新型抗体的制作方法

专利名称：新型抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型α 5β 1抗体、包含该抗体的组合物和试剂盒及使用该抗体的方法。
背景技术：
α 5 β 1整联蛋白是经由其主要配体纤连蛋白介导细胞_细胞和细胞-ECM相互作 用的细胞膜糖蛋白。α 5β1整联蛋白在细胞迁移、分化和存活中发挥作用。在肿瘤血管 内皮(例如胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、子宫宫颈癌和乳腺癌)和其它血管发生性血管中 αδβ 整联蛋白的水平升高。α 5β 1整联蛋白调控血管发生期间壁细胞与内皮细胞的结 合和内皮细胞外基质的装配。因此，α 5β1整联蛋白是抑制血管发生及使细胞对VEGF拮 抗剂的效果敏感的有用靶物。如此，本领域需要用于靶向α 5β 1整联蛋白的组合物和方法。本发明满足了此需 要和其它需要。发明概述本发明涉及自7Η5杂交瘤生成的抗体衍生的新型抗α 5β1抗体，包含该新型抗 αδβ 抗体的试剂盒和组合物，及制备和使用它们的方法。本发明的抗α 5β 1抗体具有 与7Η5杂交瘤生成的抗体相比改进的对α 5β1的结合。此类抗体包括人源化抗体。依照 另一个实施方案，所述新抗α 5β 1抗体可偶联至另一实体，诸如但不限于治疗剂或荧光染 料或其它标志物，用以在患者中或在患者样品中检测α 5β 1。此类新α 5β 1抗体可在各种 治疗和诊断方法中使用。例如，此类抗α5β1抗体可在治疗异常血管发生、瘤形成、眼病和 自身免疫性疾病中使用。此类抗体可用于在患者或患者样品中检测α 5β 1蛋白质，其通过 使此类抗体接触患者中或患者样品中的α 5β 1蛋白质并定性或定量测定结合至α 5β 1蛋 白质的抗α5β1抗体来进行。依照一个实施方案，本发明的抗α 5β 1抗体包含轻链可变域序列，该轻链可变域 序列包含(1)包含氨基酸序列KASQ-N/S-VGSDVA(SEQ ID NO 10)的LHVRl、(2)包含氨基 酸序列 STSYRYS (SEQ ID NO: 11)的 LHVR2 禾口(3)包含氨基酸序列 QQY-N/S-SYPFT (SEQ ID NO 12)的LHVR3。依照另一个实施方案，本发明的抗α 5 β 1抗体包含重链可变域序列，该 重链可变域序列包含⑴包含氨基酸序列GYTF-T/S-DYYLY(SEQ ID NO 13)的HHVR1、(2) 包含氨基酸序列 GISPS-N/S-GGTTF-N/A-D-N/A-FE-N/G(SEQ ID NO: 14)的 HHVR2 和(3)包 含氨基酸序列 DAY ⑶ WYFDV (SEQ ID NO: 15)的 HHVR3。依照另一个实施方案，本发明的抗α 5β 1抗体包含轻链可变域和重链可变域，该 轻链可变域具有序列SEQ ID NO 1或其变体，该重链可变域具有序列SEQ ID NO 6或其变 体。依照一个实施方案，所述重链可变域变体序列在选自下组的残基处包含氨基酸替代30、48、49、54、60、62、65、66、67和69(Kabat编号系统)。依照另一个实施方案，所述轻链可 变域变体序列在选自下组的残基处包含氨基酸替代28、46和92(1(油站编号系统)。依照 一个实施方案，所述重链可变域包含选自下组的氨基酸替代T30S、I48V、G49S、N54S、N60A、 N62A、N62S、N65G、K66R、A67F和L69I (Kabat编号系统)。依照一个实施方案，所述轻链可 变域包含选自下组的氨基酸替代N28S、T46L和N92S (Kabat编号系统)。本发明还涉及一种组合物，其包含多肽，该多肽包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、和9。依照另一个实施方案，所述组合物包含抗体，该抗体包含轻 链可变域序列SEQ ID NO :1和重链可变域序列SEQ ID NO :5。依照另一个实施方案，所述组 合物包含抗体，该抗体包含轻链可变域序列SEQ ID NO :2和重链可变域序列SEQ ID NO :6。 依照另一个实施方案，所述组合物包含抗体，该抗体包含轻链可变域序列SEQ ID N0:2和重 链可变域序列SEQ ID NO :7。依照另一个实施方案，所述组合物包含抗体，该抗体包含轻链 可变域序列SEQ ID NO: 3和重链可变域序列SEQ ID NO :8。依照另一个实施方案，所述组 合物包含抗体，该抗体包含轻链可变域序列SEQ ID NO :4和重链可变域序列SEQ ID NO :9。依照又一个实施方案，本发明提供了一种在受试者中治疗癌症的方法，其包括施 用VEGF拮抗剂和本发明的抗α5β1抗体的步骤。依照一个优选的实施方案，所述癌症响 应VEGF拮抗剂疗法。在另一个实施方案中，一种在患有AMD的受试者中治疗年龄相关黄斑 变性(AMD)(包括湿性年龄相关黄斑变性)的方法，包括施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和 本发明的抗α5β1抗体的步骤。在又一个实施方案中，一种在受试者中治疗自身免疫性疾 病的方法，包括施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和抗α 5 β 1抗体的步骤。在一个实施方案中，要治疗的受试者可以首先施用VEGF拮抗剂，随后用本发明的 抗α5β1抗体治疗。在另一个实施方案中，在用任一药物的多轮治疗中，用VEGF拮抗剂和 本发明的抗α 5β1抗体治疗受试者。依照另一个实施方案，用VEGF拮抗剂治疗受试者，直 至受试者对VEGF拮抗剂治疗没有响应，然后用本发明的抗α 5β 1抗体治疗受试者。在一个 具体的实施方案中，在所述癌症是非侵入性的或早期的时候用VEGF拮抗剂治疗受试者，而 在所述癌症是侵入性的时候用本发明的抗α 5β1抗体治疗受试者。在另一个实施方案中， 用本发明的抗α 5β 1抗体治疗的受试者在患病组织中有与来自未患病受试者的组织相比 升高的α5β1水平。在这种情况中，所述方法可进一步包括检测受试者中的α5β1的步 骤，例如在用VEGF拮抗剂治疗后在患病组织中。依照一个实施方案，所述侵入性癌症是转 移性癌症。依照另一个实施方案，所述早期癌症是通过辅助疗法(例如化疗或手术切除) 治疗的癌症。在一个优选的实施方案中，所述受试者患有具有异常血管发生的疾病。依照另一 个实施方案，所述疾病选自下组癌症、自身免疫性疾病或眼病。依照一个优选的实施方 案，所述疾病选自下组实体瘤、转移瘤、软组织肿瘤、具有眼新血管形成的疾病、具有异常 血管发生的炎性疾病、移植入受试者后发生的疾病和具有纤维血管(fibrovascular)组织 异常增殖的疾病。依照另一个优选的实施方案，所述癌症选自下组乳腺癌(包括转移性 乳腺癌)、宫颈癌、结肠直肠癌(包括转移性结肠直肠癌)、肺癌(包括非小细胞肺癌)、非 何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病、肾细胞癌、前列腺癌(包括激素 不应性前列腺癌(homone refractory prostate cancer))、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、 间皮瘤、软组织癌、胃肠道间质瘤(gastrointestinalstromal tumor)、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)和多发性骨髓瘤。