重组金黄色葡萄球菌肠毒素g口服制剂及应用的制作方法

专利名称：重组金黄色葡萄球菌肠毒素g口服制剂及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程，涉及重组金黄色葡萄球菌肠毒素G (Staphylococcal Enterotoxin G， SEG)的制备以及以SEG主要有效成分的口服制剂的制备和在 肿瘤治疗中的应用。具体地说，就是利用基因工程方法制备高纯度重组金黄色 葡萄球菌肠毒素G蛋白及其相关蛋白制品，并将其制备成口服制剂，用于肿瘤 患者的治疗和康复。
技术背景金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin)由金黄色葡萄球菌产 生。目前已经获得鉴定的肠毒素有二十余种，其中包括经典的肠毒素如SEA、 SEB、 SEC、 SED、 SEE等，以及新近发现的肠毒素SEG SEQ。不同种类肠 毒素分子量为25 33kD不等，各类肠毒素氨基酸序列具有一定的同源性(28 % 98%),通过蛋白质晶体衍射以及计算机三维结构模拟技术可知，各类肠 毒素的三维结构十分相似，均具有两个结构域，多数肠毒素包含一个对维持三 维结构十分重要的二硫键。金葡菌肠毒素是一类典型的细菌性超抗原，能在短时间内引起宿主体内T 细胞的大量增殖与活化。研究发现，肠毒素分子可以以完整分子结合于抗原提 呈细胞(Antigen presenting cells, APC)表面的MHC-II类分子的抗原肽结合沟槽 外侧，进而通过与T细胞受体(T cell receptor, TCR) V卩区特异性结合激活T 细胞。与普通抗原不同的是，肠毒素不需要同时被TCR分子的Va、 Jcu J(3、 VP和D(3等各部分共同识别，也无MHC-II限制性，使得金葡菌肠毒素只需极 低浓度(0.01 10ng/mL)即可激活2 30X的初始T淋巴细胞，是普通抗原激活 的T细胞数量的103 106倍。同时，肠毒素亦能促进受其激活的T细胞分泌多 种细胞因子，间接激活B细胞、NK细胞，因此金葡菌肠毒素能高效地刺激和 增强免疫应答。介于此性质，国内外对肠毒素超抗原应用于肿瘤治疗的研究已有大量的文 献报导。Frank等人将SEB (10吗/mL)膀胱内灌注荷RT112和RT4细胞小鼠， 六周后约76%的小鼠膀胱内肿瘤消失，其余小鼠膀胱内的肿瘤细胞则产生明显调亡现象。Hedhmd等人进行的体内实验表明，SEA激活T细胞使之增殖作用 在每只小鼠0.1 — 100吗范围内呈剂量依赖关系，注射后1天出现最大效应，增 殖效应维持4天。Litton等人用结肠癌相关抗原C242的单抗Fab片段和SEA 制备融合蛋白，证明该融合蛋白在体内能够高效地促进T细胞和单核细胞在肿 瘤组织处聚集、渗透，并诱导T细胞产生大量细胞因子，同时诱导结肠癌细胞 产生IL-4、 IL-IO、 TNF-a等细胞因子，并引起癌细胞IFN，受体、Fas受体表 达上调，从而有效诱导肿瘤细胞调亡。Kodama等制备了 SEA的突变体 mSEAD227A，该突变蛋白与天然SEA相比降低了与MHC-II分子的结合能力， 但未改变对T细胞的刺激增殖能力。实验证明家兔对该突变体的耐受力是天然 SEA的500倍。利用该突变蛋白与抗MUC1抗原的单克隆抗体MUSE11制备 融合蛋白，证明该融合蛋白在体内和体外均能高效地增强T-LAK细胞对表达 MUC1的胆管癌细胞的特异性细胞毒作用。在国外，以金葡菌肠毒素及其融合蛋白为主要有效成分的药物己经进入了 临床研究。如Giantonio等人完成的PNU-214565 (重组SEA与C242单克隆抗 体的Fab片段制备的融合蛋白)的I期临床实验表明，患者可能产生的细胞毒 性与给药剂量密切相关，而给药剂量又取决于患者的体重和血液循环中抗SEA 抗体浓度。在给药过程中，76%的患者出现不同程度的体温升高，62%的患者 出现不同程度的血压降低，其主要因素是诱导产生的IL-2和TNF，毒副作用 均为暂时性的，容易得到控制。他们发现，治疗开始之前病人体内抗SEA抗 体在一定程度上降低了毒副反应，通过综合考虑个体体重与抗SEA抗体浓度， 可以确定一个副作用最小的给药剂量。Jonathan等人完成了 PNU-214565的第 二代产品PNU-214936的I期临床实验，目的为了在非小细胞肺癌 (non-small-cell lung cancer ， NSCLC)患者身上实现个体化给药，并使用 Bayesian模型结合过量剂量控制方法进行剂量放大，确定了该药的最大耐药剂 量(MTD)。在我国，以肠毒素C2 (SEC2)为主要有效成分的金葡菌滤液制剂应用于 临床肿瘤治疗已逾十年。资料显示，该类制剂不仅可以显著增强中晚期肿瘤患 者的机体免疫能力，同时可以减轻因放化疗引起的毒副作用，对恶性肿瘤患者 生存期的延长和生存质量的改善具有重要的临床价值和意义。如朱根海等研究 了 56例卵巢上皮癌患者化疗后及高聚金葡萄素辅助治疗后的机体细胞免疫状 态，治疗结果显示应用高聚生金葡素联合化疗后，CD4+ZCD8+比例、NK细胞 活性较单纯化疗显著提高，同时高聚金葡素联合化疗组2个疗程治疗后血中CA125、 TSGF等恶性肿瘤特异性生长因子降至正常的例数多于单纯化疗组， 白细胞或血小板计数低于正常的例数少于单纯化疗组。罗锋等对35例浅表转 移性肿瘤应用高聚生金葡素局部治疗，治疗一个月后总有效率达82.9%，并证 实经高聚生金葡素治疗后肿瘤细胞平均细胞调亡率增加(PO.Ol)。汤炜等对 早期口腔癌采用局部金葡素治疗及对晚期口腔癌应用金葡素联合化疗，观察疗 效和病理改变，发现应用金葡素可使大量淋巴细胞及纤维组织聚集在癌巢附 近，并能观察到肿瘤细胞显著减少，甚至部分病例肿瘤细胞消失。吴洁等观察 了高聚金葡素在食管癌根治性放疗期间，对近期疗效、胃肠道反应、白细胞变 化以及对全身状况的辅助作用，结果显示与对照组相比，观察组在放疗期间的 胃肠道反应、白细胞数量变化差异显著，表明高聚金葡素可明显升高白细胞数 量，减轻胃肠道反应。同时，观察组Kps评分增加M0分的患者占86. 6°%， 对照组仅占36.6% CPO. 05)，说明高聚金葡素有明显的改善全身状况的作用。 但另一方面，由于制剂中含有大量杂质蛋白，其中包括多种金葡菌属的毒素蛋 白，如溶血素、白细胞杀伤因子、表皮剥落因子等，在应用金葡菌滤液注射制 剂用于肿瘤患者治疗时，发现肿瘤患者使用时普遍出现低热，低血压等毒副作 用，同时也会导致注射或灌注部位红肿、疼痛等症状，对肿瘤患者的治疗和生 存质量产生一定影响。一般认为，蛋白质以及多肽类物质在进入胃肠道以后，胃内低pH环境以 及胃肠道内大量存在的胰蛋白酶、糜蛋白酶、多肽酶等多种酶类对蛋白质以及 多肽的生物学活性以及分子的完整性有着非常大的影响，大多数蛋白以及多肽 类物质会很快分解为氨基酸从而被人体吸收利用。目前，对于二肽、三肽等寡 肽分子的胃肠道内吸收的研究开展地较为广泛，在小肠绒毛上皮表面也寻找到 了部分二肽、三肽转运蛋白，上述研究结果也对传统的人体内蛋白、多肽的分 解、吸收等代谢途径给予了新的补充，但是，对于完整的蛋白以及多肽分子的 胃肠道吸收的研究仍然处于起步阶段，目前也只有极少数蛋白被推测可能能够 以完整形式被人体直接吸收利用。目前，对于肠毒素在胃肠道内的作用原理和方式的研究开展地并不深入， 对金葡菌肠毒素如何导致食物中毒症状以及是否能够通过口服吸收进而产生 超抗原作用仍未能取得共识。