专利名称：一种阿霉素-二肽复合物的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物与医药技术领域，具体涉及一种具有抗癌活性的 阿霉素-二肽复合物的制备方法和应用。
背景技术：
由于其广泛的抗肿瘤作用，阿霉素作为治疗癌症的一线药物常用 于肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和多种血癌等的临床治疗中。 然而，阿霉素的骨髓抑制和心脏毒性等不良反应往往破坏病人的免疫 功能，严重影响了治疗效果。因此，寻找一种降低阿霉素毒性、提高 阿霉素对肿瘤组织的选择性的修饰方法成为目前研究的重点之一。前体药物技术的一个核心是许多抗肿瘤小分子化学药物的结构 中含有可发生酰化反应的游离氨基，并且这些游离氨基往往影响着药 物的化学和生物学特性， 一旦被其他化学基团修饰或封闭，将导致药 物的细胞毒性显著降低，而去除修饰基团其细胞毒性则即可恢复。这些药物包括阿霉素(doxorubicin, Dox)、道诺霉素(daunomycin， DM)等等。Bairrain等制备了多个道诺霉素的多肽衍生物，结果发现， Ala-Leu-DM与Leu-Leu-DM的细胞毒性分别下降至母体药物DM的 1/100和1/250。而一旦水解去除多肽，DM的细胞毒性即可恢复 [Baurain R， et al. J Med Chem. 23 (11) :1171—4. 1980]。 Trouet 报道，阿霉素的四肽衍生物N-alanyl-leucyl-alanyl-leucyl-Dox对 正常小鼠及荷瘤小鼠的毒性仅为阿霉素的1/9[Trouet A， etal. Cancer Res. 61 (7) :2843-6. 2001.]分子靶向药物依据肿瘤细胞与正常细胞之间分子生物学上的差 异，选择性作用于靶细胞的基因、酶、信号传导分子等，从而达到治 疗的目的。虽然分子靶向药物治疗是一种理想的治疗方式，但单药使 用效果并不佳，尚存在许多问题。其中由于肿瘤细胞基因的不稳定性， 肿瘤细胞往往通过靶分子的调变或缺失逃避药物的攻击，致使分子靶 向药物失去疗效就是一个亟待解决的课题。近年来，研究者开始将目 光转向基因组稳定的肿瘤间质细胞。在肿瘤间质中，成纤维细胞通过 与肿瘤细胞相互作用而活化，这种活化成纤维细胞被称为肿瘤相关成 纤维细胞(Carcinoma-Associated Fibroblasts, CAF) [BhowmickNA， et al. Nature. 432(7015) :332-7. 2004.]。大量证据表明，CAF对 肿瘤的发生发展起着必要的支持促进作用，比如表达细胞因子、蛋白 酶及粘附分子等促进肿瘤浸润与转移[Tuxhorn JA， et al. Clin Cancer Res. 8(9) :2912-23. 2002.]。
鉴于CAF对于肿瘤发生发展 的重要性，选择这群细胞为靶标，切断其对肿瘤细胞的支持促进作 用，不失为提高肿瘤靶向治疗有效性的必要措施。现已发现，肿瘤相 关成纤维细胞含有多种水解第二位由脯氨酸残基形成的肽键的蛋白 酶，比如成纤维激活蛋白。这类蛋白酶通常存在于肿瘤组织，伤口愈 合组织，胚胎成纤维细胞[Niedermeyer J， et al. Int J CANCER. 71:383-389. 1997]，使肿瘤间质细胞具有与周围正常组织不同的特 性。但现有技术中，阿霉素-二肽复合物的制备方法一般耗时较长，反应速率较低，产物的产率和纯度也比较低。 发明内容本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种阿霉素-二肽复 合物的制备方法，弓i入可被肿瘤间质细胞表达的蛋白水解酶选择性水 解的二肽来修饰阿霉素。本发明的技术方案是提供一种阿霉素-二肽复合物的制备方法，包括以下步骤(1) 称取N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸(二肽)溶于N， N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入氯甲酸乙酯，室温下搅拌，加入三乙胺，室温搅 拌，得到活化的二肽的溶液；(2) 盐酸阿霉素溶于含有与之等物质的量的Et3N的DMF，加入 活化的二肽溶液，室温搅拌，乙醚萃取反应产物，萃取液经旋转蒸发 制得阿霉素-二肽复合物；(3) 采用柱层析法对阿霉素-二肽复合物进行纯化。步骤(1)所述氯甲酸乙酯与N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸摩尔比为 1:1.2。步骤(l)所述所述加入氯甲酸乙酯后室温下搅拌时间为10分钟； 所述加入三乙胺后室温搅拌时间为40分钟。