依照另一个优选的实施方案，所述疾病 选自下组视网膜病、年龄相关黄斑变性(例如湿性AMD)、糖尿病黄斑水肿、视网膜静脉闭 塞(RVO)、和干性AMD/地理性萎缩(geographic atrophy)(为了阻止发展成湿性AMD)、 发红；银屑病、炎性肾病、溶血性尿毒综合征(haemolytic uremic syndrome)、糖尿病肾病 (例如增殖性糖尿病视网膜病)、关节炎(例如银屑病关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎)、 炎性肠病、慢性炎症、慢性视网膜剥离、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、角膜移植片排斥、角 膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、克罗恩(Crohn)氏病、近视、眼新血管病、佩吉特 (Paget)氏病、类天疱疮、多动脉炎、激光放射状角膜切开术后、视网膜新血管形成、斯耶格 伦(Sogren)氏综合征、溃疡性结肠炎、移植物排斥、肺部炎症、肾病综合征、水肿、与恶性肿 瘤有关的腹水、中风、血管纤维瘤和新生血管性青光眼。在一个实施方案中，对所述受试者 进一步施用选自下组的治疗剂抗肿瘤剂、化疗剂和细胞毒剂。依照本发明的一个优选实施方案，要用抗α 5β 1抗体治疗的受试者患有VEGF拮 抗剂治疗后的复发或变成对VEGF拮抗剂治疗不应。依照另一个实施方案，要用本发明抗 α 5 β 1抗体和VEGF拮抗剂治疗的受试者患有转移性癌症或先前用辅助疗法治疗过。在一 个实施方案中，候选患者是对化疗剂(诸如伊立替康(irinotecan)复发的、不应的或有抗 性的。此类疾病的例子包括但不限于转移性结肠直肠癌、复发性结肠直肠癌、转移性乳腺 癌、复发性转移性乳腺癌、转移性HER2+乳腺癌、乳腺癌、HER2+乳腺癌、转移性胰腺癌、结肠 癌、非小细胞肺癌、肾癌、非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、转移性卵巢癌、转移性肾细 胞癌和肾细胞癌。依照一个实施方案，在用VEGF拮抗剂治疗疾病后对患有本文所述疾病的受试者 施用维持疗法，其中所述维持疗法是单独地施用抗α 5β 1抗体，或者抗α 5β 1抗体与VEGF 拮抗剂序贯地施用或同时施用。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂可选自下组抗体、免疫粘附素、肽 抗体(ρ印tibody)、小分子和在严格条件下与编码VEGF的核酸分子杂交的核酸(例如核 酶(ribozyme)、siRNA和适体(aptamer))。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂是 抗体。依照另一个实施方案，所述抗体是单克隆抗体。依照一个优选的实施方案，所述抗 VEGF抗体对人VEGF的结合能够被Avastin 抗体竞争性抑制。依照另一个实施方案，所述 抗VEGF抗体是人的、人源化的或嵌合的。依照一个具体的实施方案，所述抗VEGF抗体是 Avastin 抗体。依照另一个实施方案，所述抗VEGF抗体选自下组Fab、Fab，、F(ab)，2、单 链Fv(SCFV)、Fv片段、双抗体和线性抗体。依照另一个实施方案，所述VEGF拮抗剂是结合 VEGF的双特异性抗体且包含本发明抗α 5β 1抗体的重链和轻链可变域。依照一个优选的实施方案，本发明的抗α5β1抗体是包含人IgG Fc部分的抗体。 依照另一个实施方案，本发明的抗α 5 β 1抗体包含人IgGl或hIgG4的CHI、CH2和CH3结 构域。依照一个优选的实施方案，所述抗α 5β1抗体是人源化抗体。依照一个具体的实施 方案，所述抗α5β1抗体是7Η5抗体或其嵌合或人源化抗体。依照另一个实施方案，所述 抗α5β 1抗体选自下组Fab、Fab，、a F (ab)，2、单链Fv (scFv)、Fv片段、双抗体和线性抗 体。依照另一个实施方案，本发明的抗α 5β 1抗体是结合VEGF和α 5β 1的双特异性抗体 且是VEGF拮抗剂。依照又一个实施方案，本发明的抗α 5β1抗体具有改变的效应器功能。 依照一个实施方案，抗α 5β1抗体被改变以降低或阻止抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补
6体依赖性细胞毒性(CDC)活性(例如通过改变编码抗体Fc部分的核酸序列)。依照又一个 实施方案，所述抗α 5β1抗体被改变以延长或缩短在人类中的半衰期(例如通过改变编码 抗体Fc部分的核酸序列)。依照一个实施方案，所述α 5β 1抗体偶联有细胞毒剂或化疗剂。依照另一个实施 方案，所述细胞毒剂是放射性同位素或毒素。本发明提供了组合物，其包含VEGF拮抗剂、本发明的α 5β 1抗体和药学可接受载 体。本发明还提供了制品，其包含关于在已经用VEGF拮抗剂治疗过的受试者中检测α 5β 1 的说明。附图简述

图1描绘了下述人源化抗体相对于抗整联蛋白α 5 β 1克隆7Η5的轻链可变域序 列比对基于嫁接鼠7Η5 CDR的人源化7Η5抗体(h7H5. vl,SEQ ID NO 1)、基于替换h7H5. vlCDR-Ll、-L3 和-H2 中残基的人源化 7H5 抗体(h7H5. v2, SEQ ID NO 2)和基于在 h7H5. v2 上修饰框架的人源化 7H5 抗体(h7H5. v4, SEQ ID NO 3 和 h7H5. v5, SEQ ID NO 4)。h7H5. v3轻链可变域在序列上与SEQ ID N0:2相同。图2描绘了下述人源化抗体相对于抗整联蛋白α 5 β 1克隆7H5的重链可变域序 列比对基于嫁接鼠7Η5 CDR的人源化7Η5抗体(h7H5. vl,SEQ ID NO 5)、基于替换h7H5. vl CDR-L1、-L3 和-H2 中残基的人源化 7H5 抗体(h7H5. v2,SEQ ID NO 6)和基于在h7H5. v2 上框架修饰的人源化 7H5 抗体(h7H5. v4, SEQ ID NO 8 和 h7H5. v5, SEQ ID NO 9)。h7H5. v3重链可变域在序列上与h7H5. v2相同，只是它具有N62S氨基酸突变(h7H5. v3VH序列称 作 SEQ IDNO 7)。图3描绘了嵌合7H5_IgG和人源化7H5. vl-IgG对人整联蛋白α5β1的 BIACORE 分析的结果。(A)在CM5传感器芯片的两个不同流动室上固定化450RU(响 应单位)的嵌合7H5-IgG和人源化7H5.vl-IgG并注射2倍连续稀释的人整联蛋白 α 5β 1(300ηΜ至0. 29nM)通过传感器芯片以测定结合亲和力和动力学，于25°C进行。(B)在 CM5传感器芯片上固定化800RU的人整联蛋白α 5 β 1并注射2倍连续稀释的嵌合7H5_IgG 和人源化7H5. vl-IgG(200nM至0. 2nM)通过传感器芯片以测定结合亲和力和动力学，于 25°C进行。图4描绘了噬菌体竞争ELISA，用于测定在噬菌体上作为单价Fab形式展示的人源 化7H5. vl单一点突变克隆对人整联蛋白α 5 β 1的噬菌体IC50。图5描绘了每一处对亲本克隆h7H5. vl的单一点突变的结合亲和力(IC50)的相 对变化倍数的汇总。图6描绘了噬菌体竞争ELISA，用于测定在噬菌体上作为单价Fab形式展示的人源 化7H5. vl多处替代克隆对人整联蛋白α 5 β 1的噬菌体IC50。前两种变体是基于来自图5 的选集(突出显示的)生成的。总之，所有六种变体保留并显示略微改进的结合亲和力；因 此，选择所示两种变体h7H5. v2和h7H5. v3来包括⑶R-H2第65位甘氨酸替代。图7描绘了人源化7H5. vl、v2和v3_IgG对人整联蛋白α 5 β 1的BIACORE 分析的结果。在CM5传感器芯片的三个不同流动室上固定化450RU(响应单位)的人源化 7H5. vl、v2和v3-IgG并注射2倍连续稀释的人整联蛋白α 5 β 1 (300ηΜ至0. 29ηΜ)通过传 感器芯片以测定结合亲和力和动力学，于25°C进行。人源化7H5. v2指示解离速率的最大结合亲和力改善。