙酸聚合物和致孔剂。2、根据权利要求1所述的微球，其特征在于所述微球中各组分重量百分比重组人血管内皮抑制素占l%wt至30。/。wt、致孔剂占l%wt至20。/。wt、乳酸-羟基乙酸聚合物占50%wt至98%wt，缓释微球体积平均粒径在O.lnm至30(Him之间，表面小孔的孔径大小在O.Olpm至4pm之间。3、根据权利要求1所述的微球，其特征在于所述乳酸-羟基乙酸聚合物的乳酸/羟基乙酸的摩尔比为40:60至100:0，聚合物重均分子量大小为5000至150000道尔顿。4、根据权利要求1所述的微球，其特征在于所述致孔剂包括糖和多元醇类、无机盐类、高分子聚合物类、脂肪酸甘油酯类的一种或几种。5、根据权利要求1至4中任一项所述的微球，其特征在于所述重组人血管内皮抑制素为重组人血管内皮抑制素Endostar。6、权利要求l所述的注射用重组人血管内皮抑制素多孔缓释微球制剂的制备方法，它包括(1)制备含有致孔剂的油包水的乳剂，其中内水相为含有重组人血管内皮抑制素的缓冲液，油相为含有乳酸-羟基乙酸聚合物的有机溶剂；致孔剂可以分散在内水相或油相中；(2)将两相混合分散成乳后加入到含有亲水性乳化剂的外水相中搅拌，使油包水乳剂中的有机溶剂挥发，聚合物发生相分离形成微球；挥发过程控制的温度范围在0至40摄氏度；压力控制在0.01至101kpa;(3)将所得微球洗涤干燥，得缓释微球制剂成品。7、根据权利要求6所述的制备方法，其中步骤(1)所述的缓冲液可以是醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或者甘氨酸-盐酸缓冲液中的一种；缓冲液的pH值在2至9之间；重组人血管内皮抑制素在缓冲液中的浓度为1mg/ml至500mg/ml。8、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈或甲醇中的一种或两种混合；混合有机溶剂体积比例为0.1:9.9至9.9:0.1;乳酸-羟基乙酸聚合物在有机溶剂中的浓度为1mg/ml至500mg/ml。9、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述油包水的乳剂中油相与内水相的体积比为99:1至51:49;油包水的乳剂与外水相的体积比为0.1:99.9至30:70。10、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述亲水性乳化剂为聚乙烯醇、tween20、tween60、tween80中的一种或多种，亲水性乳化剂所占外水相的重量百分数范围在0.0"/owt至5%wt。11、根据权利要求10所述的制备方法，其中聚乙烯醇聚合度范围在100至3000道尔顿，醇解度范围在85至89%。全文摘要本发明涉及一种注射用重组人血管内皮抑制素多孔缓释微球及其制备方法，具体涉及一种以可生物降解乳酸-羟基乙酸聚合物为基质，包括重组人血管内皮抑制素和致孔剂的注射用多孔缓释微球及其制备方法。文档编号A61P35/00GK101536984SQ20081001987公开日2009年9月23日申请日期2008年3月20日优先权日2008年3月20日发明者孟博宇,玲李,许向阳申请人:江苏先声药物研究有限公司