步骤(2)所述活化的二肽溶液的加入量为与盐酸阿霉素的DMF 溶液等摩尔比。步骤(2)所述室温搅拌时间为5 6小时。步骤(3)所述柱层析法的色谱条件为常规柱2.5X30 cm;固定 相为柱层析硅胶；流动相为7.5:1和5:1的乙酸乙酯-甲醇。产品通过薄层层析鉴定后，用高效液相色谱法(HPLC)检测纯度。本发明通过肽修饰技术，将含有脯氨酸残基的二肽或多肽通过酰 化反应连接到阿霉素的氨基上，可以使阿霉素的毒性降低，同时这种 前体药物在肿瘤间质细胞的作用下能释放阿霉素，使阿霉素能富集到 肿瘤组织周围，提高阿霉素对肿瘤组织的选择性。本发明的有益效果是(1) 本发明提供的制备方法制备出的阿霉素-二肽复合物具有两 方面的特点 一方面由于阿霉素氨基的封闭，阿霉素-二肽复合物比 其母药阿霉素的毒性降低；另一方面，阿霉素-二肽复合物在肿瘤间质细胞的蛋白水解酶的作用下释放出阿霉素，从而达到阿霉素被选择 性释放的富集功能，赋予了阿霉素-二肽复合物对正常组织低毒，对 肿瘤组织具有杀伤性作用的治疗效果。(2) 本发明的方法简单易行，反应速率高，耗时短，产物的纯 度和产率比较高。
图1血桨稳定性实验结果 图2肿瘤生长曲线图3药物毒性实验中实验动物体重变化曲线具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明。实施例1苄氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素的合成(1) N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸的活化称取26. 4 mg (86. 2 u inol)的N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸溶于1. 5 ml的N， N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入9. 8 ul (86.2X1.2 = 103.4 umol)氯甲酸乙酯，室温下搅拌10分钟，加入14.5 ul (103.4 umol) 三乙胺，室温搅拌40分钟。(2) N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素的制备称取40mg (86.2 u mol)盐酸阿霉素溶于1. 5 mL DMF中，向其 中加入12.5 ul (86.2 ymol)三乙胺并混匀。将溶解好的盐酸阿 霉素溶液加入经上述活化的Z-GP溶液，室温搅拌5 6小时；产物用 30 ml的乙醚(5倍于反应液体积)进行萃取，减压抽滤弃去沉淀， 乙醚萃取液经旋转蒸发即得粗品。(3) N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素的纯化 采用柱层析法对粗产品进行纯化。色谱条件常规柱(2.5X30cm)。固定相柱层析硅胶；流动相乙酸乙酯-甲醇(7. 5: 1， 5:1)。 产品通过薄层层析鉴定，质谱确证(ES-MS : [M+K]+= 870)，用高效液 相色谱法(HPLC)检测纯度，纯度达98%。实施例2苄氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素(Z-GP-Dox)体外细胞毒性 实验将K562， MOLT-4细胞接种在96孔板中，密度为10， 000/孔，将 含有0nM - 2nM的游离阿霉素或等摩尔浓度的Z-GP-Dox (溶剂是 DMS0)加到细胞中，或者将K562， MOLT-4细胞培养基替换成与上述游离阿霉素等摩尔浓度的Z-GP-Dox孵育过24小时和48小时的mEF 细胞培养基，分别于24小时和48小时后，通过MTT法检测K562， M0LT-4的细胞存活率。从结果可得，Z-GP-Dox细胞毒性比Dox的IC50 分别减少4 7倍(K562细胞)和9 24倍(M0LT-4细胞)。而Z-GP-Dox 经与mEF细胞孵育后可恢复到与母体药物相似的细胞毒性IC50，见 表l。表1 mEF细胞孵育前后Z-GP-Dox和Dox的细胞毒性比较(IC50)细胞株Dox (IC50)Z-GP-Dox (mEF细胞孵育前IC50)Z"GP-Dox (mEF细胞孵育后IC50)K56224小时0.22394 pM0.960753 pM0.355691 mM48小时0.04469 pM0.305835 mM0.09653 mMMOLT424小时0.04665 nM0.460327 nM0.05098 mM48小时0.01795 |iM0.440791 mM0.03879 nM实施例3苄氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素(Z-GP-Dox)血浆稳定性实 验含有0. 