专利名称：：瘢痕生成中的新型活性物质和其用途的制作方法瘢痕生成中的新型活性物质和其用途本发明的目的基本上是作为2-甲基-2-[(l-氧代-2-丙烯基)氨基]-l-丙磺酸盐和2-羟乙基丙烯酸酯的共聚物的化合物的用途。更具体而言，本发明涉及这种化合物作为促进和/或加速成纤维细胞增殖和/或分化的试剂的用途，尤其是制备用于促进愈合的组合物的用途，或者是制备体外用于产生皮肤移植用细胞的组合物的用途。本发明还涉及用于处理伤口的单独含有这种化合物或与其他活性物质组合的敷料。已知的是，开放性伤口代表绝大多数伤口，包括烧伤、溃疡、神经性溃疡、静脉或动脉溃疡、糖尿病溃疡、褥疮、水泡、渗出性伤口、表面真皮表皮损伤，可以是慢性或急性的。处理伤口的主要目标之一是使伤口闭合，不论其性质或来源如何。此外，众所周知的是，伤口愈合是一种自然的生物现象，人类和动物组织通过修复和再生过程能够修复局部损伤。通常，伤口愈合发生在三个阶段清洁阶段、肉芽生长阶段和上皮化阶段，这些中的每一个阶段都以根据精确的时间顺序使修复过程进展的特异性细胞活性为特征。清洁阶段的特征在于早期炎症现象的出现。紧接着创伤之后，开始源于血液和淋巴管的分泌。通过纤维蛋白的相关形成而释放的凝血酶原激酶的激活诱发凝集。约10分钟后，开始渗出，它将提供对感染的防御并清洁伤口。约4天后，损伤开始增殖阶段。有机体开始用新组织代替损失的物质。为此，成纤维细胞首先产生将作为结缔组织的胶原纤维发展基质的粘多糖。平均在第6天至第IO天之间，发生分化阶段。开始胶原纤维成熟。伤口在特定细胞(肌成纤维细胞)的影响下收縮。肉芽组织逐渐变得缺水并含有越来越少的血管，从而变得坚固。然后，转换成疤痕组织，反过来这也将促进疤痕收縮。在被称为肉芽生长阶段的第二愈合阶段过程中，成纤维细胞将发挥重要作用。肉芽生长阶段持续约3周，并且在正常愈合过程中，上皮化也在进行。成纤维细胞和角质前体细胞一样从伤口边缘、从毛囊和从汗腺开始在伤口中繁殖。3天后，成纤维细胞产生胶原蛋白，其纤维根据受到的力取向。其增殖受若干因素控制。通常，当肉芽组织已经代替了损失的物质时并且当成纤维细胞增殖已经上升到了边缘的水平时，这种增殖中断。成纤维细胞是愈合过程中的主要试剂之一。事实上，大约在第6天时，伤口中存在的超过一半的成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。这些细胞的特征在于，在细胞质中存在造成伤口收縮并因而使伤口表面积减小和加速其闭合的收縮性肌原纤维。因此，这些细胞在伤口收縮中发挥重要作用，而伤口收縮是空腔伤口自发闭合的主要现象。超过40%的肌成纤维细胞(含有收縮蛋白、a平滑肌肌动蛋白)存在于肉芽组织中。当伤口愈合时，这些细胞死亡，尽管触发它们消失的信号还不能完全理解。成纤维细胞也是增殖阶段的关键细胞。成纤维细胞分泌胶原蛋白型III，然后分泌胶原蛋白型I和硫酸乙酰肝素，它们是真皮细胞外基质的基本成分，而且还分泌透明质酸、硫酸软骨素、纤连蛋白和胶原酶，从而导致伤口闭合。在某些情况下，愈合过程(即使对于小伤口或开口)可以持续几小时、几天或几周，甚至更长，如在溃疡的情况下，伤口可能持续存在更长的时间，例如数月或数年。在愈合期间，不论持续短期或很长时间，伤口可能受到任何类型的入侵(病原微生物或外来物质)，直到新的组织再生使开口完全闭合。为了防止感染，伤口通常被处理，以除去能够在受损区域引入致病物质的任何污染物(灰尘、碎屑等)。随后进行在该区域的组织清创和消毒。在某些情况下，还插入一定数量的缝合线，以促进伤口闭合。一旦已经进行了这些步骤，伤口保持在有利于愈合的环境中。为此，使用各种类型的敷料，以防止病原体入侵和/或其增殖。因此，在处理伤口时，重要的是促进伤口-闭合现象，以防止例如微生物或外来物质入侵伤口，并因此防止伤口感染。