专利名称：聚阳离子纳米脂质载体系统及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种新型的非病毒基因给药载体，具体 涉及一种聚阳离子纳米脂质载体系统及其制备方法。
背景技术：
基因治疗技术已经成为目前国内外生物医药研究的热点领域之一，该技术应 用的关键是需要一种安全、高效的基因给药载体系统。目前，基因给药载体主要 分为病毒载体和非病毒载体。其中，病毒载体具有非常高的转染效率，是目前临 床上应用最为广泛的一种基因给药载体，但是病毒载体本身具有很强的免疫原 性，有潜在的与宿主细胞整合的危险性，而且缺乏靶向性，所存在的缺点严重影
响了该类产品的临床应用，如1999年美国重组腺病毒"Jesse Gelsinger"事件和 2000年法国发生的逆转录病毒诱导白血病恶性事件等；因而，近年来非病毒基 因给药载体的研究备受关注。
目前使用的非病毒基因给药载体主要有阳离子脂质体(Dalby B， Cates S, et al. Methods, 2004, 33:95-103)，阳离子聚合物(Boussif 0 etal. Proc NatAcad Sci USA'1995,92:7297-7301 )和纳米粒(Hu FQ， et al. Inter J Pharm" 2006,315:158-166.)等。其中，阳离子脂质体是目前应用最多最为广泛的一种 非病毒基因给药载体，其主要由阳离子的磷脂和中性磷脂DOPE 二者组成，具 有较高的体外转染效率，但是有血浆存在时，转染效率则急剧降低，不能用于体 内的基因转染，严重限制了其临床应用，而且该载体毒性较强；阳离子聚合物是 目前研究较多的另外一种非病毒基因给药载体，如聚乙烯亚胺 (Polyethylenimine， P曰)，树状大分子(PAMAM)以及聚赖氨酸(PLL)和其 他的聚阳离子蛋白质如鱼精蛋白等，该类基因给药载体也具有较高的体外转染效 率，并且能够促进质粒向细胞核内的转运，可用于体内的基因转染，但同样存在
毒性较强，而且很容易聚集的缺点；纳米粒能够克服组织的障碍，具有良好的细 胞摄取效果，能够将质粒DNA导入细胞桨内，但转染效率较低。阳离子脂质体具有较高的转染效率，原因是其中的成分DOPE进入细胞后， 在内吞泡中在酸性pH条件下，形成六角形的Hu相，使得内吞泡破裂，从而避 免了质粒DNA的降解；阳离子聚合物主要是由于其在酸性条件下，其中的氨基 带有正电荷，引起离子的内流，即"质子海绵"作用从而使内吞泡破裂，而且该类 聚合物能够促进质粒DNA往细胞核内的转运；纳米粒则具有良好的细胞摄取效 果。有研究表明油酸类物质如三油酸甘油酯(TO)， 二油酸甘油酯(DO)单油 酸甘油酯(MO)和油酸(OA)能够促进磷脂形成Hn相。
发明内容
本发明的目的是提供一种非病毒基因给药载体，具体涉及一种聚阳离子纳米 脂质载体系统。
本发明在该载体系统中引进油酸类物质制备一种新型的非病毒基因给药载 体。在国家973项目基金(No.2007CB935800)的支持下制备了聚阳离子纳米 月旨质载体系统(Polycation nanostructured lipid carrier, PNI_C)。
本发明聚阳离子纳米脂质载体系统由垸基化聚乙烯亚胺、磷脂和类脂类物质 组成，其中，烷基化聚乙烯亚胺与磷脂的摩尔比为0.05 2:1，类脂类物质与磷 脂的摩尔比为0. 2 6:1。
所述的聚阳离子纳米脂质载体系统，具有较高的体外细胞转染效率，可作为 一种非病毒基因给药载体。
本发明聚阳离子纳米脂质载体系统采用磷脂、类脂类物质和阳离子的烷基化 PEI制成，其中所述的磷脂和类脂类物质形成疏水性的纳米脂质内核结构，所合 成的烷基化PEI具有疏水性的垸基端和亲水性的阳离子PEI ，具有双亲性的性质， 在制备过程中垸基化PEI通过疏水端的十六烷基与纳米脂质内核结合，从而将 阳离子的亲水端的P曰锚定在纳米脂质载体的表面形成阳离子化的纳米脂质载 体，使其表面具有阳离子的特征，可以通过静电结合的作用与带有负电荷的质粒 DNA结合。上述非病毒基因给药载体同时具有阳离子聚合物P曰、脂质载体和 纳米给药系统的特征，从而能够更好地作为基因类药物的非病毒类给药载体，而 且该系统采用了小分子量的PEI以降低载体系统的毒性，所述的类脂和磷脂成 份具有较好的生物相容性，因而该系统具有较低的毒性。
本发明所述的垸基化聚乙烯亚胺采用溴化十四烷、溴化十六垸和溴化十八垸分别与聚乙烯亚胺600Da，聚乙烯亚胺1200Da，和聚乙烯亚胺1800Da反应，合 成制备烷基化聚乙烯亚胺；
所述的类脂类物质选自单硬脂酸甘油酯、单豆蔻酸甘油酯、单棕榈酸甘油 酯、单山榆酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二豆蔻酸甘油酯、二棕榈酸甘油酯、二 山榆酸甘油酯、硬脂酸三甘油酯(TS)、豆蔻酸三甘油酯(TM)、棕榈酸三甘油 酯(TP)、三山榆酸甘油酯、辛酸/癸酸三甘油酯、油酸、单油酸甘油酯(MO)、 二油酸甘油酯(DO)和三油酸甘油酯(TO)、中链甘油三酯M812、辛酸癸酸 亚油酸甘油酯M818或其中任意两种或两种以上的混合物。优选油酸、单油酸甘 油酯、二油酸甘油酯或/和三油酸甘油酯；