由于给予外源性的IL一2可以模拟产生食物中毒 时的症状，因此有学者认为肠毒素引起的食物中毒症状可能与其超抗原性质有 关，并猜测肠道上皮细胞表面存在能够与肠毒素分子结合的受体，他们指出肠 道中存在MHC-II+的M细胞，该类细胞能够与肠毒素分子结合。肠毒素正是通过该类细胞产生超抗原作用。但也有研究人员认为肠毒素的致呕吐作用和超 抗原作用并无直接联系，他们利用氨基酸突变的方法分别找到了对肠毒素分子 的这两种活性有重要影响的氨基酸残基，从而猜测胃肠道上皮细胞表面存在其他种类的受体或转运分子与其发生相互作用。Hamad等证实了 MHC-II一的 Caco-2细胞能够对SEB 实现双向转运 (Apical—Basolateral ， Basolateral—Apical),并且在转运过程中能够保持SEB分子的完整性，Shupp 等也利用体外实验证实了模拟小肠隐窝上皮细胞的T84细胞系能对SEA、 SEB 实现单向转运，提示肠毒素分子有可能在穿越胃肠道上皮进入血液循环系统后 产生超抗原作用。马海英等将金葡菌滤液制剂经灌胃给药，可使因注射环磷酰 胺所致的免疫功能低下模型小鼠的细胞免疫能力和体液免疫功能得到良好的 改善和提高，其中以细胞免疫功能的改善和提高尤为明显。需要指出的是，肠 毒素在肠道中未必仅限于以某种单一方式发挥作用，可能存在更为复杂的机 理，如Gerburg等人发现口服给予低剂量肠毒素后虽可以迅速激活大量存在于 肠系膜淋巴节以及皮氏小节处的VP8+T细胞，但对体循环系统中的T淋巴细 胞并无显著的刺激作用。可见改变肠毒素给予的剂量和时间与肠毒素在肠道内 以及全身的生物学效应存在着微妙的关系。以金葡菌肠毒素为主要成分的口服抗肿瘤制剂的理论研究和治疗应用开 展地也较为缓慢，且主要以经典肠毒素如SEA、 SEB、 SEC等为研究对象。如 中国专利CN 1509762A公开了一种金葡菌发酵液中提取代谢产物用于治疗和 预防艾滋病，其中主要成分包括了 SEA、 SEB、 SEC1、 SEC2、和SED，病人 口服后可以提高抗病毒能力；中国专利CN 1509725A公开了一种金葡菌发酵 液中提取获得SEA、 SEB、 SEC、 SED以及TSST—1制备用于提高机体免疫功 能的口服制剂，病人使用后可以提高白细胞数量、改善健康状况；中国专利 CN 1283264C公开了一种金葡菌代谢产物中提取SEA、 SEB、 SEC1、 SEC2、 SEC3、 SED以及TSST—l用于制备口服制剂，应用于防治肿瘤、糖尿病、乙 肝、戒毒、抗病毒、抗艾滋病、提高免疫力。但上述从金葡菌发酵代谢产物中 提取肠毒素的方法存在一定不足，如制备工艺简单，缺乏严格质量控制标准， 批次之间不稳定，容易引入其他蛋白杂质等，从而影响最终产品的纯度、活性 和质量。 发明内容本发明的一个目的是提供重组金黄色葡萄球菌肠毒素G 口服制剂，所述重 组金黄色葡萄球菌肠毒素G是利用基因工程方法制备获得的超抗原蛋白，具有SEQIDNO.l的氨基酸序列，表达重组金黄色葡萄球菌肠毒素G的是重组质粒 pGEX-4T-l-SEG，该质粒由pGEX-4T-l和SEQ ID NO.2的核苷酸序列经过重 组构建而成，所述制剂形式是以重组金黄色葡萄球菌肠毒素G及其相关蛋白制 品为主要有效成分的口服制剂，该口服制剂还含有制剂允许的药物赋形剂或载 体。本发明通过Caco-2单层细胞跨膜转运试验证实了该蛋白可以以完整分子 的形式透过小肠上皮细胞进入全身血液循环并能保持其促脾淋巴细胞增殖以 及抑制肿瘤细胞生长的超抗原活性，可以应用于口服抗肿瘤制剂的制备。本发明描述的口服制剂可以被称为"口服的"、"口服给药的"、"肠的"、"肠 给药的"、"非肠胃外的"、"非肠胃外给药的"等，以表明为沿消化道对个体进行 给药的途径或方式。这种"口月艮"或"肠"给药途径包括但不限于例如吞咽固体(药 丸、片剂、胶囊)或液体(糖浆)化合物或组合物；舌下；鼻空肠管或胃造口 术管；十二指肠给药；直肠给药等，同时，可以采用一种或多种口服或肠给药 途径，其中优选口服给药。"药学上可接受的"是指不会在生物学、医学、化学上或以任何其他方式与 身体化学和新陈代谢不相容的物质。根据本发明制备的口服抗肿瘤制剂中除含有的以重组金黄色葡萄球菌肠 毒素G及其相关蛋白制品作为主要有效成分以外，同时含有的组分和辅料包括 防止胃蛋白酶降解上述主要有效成分的组分、防止糜蛋白酶降解上述主要有效 成分的组分、防止肠胰蛋白酶降解上述主要有效成分的组分、吸收促进剂以及 其他生物制品及/或基因工程药品中可以接受的辅料和组分中的一种或多种，从 而可以使得有效量的上述主要有效成分到达肠内并最终被吸收到使用个体的 血液中。本发明的重组金黄色葡萄球菌肠毒素G通过以下步骤获得(1) 设计分别带有5awH I和J^o I酶切位点的用于克隆金黄色葡萄球菌肠毒素G成熟肽序列的上下游引物SEQ ID NO.3: gta gga tec caa ccc gat cct aaa tta gac (划线部分为5awH I酶切位 占)，'、、、乂 7SEQ ID N0.4: gga etc gag tea gtg agt att aag aaa tac (划线部分为I酶切位 点)；(2) 以金黄色葡萄球菌(FRIS6)基因组为模板，采用PCR扩增获得编 码金葡菌肠毒素G蛋白成熟肽的基因片段，将其连入pGEM-T质粒载体上的多克隆位点，成功构建pGEM-T-SEG重组质粒。通过测序证实通过PCR扩增 获得的编码金葡菌肠毒素G蛋白成熟肽的基因片段序列(见SEQIDN0.2)与 GenBank数据库中的编码相同蛋白质的基因序列(AY920260)完全一致；(3) 以pGEM-T-SEG质粒为模板，PCR扩增获得两端带有酶切位点的编 码金葡菌肠毒素G蛋白成熟肽的基因序列，将上述基因片段用内切酶^^HI 和^2oI进行酶切后与用相同内切酶处理后的pGEX-4T-l质粒相连接，成功构 建表达质粒pGEX-4T-l-SEG;(4) 将pGEX-4T-l-SEG表达质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，诱导表 达带GST标签的重组GST-SEG融合蛋白。收获菌体并破碎后离心收集上清， 依次采用亲和层析、离子层析、凝胶层析获得高纯度(>98%)的重组金葡菌 肠毒素G。将该纯化产物经过脱盐、冷冻干燥即得重组金黄色葡萄球菌肠毒素 G冻干粉。重组金葡菌肠毒素跨膜实验建立单层Caco-2细胞跨膜转运模型，检测重组肠毒素G的跨膜效应。证 实了重组金葡菌肠毒素G可以以完整分子形式透过小肠上皮细胞进入人体血 液循环。跨膜后的重组肠毒素分子的超抗原活性检测采用MTT法，以有丝分裂原ConA为阳性对照，建立合适的体外模型以 观察跨膜后的重组金葡菌肠毒素G对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用以及受其刺 激增殖的小鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，并与金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 (SEC2)进行比较，结果显示跨膜后的重组金葡菌肠毒素G蛋白分子仍然 保持典型的超抗原活性，与SEC2的作用相当。本发明的以重组金葡菌肠毒素G及其相关蛋白制品为主要有效成分的口 服制剂的制备方法为以重组金葡菌肠毒素G及其相关蛋白制品为主要有效成分，通过添加药学 上可接受的组分和辅料制备口服抗肿瘤制剂。