结果，必须具有诱发或促进伤口愈合过程的手段。为了诱发或加速伤口愈合，可以给予一定数量的活性剂。这些活性剂可在各种水平下和在愈合的各个阶段起作用。活性剂根据将要处理的阶段和伤口的类型不同而不同。这些活性剂例如可以是成纤维细胞和/或角质细胞生长因子(如碱性成纤维细胞生长因子)或伪生长因子(如甘露糖-6-磷酸)、粘多糖(如透明质酸、胶原蛋白等)、激素(如雌二醇、DHEA等)、多糖(如右旋糖酐)等等。己经发现，完全令人惊讶和出乎意料的是，通过使用作为2-甲基-2-[(1-氧代-2-丙烯基)氨基]-1-丙磺酸的盐和2-羟乙基丙烯酸酯的共聚物的化合物也可以促进和/或加速成纤维细胞增殖和/或分化，并因此促进愈合。优选地，上述2-甲基-2-[(l-氧代-2-丙烯基)氨基]-l-丙磺酸盐是钠这种共聚物由于其乳化-稳定性能和良好的增稠能力而本身是已知的产品，特别是在化妆品领域。这种产品例如由公司SEPPIC以商品名SepinovEMTl(f出售。因此，根据第一方面，本发明的目的是2-甲基-2-[(l-氧代-2-丙烯基)氨基]-l-丙磺酸的盐和2-羟乙基丙烯酸酯的共聚物制备用于体内或体外促进和/或加速成纤维细胞增殖的组合物的用途，尤其是制备用于促进愈合的组合物的用途。上述共聚物可以体内或体外使用。作为体外应用的例子，可以提到该化合物制备用于促进成纤维细胞增殖的培养基的用途。可以证明这种用途对于自体真皮或真皮表皮片移植是有用的。这是因为，在这种移植类型中，使用细胞培养技术是为了从患者本身采集的小样本获取足够的皮肤表面积。根据本发明的共聚物的用途使得可以加速成纤维细胞增殖，并因此可以证明在这种类型的治疗中是有用的。在体内应用时，上述共聚物可以用于制备允许直接施用在伤口和周围区域或粘膜上的组合物，有利地是通过局部施用。优选地，这种共聚物被整合到敷料中。一般地，上述共聚物可以单独使用或与能够诱发或加速愈合或在伤口处理中可以具有有利作用的其他活性物质组合使用，例如抗菌剂或止痛剂。活性剂的这种组合能够实现对伤口的组合治疗。在本发明可以使用的活性物质中，例如可以提到杀菌剂或抑菌剂(氯胺、氯己定、银盐、锌盐、甲硝唑、青霉素等)、促进愈合的试剂(激素、多肽等)、促进伤口清洁的酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶等)、蛋白酶或金属蛋白酶抑制剂、止痛药或局部麻醉剂(利多卡因、辛可卡因)或非甾体类抗炎药(布洛芬、酮洛芬、非诺洛芬、双氯芬酸)。优选地，上述共聚物与硫酸化的糖、硫酸化的糖盐或复合物组合使用。这种硫酸化的糖例如可以是与金属(如Na、K、Ca、Mg、Ba、Al、Zn、Cu、Zr、Ti、Mn或Os)或有机碱(如氨基酸)的复合物或盐形式的蔗糖八硫酸盐。当上述共聚物与在愈合过程中已知作为活性成分的蔗糖八硫酸钾组合使用时获得了特别有利的结果。体外增殖研究表明，出乎意料的是，2-甲基-2-[(l-氧代-2-丙烯基)氨基]-l-丙磺酸盐和2-羟乙基丙烯酸酯的共聚物在非常低的剂量下对成纤维细胞增殖表现出活性。具体而言，当共聚物以0.00064mg/mL的浓度存在于培养基中时已经观察到这种活性。还已经表明，特别有利的是，上述共聚物在几天内也表现出活性。体内进行的测试检测了所述共聚物加到培养基中72小时后对成纤维细胞增殖的活性。当共聚物加到敷料中时，这一点是特别有利的。具体而言，同一敷料可以使用几天，同时保持活性，而无需更换。通常，本发明中使用的共聚物可以整合到任何类型的组合物，例如，特别是溶液、霜剂、凝胶、物质(尤其是弹性体)或敷料。共聚物可以整合到绷带中。