所述的磷脂是中性磷脂，选自磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺，所述的磷脂酰胆 碱选自卵磷脂(EPC)、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄 卵磷脂(HPC)、 二硬脂酰磷脂酰胆碱，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱或二油酰磷脂酰 胆碱；所述的磷脂酰乙醇胺选自二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)， 二棕榈酰磷脂 酰乙醇胺(DPPE)、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或棕榈酰油酰磷脂酰乙醇 胺。优选二油酰磷脂酰乙醇胺或卵磷脂。
本发明所述的聚阳离子纳米脂质载体系统通过薄膜法、逆相蒸发法、注入法、 高压匀质法、溶剂扩散法或者乳化溶剂蒸发法制备。
其中，所述的乳化溶剂蒸发法是将垸基化聚乙烯亚胺、磷脂和类脂类物质溶 于二氯甲垸等易挥发且与水不互溶的有机溶剂中，然后滴加到双蒸水中，乳化后， 蒸发除去有机溶剂即得；薄膜超声分散法是将烷基化聚乙烯亚胺、磷脂和类脂类 物质溶于加入氯仿甲醇混合溶剂(2:1， V/V)等有机溶剂中，旋转蒸发在瓶壁上 形成一层薄膜，然后加入双蒸水加热水化，超声，即得；溶剂扩散法是将垸基化 聚乙烯亚胺、磷脂和类脂类物质溶于二氯甲烷等易挥发且与水不互溶的有机溶剂 中，在高速搅拌的条件下滴加到双蒸水中，然后超声乳化制备乳剂， 一直搅拌直 至有机溶剂挥发完全，即得；逆相蒸发法是将烷基化聚乙烯亚胺、磷脂和类脂类 物质溶于二氯甲烷等有机溶剂中，然后与双蒸水按照3: l的体积比混合，超声 乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，加入双蒸水， 继续旋转制得水性混悬液。
本发明经基因转染试验，结果表明，所制备的聚阳离子纳米脂质载体系统在
6SPC-A1细胞和CHO细胞中的转染效率显著高于阳性对照阳离子脂质体 Lipofectamine 2000，流式细胞仪测定其转染绿色荧光蛋白报告基因后的结果 表明，PTE和PDE组成的聚阳离子纳米脂质载体转染效率与阳离子脂质体 LipofectamineTM2000相当，而PME、 PTD、 PDD和PMD组成的聚阳离子纳 米脂质载体的转染效率显著高于阳离子脂质体LipofectamineTM2000。
图1是流式细胞仪测定聚阳离子那米脂质载体和阳离子脂质体 UpofectamineTM2000在SPC-A1细胞和CHO细胞中的转染效率的图，
其中Lipofectamine 2000为阳离子脂质体阳性对照，PTE为组成成分为垸 基化聚乙烯亚胺P12C16 (1: 6)、三油酸甘油酯和卵磷脂的聚阳离子纳米脂质载 体；PDE为组成成分为烷基化聚乙烯亚胺P^d6 (1:6)、 二油酸甘油酯和卵磷 脂的聚阳离子纳米脂质载体；PME为组成成分为垸基化聚乙烯亚胺P12C16 (1: 6)、单油酸甘油酯和卵磷脂的聚阳离子纳米脂质载体；PTD为组成成分为烷基 化聚乙烯亚胺P^Cw (1:6)、三油酸甘油酯和磷脂DOPE的聚阳离子纳米脂质 载体；PDD为组成成分为烷基化聚乙烯亚胺P!2C化(1:6)、 二油酸甘油酯和磷 脂DOPE的聚阳离子纳米脂质载体；PMD为组成成分为垸基化聚乙烯亚胺 P12Ct6 (1: 6)、单油酸甘油酯和磷脂DOPE的聚阳离子纳米脂质载体。
图2是阳离子脂质体LipofectamineTM2000和PTE、 PDE、 PME、 PTD、 PDD、 PMD组成的聚阳离子纳米脂质载体转染SPC-A1细胞和CHO细胞48h 后的荧光显微镜图片，
其中，PTE和PDE组成的PNLC转染SPC-A1细胞和CHO细胞后的细胞 中表达绿色荧光蛋白的细胞数量与阳离子脂质体Lipofectamine 2000相当，而 PME、 PTD、 PDD、 PMD组成的聚阳离子纳米脂质载体转染SPC-A1细胞和 CHO细胞后表达绿色荧光蛋白的细胞数量显著高于阳离子脂质体 Lipofectamine 2000对照。
图3是阳离子脂质体Lipofectamine 2000和PTE、 PDE、 PME、 PTD、 PDD、 PMD组成的聚阳离子纳米脂质载体转染SPC-A1细胞后细胞中表达的绿 色荧光蛋白的荧光强度，
其中，PTE转染SPC-A1细胞后表达的绿色荧光蛋白的荧光强度与阳离子脂
7质体LipofectamineTM2000转染后表达的绿色荧光蛋白强度相当，而PDE、 PME、 PTD、 PDD和PMD组成的聚阳离子纳米脂质载体转染SPC-A1细胞后表达的 绿色荧光蛋白的荧光强度显著高于阳离子脂质体LipofectamineTM2000转染 SPC-A1细胞后表达的绿色荧光蛋白的荧光强度。
具体实施例方式
