专利名称：治疗脆性x综合症的药物靶点及其在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗脆性x综合症的药物耙点及其在制药中的应用，具体地说，中枢神经多
巴胺l型受体(Dl受体)功能降低和/或G-蛋白藕联受体激酶-2 (GRK2)活性异常增加可作 为治疗脆性X综合症的药物靶点，并可用于制备治疗脆性X综合症的药物。
背景技术：
脆性X综合症是最常见的遗传性智力低下症。其发病率约每2000个男性或4000个女性 中有一人发病，临床表现主要是智力低下(智商为40-60)。据保守估计，我国至少有40万 脆性X综合症病人。脆性X综合症是由FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1)基因的突 变而导致体内缺乏其所编码的产物FMRP蛋白质引起，体内缺乏FMRP最终导致智力低下，因 而FMRP被视为一种智力蛋白。蛋白质合成在突触可塑性特别是后阶段可塑性(late-phase LTP)形成中起非常重要的作用，FMRP是一种与核糖体相关的mRNA结合蛋白，参与mRNA的 聚集并调控耙基因的转录效率。长时程增强(LTP)被广泛认为是学习与记忆形成的细胞学基 础。研究表明，在脆性X综合症模型FMR1基因敲除小鼠海马CA1区域，可诱导正常LTP，但 长时程抑制(LTD)明显增强。有研究认为，代谢型谷氨酸l组受体(Gpl mGluR)由于失去 FMRP的抑制性调控，活性明显增加而导致LTD增强，增强的LTD导致突触发育减缓。因此， Gpl mGluR信号过度或异常可能是导致脆性X综合症的认知障碍、颠痫、发育迟缓以及突触 发育障碍的原因。然而，以此为药物作用靶点的研究尚处于起步阶段。到目前为止，治疗脆 性X综合症尚无有效药物，寻找高效特异性强的药物成为当今药界的迫切任务。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的有实际应用价值的治疗脆性X综合症的药物靶点，并将 其用于开发新型治疗脆性X综合症的药物。
本发明提供了一种治疗脆性X综合症的的药物靶点，该靶点为中枢神经多巴胺D1受体功 能降低和/或G-蛋白藕联受体激酶-2活性异常增加。
根据该靶点可开发治疗脆性X综合症的药物。该药物为中枢多巴胺Dl受体激动剂和/或 G-蛋白藕联受体激酶-2抑制剂，可以是小分子化合物、中药、植物药提取物、有效部位或有 效成分、核酸类如RNAi，多肽类或蛋白质类药物，可以单独使用或采用组合物形式包括联合 其他药物使用。
3本发明的中枢多巴胺Dl受体激动剂和G-蛋白藕联受体激酶-2抑制剂，可以各自单独使 用，也可以两类药物联合使用，均具有治疗脆性X综合症的作用。
本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药代动力学、药效动力学、给药模式、 给药途径，受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时间等，以适宜的 剂量给药。
本发明的有益效果是，利用中枢多巴胺Dl受体激动剂或G-蛋白藕联受体激酶-2抑制剂， 可有效地改善脆性X综合症动物的行为表现，显示出治疗脆性X综合症的应用价值。既进一 步阐明了脆性X综合症的发病机制，又为脆性X综合症的治疗提供了新的治疗靶点。
为了使本发明更加清晰明了，结合附图进一歩说明如下