术语"绷带"指敷料中常用的任何类型的吸收性材料，例如，可以是吸收性非织物(例如，基于粘胶)的纺织材料，可能与非吸收性非织物(如聚酯纤维)组合。这还可能涉及超强吸水纤维(如由ToyoboCo.,Ltd.出售的Lansea产)或聚氨酯泡沫。特别地，共聚物可以存在于构成敷料的物质中、或存在于敷料的单独层上、或存在于覆盖敷料表面的涂层中，与伤口接触，从而对其进行处理。术语"敷料"包括任何类型的已知敷料，优选界面敷料。这种敷料例如是以商品名TulleGras(SolvayPharma)、Physiotulle(Coloplast)或者Urgotul(LaboratoiresUrgo)出售的那些，并记载在专利EP1143895中。这些界面敷料一般以用通常为弹性体的物质涂布的网织物或丝网的形式提供。它们也可以由没有网织物或丝网的物质构成，呈可以具有或不具有通孔的片状物形式，这取决于将要施用敷料的伤口类型(当物质仅具有很低或无吸收能力时，具有通孔的片状物会优选用在渗出性伤口上，从而通孔允许伤口渗出液流出)。本发明还发现了在制备基于加入有上述共聚物的水凝胶或水胶体的敷料中的应用。已知的水胶体基敷料例如以名称Algoplaque(LaboratoiresUrgo)、Duoderm(Convatec)禾卩Comfeel(Coloplast)出售。这种敷料记载在以下专利申请中FR2392076、FR2495473、WO98/10801和EP264299。如专利申请WO2006/007844中所记载的，本发明中使用的共聚物可以加到吸收性要素中，如绷带或泡沫，例如通过在将要与伤口接触的表面上沉积。本发明还发现了在制备与吸收层(如泡沫或绷带)复合的界面敷料中的应用，或在制备与吸收泡沫复合的水胶体中的应用。这种敷料是已知的，并例如是以商品名UrgotulDuo②和Cellosorb(LaboratoiresUrgo)出售的产品。在这种敷料中，上述共聚物被加到物质中和/或加到吸收层中。本发明中优选使用的界面敷料由弹性体构成，即由选自聚(苯乙烯-烯烃-苯乙烯)嵌段共聚物的一种或多种弹性体和选自增塑剂、增粘树脂和需要时的抗氧化剂的一种或多种化合物构成。这种弹性体对于本领域技术人员是公知的，并记载在例如由DonatasSatas编著的"AdvancesinPressureSensitiveAdhesiveTechnology"中，1995年4月，第7章，"Wounddressings(伤口敷料)"，第158-171页，当整合到敷料(如界面敷料)中时，上述共聚物相对于弹性体的重量可以1~5重量％的浓度使用。已经表明，这样的浓度足以激活成纤维细胞增殖，从而促进愈合。通常，上述共聚物相对于加入它的物质重量以0.1-20重量％的量存在于敷料中，优选1~5重量％。根据第二方面，本发明的目的是提供上述敷料，其含有2-甲基-2-[(1-氧代-2-丙烯基)氨基]-l-丙磺酸的盐和2-羟乙基丙烯酸酯的共聚物。为了证实上述共聚物对成纤维细胞的活性，使用两种类型的实验进行体外研究1.将共聚物单独或与活性物质(在目前情况下，蔗糖八硫酸钾)的组合直接加到不同浓度的成纤维细胞培养基中。在这种情况下，制备单独共聚物或与蔗糖八硫酸钾的组合的各种稀释物，并加到培养基中。这样，在含有成纤维细胞的培养基中测试0.011mg/mL的SepinovEMT10共聚物和0.00064mg/mL的蔗糖八硫酸钾的稀释物。2.将共聚物单独或与活性物质(在目前情况下，蔗糖八硫酸钾)的组合整合到界面敷料的基质中，然后将敷料施用于含有成纤维细胞的培养孔上。在这种情况下，根据下述方法制备含有不同浓度的共聚物与蔗糖八硫酸钾组合或不与其组合的各种界面敷料。还制备不含有这两种活性剂中任一种的界面敷料，并测试，用于比较。制备测试敷料的方法a.