通过下列实施实例进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围，不 局限于此。 实施例1
合成烷基化聚乙烯亚胺
按现有技术称取P曰600或者冷冻干燥后的PEI1200、 P曰1800和溴化十四 垸或溴化十六垸或者溴化十八烷加入20ml的三氯甲垸和1ml的三乙胺，加热回 流12h，首先用40%乙醇然后用蒸馏水透析24h后，冷冻干燥即得烷基化聚乙 烯亚胺，所制得的烷基化聚乙烯亚胺，其中聚乙烯亚胺与溴化烷烃的摩尔比如表 1所示。表1是合成的垸基化聚乙烯亚胺。
表1
溴化十四烷溴化十六烷溴化十八垸
P6C14(1:2)P6C16(1:2)P6C18(1:2)
PE幽P6C14(1:3)P6C16(1:4)P6C18(1:3)
P6C14(1:6)P6C16(1:6)P6C18(1:6)
4)Pi2C16(1:4)Pi2C18(1:4)
PEI1200Pl2Ci4(18)P12C16(1:6)Pi2C18(1:8)
Pl2Ci4(112)P12C16(1:9)Pi2C18(1: 11)
Pl8Cl4(14)P18C16(1:2)Pi8C18(1:4)
PE画OPi8C14(18)P18C16(1:5)Pi8C18(1:6)
Pl8Cl4(112)P18C16(1:7)Pi8C18(1: 10)
实施例2薄膜超声分散法制备聚阳离子纳米脂质载体 TO 1 EPC 1 P12C16(1:6) 0.1
制备工艺准确称取处方量(摩尔比)的烷基化PEI、三油酸甘油酯和卵磷
8脂，加入氯仿甲醇混合溶剂(2:1, V/V)适量，使其完全溶解并转移至茄形瓶中。 37t恒温水浴减压蒸发除去有机溶剂，使脂质在瓶壁上形成均匀薄膜。茄形瓶置 真空干燥箱内真空干燥过夜，加入一定量双蒸水，5(TC水浴使脂质膜脱落，得白 色混悬液；冰浴下探头超声5s，间歇3s，重复60次，功率200W;微孔滤膜过 滤，即得。测得粒径278. 2±123. 6咖，zeta电位+19. 48mv。
实施例3溶剂扩散法制备聚阳离子纳米脂质载体 TO 1 EPC 1 P12C16(1:6) 0.1
制备工艺准确称取处方量(摩尔比)的垸基化PEI、三油酸甘油酯和卵磷脂， 加入二氯甲垸适量使之溶解，在高速搅拌的条件下滴加到双蒸水中，然后超声乳
化制备乳剂， 一直搅拌直至有机溶剂挥发完全，即得。测得粒径178.2土78.6nm， zeta电位+21. 46mv。
实施例4逆相蒸发法制备聚阳离子纳米脂质载体
TO 1
EPC 1
Pi2C16(1:6) 0.1 制备工艺准确称取处方量(摩尔比)的烷基化PEI、三油酸甘油酯和卵磷脂， 加入二氯甲烷适量使之溶解，然后与双蒸水按照3: 1的体积比混合，超声乳化
制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，加入双蒸水，继续 旋转制得水性混悬液。测得粒径167. 3 ±67. lnm， zeta电位为26. 69mv。
实施例5:
TO 1
EPC 1
P12C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的烷基化聚乙烯亚胺与三油酸甘油 酯和卵磷脂溶于二氯甲烷中，将该二氯甲垸溶液加入到一定量的双蒸水中，用探
针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所得体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为 130. 1±48. 3nm, zeta电位为+34. 32mv。
实施例6
EPC 1 TM 1 P12C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的烷基化聚乙烯亚胺与三肉豆蔻酸 甘油酯和卵磷脂溶于二氯甲垸中，将该二氯甲烷溶液加入到一定量的双蒸水中，
用探针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所 得体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为 131. 3±52. 7nm， zeta电位为+48. 04mv。
实施例7:
EPC 1 M812 1 P12C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的烷基化聚乙烯亚胺与中链甘油三酯 M812和卵磷脂溶于二氯甲垸中，将该二氯甲垸溶液加入到一定量的双蒸水中， 用探针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所 得体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为 145. 3±49. 2nm， zeta电位为+55. 91mv。
实施例8:
EPC 1 M818 1 P12C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的垸基化聚乙烯亚胺与辛酸癸酸甘油
