专利名称：：菱角挥发油在制备抑瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于中药
技术领域：
。技术背景菱角为菱科植物的果实，又称菱、菱实，是一种应用广泛的药食同用水生植物，菱实味甘鲜，性平，无毒，具有清热祛暑，除湿祛风，益气健脾功效，被药典、中药大辞典等广泛收载。近年来研究表明，菱角具有抗肿瘤作用，可用于肿瘤的辅助治疗，但其作用的有效成分一直未明确。
发明内容本发明提供一种菱角挥发油在制备抑瘤药物中的应用。本发明菱角挥发油可通过现有文献报导的方法获得，优选为以下超临界流体萃取方法获得。具体方法是1、仪器、试剂与原料HA221-50-06超临界流体萃取仪(江苏南通华安超临界萃取有限公司)；TRACE-MS气相色谱一质谱联用仪(美国Finnigan公司)；AB104型电子天平(瑞士Mettletoledo公司)。(:02(食用级，液态纯度为99.99%)乙醚、无水硫酸钠等均为分析纯。所用菱角均采自吉林省大安县,并经吉林农业大学樊绍钵教授鉴定为东北菱(TrapamanshuricaFler)。2、实验方法将干燥菱壳粉粹并过24目筛，称取1760g盛入5L萃取釜。萃取温度40'C-45。C,分离温度45。C-50。C,萃取压力25Mpa-30Mpa,分离压力12Mpa-15Mpa，C02流量15-20kg/hr，待各条件稳定后开始等压循环萃取，共萃取4h,每小时接取一次萃取物。将萃取物溶于50ml乙醚,无水硫酸钠干燥,低温存放，用于GC-MS检测。3、挥发油GC-MS检测条件气相色谱:HP-5MS弹性石英毛细管柱(30mx0.25mmx0.25um);进样口温度280°C;起始柱温80°C，保持1min，以每分钟20'C升至280°C，保持15min;载气氦气，流量1.0mL/min;分流比30:1;进样量lpL。质谱EI离子源；电子能量70eV;界面温度28(TC;离子流温度180°C。扫描范围33-600U。通过G1701BA化学工作站数据处理系统,检索Nist98谱图库，相对含量在1%以上的14种，含量占总化合物的75.2%，其中香豆素类1种，占总化合物的22.97%，脂肪族类2种，占总化合物的26.26%，酮类5种，占总化合物的13.08%，醛类1种，占总化合物的2.36%，吡喃类1种，占总化合物的2.15%,醇类1种，占总化合物的1.87%,酯类1种，占总化合物的1.47%,酚类1种，占总化合物的1.83%;含量较高的化合物依次为蛇床子素(22.97%)，9，12-亚油酸(17.18%)，棕榈酸(9.08%)，4,5，6，7-四甲基苯并[c]呋喃酮(5.49。/。)。其中含量最高的香豆精类物质蛇床子素，具有抗菌、镇静、降压、抗心律不齐、抗癌抗突变及提高机体免疫力等作用。另外，占挥发油总量26.26%的两种脂肪酸具有较多的应用价值,其中亚油酸(LA)为人体必需脂肪酸，是共轭亚油酸(CLA)的前体物，而共轭亚油酸具有抗癌、抗动脉粥样硬化等生理功能。本发明的积极效果是菱角挥发油对肿瘤细胞的生长增殖具有较明显的抑制作用，药效学实验表明对人宫颈癌和肝癌的抑制作用明显，并且无明显的毒性反应。本发明药物用法用量，口服剂量20毫克-100毫克/次'人，一日三次。图l是菱角挥发油总离子流图。图2是菱角挥发油对Hda细胞的生长抑制曲线。图3是24h后对照组Hela细胞(X200)。图4是给药24h后Hela细胞(X200)。图5是检测挥发油诱导Hela细胞凋亡电泳图。具体实施方式下面通过药效学实验来进一步说明菱角挥发油的抑瘤作用。1.菱角挥发油对人宫颈癌细胞Hela的增殖抑制作用体外MTT实验结果表明，菱角挥发油对Hda细胞作用24h，显示具有较强的抑制增殖作用，由表2可知IC5o为228.39吗'mL'1。由图2可见当菱角挥发油浓度为12.5、25、50、100、200、300、400、500吗'mL"时，随着给药浓度的增大，对肿瘤细胞的抑制作用逐渐增强，两者呈明显的量效关系，与对照组相比，差异显著(P<0.05)。