制备弹性体使用表1所示的按重量比例的以下各成分制备各种弹性体(实施例1~5):-弹性体聚(苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯)(简称SEBS)的嵌段共聚物;KratonG1654和G1651，由公司Kraton出售；-增塑剂:矿物油Ondina917，由公司Shell出售；-抗氧化剂:Irganox1010，由公司CibaSpecialtyChemicals出售；-脂肪物质:矿脂CodexA矿脂，由Aiglon出售；-水胶体:羧甲基纤维素钠CMCBlanose7H4XF，由公司Hercules出售；-额外的活性物质:蔗糖八硫酸钾由公司Euticals出售；-2-甲基-2-「(1-氧代-2-丙烯基)氨基1-1-丙磺酸盐和2-羟乙基丙烯酸酯的共聚物:SepinovEMT10，由公司SEPPIC出售。通过在155°C的设定点温度下在Z-叶片混合器中混合来制备弹性体基物质1.将苯乙烯-乙烯丁烯-苯乙烯三嵌段弹性体与同量的矿物油和抗氧化剂混合。2.30分钟时，将矿脂加到混合物中。3.40分钟时，加入其余的矿物油。4.55分钟时，将羧甲基纤维素钠和适宜时的活性物质加到混合物中。混合器在70分钟时清空。b.制备敷料使用上述弹性体制备由用弹性体涂布的网织物构成的界面敷料。更具体而言，使用由热固性薄纱罗形成的网织物，这种薄纱罗在经纱和纬纱方向由33decitex(分特克斯)的聚酯(聚对苯二甲酸乙二醇酯)纱制成，这种网织物具有孔径约0.8~1mm2的方形网孑L(由公司MDBTexinov出售的网织物555)。用在135145。C下熔融的弹性体层涂布这种网织物，然后通过在间隙为200pm的两个固定辊之间经过除去过量的弹性体。切割这样得到的条带，然后在每一侧上与23pm厚的保护性聚酯膜复合，从而形成包装在非渗透性袋中并在25kGy的P-射线下消毒的敷料。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>根据以下方案测定2-甲基-2-[(l-氧代-2-丙烯基)氨基]-l-丙磺酸的盐和2-羟乙基丙烯酸酯的共聚物对成纤维细胞增殖的影响。上述共聚物对成纤维细胞增殖的活性的证实使用的细胞类型正常人上皮成纤维细胞(NHDF)R9PF2培养37°C，5%C02培养基薩EM(Dulbecco，sModifiedEagleMedium,Invitrogen21969035)2mML-谷氨酰胺(Invitrogen25030024)50IU/mL青霉素(Invitrogen15070063)1()0/。胎牛血清(v/v，Invitrogen10270098)。测试的产品测试使用实施例1~5的弹性体制备的具有孔大小的敷料，SepinovEMT10共聚物稀释到0.011mg/mL，蔗糖八硫酸钾稀释到0.00064mg/mL。对增殖的影响将成纤维细胞以低密度(60%融合)接种在12孔板上，然后用稀释液处理细胞，或将敷料块施用到这些板上，并使用堵塞物保持在适当位置(称为"测试")。对照没有敷料、没有稀释液但有堵塞物(称为"对照")。然后将细胞培养24小时、48小时和72小时。对于每个培养时间，在培养的最后24小时，加入氚化胸腺嘧啶核苷([甲基-3H]-胸腺嘧啶核苷，AmershamTRK686，2.5nCi/ml的最终浓度)，然后提取细胞层的细胞的DNA，并纯化，使用闪烁计数器计数DNA中的放射性。所得结果以每分钟计数(cpm)表示，然后根据下式以相对于对照的百分比表示n/o对照=(cpm测试/cpm对照)xioo其中cpm皿使用测试得到的每分钟计数cpm对照使用对照得到的每分钟计数。所有实验均进行三次。所得结果列于下表24。