酯M818和卵磷脂溶于二氯甲烷中，将该二氯甲垸溶液加入到一定量的双蒸水中， 用探针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所 得体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为136. 2±50. 1nm， zeta电位为+54. 83mv。
实施例9:
DOPE 1
TO 0.2
P12C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的烷基化聚乙烯亚胺与三油酸甘油
酯和磷脂DOPE溶于二氯甲烷中，将该二氯甲垸溶液加入到一定量的双蒸水中， 用探针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所 得体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为 105. 4±33. 7nm， zeta电位为+35. 37mv
实施例10:
EPC 1
DO 2
P12C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的垸基化聚乙烯亚胺与二油酸甘油 酯和卵磷脂溶于二氯甲烷中，将该二氯甲垸溶液加入到一定量的双蒸水中，用探
针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所得体 系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为 111.4±47. lnm， zeta电位为+37. 85nw
实施例11:
DOPE 1
DO 0.75
P12C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的垸基化聚乙烯亚胺与二油酸甘油酯 和磷脂D0PE溶于二氯甲烷中，将该二氯甲烷溶液加入到一定量的双蒸水中，用 探针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所得 体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为
11103±38. 9咖，zeta电位为+29. llmv。
实施例12
EPC 1
M0 6
Pi2C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的烷基化聚乙烯亚胺与单油酸甘油酯 和卵磷脂溶于二氯甲垸中，将该二氯甲垸溶液加入到一定量的双蒸水中，用探针
超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所得体系 然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为 89. 9±36. lnm， zeta电位为+38. 46mv
实施例13:
DOPE 1
MO 1.5
P12C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的烷基化聚乙烯亚胺与单油酸甘油
酯和磷脂DOPE溶于二氯甲垸中，将该二氯甲烷溶液加入到一定量的双蒸水中， 用探针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所 得体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为 87. 1±32. 3nm， zeta电位为+34. 03mv。
实施例14:
DOPE 1 M812 1
Pi2C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的垸基化聚乙烯亚胺与中链甘油三 酯M812和二油酰磷脂酰乙醇胺溶于二氯甲垸中，将该二氯甲垸溶液加入到一定 量的双蒸水中，用探针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除 去有机溶剂，所得体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质 载体粒径为113±41. 9nm， zeta电位为+41. 5mv。
12实施例15:
TO 1 EPC 1 P6C16(1:4) 2
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的垸基化聚乙烯亚胺与三油酸甘油 酯和卵磷脂溶于二氯甲烷中，将该二氯甲垸溶液加入到一定量的双蒸水中，用探
针超声乳化制备乳剂，然后在35t:水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所得体
系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为 62. 8±27. 7nm， zeta电位为+30. 02mv。