图8描绘了噬菌体竞争ELISA，用于测定在噬菌体上作为单价Fab形式展示的人 源化7H5.V2框架修饰克隆对人整联蛋白α5β1的噬菌体IC50。大多数框架替代显示出 与h7H5. v2相比相当的结合亲和力，除了分别将甘氨酸变成丝氨酸和将丙氨酸变成亮氨酸 的重链第49位和第78位。图9描绘了人源化7H5. v2、v4和v5_IgG对人整联蛋白α 5 β 1的BIACORE 分析的结果。(A)在CM5传感器芯片的三个不同流动室上固定化450RU(响应单位)的人 源化7H5. v2、v4和v5-IgG并注射2倍连续稀释的人整联蛋白α 5 β 1 (300ηΜ至0. 29ηΜ)通 过传感器芯片以测定结合亲和力和动力学，于25°C进行。(B)在CM5传感器芯片上固定化 800RU的人整联蛋白α 5 β 1并注射2倍连续稀释的人源化7Η5. v2、v4和v5_IgG(200nM至 0. 2nM)通过传感器芯片以测定结合亲和力和动力学，于25°C进行。在两种形式中，人源化 7H5. v4显示与人源化7H5. v2相比相当的结合亲和力。图10描绘了皮肤伤口愈合实验的结果，证明了组合施用h7H5.v2和抗VEGF增强 单独的抗VEGF的抗血管发生效果。图11描绘了皮肤伤口愈合实验的结果，证明了组合施用h7H5. v4和抗VEGF增强 单独的抗VEGF的抗血管发生效果。发明详述I.引言本发明基于结合Cij1整联蛋白的新型抗体的鉴定。所述Ci5^抗体衍生自单克 隆抗体7H5且能在各种治疗和诊断方法中使用。例如，所述α 5β工抗体能单独地或与其它药 剂组合地在治疗异常血管发生、瘤形成、眼病和自身免疫性疾病中使用。所述抗体还能用于 在患者或患者样品中检测α5β1蛋白质，其通过施用针对患者中Cij1蛋白质的抗体并检 测结合至来自患者的样品(例如体内的或离体的)中Ci5^1蛋白质的抗α5β1抗体或者 通过使所述抗体接触来自患者的样品并定性或定量检测结合至α J1蛋白质的抗α5β1 抗体来进行。II.定义“阿尔法5贝塔1 ”或“ α 5 β 1 ”或“a5b 1 ”或“ α 5 β i，，或指包含两个不同蛋白质 (即亚基α 5和β 1)的整联蛋白。α5β1已显示出结合纤连蛋白、Ll-CAM和纤维蛋白原。 α 5β 1 整联蛋白还称为 VLA_5(极晚激活蛋白(very late activation) _5)、alpha5betal、 ⑶49e/⑶29、纤连蛋白受体、FNR和GPIc-IIa。依照一个优选的实施方案，所述α 5 β 1是人 α 5β 1。“ α 5”在本文中与 CD49e、alpha5、整联蛋白 a5MS、VLA_5a 亚基、GPIc-IIa 的 IC亚基和FNR α链可互换使用，指α J1整联蛋白的一个亚基。α5具有四种通过可变剪 接生成的同工型(isoform) (A-D)，它们在其胞质结构域内有所不同。α 5人同工型的氨基 酸序列可分别见于例如Genbank编号X07979、U33879、U33882和U33880。“ β 1” 也称为 CD29、betal、血小板 GPIIa ；VLA-β 链；β _1 整联蛋白链、CD29 ； FNRB ；MDF2 ；VLAB ；GPIIA ；MSK12和VLA5B。人β 1的氨基酸序列可见于例如Genbank编号 Χ06256。术语“VEGF”在用于本文时指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等Science 246 1306(1989)和Houck等Mol.Endocrin，5 :1806(1991)所述，及其天然存在等位基因形式和 加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来 自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等等。术语“VEGF” 还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位 的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109) ”、“VEGF(1-109)”或"VEGF165”来 鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。 例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲 硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-I受体的结合亲和力。 依照一个优选的实施方案，所述VEGF是人VEGF。"VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括其与 VEGF或一种或多种VEGF受体或编码它们的核酸结合)的分子。优选的是，所述VEGF拮抗 剂能结合VEGF或VEGF受体。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其抗原结合片段、能结合VEGF 和VEGF受体并阻断配体-受体相互作用的多肽(例如免疫粘附素、肽体(ρ印tibody))、抗 VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂、能结合VEGF的 适体和能在严格条件下与编码VEGF或VEGF受体核酸序列杂交的核酸(例如RNAi)。依照 一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂能结合VEGF并抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖(在 体外)。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以大于非VEGF或非VEGF受体的亲和 力结合VEGF或VEGF受体。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以介于1 μ M和IpM 之间的Kd结合VEGF或VEGF受体。依照另一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以介于 500ηΜ和IpM之间的Kd结合VEGF或VEGF受体。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂选自下组多肽诸如抗体、肽 体、免疫粘附素、小分子或适体。在一个优选的实施方案中，所述抗体是抗VEGF抗体 (诸如AVASTIN 抗体)或抗VEGF受体抗体(诸如抗VEGFR2或抗VEGFR3抗体)。 VEGF 拮抗剂的其它例子包括VEGF-Trap、Mucagen, PTK787、SUl 1248、AG-013736、Bay 439006(sorafenib)、ZD-6474、CP632、CP-547632、AZD-2171、CDP-171、SU_14813、CHIR-258、 AEE-788、SB786034、BAY579352、CDP-791、EG-3306、Gff-786034, RWJ-417975/CT6758 和 KRN-633。“抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。优选的是，本发明的 抗VEGF抗体可在靶向和干预其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患中用作治疗剂。抗VEGF抗 体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如 P1GF、PDGF或bFGF。一种优选的抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗 VEGF抗体A4. 6. 1结合相同表位的单克隆抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是依照Presta等 (1997) Cancer Res. 57 =4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称 为贝伐单抗(bevacizumab) (BV ；Avastin )的抗体。依照另一个实施方案，可以使用的抗 VEGF抗体包括但不限于WO 2005/012359中披露的抗体。依照一个实施方案，所述抗VEGF 抗体包含WO 2005/012359的图24、25、26、27和29中披露的任一抗体(例如G6、G6-23、 G6-3UG6-23. 1、G6-23. 2、B20、B20-4和B20. 4. 1)的重链可变区和轻链可变区。在另一个 优选的实施方案中，称为ranibizumab的抗VEGF抗体是为了眼病诸如糖尿病视网膜病和湿