表2:24小时时加入氚化胸腺嘧啶核苷后NHDF增殖的研究结果处理%对照对照100根据实施例1的敷料130根据实施例2的敷料196表3:48小时时加入氚化胸腺嘧啶核苷后NHDF增殖的研究结果处理对照100实施例1的敷料181实施例2的敷料260实施例3的敷料506实施例4的敷料456实施例5的敷料2430.011mg/mL的蔗糖八硫酸钾1060.00064mg/mL的SepinovEMT101250.011mg/mL的蔗糖八硫酸钾和0.00064mg/mL的S印inovEMT1015212<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>这些体外实验可以证实SepinovEMT10共聚物对成纤维细胞增殖的影响以及该共聚物和蔗糖八硫酸钾对相同细胞的组合活性。当SepinovEMT10共聚物以占总质量5%的浓度整合到弹性体中时，得到的效果是特别有利的，这是在与细胞培养基接触48小时和72小时之后。以非常低的浓度(0.00064mg/mL)在细胞培养基中作为稀释物单独使用的共聚物也显著地促进成纤维细胞增殖。还可以观察到，令人惊讶的是，当SepinovEMTIO共聚物与蔗糖八硫酸钾组合使用时，对成纤维细胞增殖产生协同效果。特别是当以0.011mg/mL的浓度将蔗糖八硫酸钾加到培养基中和以0.00064mg/mL的浓度加入SepinovEMTIO共聚物时，观察到这种协同作用。因此，根据本发明使用的共聚物对于处理伤口是特别有利的，尤其是用于促进愈合，特别是当加到敷料中时。权利要求1.2-甲基-2-[(1-氧代-2-丙烯基)氨基]-1-丙磺酸的盐和2-羟乙基丙烯酸酯的共聚物制备用于体内或体外促进和/或加速成纤维细胞增殖的组合物的用途。2.如权利要求l所述的用途，制备用于促进愈合的组合物。3.如权利要求l或2所述的用途，其特征在于，所述共聚物与一种或多种活性物质组合。4.如权利要求l-3任一项中所述的用途，其特征在于，所述共聚物与硫酸化的糖组合，优选蔗糖八硫酸钾。5.如权利要求l-4任一项中所述的用途，其特征在于，所述2-甲基-2-[(1-氧代-2-丙烯基)氨基]-1-丙磺酸盐是钠盐。6.—种伤口处理用的敷料，其特征在于，其含有2-甲基-2-[(l-氧代-2-丙烯基)氨基]-1-丙磺酸的盐和2-羟乙基丙烯酸酯的共聚物。7.如权利要求6所述的敷料，其中所述共聚物与一种或多种活性物质组合。8.如权利要求7所述的敷料，其中所述活性物质是硫酸化的糖，优选蔗糖八硫酸钾。9.如权利要求68中任一项所述的敷料，其中所述共聚物存在于构成所述敷料的吸收性要素中。10.如权利要求6~9中任一项所述的敷料，其中所述共聚物存在于构成所述敷料的物质中，优选存在于弹性体中。11.如权利要求io所述的敷料，其中所述共聚物相对于加入它的物质重量以0.1~20重量％的量存在，优选1~5重量％。12.如权利要求6~11中任一项所述的敷料，其特征在于，所述2-甲基-2-[(l-氧代-2-丙烯基)氨基]-l-丙磺酸盐是钠盐。全文摘要本发明涉及已知的化合物作为促进和/或加速成纤维细胞增殖和/或分化并因而生成瘢痕的试剂的用途。这种化合物是2-甲基-2-[(1-氧代-2-丙烯基)氨基]-1-丙磺酸盐和2-羟乙基丙烯酸酯的共聚物。这种化合物可以单独使用或与能够诱发或加速瘢痕生成的其他活性物质组合使用。可以通过局部施用在伤口和周围区域或粘膜上单独给予这种化合物或与其他活性物质组合。其还可以体外使用，尤其是用于产生皮肤移植用细胞。文档编号A61P17/02GK101678036SQ200880017368公开日2010年3月24日申请日期2008年5月23日优先权日2007年5月25日发明者克里斯特勒·劳伦索申请人:于尔戈实验室