一种淫羊藿多糖的硫酸化分子修饰方法

专利名称：：一种淫羊藿多糖的硫酸化分子修饰方法
技术领域：
：本发明一种淫羊藿多糖的硫酸化分子分子修饰方法，属于中药多糖的结构改造
技术领域：
。二
背景技术：
：多糖是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的生物大分子物质，具有抵抗感染、增强免疫、防治肿瘤和病毒性肝炎、类风湿症、艾滋病等免疫损伤或免疫缺损症和抗氧化等多方面的功能和生物活性。随着化学和生物学的快速发展和分离技术的提高，多糖的生物学功能，特别是作为生命物质参与生命的全部时间和空间功能，突破了多糖作为支持组织和能量来源的传统观念，发现其具有更广泛的生物学功效，特别是具有免疫增强、抗病毒等功效使得多糖物质成为人类及动植物医疗、保健、病虫害防治领域的重要成员。多糖的研究己成为天然药物研究和生命科学研究的热点之一。在对多糖的结构及其活性的研究中，科技人员注意到以下问题①自然界中存在的多糖并不都具有活性。②有些多糖由于结构或理化性质等障碍而不利于其生物学活性的发挥。③也有些多糖尽管药效良好，但同时也会产生一些不良反应，甚至毒副作用。④有些从天然生物体内分离的多糖活性较弱，有待进一步提高。因此，采取一定的方法对多糖结构进行适当修饰是解决以上问题的根本途径，通过结构修饰能提高或赋予多糖活性、降低某些多糖的毒副作用。淫羊藿是补肾壮阳中药，其有效成分淫羊藿多糖具有显著的免疫增强作用。本研究室前期应用淫羊藿和蜂胶研制成功淫羊藿一蜂胶免疫佐剂。为进一步提高淫羊藿一蜂胶免疫佐剂的功效，本发明首次对淫羊藿多糖进行分子修饰，发现硫酸化修饰能进一步淫羊藿多糖的活性；以筛选出硫酸化淫羊藿多糖替代淫羊藿-蜂胶佐剂中的淫羊藿后，佐剂的增强免疫效果进一步增强，而且呈现较好的抗病毒作用。三
发明内容技术问题本发明针对中药多糖生物活性低的问题，提供一种淫羊藿多糖的硫酸化分子修饰方法，达到进一步提高淫羊藿多糖的生物活性的目的。技术方案一种淫羊藿多糖的硫酸化分子修饰方法，其特征在于，提取淫羊藿多糖，用氯磺酸一吡啶法进行硫酸化分子修饰，修饰条件为反应温度80°C、氯磺酸与吡啶的配比1:8、反应时间lh。有益效果1.建立了淫羊藿多糖的硫酸化分子修饰方法，用正交实验优化了淫羊藿多糖硫酸化分子修饰的条件。2.通过系列比较证明，硫酸化分子修饰能进一步提高淫羊藿多糖的增强免疫和抗病毒活性。3.筛选出活性最好5号硫酸化淫羊藿多糖，确定其最佳修饰条件为反应温度80°C、氯磺酸与吡啶的配比1:8、反应时间lh。4.以筛选出的硫酸化淫羊藿多糖sEPS5替代淫羊藿-蜂胶佐剂中的淫羊藿后，佐剂的增强免疫效果进一步增强，而且呈现较好的抗病毒作用。与现有技术相比，本发明优点如下1.首次建立了淫羊藿多糖的硫酸化分子修饰方法，优化了淫羊藿多糖硫酸化分子修饰的条件。2.首次证明硫酸化分子修饰能进一步提高淫羊藿多糖的增强免疫和抗病毒活性，筛选出活性最好硫酸化淫羊藿多糖。3.以筛选出的硫酸化淫羊藿多糖替代淫羊藿-蜂胶佐剂中的淫羊藿，进一步提高了淫羊藿-蜂胶佐剂的增强免疫效果。具体实施例方式1.淫羊藿多糖的提取和纯化取淫羊藿2kg加8倍水武火煮沸，文火维持1h，煎煮2次，合并滤液浓縮至2000mL;室温缓慢加乙醇至70%，搅匀，静置沉淀24h;取沉淀挥去乙醇，加蒸馏水2000mL重溶，静置24h;取上清加乙醇至70%，搅匀，静置24h;取沉淀挥去乙醇，冷冻干燥，得粗淫羊藿多糖。2.淫羊藿多糖的纯化(1)三氯乙酸法去蛋白将淫羊藿多糖用蒸馏水配成10%的溶液，缓慢加入10%的三氯乙酸溶液，边加边摇动，直至三氯乙酸占总体积的0.3%，充分摇匀后静置4h，离心，过滤除去沉淀，用10X氢氧化钠溶液调节糖溶液pH达5.5。(2)ADS-7大孔树酯过滤湿法装ADS-7大孔树酯柱，取上一步pH5.5糖溶液50mL—次性缓慢加入树脂柱上层，用蒸馏水按0.28mlrmin—i的速度洗脱。