9性AMD而施用的VEGF拮抗剂。抗VEGF 抗体“贝伐单抗” (bevacizumab, BV),也称为 “rhuMAb VEGF” 或 "Avastin ”，是依照 Presta et al. (1997) Cancer Res. 57 :4593_4599 生成的重组人源化 抗VEGF单克隆抗体。它包含突变的人IgGl框架区和来自能阻断人VEGF结合其受体的鼠抗 hVEGF单克隆抗体A4. 6. 1的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93%的氨基酸序列(包括 大部分框架区)衍生自人IgGl，而大约7%的序列衍生自鼠抗体A4. 6.1。贝伐单抗具有约 149，000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。其它抗VEGF抗体包括美国专利No. 6，884，879 和W02005/044853中记载的抗体。抗VEGF抗体Ranibizumab或LUCENTIS 抗体或rhuFab V2是人源化的、亲和 力成熟的抗人VEGF Fab片段。Ranibizumab是通过标准重组技术方法在大肠杆菌表达载 体和细菌发酵中生成的。Ranibizumab是未糖基化的且分子量为约48，000道尔顿。参见 W098/45331和 US 2003/0190317。称作7H5的α 5 β 1单克隆抗体于2006年3月7日作为7Η5. 4. 2. 8 (ATCC No. ΡΤΑ-7421)保藏于 ATCC。以结合至靶物上交叠的或相似的区域为特征的分子(诸如抗体)可以通过竞争性 抑制/结合测定法来鉴定。在一个实施方案中，在竞争性抑制测定法中使用表达α 5β工的HUVEC或其它细胞， 而且使用FACS来评估两种抗Cij1抗体相对于彼此的结合位置。例如，可以将HUVEC细 胞在锥形管中清洗，并以IOOOrpm离心5分钟。通常将沉淀物清洗两次。然后，可以将细 胞重悬，计数，并放置在冰上直至使用。可以向孔中添加100 μ 1第一抗α J1抗体(例如 从1 μ g/ml浓度或更低浓度开始)。接着，可以向每个孔中添加100 μ 1细胞(例如20χ105 个细胞)，并在冰上温育30分钟。接着，可以向每个孔中添加ΙΟΟμΙ生物素化抗Cij1抗 体(5 μ g/ml储液)，并在冰上温育30分钟。然后将细胞清洗，并以IOOOrpm离心5分钟。 吸去上清液。向孔中添加第二试剂R-藻红蛋白偶联链霉亲合素(Jackson 016-110-084) (ΙΟΟμΙ,Ι 1000)。接着，可以将板包裹在金属箔中，并在冰上温育30分钟。温育后，可 以将沉淀物清洗，并以IOOOrpm离心5分钟。可以将沉淀物重悬，并转移至微量滴定管，供 FACS分析。“血管发生因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生 (angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长 因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员、P1GF、PDGF家族、成 纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(血管生成素(angiopoietin)、印hrin、Del-l、酸 性(aFGF)和碱性(bFGF)成纤维细胞生长因子、卵泡抑素(Follistatin)、粒细胞集落刺激 因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(scatter factor，SF)、白介素-8 (IL-8)、 L印tin、Midkine、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生 长因子尤其是 PDGF-BB 或 PDGFR-β、Pleiotrophin(PTN)、Progranulin, Proliferin、转化 生长因子-α (TGF-α)、转化生长因子-β (TGF-β )、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、血管内皮 生长因子(VEGF)/血管通透性因子(VPF)等。血管发生因子还包括加速伤口愈合的因子， 诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I (IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族 的成员、及 TGF-α 禾口 TGF-β。参见例如 Klagsbrun and D' Amore,Annu. Rev. Physiol. 53 217-39(1991) ；Streitand Detmar, Oncogene 22:3172—3179(2003) ；Ferrara & Alitalo， Nature Medicine5(12) 1359-1364(1999) ；Tonini等，Oncogene 22 :6549_6556(2003)(例 如列举已知血管发生因子的表 1) ；Sato, Int. J. Clin. Oncol. 8 =200-206 (2003)。在一个优选的实施方案中，依照本发明的抗VEGF抗体的“Kd”或“Kd值”是通 过如下测定法所述使用Fab型式的抗体和VEGF分子进行的放射性标记VEGF结合测定法 (RIA)来测量的通过在存在未标记VEGF的滴定系列的条件下，用最小浓度的(125I)标记 VEGF (109)平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉所结合的VEGF来测量Fab对VEGF 的溶液结合亲和力(Chen，et al.，(1999) J Mol Biol 293 =865-881) 为了确定测定条件， 用50mM碳酸钠(pH 9. 6)中的5μ g/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板 (Dynex)过夜，随后用PBS中的2% (w/v)牛血清清蛋白于室温(约23°C )封闭2_5小时。 在非吸附平板(Nunc #269620)中，将IOOpM或26pM[125I]-VEGF (109)与连续稀释的感兴趣 Fab，例如 Fab-12 (Presta et al.，(1997) Cancer Res. 57 :4593_4599)混合。然后将感兴 趣Fab保温过夜；不过，保温可持续65个小时以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉 板以进行室温保温1小时。