图l FMR1基因敲除小鼠突触可塑性降低。图1A, 1B显示SKF81297激动D1受体后加强突 触长时程增强(LTP)的效应在FMR1基因敲除小鼠(图中均简写为尸/nri^—)消失。图1C, 1D显 示在培养的ACC神经元，采用SKF81297激动D1受体，比较谷胺酸AMPA GluRl受体细胞膜转运 水平和GluRl受体丝氨酸位点磷酸化水平，发现FMRl基因敲除小鼠神经元比正常小鼠神经元显 著降低。
图2腺苷酸环化酶活性降低。在培养的ACC神经元，SKF81297激动D1受体，引起腺苷酸 环化酶活性在正常动物细胞显著升高，但在FMR1基因敲除小鼠，腺苷酸环化酶活性和激活G as蛋白的能力在FMR1基因敲除小鼠降低。
图3细胞膜GRK2明显增加。在培养的ACC神经元，FMR1基因敲除小鼠细胞浆中的GRK2向 细胞膜异常转移。
图4纹状体神经元D1受体及GRK2表达情况。在培养的纹状体神经元，SKF81297激动D1受 体后，FMRl基因敲除小鼠神经元AC活性和激活Gas蛋白的能力比正常动物细胞显著下调，细 胞浆中的GRK2向细胞膜异常转移。
图5 D1受体激动剂与GRK2抑制剂的作用。在培养的ACC神经元，单独使用D1受体激动剂 SKF81297或GRK2抑制剂h印arin，或联合使用，均可使FMR1基因敲除小鼠细胞膜上磷酸化AMPA GluRl受体表达增加。
图6D1受体激动剂的治疗作用。在FMR1基因敲除小鼠，腹腔注射D1受体激动剂SKF81297 (lmg/kg)可以显著抑制FMR1基因敲除小鼠过度活动症状，而在正常小鼠，药物则对运动无 显著影响。
具体实施例方式
在下面的实施例中进一步说明本发明，这并不限制本发明的范围。
实施例l:以D1受体和GRK2为药物新靶点的研究
材料与方法
1. 实验动物
成年(6-8周)FMR1基因敲除小鼠和野生型正常对照鼠(FVB. 129P2-FmrltmlCgr种系) 购自美国Jacksen实验室。饲养于恒温、恒湿，12小时照明、自由饮水动物室内，颗粒饲料喂 养。所有实验程序符合第四军医大学动物使用与管理委员会规定。
2. 成年脑薄片全细胞膜片钳记录
小鼠采用1-2%异氟醚麻醉，振动切片机横向切取300umACC脑片，室温下置于混合气(95 %02和5XC02)饱和的人工脑脊液(ACSF)中，恢复lh后进行实验。ACSF组成(inraM): NaCl 124; NaHC03 25; KC1 2.5: KH2P04 1: CaCl2 2: MgS04 2; glucose 10。记录时脑片放置于记录小 池中，ACSF循环灌流，混合气饱和，室温下记录。全细胞兴奋性突触后电流(EPSC)及LTP 采用美国Axon200B放大器记录，药物从灌流液中加入。在诱导LTP时，ACSF灌流液中加入IOO picrotoxin用于阻断GABAA介导的抑制性传递。钳制电压-70mV，记录兴奋性突触后电流 (EPSC),强度为50-80pA,频率0.02Hz，记录10min基线后开始电刺激诱导。LTP诱导方法 刺激电极放置于ACC第V层，80次刺激，频率2Hz，同时神经元钳制于+30 mV,然后恢复到基 线记录模式，连续记录30min。
3. 原代神经元培养
出生后当天(P0)小鼠3-5只，冰面冷冻麻醉后取脑，分离出额叶(prefrontal cortex)， 切取ACC区域皮层，机械分散后用O. 125% trypsin (Invitrogen， CA)消化15min。细胞按 3-4X103 cells/cm2密度种植于多聚赖安酸处理的盖玻片上，使用Neurobasa1-A培养基，加 入B27和2 mM GlutaMax (Invitrogen, CA) 。 37° C于0)2孵箱中培养，每4天换液一次，2-3 周后进行实验。
4. Western印迹检测