收集洗脱液，5mL/管，每隔10管测定糖含量，绘制多糖洗脱曲线图，按峰合并含糖管洗脱液，60。C减压浓缩至50mL。(3)DEAESephadexTMA-25氯化钠密度层析分离湿法装制DEAESephadexTMA-25层析柱，取上一步糖溶液50mL—次上样，用0.05mol.tnl/1和1.0mol'mU1氯化钠溶液各2000mL线性梯度洗脱，速度为0.42mL，min—、1收集洗脱液，OmL/管，每隔10管测定糖含量，绘制多糖洗脱曲线图，按峰合并含糖管洗脱液。装入透析袋先用自来水流水透析48h，而后用蒸馏水透析24h，冷冻干燥，得纯淫羊藿多糖。3.淫羊藿多糖的硫酸化修饰(1)修饰条件优化由于反应温度、试剂配比、反应时间是多糖硫酸酯化的主要影响因素，在预实验的基础上，以修饰的反应温度(A)、氯磺酸与吡啶体积比(B)和反应时间(C)为因素，按3因素3水平的正交试验L"3,设计9种修饰条件(表1)。表1L9(3,正交试验设计因素水平表因素A(。C)BC(h)1601:612801:823951:103(2)酯化试剂制备将带有搅拌和冷凝装置的三颈烧瓶置冰盐水浴中，加入25mL无水吡啶，快速搅拌，充分冷却后，按表10设定的氯磺酸-妣啶体积比逐滴加入氯磺酸，于40min内加完。反应结束后，撤去冰盐水浴。分别制备9种酯化试剂。(3)修饰操作精密称取纯化的淫羊藿多糖500mg加入装有酯化试剂的三颈烧瓶中，按表2设定的水浴温度和反应时间分别搅拌反应。反应结束后冷却至室温，反应液加入预冷的100mL冰水中，用15X氢氧化钠溶液中和pH至7.0。边摇边缓慢加入3倍体积的无水乙醇，静置24h。离心取沉淀，装入透析袋自来水流水透析48h，蒸馏水透析24h。冷冻干燥，得9种硫酸化淫羊藿多糖(sulfatedEPS，sEPS)，依次编号为sEPS卜sEPS2、sEPS3、sEPS4、sEPS5、sEPS6、sEPS7、sEPSs和sEPS9。以硫酸基取代度和糖含量为指标，采用L9(3,正交设计对反应温度、试剂配比和反应时间等修饰条件进行优选。结果，反应温度的R值最大，分别为0.596和21.817，对DS和糖含量的影响均最大；2个K2值最高(0.767和50.122)，80'C为最佳反应温度。对DS的影响，反应时间次之(0.361)、氯磺酸与吡啶的配比最小(0.274)。对糖含量的影响，氯磺酸与吡啶的配比次之(19.915)，反应时间最小(9.621)(表2)。表21_9(34)正交试验及统计结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4.硫酸化淫羊藿多糖的生物活性比较(1)硫酸化淫羊藿多糖对IBDV感染细胞能力的影响首先测定9种硫酸化淫羊藿多糖(sEPSs)，sEPSi、sEPS2、sEPS3、sEPS4、sEPS5、sEPS6、sEPS7、sEPSs和sEPS9，和未修饰的淫羊藿多糖(EPS)对鸡胚成纤维细胞(CEF)最大安全浓度，在此基础上用MTT法比较了9种sEPSs对CEF抵抗鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)感染的影响，以未修饰的EPS为对照。结果，未修饰的EPS在各浓度的^57o值与病毒对照组均无显著差异(P>0.05)。修饰后的sEPSs在250125吗'mU1范围内，除sEPSg外其余8种sEPS组的爿570值均显著大于病毒对照组(户<0.05);在62.5吗nnl/1时sEPS!、sEPS2、sEPS4、sEPS5和sEPS6组、在31.25吗nnL"时sEPS2、sEPS4、sEPSs和sEPSs组的爿57。值显著大于病毒对照组(尸<0.05)。表明，修饰后的sEPSs较未修饰的EPS对CEF抵抗IBDV感染的作用显著增强，以sEPSs和sEPS2的效果较好(表3)。