其制剂可以是片剂、微型片剂、 胶囊、微型胶囊、颗粒剂、粉剂、泡腾固体、可咀嚼固体片剂、软凝剂、囊片、 水溶液、混悬剂、乳液、微乳液、糖浆或酏剂中的一种或几种，但不限于上述 剂型。目前，还未见用非经典金葡菌肠毒素制备口服制剂用于肿瘤治疗的报导， 美国专利(PCT/US2005/02263)报道了用来源于肠毒素基因簇(egc， enterotoxin gene cluster)的金葡菌肠毒素(SEG、 SEI、 SEM、 SEN、 SEO)具有良好的抗肿瘤作用，并将其应用于恶性肿瘤及严重并发症(胸水、腹水等)患者的治疗 和康复，取得了令人满意的疗效，但该专利申请亦未提出将上述肠毒素应用于口服抗肿瘤制剂。已有中国专利(公开号CN1962692、 CN1900119、 CN101066993、 CN101037478、 CN101045924)涉及重组金葡菌肠毒素SEE、 SEI、 SEM、 SEN、 SEO的制备以及在抗肿瘤药物中的应用，也未涉及口服制 剂的应用。本发明通过基因工程的方法获得高纯度重组金葡菌肠毒素G，同时 证明通过上述方法制备得到的金葡菌肠毒素G可以以完整分子形式通过小肠 上皮细胞被人体吸收并继续发挥超抗原作用，可以刺激小鼠淋巴细胞增殖并增 强淋巴细胞的肿瘤杀伤作用。因此，我们证明了重组金葡菌肠毒素G可以通过 人体胃肠道吸收，可以进入血液循环并产生有效的抗肿瘤作用，具有良好的制 备成为口服抗肿瘤制剂的应用前景。同时，获得的高纯度重组肠毒素G蛋白不 含金葡菌属及其他革兰氏阳性菌属各类毒素蛋白，可以有效降低临床使用中各 种毒副作用发生的可能性，因此可以应用于口服制剂的制备。本发明的又一个目的是提供重组金黄色葡萄球菌肠毒素G在制备治疗恶 性肿瘤以及其他严重并发症药物中的应用。本发明方法的特点是(1)提供了高纯度的重组金葡菌肠毒素G蛋白的制 备方法，并证实该肠毒素蛋白可以以完整分子的形式透过小肠上皮细胞，并且 能保持其超抗原活性，可以应用于口服抗肿瘤制剂的制备(2)提供了一种以 重组金葡菌肠毒素G及其相关蛋白制品作为有效成分的口服抗肿瘤制剂，可以 应用于肿瘤患者的康复和治疗(3)提供了含有编码金黄色葡萄球菌肠毒素G 成熟肽基因(Mg)的重组表达质粒pGEX-4T-l-SEG，该质粒由pGEX-4T-l和 SEQIDN0.2所示核苷酸融合构建而成，可转化入合适的表达宿主，含有强启 动子，在诱导剂诱导下可高效表达带有GST标签的重组GST-SEG融合蛋白(4) 使用阴离子交换层析、凝胶过滤层析对通过亲和纯化并经过酶切的重组SEG 蛋白进行精制纯化，获得了高纯度的重组SEG蛋白(纯度>98%)。本发明方法利用基因工程的方法获得了高纯度的重组金黄色葡萄球菌肠 毒素G。重组金葡菌肠毒素G的表达强度高，占全菌蛋白的10—20%左右， 且为可溶性表达。重组GST-SEG融合蛋白经凝血酶酶切后，所得到的重组肠 毒素G与相应的天然肠毒素蛋白G成熟肽相比，只在N端多出2个氨基酸 (Gly-Ser)。本发明方法采用Caco-2单层细胞模型证实完整的重组金葡菌肠毒 素G分子可以透过小肠上皮细胞进入全身血液循环，并利用MTT法证明透过 Caco-2单层细胞的完整重组肠毒素G分子可以保持其超抗原特性。本发明通过活性比较，证实了透过Caco-2单层细胞的重组金葡菌肠毒素G的超抗原活 性与金葡菌肠毒素SEC2相当，由于在临床获得应用的金葡菌滤液制剂的主要 有效成分为SEC2,因而重组金葡菌肠毒素G可以应用于口服抗肿瘤制剂的制 备。同时，本发明方法提供的口服有效制剂中含有的组分和辅料包括防止胃蛋 白酶降解上述有效成分的组分、防止糜蛋白酶降解上述有效成分的组分、防止 肠胰蛋白酶降解上述有效成分的组分、吸收促进剂以及其他生物制品及/或基因 工程药品中可以接受的辅料和组分中的一种或多种，从而可以使得有效量的上 述主要有效成分通过口服、胃肠道、非胃肠道外等给药方式到达肠内从而最终 被吸收到使用个体的血液中。另一方面，根据鉴定实验结果，现有的三种市售 金葡素注射制剂(高聚生、思复胜、恩格菲)中除了含有作为主要有效成分的 微量肠毒素C2之外，还含有大量不同种类的金葡菌属蛋白及多肽类物质，其 中丝氨酸蛋白酶(serineprotease)、烯醇化酶(enolase)、 二氢硫辛酰胺脱氢酶 (dihydrolipoamide dehydrogenase)等三种酶含量超过了制剂中总蛋白质含量 的95%以上。同时，三种制剂中也含有多种金葡菌属外毒素以及致病因子，其 中包括a-溶血素、Y-溶血素、杀白细胞素、自溶素、纤维连接素结合蛋白以 及其他不同种类的脂酶、肽酶、核酶等。上述各种蛋白酶类结构及其功能明确， 不具备剌激、增强机体免疫系统的超抗原活性，但很有可能是导致临床应用中 普遍出现的各种毒副作用(发热、低血压、过敏、局部疼痛等)的直接原因。 通过本发明获得的高纯度重组肠毒素G不含有上述各类金葡菌属毒素蛋白以 及致病因子，在今后的临床使用中造成相关副作用的可能性大大降低，本发明 通过基因工程的方法获得高纯度重组金葡菌肠毒素G，同时证明通过上述方法 制备得到的金葡菌肠毒素G可以以完整分子形式通过小肠上皮细胞被人体吸 收并继续发挥超抗原作用，可以刺激小鼠淋巴细胞增殖并增强淋巴细胞的肿瘤 杀伤作用。因此，我们证明了重组金葡菌肠毒素G可以通过人体胃肠道吸收， 可以进入血液循环并产生有效的抗肿瘤作用。同时，获得的高纯度重组肠毒素 G蛋白不含金葡菌属及其他革兰氏阳性菌属各类毒素蛋白，可以有效降低临床 使用中各种毒副作用发生的可能性，具有良好的临床应用前景。鉴于此，本发 明方法提供了以重组金葡菌肠毒素G及其蛋白制品为主要有效成分的口服抗 肿瘤制剂的制备，用于肿瘤患者的康复与治疗。


图1为PCR扩增所得含酶切位点的编码SEG蛋白成熟肽基因的琼脂糖凝 胶电泳图。10图2为PCR扩增后所测编码SEG成熟肽的基因序列测序结果图。 图3为重组pGEX-4T-l-SEG质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳图。 图4为重组SEG表达质粒pGEX-4T-l-SEG示意图，标示的"SEG"即为编 码SEG蛋白成熟肽的基因序列插入位置。图5为重组SEG在BL21 (DE3)大肠杆菌中诱导表达电泳图。 图6为重组SEG纯化电泳图。图7为亲和层析纯化并酶切后的重组SEG的阴离子层析图谱，实线为紫 外吸收值，虚线为电导值，其中第一个洗脱峰即为重组SEG。图8为经过阴离子交换层析纯化后的重组SEG的凝胶层析图谱。图9为重组SEG的Caco-2单层细胞转运实验的时间-质量关系图(A侧到图10为重组SEG的Caco-2单层细胞转运实验的时间-质量关系图(B侧 到A侧)。图ll分别为6hr后(泳道l)、 12hr后(泳道2)、 18hr后(泳道3)、 24hr 后(泳道4)透过Caco-2单层细胞(A侧到B侧)的重组SEG的Western Blot检测结果图。图12分别为6hr后6hr后(泳道l)、 12hr后(泳道2)、 18hr后(泳道3)、 24hr后(泳道4)透过Caco-2单层细胞(B侧到A侧)的重组SEG的Western Blot检测结果图。图13为经过24hr后，透过Caco-2单层细胞的重组SEG与重组SEC2标 准品对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用(48h)。图14为分别经透过Caco-2单层细胞的重组SEG与重组SEC2标准品剌激 的ICR小鼠脾淋巴细胞对耐阿霉素慢性髓原性白血病细胞(K562-AD)的抑制 作用(48h)。