给药前后细胞形态变化见图3，图4，在倒置显微镜下观察菱角挥发油对Hela细胞的作用，发现未给药的细胞生长旺盛，而给药组随着菱角挥发油浓度的增加细胞数目逐渐减少，体积变小、变形，贴壁细胞出现皱縮、脱落，细胞胞浆内颗粒增多、增粗，细胞膜边缘变粗糙。表2菱角挥发油对Hela细胞24h生长抑制作用(3f士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*尸<0.05vs.阴性对照，**尸<0.01vs.阴性对照2.琼脂糖凝胶电泳检测挥发油诱导Hela细胞凋亡如图5所示，泳道1和3没有可见的清晰梯状条带，而泳道2则表现为特征性梯状条带(DNALadder)。说明Hela细胞经25吗mU1的菱角挥发油作用24h后没有明显的诱导凋亡作用，而当浓度达5025吗'mL"时，在核小体连接处的DNA能被挥发油随机切断，形成寡聚核小体，导致Hda细胞发生凋亡。3.菱角挥发油对体外培养肝癌细胞SMMC-7721抑制作用采用MTT法评价菱角挥发油的体外抗肿瘤活性。体外实验MTT结果表明，超临界提取挥发油对SMMC-7721细胞增殖也具有明显抑制作用，四个时间点的半数抑制浓度ICs。分别为25.88pg'mL'1、10.3昭mL—1、8.46吗mL"和5.09昭mL"。菱角超临界提取挥发油均具有抑制SMMC-7721增殖及诱导细胞凋亡的作用。并且挥发油对SMMC-7721的抑制作用明显。表3菱角挥发油作用24h对SMMC-7721细胞生长抑制作用(元士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>VO.05vs.阴性对照；**尸<0.01vs.阴性对照表4達i角挥发油作用48h对SMMC-7721细胞生长抑制作用(无士s)组别剂量(nL.ml/1)吸光度(？±s)抑制率(％)IC50(nLmL-1)阴性对照00.287±0,0215FU20.00(|ugmL-1)0.102±0.005*64.5挥发油6.250.203±0.022**29.310.3012.500.135±0扁**53.025.000.018土0.008"93.750,000.062±0.011**78.4跳OO0.023士0.011**92.0*尸<0.05vs.阴性对照；**P<0.01vs.阴性对照表5菱角挥发油作用72h对SMMC-7721细胞生长抑制作用(5±s)组别剂量(nLmU1)吸光度(5±s)抑制率(％)1C50(^iL'mL")阴性对照00.480±0.0315FU20.00(叫mU1)0.014±0.015*97.1挥发油6.250.345±0扁**28.28.4612.500.140±0,015**70,825.000.061±0.011**87,350.000.075±0.022**84.4100.000.020±0.006**95.8叩O.05vs.阴性对照；**尸<0.01vs.阴性对照表6菱角挥发油作用96h对SMMC-7721细胞生长抑制作用(i±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>7〈0.05vs.阴性对照；**尸<0.01vs.阴性对照本发明超临界挥发油对SMMC-7721细胞24、48、72、96h，半数抑制率ICs。分别为25.88、10.30、8.46和5.09pLmL"，抑制作用显著。本发明胶丸剂型的制备菱角挥发油200克，常规辅料800克，制成10000粒胶丸。权利要求1.菱角挥发油在制备抑瘤药物中的应用。2、如权利要求1所述的菱角挥发油在制备抑人宫颈癌药物中的应用。3、如权利要求1所述的菱角挥发油在制备抑肝癌药物中的应用。全文摘要本发明涉及菱角挥发油在制备抑瘤药物中的应用，属于中药领域。本发明菱角挥发油可通过现有文献报导的方法获得，优选为用超临界流体萃取方法获得。菱角挥发油对肿瘤细胞的生长增殖具有较明显的抑制作用，药效学实验表明对人宫颈癌和肝癌的抑制作用明显，并且无明显的毒性反应。文档编号A61P15/00GK101264111SQ200810050668公开日2008年9月17日申请日期2008年4月29日优先权日2008年4月29日发明者牛凤兰申请人:吉林大学