培养的神经元或脑组织用Tris缓冲液裂解，Tris缓冲液组成为10mMTris-HC1, 2mMEDTA， 1% SDS， IX protease inhibitor, pH = 7.4。 Bradford法提取总蛋白，定量后各取蛋白提 取物调至相同浓度，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜转移后， 一抗结合l小时后， 洗涤3次，再与二抗标记l小时，然后ECL系统显色，X片曝光。
5. 行为学实验
依据传统研究方法，采用小鼠自发活动仪检测小鼠旷场自主活动行为。开场活动实验装
5置为开放的活动盒(43.2 x 43.2 x 30.5 cm: MED-associates, St. Albans, VT)，小鼠腹腔 给药后45分钟，逐个放于实验装置中，摄相自动记录每个小鼠30分钟内活动距离，计算机自 动分析。 结果
1. FMRl基因敲除小鼠ACC区域LTP和细胞膜GluRl受体
脑薄片膜片钳检测扣带回皮层LTP发现，在正常动物，SKF81297激动D1受体后明显加强 突触长时程增强(LTP)的效应，而在FMR1基因敲除小鼠，激动D1受体则无明显LTP出现(附 图1A， 1B);在培养的ACC神经元，采用SKF81297激动多巴胺D1型受体(Dl受体)，比较谷胺 酸AMPAGluRl受体细胞膜转运水平(附图1C)和GluRl受体丝氨酸位点磷酸化水平(附图1D), 发现FMR1基因敲除小鼠神经元比正常小鼠神经元显著降低。目前认为，GluRl受体丝氨酸位点 磷酸化水平和膜转运的高低间接反应突触可塑性(如LTP)的能力，而LTP被认为是最重要大 脑学习和记忆的细胞学机制之一。
2. FMR1基因敲除小鼠ACC区域腺苷酸环化酶(AC)活性
D1受体为G-蛋白耦联受体，SKF81297激动D1受体后，腺苷酸环化酶(AC)活性在正常动 物细胞显著升高，但在FMR1基因敲除小鼠，AC活性则升高不显著(附图2A);进一步实验发 现，主要是由于Dl受体激活Gds蛋白的能力在FMRl基因敲除小鼠降低(附图2B)。因此，Dl 受体激活AC能力的在FMR1基因敲除小鼠降低。
3. GRK2在ACC的表达
G-蛋白藕联受体激酶-2 (GRK2)存在于细胞浆中，其向细胞膜转移后可引起D1受体磷酸 化，从而调节D1受体功能。实验发现，FMR1基因敲除小鼠和正常小鼠细胞内GRK2蛋白总量无 显著差异(附图3A)。但由于缺乏FMRP蛋白的抑制作用，GRK2活性出现异常，表现为细胞浆 中的GRK2向细胞膜异常转移(附图3B)。细胞膜上过多GRK2的导致D1受体过度磷酸化，从而 引起FMR1基因敲除小鼠D1受体功能异常。
4. 腺苷酸环化酶(AC)与GRK2在纹状体的表达
在脑内另一个与多巴胺受体功能相关的重要区域纹状体内，实验发现相似的变化，即 SKF81297激动D1受体后，FMR1基因敲除小鼠神经元AC活性比正常动物细胞显著下调(附图4A)。 SKF81297激动D1受体后，激活Ga s蛋白的能力在FMR1基因敲除小鼠显著降低(附图4B)。此 外，FMR1基因敲除小鼠纹状体神经细胞浆中的GRK2向细胞膜异常转移(附图4C)。细胞膜上 过多GRK2的导致D1受体过度磷酸化，引起D1受体功能异常，可能是脆性X综合症动物运动异常 的原因。