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。需指出的是，下列各 实施例并非是对本发明内容的进一步限定，对本发明内容技术所作出的等效替 换或者相应的改进，仍然属于本发明的保护范围之内。在本说明书上下文中，除非特别指明，否则所引用的任何技术术语具有本 领域普通技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明的实验方法是按照常 规实验方法进行或按照供应商所建议的操作说明进行。实施例1:含酶切位点的编码SEG蛋白成熟肽基因序列的PCR扩增 设计如下引物序列SEQ ID NO.3: gta gga tcc caa ccc gat cct aaa tta gac (划线部分为万awH I 酶切位点)SEQ ID NO.4: gga etc gag tea gtg agt att aag aaa tac (划线部分为J^o I酶切 位点)以金黄色葡萄球菌(FRI S6)基因组为模板，用于扩增金葡菌肠毒素SEG成熟肽基因片段Mg;PCR扩增条件如下，扩增获得编码SEG成熟肽基因片段，其中各基因片 段5'端带有^zmHI酶切位点，3'端终止子后带有^zo1酶切位点。PCR体系H20: 60jiLBuffer(10x): 10pLMg2+(25mmol/L): 8pLBSA(5mg/mL): lO^LPrimer-up(25|imol/L): 4pLPrimer-down(25|imol/L): 4jiLdNTP(20mmol/L): 2pLTemplate(Genome of 51. awrews ， 1 Ong/(iL): 1KOD Plus Polymerase(5U/jaL): 1 jxL PCR程序1、 95。C预变性3min2、 95。C变性30s， 55。C退火60s， 72。C延伸1 min3、 依步骤2循环34次4、 72。C延伸10min电泳检测PCR产物，结果显示PCR产物纯度以及产量均较高，扩增得到 的基因片段分子量位置正确，PCR结果琼脂电泳图见附图1，其中泳道l:核 酸Marker,泳道2:含酶切位点的编码SEG蛋白成熟肽基因的PCR产物。实施例2:含酶切位点的编码肠毒素SEG蛋白成熟肽基因^g的重组质粒 pGEM-T-SEG的构建将PCR扩增所得的带酶切位点的编码SEG蛋白成熟肽的基因片段克隆入 pGEM-T质粒，构建pGEM-T-SEG重组质粒，将上述重组质粒转化至大肠杆菌DH5a中进行扩增。提取上述重组pGEM-T-SEG质粒，经酶切鉴定后送样测序， 测序结果显示上述获得的带酶切位点的编码SEG蛋白成熟肽的基因序列与 GenBank上相应的基因序列除在5'增加一个酶切位点以外其余位点完全一致， 其对应的肠毒素G成熟肽的氨基酸序列与GenBank上相应蛋白成熟肽序列相 比只在N端多了两个氨基酸(Gly-Ser)，其余氨基酸位点完全一致(AAX11325)。 基因序列测序结果见附图2。实施例3:含有带酶切位点的编码SEG成熟肽基因的pGEX-4T-l-SEG重组表 达质粒的构建用S"mH I和^%0 I分别酶切由实施例2中得到的含酶切位点的编码SEG 蛋白成熟肽的基因片段的pGEM-T-SEG重组质粒和pGEX-4T-l质粒。分别回 收酶切后的含酶切位点的编码SEG成熟肽的基因片段以及pGEX-4T-l质粒酶 切产物的大片段，并连接，构建了表达质粒pGEX-4T-l-SEG。将上述重组表达 质粒转入大肠杆菌DH5a扩增并提取质粒，经过^w2HI和^7zoI酶切鉴定，结 果表明目的基因片段已插入载体质粒，电泳结果见附图3，图中泳道1:核酸 Marker,泳道2:未经过酶切的重组pGEX-4T-l-SEG质粒，泳道3:重组 pGEX-4T-l-SEG质粒5amH I与Wo I双酶切产物。pGEX-4T-l-SEG重组表达质粒示意图见附阁4。目的基因在 pGEX-4T-l-SEG质粒上的详细序列见SEQ ID NO.2实施例4:重组GST-SEG融合蛋白表达菌株的构建从含pGEX-4T-l-SEG重组表达质粒的大肠杆菌DH5a中提取该质粒，转 化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，获得可 以大量表达GST-SEG融合蛋白的工程菌菌株。实施例5:重组GST-SEG融合蛋白的表达将含pGEX-4T-l-SEG重组表达质粒的工程菌液划氨苄青霉素筛选平板， 37"C静置培养16-20hr后挑取单菌落接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养基中， 37"C振摇培养6hr，作为种子液。将该种子液以1-5%的接种量接种于含氨苄青 霉素的2xYT培养基中，37'C振摇培养4hr，按0.01 %-0.1%的体积比加入 O.lmol/L IPTG诱导表达5 — 8hr。实施例6:重组GST-SEG融合蛋白的亲和层析样品预处理样品的预处理取由实施例5中经IPTG诱导的菌液于4°C， lOOOOr.p.m 离心，弃上清后收集沉淀。用原菌液1/10体积的PBS重悬沉淀，将混悬液置 FRENCH细胞破碎仪中，于700—900psi破碎，悬液呈粘稠状。后用超声破碎 仪继续超声破碎5-10min使核酸降解，菌体裂解液粘度降低。超声后向菌体裂 解液中加入甘油至终浓度为2%，振荡混匀，冰浴静置30min。静置后将菌体 裂解液于4X:， 12000r.p,m离心30min，取上清液低温保存待用。上清液取样 进行SDS-PAGE检观U，在分子量50kD处有明显的条带，此即为诱导表达的重 组GST-SEG融合蛋白。Quantity One图像分析软件显示融合蛋白条带大约占全 菌总蛋白含量的10-20%。经诱导后菌体裂解液蛋白电泳结果见附图5，图中泳 道l:蛋白质Marker，泳道2:经过诱导表达的菌体总蛋白。实施例7:重组GST-SEG融合蛋白的亲和层析取由实施例6中经预处理的GST-SEG融合蛋白溶液，经0.45pm膜过滤后 加入至预平衡的Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲和柱中，轻轻混匀，结 合30min后流尽液体。用PBS冲洗柱子3-5次，流尽液体。向柱中加入一定体 积的还原型谷胱甘肽洗脱液，轻轻混匀。充分反应20min后收集洗脱溶液，用 紫外分光光度计测蛋白浓度。重复上步的洗脱步骤直至蛋白浓度低于0.1mg/mL 停止收集。将收集的洗脱溶液组分用SDS—PAGE检验纯度与浓度，结果显示 初步纯化得到的GST-SEG融合蛋白分子量约50kD，电泳结果见附图6，图中 泳道l:蛋白质Marker,泳道2:经过亲和纯化后的GST-SEG融合蛋白溶液样 品，泳道3: GST-SEG融合蛋白经过凝血酶酶切后的GST和重组SEG蛋白混 合蛋白溶液样品，泳道4:经过阴离子层析纯化得到的重组SEG溶液样品，泳 道5:阴离子层析后再经凝胶层析得到的含高纯度重组SEG的溶液样品。实施例8:重组GST-SEG融合蛋白的酶切将上述由实施例10中经过亲和纯化获得的重组GST-SEG融合蛋白的收集 组分合并，脱盐除去溶液中的谷胱甘肽并将蛋白所在溶液置换成含0.05mol/L Tris， 1.5mol/LNaCl， 2.5mmol/LCaCl2 (pH7.4)的凝血酶缓冲溶液。每lmL蛋 白溶液加入20mg/mL凝血酶2pL， 25"C反应24h，取样电泳，检测酶切反应程 度。