表3硫酸化淫羊藿多糖对IBDV感染细胞能力的影响(47。值)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注同列数据标注不同字母者差异显著(尸<0.05)。(3)硫酸化淫羊藿多糖对鸡脾淋巴细胞增殖的影响首先将9种sEPSs和未修饰的EPS分5个浓度，分别单独或与ConA加入到培养的鸡脾脏淋巴细胞中，培养48h后，用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化，筛选出sEPS2、sEPS5;然后将sEPS2、SEPS5和EPS分别单独或与PHA加入到培养的鸡外周血淋巴细胞中，培养48h后，同法测定淋巴细胞增殖的变化。结果，sEPS2和sEPSs组的细胞增值率多显著大于EPS组(尸O.05);高于31.25吗'mL"时，sEPS2组显著大于sEPSs组(PO.05);在7.81ug'mL—'时，sEPS5组显著大于sEPS2组(尸<0.05)。表明，修饰多糖促进淋巴细胞增殖的效果显著强于未修饰多糖，高浓度时sEPS2、低浓度时sEPSs的作用最强(表4)。表43种多糖对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响(A7o值)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>注同列数据标注不同小写字母者、同行数据标注不同大写字母者差异显著(户<0.05)。(4)硫酸化淫羊藿多糖对鸡NDV-IV疫苗免疫应答的影响将SEPS5、sEPS2和EPS分为高、低两个剂量注射14日龄雏鸡，连续3d，在末次注射的同时用NDV-IV系苗免疫，同时设无佐剂组和空白非免疫组，分别于免疫后第7、14、21、28d采血，分别用微量法和MTT法测定血清ND-HI抗体效价和外周血T淋巴细胞增殖的动态变化。结果，sEPS5和sEPS2能显著加快血清抗体产生、提高血清抗体效价和促进外周血T淋巴细胞增殖，在多数时间点的效果显著优于未修饰的EPS，以sEPSs的效果最好(表5、6)。表5各组血清ND-HI抗体效价的动态变化(log2，n=30)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>注同列数据标注不同字母者差异显著(P<0.05)，以下表同。表6各组外周血T淋巴细胞增殖的动态变化(A570值，n=30)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(5)硫酸化淫羊藿多糖对雏鸡抗NDV感染的影响用新城疫强毒对49日龄试验鸡进行人工感染，然后用sEPS5、sEP&和EPS分高、低两个剂量(1.0mg/羽和0.5mg/羽)治疗，每天1次，连续3d，对照组注射生理盐水。记录各组发病状况，出现死亡时间，统计各组的发病率、死亡率和痊愈率。结果，sEPSs高剂量组的疗效最好，死亡率最低(40%)、痊愈率最高(35%)，其次为sEPS2高剂量组。表明硫酸化修饰可以提高EPS的抗NDV活性，并有一定的量效关系(表7)。表7各组治疗效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(6)硫酸化淫羊藿多糖对鸡外周血淋巴细胞IL-2和IFN-Y的mRNA表达的影响用PrimerPremier软件设计了一对白介素-2(interleukin-2，IL-2)引物和一对干扰素-y(interferon-y，IFN-y)引物，用荧光定量PCR方法测定sEPSz和sEPS5对鸡外周血T淋巴细胞IL-2、IFN-y的mRNA表达的影响，以未修饰的EPS为对照。结果，在62.5和31.25!igmL—1时，sEPSs和sEPS2对两种细胞因子的诱生作用显著强于未修饰的EPS，sEPSs作用最强，sEPS2次之，并与剂量呈正相关(表8)。