5. 药理学研究结果针对上述病理学研究的发现，采用药理学手段，有针对性的设计具有治疗作用的药物， 通过调节异常改变的细胞信号转导过程，达到药物治疗的目的。首先，在离体细胞模型上， 单独使用Dl受体激动剂SKF81297或联合GRK2抑制剂h印arin作用于培养的FMRl基因敲除小鼠 神经元，均一定程度的改善D1受体功能，使细胞膜上磷酸化AMPA GluRl受体表达增加(附图 5A),细胞膜上GluRl受体总蛋白表达也增加(附图5B)。细胞膜上AMPAGluRl受体表达增加， 是LTP表达的关键步骤，提示对学习与记忆能力具有改善作用。
6.小鼠行为学实验结果
最后，在FMR1基因敲除小鼠整体水平，观察药物是否可以治疗FMR1基因敲除小鼠过度活 动的症状(附图6)。实验发现，在小鼠腹腔同时注射D1受体激动剂SKF81297 (lmg/kg)和GRK2 抑制剂h印arin (lmg/kg),可以显著抑制FMR1基因敲除小鼠过度活动症状，可见小鼠在不同 时间内总运动距离明显减少，而在正常小鼠，药物则对运动无显著影响。
结论
采用转基因动物实验研究发现，中枢神经多巴胺D1受体功能异常和GRK2异常激活可能是 脆性X综合症病理机制之一；行为学研究发现，联合使用D1受体激动剂和GRK2阻断剂，可以改 善脆性X综合症的临床表现。
实施例2:以D1受体为药物新靶点的研究
研究方法同实施例1。小鼠行为学研究选择Dl受体激动剂SKF81297腹腔注射。
结果小鼠腹腔注射D1受体激动剂SKF81297 (lmg/kg)可以显著抑制FMR1基因敲除小
鼠过度活动症状，可见小鼠在不同时间内总运动距离明显减少，而对正常小鼠运动无显著影响。
结论行为学研究发现，采用D1受体激动剂，可以改善脆性X综合症的临床表现。
实施例3:以GRK2为药物新耙点的研究
研究方法同实施例1 。小鼠行为学研究选择GRK2抑制剂h印arin腹腔注射。
结果小鼠腹腔注射GRK2抑制剂h印arin (lmg/kg)可以显著抑制FMR1基因敲除小鼠
过度活动症状，可见小鼠在不同时间内总运动距离明显减少，而对正常小鼠运动无显著影响。 结论行为学研究发现，阻断神经细胞内异常的GRK2活性，可以改善脆性X综合症的临
床表现。
权利要求
1.中枢神经多巴胺1型受体与G-蛋白藕联受体激酶-2是治疗脆性X综合症的的药物新靶点，用于治疗脆性X综合症。
2. 根据权利要求书l所述，治疗脆性X综合症的药物为多巴胺1型受体激动剂 和G-蛋白藕联受体激酶-2抑制剂。
3. 根据权利要求书2所述的中枢多巴胺1型受体激动剂，可以是小分子化合物、 中药、植物药提取物、有效部位或有效成分、核酸类如RNAi、多肽类或蛋白质 类药物。
4. 根据权利要求书2所述的G-蛋白藕联受体激酶-2抑制剂，可以是小分子化合 物、中药、植物药提取物、有效部位或有效成分、核酸类如RNAi、多肽类或蛋 白质类药物。
5. 根据权利要求书2所述的中枢多巴胺1型受体激动剂和G-蛋白藕联受体激酶 -2抑制剂，可以单独使用，也可以两类药物联合使用。
全文摘要
本发明涉及治疗脆性X综合症的新药靶点及其在制药中的应用。本研究发现，脆性X综合症模型动物FMR1基因敲除小鼠中枢神经多巴胺1型受体(D1R)功能降低，同时发现G-蛋白耦联受体激酶-2(GRK2)分布异常，GRK2在细胞膜上表达增加，细胞浆中GRK2减少。这些病理变化参与了脆性X综合症的发病过程。采用药理学方法，单独使用或联合腹腔注射D1R受体激动剂和GRK2抑制剂，可显著改善脆性X综合症模型动物的行为学症状。本发明为治疗脆性X综合症提供新的药物靶点，可根据该靶点开发新的治疗药物，开发的新药物既可单独使用，也可联合使用。
文档编号A61K45/06GK101618214SQ200810150238
公开日2010年1月6日 申请日期2008年7月3日 优先权日2008年7月3日
发明者敏 卓, 招明高 申请人:中国人民解放军第四军医大学