SDS-PAGE结果显示酶切反应基本完全，GST标签已与重组SEG分离， 酶切电泳结果见说明书附图6。实施例9:重组SEG的精制纯化将按实施例8中酶切得到的混合蛋白溶液(包括重组SEG、GST蛋白标签、 凝血酶以及其他少量杂质蛋白)脱盐置换成0.05mol/L Tris (pH8.52)缓冲溶液 后进行阴离子交换层析，离子交换填料选用Q Sephar0SeTMHP，待溶液中蛋白 与阴离子层析柱充分结合后，采用线性梯度洗脱方式，逐渐提高盐离子强度洗 脱，洗脱液为O.05mol/L Tris， lmol/L NaCl (pH8.52)，收集第一个洗脱峰， 即为较高纯度的重组SEG蛋白(纯度>95%)。将经离子层析得到的重组SEG 溶液组分浓縮，利用Sephacryl-200凝胶层析柱对重组SEG蛋白进行精制纯化， 流速0.75ml/min，收集紫外吸收最高峰对应溶液组分，即为高纯度重组SEG(纯 度>98%)。层析图谱见附图7、 8，图7中实线为紫外吸收值，虚线为电导值， 其中第一个洗脱峰即为重组SEG;图8中实线为紫外吸收值，该峰即为高纯度 的重组SEG。利用SDS-PAGE检测，显示重组金葡菌肠毒素G为约28kD位 置的单一条带，纯化结果见附图6。实施例10:高纯度重组SEG的保存将上述实施例9中获得的高纯度重组肠毒素G溶液置换成甲酸铵溶液后， 冷冻抽干，即制备成重组肠毒素G冻干粉，-20〔保存实施例lh重组SEG的跨膜测定建立单层Caco-2细胞跨膜转运模型，检测重组肠毒素G的跨膜效应。证 实了重组金葡菌肠毒素G可以以完整分子形式透过小肠上皮细胞进入人体血 液循环。 具体步骤取一定量实验室制备保存的高纯度重组SEG以及作为阴性对照的HRP(辣 根过氧化物酶)粉末，溶于HBSS，利用BCA蛋白质浓度测定试剂盒进行准确 定量，制备重组SEG以及HRP储备液。用HBSS按一定比例将两种储备液稀 释并混合均匀，使重组SEG和HRP终浓度分别为7.5吗/mL和10pg/mL,使 用前0.22pm滤膜过滤除菌。将Caco-2细胞培养于TmnswellTM小室中，培养18—25天，待分化充分后， 吸弃原有培养液，加入37'C预热的HBSS溶液，37°C ， 5%(:02条件下静置20min， 吸弃，再加入预热至37。C的HBSS溶液，37°C， 5%002条件下静置20min，吸 弃。将含重组SEG(7.5 pg/mL)和HRP(IO吗/mL)的混合蛋白溶液分别加入TranswelFM小室的顶侧(Apical， A侧)或者底侧(Basolateral， B侧)，其中 A侧加入500^L， B侧加入1.5 mL，相应侧加入HBSS溶液，其中A侧加入 500pL， B侧加入1.5 mL，于37 'C摇床低速振摇(35画55r.p.m)孵育6、 12、 18、 24hr后，根据混合蛋白溶液加入位置收集另一侧溶液，后利用BA-ELISA 以及显色法分别测定透过Caco-2单层细胞的重组SEG蛋白和HRP的含量。(1) BA画ELISA法测定SEG浓度 将96孔酶标板用小鼠抗SEG单抗包被过夜后，弃去包被液，用含IO %FCS的PBS 37 'C封闭2 hr。弃去封闭液，用PBS洗板后加入样品溶液以及重 组SEG系列浓度标准溶液，37。C孵育2hr。弃去上述液体，用PBS洗板后加 入抗SEG兔多克隆抗体，37'C孵育2hr。弃去多克隆抗体溶液，PBS洗板后 加入生物素化山羊抗兔IgG， 37 。C孵育0.5 hr。弃去生物素化山羊抗兔IgG溶 液，PBS洗板后加入HRP标链亲和素，37'C孵育0.5hr。弃去HRP标链亲和 素溶液，PBS洗板后加入现配ELISA显色液，37 'C孵育1 5 min后加入现配 中止液中止反应。用酶标仪读取OD45o值，根据重组SEG系列浓度标准曲线计 算样品中重组SEG含量，其中每个样品各三个复孔。(2) 显色法测定HRP浓度将样品溶液以及HRP系列浓度标准溶液加入96孔培养板中，加入TMB 作为显色底物，37 。C孵育1 5min后加入中止液中止反应，用酶标仪读取OD450 值，根据HRP系列浓度标准曲线计算样品中HRP浓度，其中每个样品各三个 复孔。实验结果显示，与阴性对照HRP相比，重组SEG的Caco-2细胞双侧转运 (A—B， B—A)效率均显著高于HRP，并且在24hr内转运的量随时间变化呈 现递增趋势。重组SEG的Caco-2单层细胞转运实验结果见附图9、 10。图9 中实线为重组SEG，虚线为阴性对照HRP，横标为时间，纵标为转运/透过 Caco-2单层细胞的重组SEG的质量。图10中实线为重组SEG，虚线为阴性对 照HRP，横标为时间，纵标为转运/透过Caco-2单层细胞的重组SEG的质量。实施例12:透过Caco-2单层细胞的重组金葡菌肠毒素G的完整性检测利用Western Blot法检测透过Caco-2单层细胞后的重组SEG蛋白的完整 性。取实施例11中的各时间点样品溶液，常规SDS-PAGE后转膜，将膜用含 10%无脂奶粉的PBS溶液封闭过夜。弃去封闭液，PBS洗膜后将膜置于兔抗 SEG多克隆抗体溶液中，于37-C缓慢振摇孵育2hr。弃去一抗溶液，PBS洗膜后将膜置于HRP酶标羊抗兔IgG溶液中，于37'C缓慢振摇孵育2hr。 PBS洗 膜后取Lumi-Light Western Blotting Substrate溶液1 、 2各0.5mL混匀，滴于 膜上，暗处放置2min，保鲜膜封膜，固定于暗盒内，压片，分别压20sec、 1 min和5min后，自动洗片机洗片。结果显示透过Caco-2单层细胞的重组SEG无论是从A侧到B侧还是从B 侧到A侧均能保持其完整性，即重组SEG蛋白可以以完整分子形式透过Caco-2 单层细胞，证实重组SEG蛋白可以以完整分子形式被人体小肠上皮细胞吸收 进入血液循环。WesternBlot实验结果见说明书附图11、 12。实施例13 : MTT法测定透过单层Caco-2细胞的重组肠毒素SEG的体外抑瘤 活性采用MTT法，以有丝分裂原ConA为阳性对照，观察跨膜后的重组金葡 菌肠毒素G对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用以及受其刺激增殖的小鼠脾淋巴细 胞对肿瘤细胞的杀伤作用，并与金黄色葡萄球菌肠毒素C2 (SEC2)标准品进 行比较。设调零孔(仅含培养基)、肿瘤细胞对照孔(培养基+肿瘤细胞)、淋巴 细胞本底释放孔[含空白孔(培养基+ICR小鼠脾淋巴细胞)、阴性对照孔(培 养基+ICR小鼠脾淋巴细胞+重组GST蛋白)、阳性对照孔(培养基+ICR小 鼠脾淋巴细胞+ConA)、SEC2标准品孑L(培养基+ICR小鼠脾淋巴细胞+ SEC2 标准品)和实验孔(培养基+ICR小鼠脾淋巴细胞+透过单层Caco-2细胞的重 组肠毒素SEG)]以及抑瘤作用孔[含空白孔(培养基+1。仗小鼠脾淋巴细胞+ 肿瘤细胞)、阴性对照孔(培养基+ICR小鼠脾淋巴细胞+肿瘤细胞+重组GST 蛋白)、阳性对照孔(培养基+ICR小鼠脾淋巴细胞+肿瘤细胞+ConA)、SEC2 标准品孔(培养基+ICR小鼠脾淋巴细胞+肿瘤细胞+ SEC2标准品)和实验孔 (培养基+ICR小鼠脾淋巴细胞+肿瘤细胞+透过单层Caco-2细胞的重组肠 毒素SEG)]，每种设三个复孔。