表8IL-2的mRNA表达的影响多糖浓度(ng'ml/1)翻-----------------—------------------------------------_12562.531.25sEPS50,193±0.010asEPS20.178±0.028aEPS0.165±0.026a_^_0.083±0.022b(7)硫酸化淫羊藿多糖提高淫蜂佐剂效果的测定分别用sEPSs和EPS替代淫蜂佐剂(EPA)中的淫羊藿组成2个新方，作为佐剂配合新城疫IV系(NDV-IV)弱毒苗免疫14日龄雏鸡，以原方EPA及其相关单味药(sEPSs、EPS)为对照。分别在免疫后第5、10、15和20d采血，用微量法测定血清ND-HI抗体效价；在免疫后第21d用NDV强毒株攻毒，统计发病率、死亡率和保护率；并于攻毒后第3、6、9d测定各组的ND-HI抗体效价。结果，sEPS5替代方组雏鸡抗体产生的速度最快，效价最高，攻毒保护率最高(87.5%)、死亡率最低(5%),均明显优于EPA组(75%,10%)。表明硫酸化淫羊藿多糖可提高淫蜂佐剂的效果，sEPSs替代方可以作为EPA的改进方(表9、10)。表9血清ND-HI抗体效价的动态变化(1og2)组别GroupD5D10D15D20sEPSs替代方5.3±0.03a7.3±0.52a7.2±0.41a7.6±0.54aEPS替代方5.2±0.86ab6.3±0.42ab7.3±0.52a7.3±0.50aEPA4.0±0.26abc5.8±0.41abe6.2±0.82bc6.8±0.61absEPS54.5±0.05abe6,0±0.37abc6.7±0.52ab7.0±0.48abEPS4.5±0.55abe6.2±0.87abe6.3±0.75be7.2±0.60ab生理盐水对照3.5±0.55cd4.4±0.42cd5.2±0.40e5.7±0.82b空白对照2.3±0.21d2.7±0.61e2.7±0.50d3.5±0.43e表10各组对NDV攻毒保护效力组别数量(羽)发病率(％)死亡率(％)保护率(％)sEPSs替代方40EPS替代方400.155±0.013a0.163±0.028a0.125土0.017'0.083士0.022'0.135±0.013a0.130±0.008ab0.108±0.017b0.083±0.022c12.520.05.0b87.5a80.0',abEPA4025.010.0D75.0acsEPS54020.07.5b80.0abEPS4027.510.0b72.5ab生理盐水对照4052.517.5b47.5e空白对照40100100a系列研究测试结果见表29。综合评价以sEPS5的活性最强，确定其最佳修饰条件为反应温度80°C,氯磺酸与吡啶的配比1:8、、反应时间lh。权利要求1.一种淫羊藿多糖的硫酸化分子修饰方法，其特征在于，提取淫羊藿多糖，用氯磺酸—吡啶法进行硫酸化分子修饰，修饰条件为反应温度80℃、氯磺酸与吡啶的配比1:8、反应时间1h。全文摘要本发明为一种淫羊藿多糖的硫酸化修饰方法，属于中药多糖的结构改造
技术领域：
。提取、纯化淫羊藿多糖，用氯磺酸-吡啶法进行硫酸化分子修饰，以反应温度、试剂配比和反应时间3因素按L₉(3⁴)正交实验设定9种修饰条件，分别修饰得到9种硫酸化淫羊藿多糖。系统比较9种硫酸化淫羊藿多糖的增强免疫和抗病毒活性，确定最佳修饰条件为反应温度80℃、氯磺酸与吡啶的配比1∶8、反应时间1h，所得硫酸化淫羊藿多糖的糖含量最高、活性最强。本发明能显著提高淫羊藿多糖的增强免疫和抗病毒活性。文档编号A61P37/04GK101367882SQ200810156179公开日2009年2月18日申请日期2008年9月24日优先权日2008年9月24日发明者刘家国,宇卢,张宝康,王德云,胡元亮申请人:南京农业大学