实施例16-
TO 1 EPC 1
P18C18(1:10) 0.05
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的垸基化聚乙烯亚胺与三油酸甘油 酯和卵磷脂溶于二氯甲烷中，将该二氯甲烷溶液加入到一定量的双蒸水中，用探 针超声乳化制备乳剂，然后在35。C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所得体 系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为 141 ±61. 3nm， zeta电位为+29. 56mv。
实施例17
TO 1
HPC 1
Pi2C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的烷基化聚乙烯亚胺与三油酸甘油 酯和氢化卵磷脂溶于二氯甲垸中，将该二氯甲烷溶液加入到一定量的双蒸水中， 用探针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所 得体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为 139. 4±58. 4nm， zeta电位为+23. 46mv。
实施例18
13<formula>formula see original document page 14</formula>
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的烷基化聚乙烯亚胺与三油酸甘油 酯和二油酰磷脂酰胆碱溶于二氯甲烷中，将该二氯甲垸溶液加入到一定量的双蒸
水中，用探针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶 剂，所得体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径 为133. 5±55. 4nm， zeta电位为+27. 38mv。
实施例19
TO 1 DPPE 1 P12C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的垸基化聚乙烯亚胺与三油酸甘油 酯和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺溶于二氯甲垸中，将该二氯甲垸溶液加入到一定量的 双蒸水中，用探针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有 机溶剂，所得体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体 粒径为121. 5 ±47. 4nm， zeta电位为+37. 46mv。
实施例20
<formula>formula see original document page 14</formula>
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的垸基化聚乙烯亚胺与三油酸甘油 酯和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶于二氯甲垸中，将该二氯甲垸溶液加入到一定量的 双蒸水中，用探针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有 机溶剂，所得体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体 粒径为143. 4 ±60. 2nm， zeta电位为+39. 42mv。
实施例21
TP 1EPC 1
P12C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的垸基化聚乙烯亚胺与三棕榈酸甘 油酯和卵磷脂溶于二氯甲烷中，将该二氯甲烷溶液加入到一定量的双蒸水中，用
探针超声乳化制备乳剂，然后在35'C水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所得 体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为 164. 4±56. 9nm， zeta电位为+44. 45mv。
实施例22
TS 1 EPC 1 P12C16(1:6) 0.1
制备工艺分别精密称取处方量(摩尔比)的垸基化聚乙烯亚胺与三硬脂酸甘 油酯和卵磷脂溶于二氯甲垸中，将该二氯甲烷溶液加入到一定量的双蒸水中，用
探针超声乳化制备乳剂，然后在35t水浴条件下减压蒸发除去有机溶剂，所得 体系然后用220nm的滤膜过滤即得。制备的聚阳离子纳米脂质载体粒径为 173. 4±64. 3nm， zeta电位为+31. 31mv。 实施例23基因转染试验