其中，Con A终浓度为10pg/mL， GST终浓 度为10|ig/mL， SEC2标准品终浓度为100ng/mL，透过单层Caco-2细胞SEG 终浓度为90 150ng/mL (根据实际透过量)，本底释放孔中5xl(^个/mL ICR 小鼠脾淋巴细胞以100pL/孔加入，肿瘤作用孔中5xl(^个/mLICR小鼠脾淋巴 细胞和2.5xl()S个/mL耐阿霉素慢性髓原性白血病细胞(K562—AD)的混合悬 液以100pL/孔加入到实验孔中，透过单层Caco-2细胞SEG样品溶液50pL/孔 加入各孔，并小心吹打混匀。17铺板后44hr在待测孔中加入15pL/孔的MTT溶液，小心吹打混匀后，培 养箱中继续培养4hr后，小心吸除上清，按120pL/孔的加入DMSO，吹打助溶 后37-C培养箱中放置10min，酶标仪双波长法(570nm为测定波长，630nm为参考波长)测定各孔OD570nm-OD630nm值，以仅含培养基的调零孔调零。按下式 计算抑瘤率抑瘤率(％) =100-[(抑瘤作用孔-淋巴细胞本底释放孔)/肿瘤细胞对照孔]xl00，作图分析受透过Caco-2单层细胞的完整重组肠毒素SEG分子 激活的ICR小鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞生长的抑制作用，并用students检验做 统计分析。利用MTT法测定透过单层Caco-2单层细胞的完整重组肠毒素SEG体外 抑瘤活性结果显示，以ICR小鼠脾淋巴细胞为作用细胞，以K562-AD为靶细 胞，与抑瘤阴性对照孔相比，阳性对照Con A和透过Caco-2单层细胞的完整 分子形式的重组肠毒素SEG (90 150ng/mL)作用48hr后小鼠脾淋巴细胞抑 瘤率均有显著增高。按相同实验方案检测重组肠毒素SEC2标准品激活的ICR 小鼠脾淋巴细胞对K562-AD细胞的杀伤作用，经比较，由透过Caco-2单层细 胞的完整重组肠毒素SEG分子激活的ICR小鼠脾淋巴细胞对K562-AD细胞的 杀伤作用与重组肠毒素SEC2标准品激活的ICR小鼠脾淋巴细胞杀伤作用相 当。实验结果见说明书附图13、 14。图13、 14中与空白对照组相比***:尸<0.001; **: P<0.01。实施例14:市售金葡菌注射制剂成分分析将市售三种金葡素注射液利用超滤管超滤浓縮40倍后进行电泳。电泳完 毕后使用Colloidal Coomassie Blue染色液染色，根据凝胶上各样品中不同蛋白 条带颜色深浅以及位置将凝胶分割成若干部分，分别进行胶内酶切和肽段提 取。将提取获得的肽段用LC上样液(2%乙腈，0.5%甲酸)20UL溶解，振 荡数秒后10000r.p.m离心10min， 30。C水浴超声10min， 10000rpm离心10min， 取上清液进行LC/MS/MS分析。根据质谱分析结果，三种金葡菌注射制剂(高聚生、思复胜、恩格菲)中 共鉴定获得约250种来源于不同菌属蛋白质，其中约有100种金葡菌属蛋白， 包括了金葡菌肠毒素C2以及多种金葡菌属毒素蛋白以及致病因子，如a-溶血 素、Y-溶血素、杀白细胞素、自溶素、纤维连接素结合蛋白以及其他不同种 类的脂酶、肽酶、核酶等。上述各类蛋白以及金葡菌毒素蛋白结构功能明确， 不具备刺激、增强机体免疫系统的超抗原活性，而是多种临床疾病的直接致病 因子。如Dinges等指出，a-溶血素能引起皮肤坏死，引起血管收缩，造成局部缺血坏死，并最终可能导致肺水肿、呼吸窘迫综合征以及各器官的化脓性感染； Y -溶血素可引起炎症因子的产生，导致多种炎症反应(Martin M. Dinges W W. Exotoxins of (S鄉/^/ococcws m/re肌C7/w M/cro6z'o/ i ev. 2000; Vol. 13， No. 1:16-34)。 Iwatsuki等指出，杀白细胞素能引起皮肤以及皮下组织坏死，亦能引 起儿童以及青年坏死性月巿炎(Keiji Iwatsuki e, a/. Staphylococcal cutaneous infections: Invasion, evasion, and aggression. /Z)ermato/ 2006 Jun; Vol. 42, No. 3:203-214)。 Menzies指出，纤维连接素蛋白则是引起感染性心内膜炎的重要因 子(Menzies BE. The role of fibronectin binding proteins in the pathogenesis of S啤/^/ococcws awrews infections. Cwr (9/ /" Zfe. 2003 Jun; Vol. 16, No.3:225-229)。上述各种金葡菌致病因子的存在极有可能是导致现有三种市售金 葡素注射制剂在临床应用中产生多种副作用(发热、低血压、过敏、局部疼痛 等)的直接原因，因此在今后同类药物的开发、研制以及生产过程中必须严格 控制并尽量去除。三种针剂(高聚生、恩格菲、思复胜)中获得鉴定的金葡菌 属重要毒素蛋白见表l。其中首列为GenBank蛋白序列号，第二列为获得鉴定 的毒素蛋白质名称，第三列为蛋白质种属名称。表1金葡素注射制剂中获得鉴定的金葡菌属重要毒素蛋白蛋白序列号蛋白名称种 属gi|2914575Chain Q Alpha-Hemolysin[Staphylococcus aureus]gi|9931632serine protease-like exoprotein A[Staphylococcus aureus]gi|9931634serine protease-like exoprotein E[Staphylococcus aureus]gi|19879322lipase[Staphylococcus aureus]gi|21203559set26[Staphylococcus aureus subsp. aureus MW2]gi|21284073gamma画hemolysin component B[Staphylococcus aureus subsp. aureus MW2]gi|49483762putative peptidase[Staphylococcus aureus subsp. aureus MRSA252]gi|49484059serine protease[Staphylococcus aureus subsp. aureus MRSA252]gi|76009542enterotoxin C2 precursor[Staphylococcus aureus]gi|82750663Autolysin[Staphylococcus aureus RF122]gi|82752016gamma-hemolysin component C[Staphylococcus aureus RF122]gi|83681617fibronectin binding protein B[Staphylococcus aureus]gi|87160772V8 protease[Staphylococcus aureus subsp. aureus USA300]gi|87162036leukotoxin LukE[Staphylococcus aureus subsp. aureus USA300]gi|871621231 -phosphatidylinositol phosphodiesterase[Staphylococcus aureus subsp. aureus USA300]gi|90585272Sulfatass[Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9]gil卯585564Peptidase SI and S6， chymotrypsin/Hap[Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9]gi,85851Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase[Staphylococcus aureus subsp, aureus JH9]上述一系列实验证实，通过基因工程方法获得的高纯度重组金葡菌肠毒素SEG可以通过小肠上皮细胞吸收进入血液循环，同时，吸收后的重组肠毒素G 仍然保持其超抗原活性，可以刺激小鼠T淋巴细胞显著增殖，增殖的T淋巴细 胞对肿瘤细胞具有显著的杀伤作用。