675 u M Z-GP-Dox分别在含有20%肝癌细胞，乳腺癌患者 血清和正常人血浆中6小时，12小时，24小时后，取上清作用于K562 细胞，MTT法检测细胞存活率。结果显示，在24小时后，细胞存活 率仍达70%以上，表明Z-GP-Dox在血清中裂解成细胞毒性母药阿霉 素较少，在肝癌患者，乳腺癌患者和正常人的血清中是稳定的。见附 图1所示。实施例4苄氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素(Z-GP-Dox)体内抗肿瘤活 性实验Balb/C小鼠每只皮下接种106个4T1细胞，肿瘤移植荷瘤小鼠 随机分为生理盐水组，Dox组和Z-GP-Dox组，小鼠分别给与Dox (5mg/kg)和等摩尔的Z-GP-Dox (7. 164 mg/kg)，连续12天观察肿瘤 大小，结果证明二肽修饰后的阿霉素与母药阿霉素相比抗肿瘤活性变 化不大，仍与母药有相似的疗效，见附图2所示肿瘤生长曲线。实施例5苄氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素(Z-GP-Dox)体内毒性实验按实施例4方法，分别在l， 2， 3， 4， 8， 12， 17， 20天测量小 鼠体重。结果发现二肽修饰后的阿霉素的体重变化不大，而阿霉素在 第八天体重开始下降，说明修饰后的阿霉素比母药阿霉素毒性降低。 见附图3所示药物毒性实验中实验动物体中变化曲线。综上所述，本发明所述的制备方法制备出的阿霉素-二肽复合物 母药阿霉素相比，毒性降低；阿霉素-二肽复合物能被与肿瘤间质细 胞具有相似特性的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryo Fibroblast, mEF)所表达的酶催化裂解出具有细胞毒性的阿霉素；阿 霉素-二肽复合物在肝癌患者，乳腺癌患者和正常人血清是稳定的； 通过4T1乳腺癌移植小鼠模型证实用本发明制备方法制备出的阿霉 素-二肽复合物与母药阿霉素相比，毒性降低，抗肿瘤疗效不变。
权利要求
1、一种阿霉素-二肽复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)称取N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸溶于N，N-二甲基甲酰胺，加入氯甲酸乙酯，室温下搅拌，加入三乙胺，室温搅拌，得到活化的二肽的溶液；(2)盐酸阿霉素溶于含有与之等物质的量的Et3N的DMF，加入活化的二肽溶液，室温搅拌，乙醚萃取反应产物，萃取液经旋转蒸发制得阿霉素-二肽复合物；(3)采用柱层析法对阿霉素-二肽复合物进行纯化。
2、 根据权利要求1所述阿霉素-二肽复合物的制备方法，其特征 在于步骤(1)所述氯甲酸乙酯与N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸摩尔比为 1:1.2。
3、 根据权利要求1所述阿霉素-二肽复合物的制备方法，其特征 在于步骤(l)所述所述加入氯甲酸乙酯后室温下搅拌时间为10分钟； 所述加入三乙胺后室温搅拌时间为40分钟。
4、 根据权利要求1所述阿霉素-二肽复合物的制备方法，其特征 在于步骤(2)所述活化的二肽溶液的加入量为与盐酸阿霉素的DMF 溶液等摩尔比。
5、 根据权利要求1所述阿霉素-二肽复合物的制备方法，其特征 在于步骤(2)所述室温搅拌时间为5 6小时。
6、 根据权利要求1所述阿霉素-二肽复合物的制备方法，其特征在于步骤(2)所述乙醚用量为5倍于反应液体积。
7、 根据权利要求1所述阿霉素-二肽复合物的制备方法，其特征 在于步骤(3)所述柱层析法的色谱条件为常规柱2.5X30 cm;固定 相为柱层析硅胶；流动相为7.5:1和5:l的乙酸乙酯-甲醇。
8、 一种权利要求1所述制备方法制备得到的阿霉素-二肽复合物 在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种阿霉素-二肽复合物的制备方法，通过肽修饰技术，将含有脯氨酸残基的二肽或多肽通过酰化反应连接到阿霉素的氨基上，可以使阿霉素的毒性降低，同时这种前体药物在肿瘤间质细胞的作用下能释放阿霉素，使阿霉素能富集到肿瘤组织周围，提高阿霉素对肿瘤组织的选择性。本发明反应速率快，耗时短，产物产率和纯度较高。
文档编号A61K31/704GK101274100SQ20081002638
公开日2008年10月1日 申请日期2008年2月20日 优先权日2008年2月20日
发明者鹏 刘, 卜宪章, 军 杜, 谢白露 申请人:中山大学