按常规方法，进行基因转染试验，结果表明，所制备的聚阳离子纳米脂质载 体系统在SPC-A1细胞(市购)禾BCHO (市购)细胞中的转染效率显著高于阳 性对照阳离子脂质体Lipofectamine 2000，流式细胞仪测定其转染绿色荧光蛋 白报告基因后的结果表明，PTE和PDE组成的聚阳离子纳米脂质载体转染效率 与阳离子脂质体Lipofectamine 2000相当，而PME、 PTD、 PDD和PMD组 成的聚阳离子纳米脂质载体的转染效率显著高于阳离子脂质体 Lipofectamine 2000，结果如图1，图2，图3所示。
权利要求
1.一种聚阳离子纳米脂质载体系统，其特征是由烷基化聚乙烯亚胺、磷脂和类脂类物质组成，其中，烷基化聚乙烯亚胺与磷脂的摩尔比为0.05～2∶1，类脂类物质与磷脂的摩尔比为0.2～6∶1。
2、 根据权利要求1所述的聚阳离子纳米脂质载体系统，其特征是所述的烷 基化聚乙烯亚胺是由溴化十四烷、溴化十六烷和溴化十八垸分别与聚乙烯亚胺 600Da，聚乙烯亚胺1200Da，和聚乙烯亚胺1800Da反应制得；所制得的垸基化聚乙烯亚胺，其中聚乙烯亚胺与溴化垸烃的摩尔比如下表所不，溴化十四垸溴化十六烷溴化十八烷P日600P6C14(1:2) P6C14(1:3) P6C14(1:6)P6C16(1:2) P6C16(1:4) P6C16(1:6)P6C18(1:2) P6C18(1:3) P6C18(1:6)PE訓OPi2C14(1:4) P12C14(1:8) P12C14(1:12)Pi2C16(1:4) P12C16(1:6) P12C16(1:9)Pi2C18(1:4) Pi2C18(1:8) Pi2C18(1: 11)PEI1800Pi8C14(1:4) P18C14(I: 8) P18C14(1:12)P18C16(1:2) PiaC16(1: 5) Pi8C16(1:7)P18C18(1:4) Pi8Ci8(1: 6) P18C18(1: 10)
3、 根据权利要求1所述的聚阳离子纳米脂质载体系统，其特征是所述的类脂类物质选自单硬脂酸甘油酯、单豆蔻酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、单山榆酸 甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二豆蔻酸甘油酯、二棕榈酸甘油酯、二山榆酸甘油酯、 硬脂酸三甘油酯、豆蔻酸三甘油酯、棕榈酸三甘油酯、三山榆酸甘油酯、辛酸/ 癸酸三甘油酯、油酸、单油酸甘油酯、二油酸甘油酯和三油酸甘油酯、中链甘油三酯M812、辛酸癸酸亚油酸甘油酯M818或其中任意两种或两种以上的混合物。
4、 根据权利要求3所述的聚阳离子纳米脂质载体系统，其特征是所述的类 脂类物质选自油酸、单油酸甘油酯、二油酸甘油酯或/和三油酸甘油酯。
5、 根据权利要求1所述的聚阳离子纳米脂质载体系统，其特征是所述的磷 脂选自磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺，所述的磷脂酰胆碱选自卵磷脂、大豆卵磷脂、 蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱或二油酰磷脂酰胆碱；所述的磷脂酰乙醇胺选自二油酰磷脂酰乙 醇胺，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕榈酰油酰磷脂酰乙醇 胺；
6、 根据权利要求5所述的聚阳离子纳米脂质载体系统，其特征是所述的磷 脂是二油酰磷脂酰乙醇胺或卵磷脂。
7、 权利要求l所述的聚阳离子纳米脂质载体系统的制备方法，其特征是采 用乳化溶剂蒸发法、溶剂扩散法、薄膜超声分散法或逆向蒸发法，其中所述的乳 化溶剂蒸发法是将垸基化聚乙烯亚胺、磷脂和类脂类物质溶于二氯甲烷，然后滴 加到双蒸水中，乳化后，蒸发除去有机溶剂，即得。
8、 权利要求1所述的聚阳离子纳米脂质载体系统在制备非病毒基因给药载 体中的用途。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种聚阳离子纳米脂质载体系统及其制备方法。本发明由烷基化聚乙烯亚胺、磷脂和类脂类物质依次按摩尔比0.05～2∶1和摩尔比0.2～6∶1制成聚阳离子纳米脂质载体系统，本发明经基因转染试验，结果表明，所制得的载体系统在SPC-A1细胞和CHO细胞中的转染效率显著高于阳性对照阳离子脂质体Lipofectamine<sup>TM</sup>2000，流式细胞仪测定其转染绿色荧光蛋白报告基因后的结果表明，其转染效率显著高于阳离子脂质体Lipofectamine<sup>TM</sup>2000。所述的聚阳离子纳米脂质载体系统，具有较好的生物相容性，毒性较低，具有较高的体外细胞转染效率，可作为非病毒基因给药载体。
文档编号A61K47/32GK101554478SQ200810035929
公开日2009年10月14日 申请日期2008年4月10日 优先权日2008年4月10日
发明者江 吴, 张丽珺, 张志文, 方晓玲, 沙先谊, 王永中, 洁 郭 申请人:复旦大学