然后除去溶液，并用含0. l%Tween-20的PBS洗板8次。平板 干燥后，加入150 μ 1/孔闪烁液(MicroScint-20 ；Packard)，然后在Topcount伽马计数器 (Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用 于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使 用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore，Inc.，Piscataway, NJ)于 25°C使用固定化 hVEGF(8-109)CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用 盐酸N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸钠pH 4. 8将人 VEGF稀释至5 μ g/ml (约0. 2 μ Μ)，然后以5 μ 1/分钟的流速注入至获得约10个响应单位 (RU)的偶联蛋白质。注入人VEGF后，注入IM乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学 测量，于25°C以约25 μ 1/分钟的流速注入在含0. 05% Tween-20的PBS (PBST)中两倍连续 稀释的Fab (0. 78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k。n) 和解离速率(k。ff)。平衡解离常数(Kd)以比率k。ff/k。n计算。参见例如Chen，Y.，et al.， J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过 IO6M-1S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的 分光光度计(astop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的 人VEGF短型(8-109)或小鼠VEGF的条件下，测量PBS，pH 7. 2中的20nM抗VEGF抗体(Fab 形式)于25°C的荧光发射强度(激发=295nm;发射=340nm，16nm带通)的升高或降低。 可以使用α 5 β 1作为靶物实施相似的结合测定法来测定抗α 5 β IFab或抗体的Kd。在用于本文时，待治疗的受试者指哺乳动物(例如人、非人灵长类、大鼠、小鼠、 牛、马、猪、绵羊、山羊、犬、猫等)。受试者可以是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。 受试者可以是怀疑患有或有风险患上癌症、免疫病、或具有异常血管发生的任何其它疾病， 诊断有癌症、免疫病、或具有异常血管发生的任何其它疾病。癌症、免疫病或展现出异常血 管发生的任何其它疾病的许多诊断方法及那些疾病的临床描述是本领域已知的。依照一个优选的实施方案，有待依照本发明治疗的受试者指人。术语“异常血管发生”发生于疾病状态中的或引起疾病状态的新血管生长过度或 其它方面不当(例如从医学观点看不良的血管发生位置、时间、程度、或启动)时。在有些 情况中，过度的、失控的、或其它方面不当的血管发生发生于有促成疾病状态恶化或引起疾 病状态的新血管生长时，诸如癌症尤其是血管化实体瘤和转移瘤(包括结肠癌、肺癌(尤其 是小细胞肺癌)、或前列腺癌)，由眼新血管形成引起的疾病尤其是糖尿病性失明、视网膜 病变、原发性糖尿病性视网膜病变(primarily diabetic retinopathy)或年龄诱发的黄斑 变性(AMD)，脉络膜新血管形成(CNV)，糖尿病黄斑水肿，病理性近视，von Hippel-Lindau 病，眼组织胞浆菌病，视网膜中央静脉阻塞(CRVO)，角膜新血管形成，视网膜新血管形成和 发红；银屑病、银屑病关节炎、成血管细胞瘤诸如血管瘤；炎性肾病，诸如肾小球肾炎，尤其 是膜增生性肾小球肾炎、溶血性尿毒综合征(haemolytic uremic syndrome)、糖尿病肾病 或高血压肾硬化；各种炎性疾病，诸如关节炎，尤其是类风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病、 结节病、动脉硬化和移植后发生的疾病、子宫内膜异位症或慢性哮喘，及超过70种其它疾 患。新血管可供应患病组织，破坏正常组织，而且，在癌症的情况中，新血管可容许肿瘤细胞 逃入循环并停留在其它器官中(肿瘤转移)。本发明涵盖治疗那些有风险发生上述疾病的
^^ ο“异常血管通透性”发生于疾病状态中的或引起疾病状态的血管与血管外区室之 间的流体、分子(例如离子和营养物)和细胞(例如淋巴细胞)的流动过度或其它方面不 当(例如从医学观点看不良的血管通透性位置、时间、程度、或启动)时。异常血管通透性可 导致过度的或其它方面不当的离子、水、营养物、或细胞经由血管系统“渗漏”。在有些情况 中，过度的、失控的、或其它方面不当的血管通透性或血管渗漏加剧或诱发疾病状态，包括 例如与肿瘤(包括脑瘤)有关的水肿；与恶性肿瘤有关的腹水；梅格斯氏(Meigs)综合征； 肺部炎症；肾病综合症征；心包积液；胸腔积液；与心血管疾病(诸如心肌梗死和中风后的 疾患)有关的通透性等等。本发明涵盖治疗那些形成或有风险形成与异常血管通透性或渗 漏有关的疾病和病症的患者。作为接受本发明抗体或多肽的候选者的其他患者具有或者有风险发生纤维血管 组织异常增殖、酒渣鼻(红斑痤疮)、获得性免疫缺陷综合征、动脉阻塞、特应性角膜炎、细 菌性溃疡、贝切特氏病(Bechets disease)、血液传播的肿瘤(blood borne tumor)、颈动 脉阻塞性疾病、脉络膜新血管形成、慢性炎症、慢性视网膜剥离、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体 炎、接触镜佩戴过度、角膜移植片排斥、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、克罗恩氏 病(Crohn' s disease)、伊尔斯病(Eales disease)、流行性角膜结膜炎、真菌性溃疡、单纯 疱疹感染、带状疱疹感染、高粘滞综合征、卡波西氏肉瘤(Kaposi' ssarcoma)、白血病、脂 质变性、莱姆氏病(Lyme' s disease)、边缘角质层分离(marginal keratolysis)、莫伦溃 疡(Mooren ulcer)、除麻风以外的分枝杆菌感染、近视、眼新血管疾病、视窝(optic pits)、 奥 _ 韦二氏综合征(Osier-Weber syndrome)(奥斯勒-韦伯-朗迪(Osler-Weber-Rendu) 病)、骨关节炎、佩吉特氏病(Pagetsdisease)、扁平部睫状体炎(pars planitis)、类天疱
> phylectenulosis^sjjEi^^^Tfeip(post-laser complication) > J^^sjjiItl