同时，与现有金葡素注射制剂相比，制备 获得的重组肠毒素G不含有各种金葡菌属毒素蛋白以及致病因子。综上所述， 本发明提供的重组肠毒素G可以用于口服抗肿瘤制剂的制备。本发明涉及的序列 <110>浙江大学<120>重组金黄色葡萄球菌肠毒素0 口服制剂及应用 <160>4<210> 1<211>705<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222> (1)…(705)<223>含部分凝血酶酶切位点序列的重组金黄色葡萄球菌肠毒素G <440> 1gga tcc caa ccc gat cct aaa tta gac gaa cta aat aaa gta agtGly Ser Gin Pro Asp Pro Lys Leu Asp Glu Leu Asn Lys Val Ser15 10 15 gat tat aaa aat aat aag gga act atg ggt aat gta atg aat cttAsp Tyr Lys Asn Asn Lys Gly Thr Met Gly Asn Val Met Asn Leu16 20 25 30 tat acg tct cca cct gtt gaa gga aga gga gtt att aat tct agaTyr Thr Ser Pro Pro Val Glu Gly Arg Gly Val lie Asn Ser Arg31 35 40 45cag ttt tta tct cat gat tta att ttt cca att gag tat aag agtGin Phe Leu Ser His Asp Leu lie Phe Pro lie Glu Tyr Lys Ser46 50 55 60tat aat gag gtt aaa act gaa tta gaa aat aca gaa tta get aacTyr Asn Glu Val Lys Thr Glu Leu Glu Asn Thr Glu Leu Ala Asn61 65 70 75aat tat aaa gat aaa aaa gta gac att ttt ggc gtt cca tat tttAsn Tyr Lys Asp Lys Lys Val Asp lie Phe Gly Val Pro Tyr Phe76 80 85 90tat aca tgt ata ata cct aaa tct gaa ccg gat ata aac caa aatTyr Thr Cys lie lie Pro Lys Ser Glu Pro Asp lie Asn Gin Asn91 95 100 105ttt gga ggt tgt tgt atg tat ggt ggt ctt aca ttt aat agt teaPhe Gly Gly Cys Cys Met Tyr Gly Gly Leu Thr Phe Asn Ser Ser106 110 115 120gaa aat gaa aga gat aaa tta att act gta cag gta aca ate gacGlu Asn Glu Arg Asp Lys Leu lie Thr Val Gin Val Thr lie Asp121 125 130 135aat aga caa tea ctt gga ttt aca ata act aca aat aag aat atgAsn Arg Gin Ser Leu Gly Phe Thr lie Thr Thr Asn Lys Asn Met136 140 145 1504590135180225270315360405450gtt act att cag gaa eta gat tac aaa gca aga cac tgg etc actVal Thr lie Gin Glu Leu Asp Tyr Lys Ala Arg His Trp Leu Thr151 155 160 165aaa gaa aaa aag eta tac gag ttt gat tgt tct gcg ttt gaa tctLys Glu Lys Lys Leu Tyr Glu Phe Asp Cys Ser Ala Phe Glu Ser166 170 175 180gga tat ata aaa ttt act gaa aag aac aat aca agt ttt tgg tttGly Tyr lie Lys Phe Thr Glu Lys Asn Asn Thr Ser Phe Trp Phe181 185 190 195gac tta ttt cct aaa aaa gaa eta gta cct ttt gtt cca tat aagAsp Leu Phe Pro Lys Lys Glu Leu Val Pro Phe Val Pro Tyr Lys196 200 205 210ttt tta aat att tac gga gat aat aaa gtt gtt gat tct aag agtPhe Leu Asn lie Tyr Gly Asp Asn Lys Val Val Asp Ser Lys Ser211 215 220 225att aaa atg gaa gta ttt ctt aat act cacHe Lys Met Glu Val Phe Leu Asn Thr His226 230 235495540585630675705<210>2<211>699<212>DNA<213>金黄色葡萄球菌(5top/j_y/。coccMS<220><221>CDS.