感染、弹性假黄色瘤、翼状胬肉(Pterygium)、干燥性角膜炎、放射状角膜切开术、视网膜新 血管形成、早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、类肉瘤/结节病(sarcoid)、巩膜炎、镰状细胞贫血、斯耶格伦氏综合征(Sogrens syndrome)、实体瘤、斯塔加特病(Stargarts disease)、约-斯病(Steven ‘ s Johnson disease)、上缘角膜炎(superior limbic keratitis)、梅毒、全身性狼疮、特里昂氏边缘变性(Terrien' smarginal degeneration)、 弓形虫病、外伤、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)的肿瘤、成神经细胞瘤的肿瘤、骨肉瘤的肿瘤、 视网膜母细胞瘤的肿瘤、横纹肌肉瘤的肿瘤、溃疡性结肠炎、静脉阻塞、维生素A缺乏和韦 格纳结节病(Wegenerssarcoidosis)、与糖尿病有关的不良血管发生、寄生虫病、异常伤口 愈合、外伤、损伤或手术后肥大、毛发生长抑制、排卵和黄体形成抑制、子宫中胚胎发育抑制 和植入抑制。抗血管发生疗法可用于以下各项的一般治疗移植物排斥、肺部炎症、肾病综合 征、先兆子痫、心包积液(诸如与心包炎有关的)和胸腔积液、特征为不良血管通透性或血 管渗漏的疾病和病症，例如与脑瘤有关的水肿、与恶性肿瘤有关的腹水、梅格斯氏(Meigs) 综合征、肺部炎症、肾病综合征、心包积液、胸腔积液、与心血管疾病有关的通透性，诸如心 肌梗死和中风后的疾患，诸如此类。依照本发明的其它血管发生依赖性疾病包括血管纤维瘤(倾向于出血的异常血 管)、新生血管性青光眼(眼中的血管生长)、动静脉畸形(动脉与静脉之间的异常联络)、 不连接的骨折(不会愈合的骨折)、动脉粥样硬化斑块(动脉的硬化)、脓性肉芽肿(由血 管构成的常见皮肤损伤)、硬皮病(结缔组织疾病的一种形式)、血管瘤(由血管构成的肿 瘤)、沙眼(第三世界失明的第一位原因)、血友病性关节、血管粘连和肥厚性瘢痕(异常瘢 痕形成)。“治疗”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患 有病症的受试者以及要预防病症的受试者。术语“反复”、“复发”指癌症或疾病在疾病消失的临床评估后回复。远距转移或局 部复发的诊断可以视为复发。术语“耐受性”、“抗性”或“不应性”指癌症或疾病对治疗没有响应。术语“辅助疗法”指在主要疗法(通常是手术)之后给予的治疗。癌症或疾病的 辅助疗法可以包括免疫疗法、化疗、放疗或激素疗法。术语“维持疗法”指为了帮助维持先前的治疗效果而给予的有计划的复治 (retreatment) 0常常为了帮助将癌症保持在消退或延长对特定疗法的响应(不管疾病是 否进展)而给予维持疗法。术语“侵入性癌”指超过其起始的组织层而传播进入正常周围组织的癌。侵入性 癌可以是或不是转移性的。术语“非侵入性癌”指非常早期的癌或没有向起源组织以外的组织传播的癌。术语“无进展存活(progression-free survival) ”在肿瘤学中指治疗期间和之后 癌症没有生长的时间长度。无进展存活包括患者经历完全响应或部分响应的时间量，以及 患者病情稳定的时间量。术语“进行性疾病(progressive disease) ”在肿瘤学中可以指自治疗开始超过 20%的肿瘤生长-或是由于质量的增加或是由于肿瘤的扩散。“病症”指任何会受益于抗体治疗的疾患。例如，患有或需要预防异常血管发生(过 度的、不当的或失控的血管发生)或异常血管通透性或渗漏的哺乳动物。这包括慢性和急
13性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症 的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星 细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症；及炎性、血管发生性和免疫 学病症。术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征典型的为细胞生长不受调节的 生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌(癌瘤)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类 癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer, hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝肉瘤(h印atoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内 膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer, renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、头 颈癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞 癌)、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、前列腺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞 瘤、泡膜细胞瘤(thecomas)、男性细胞瘤、肝瘤(h印atoma)、血液学恶性肿瘤(包括非何 杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤和急性血液学恶性肿瘤)、子宫内膜癌或 子宫癌、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、食管癌、肝癌 (h印aticcarcinoma)、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、黑素瘤、皮 肤癌、许旺氏细胞瘤、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨源性肉瘤、平滑肌肉 瘤、尿道癌、甲状腺癌、维尔姆斯(Wilm)氏肿瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何 杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL) NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免 疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease) NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、 慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成 髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及梅格斯氏(Meigs)综合征、和瘢痣 病(phakomatoses)有关的异常血管增殖。“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的或者是良性 的，及所有癌前的和癌性的细胞和组织。术语“抗肿瘤组合物”或“抗肿瘤剂”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一 种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的例子包括但不限于例如化疗剂、生长 抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其 它用于治疗癌症的药剂诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗 剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如erlotinib (Tarceva )、血小板衍 生生长因子抑制剂(例如Gleevec (Imatinib Mesylate) )、C0X-2抑制剂(例如塞来考昔 (celecoxib))、干扰素、细胞因子、能与 ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR- β、BAFF、BR3、APRIL、 BCMA或VEGF受体中的一种或多种靶物结合的拮抗剂(例如中和性抗体)、TRAIL/Apo2、及 其它生物活性和有机化学剂等。