<222> (1)…(699)<223>克隆所得金黄色葡萄球菌肠毒素G <440>2caa ccc gat cct aaa tta gac gaa eta aat aaa gta agt gat tat 45 Gin Pro Asp Pro Lys Leu Asp Glu Leu Asn Lys Val Ser Asp Tyr15 10 15aaa aat aat aag gga act atg ggt aat gta atg aat ctt tat acg 90 Lys Asn Asn Lys Gly Thr Met Gly Asn Val Met Asn Leu Tyr Thr16 20 25 30tct cca cct gtt gaa gga aga gga gtt att aat tct aga cag ttt 135 Ser Pro Pro Val Glu Gly Arg Gly Val He Asn Ser Arg Gin Phe 31 35 40 45tta tct cat gat tta att ttt cca att gag tat aag agt tat aat 180Leu Ser His Asp Leu lie Phe Pro lie Glu Tyr Lys Ser Tyr Asn 46 50 55 60gag gtt aaa act gaa tta gaa aat aca gaa tta get aac aat tat 225 Glu Val Lys Thr Glu Leu Glu Asn Thr Glu Leu Ala Asn Asn Tyr61 65 70 75aaa gat aaa aaa gta gac att ttt ggc gtt cca tat ttt tat acaLys Asp Lys Lys Val Asp He Phe Gly Val Pro Tyr Phe Tyr Thr76 80 85 90tgt ata ata cct aaa tct gaa ccg gat ata aac caa aat ttt ggaCys He lie Pro Lys Ser Glu Pro Asp lie Asn Gin Asn Phe Gly91 95 100 105ggt tgt tgt atg tat ggt ggt ctt aca ttt aat agt tea gaa aatGly Cys Cys Met Tyr Gly Gly Leu Thr Phe Asn Ser Ser Glu Asn106 110 115 120gaa aga gat aaa tta att act gta cag gta aca ate gac aat agaGlu Arg Asp Lys Leu lie Thr Val Gin Val Thr lie Asp Asn Arg121 125 130 135caa tea ctt gga ttt aca ata act aca aat aag aat atg gtt actGin Ser Leu Gly Phe Thr lie Thr Thr Asn Lys Asn Met Val Thr136 140 145 150att cag gaa cta gat tac aaa gca aga cac tgg etc act aaa gaalie Gin Glu Leu Asp Tyr Lys Ala Arg His Trp Leu Thr Lys Glu151 155 160 165aaa aag cta tac gag ttt gat tgt tct gcg ttt gaa tct gga tatLys Lys Leu Tyr Glu Phe Asp Cys Ser Ala Phe Glu Ser Gly Tyr166 170 175 180ata aaa ttt act gaa aag aac aat aca agt ttt tgg ttt gac ttalie Lys Phe Thr Glu Lys Asn Asn Thr Ser Phe Trp Phe Asp Leu181 185 190 195ttt cct aaa aaa gaa cta gta cct ttt gtt cca tat aag ttt ttaPhe Pro Lys Lys Glu Leu Val Pro Phe Val Pro Tyr Lys Phe Leu196 200 205 210aat att tac gga 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权利要求
1.一种重组金黄色葡萄球菌肠毒素G口服制剂，所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素G属于超抗原蛋白，其特征是SEQ ID NO.1是个重该组金黄色葡萄球菌肠毒素G的氨基酸序列，表达该重组金黄色葡萄球菌肠毒素G的是重组质粒pGEX-4T-1-SEG，该质粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列经过重组构建而成，该口服制剂还含有制剂允许的药物赋形剂或载体。
2. 根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素G口服制剂，其特 征是所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素G通过以下步骤获得(1) 设计分别带有B"mH I和^zo I酶切位点的用于克隆金黄色葡萄球菌 肠毒素G成熟肽序列的上下游引物SEQ ID NO.3: gta gga tcc caa ccc gat cct aaa tta gac，戈U线部分为5amH I 酶切位点，SEQ ID N0.4: gga etc gag tea gtg agt att aag aaa tac划线部分为J^o I酶切(2) 以金黄色葡萄球菌基因组为模板，采用PCR扩增获得编码金葡菌肠 毒素G蛋白成熟肽的基因片段，将其连入pGEM-T质粒载体上的多克隆位点， 构建pGEM-T-SEG重组质粒，通过测序证实具有SEQ ID NO.2的序列的基因 片段与GenBank数据库中的编码相同蛋白质的基因序列完全一致；(3) 以pGEM-T-SEG质粒为模板，PCR扩增获得两端带有酶切位点的编 码金葡菌肠毒素G蛋白成熟肽的基因序列，将上述基因片段用内切酶5amH I 和^2oI进行酶切后与用相同内切酶处理后的pGEX-4T-l质粒相连接，构建表 达质粒pGEX-4T-l-SEG;(4) 将pGEX-4T-l-SEG表达质粒转化至大肠杆菌BL21 ，诱导表达带GST 标签的重组GST-SEG融合蛋白，收获菌体并破碎后离心收集上清，依次采用 亲和层析、离子层析、凝胶层析获得重组金葡菌肠毒素G。
3. 根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素G口服制剂，其特 征是所述药物的给药方式选用口服给药、胃肠道给药或非胃肠道外给药。
4. 根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素G口服制剂，其特 征是该口服制剂含有的药物赋形剂或载体包括防止或抑制肠糜蛋白酶蛋白水 解活性的成分、防止或抑制肠胰蛋白酶蛋白水解活性的成分、防止或抑制胃蛋 白酶蛋白水解活性的成分、吸收促进剂和生物制品中可接受的组分和辅料。
5. 根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素G 口服制剂在制备 治疗恶性肿瘤以及其他严重并发症药物中的应用。
全文摘要
本发明提供重组金黄色葡萄球菌肠毒素G口服制剂，所述重组金黄色葡萄球菌肠毒素G具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列，该口服制剂还含有制剂允许的药物赋形剂或载体。本发明通过Caco-2单层细胞跨膜转运试验证实了该蛋白可以以完整分子的形式透过小肠上皮细胞进入全身血液循环并能保持其促脾淋巴细胞增殖以及抑制肿瘤细胞生长的超抗原活性，在制备治疗恶性肿瘤以及其他严重并发症药物中的应用。
文档编号A61P37/04GK101322842SQ20081006247
公开日2008年12月17日 申请日期2008年6月12日 优先权日2008年6月12日
发明者丁 丁, 陈枢青 申请人:浙江大学