本发明还涵盖它们的组合。“生长抑制剂”在用于本文时指在体外和/或在体内抑制细胞生长或增殖的 化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。 生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱 导Gl停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(Vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、TAXOL 、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多 柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霄素(daunorubicin)、依托泊昔 (etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞Gl的药剂也溢出进入S期停滞，例如 DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、 双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺钼(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿 啼唆(5-fluorouracil)禾口 ara_C。更多信息可参见 The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel 编，第 1 章，题 ^J "Ge 11 cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", Murakamiet al.，WB Saunders, Philadelphia(1995) ,jtMMM 13页。术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物 质。该术语意图包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)、化疗剂、和毒素诸如细菌、 真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括可用于治疗癌症的 化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa) 和CYTOXAN 环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates), 诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类 (aziridines)，i者如苯佐替派(benzodepa)、卡波酉昆(carboquone)、美妥替派(meturedepa) 和乌瑞替派(ured印a)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)， 包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他 Φ (bullatacin)禾口 ^fJ ii (bullatacinone)) ； ^ W M (camptothecin) ( ^ ^ 成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin) ；callystatin ;CC_1065 (包 括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合 成类似物)；隐藻素类(cryptophycinsM特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他 汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素 (eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin ；海绵 ^^ 素(spongistatin)；氣芥类 (nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆 磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯 乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride) > 美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫 司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard)；亚 硝脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、 福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)禾口雷莫司 汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素 (calicheamicin)，尤其是加利车霉素Y II和加利车霉素ω Il (参见例如Agnew，Chem. Intl. Ed. Engl. 33 183-186 (1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括 dynemicin A ；二膦 酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)； 以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、方文线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮 丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素 C (cactinomycin)、carabicin、 洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、方文线 菌素 D (dactinomycin)、柔红霄素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二 氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN 多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比 星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、 依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素 类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、 橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(ρ印lomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、 三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(str印tonigrin)、链 佐星(Sti^ptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁 (zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5_氟 尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗 呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、 6_ 巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶 类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷(azauridine)、 卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿 苷(doxif luridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(f loxuridine)；雄激素类，诸 如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇 (印itiostanol)、美雄烷(m印itiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁 米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸 如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫 唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酉先 月安(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ； Hc 利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(印othilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝 酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)；氯尼达明(Ionidamine)；美登木素 生物喊类(maytansinoids),诸如美登素(maytansine)禾口安丝菌素(ansamitocin)； 米it月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；莫喊达酉享(mopidamol) ； 二月安 硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星 (pirarubicin)；洛索惠酉昆(Iosoxantrone)；鬼白酸(podophyllinic acid) ；2-乙基 酰胼(ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine) ；PSK 多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐口南(sizofiran)；螺 方 错(spirogermanium)；细交链 包菌丽酸(tenuazonic acid)；三亚月安酉昆(triaziquone)； 2,2'，2〃 -三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素 (verrucarin)A、杆抱菌素(roridin)A 禾口蛇 亍菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长 春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine) ；二溴甘露 酉享(mitobronitol) ；二漠卫矛酉享(mitolactol)；喊泊漠烧(pipobroman) ；gacytosine ；阿 糖胞苷(arabinoside) ( “Ara-C")；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如TAXOL 帕利他塞(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.)、ABRAXANE 帕利他塞的不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋 白改造纳米颗粒剂型(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) 禾口 TAXOTERE 多西他塞(doxetaxel) ( Rhone -Poulenc Rorer, Antony, France)； 苯丁 酸氮芥(chlorambucil) ； GEMZAR 吉西他滨(gemcitabine) ；6-硫鸟嘌呤 (thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；钼类似物，诸如 顺怕(cisplatin)禾口卡怕(carboplatin)；长春喊(vinblastine)；怕(platinum)；依托 泊苷(etoposide) (VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春 新碱(vincristine) ；NAVELBINE 长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)； 替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤 (aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (Camptosar, CPT-11)(包括伊立替康及5-FU和亚叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制 剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亚叶酸(Ieucovorin) (LV)；奥沙利钼(oxaliplatin)，包括奥沙利钼治疗方案(FOLFOX) ；PKC- α、Raf、H-Ras^P EGFR(例如erlotinibCTarceva ))的、降低细胞增殖的抑制剂；及任何上述物质的药学可 接受的盐、酸或衍生物。化疗剂还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗雌激 素类和选择性雌激素受体调控剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括 NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、 4_羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LYl 17018、奥 那司酮(onapristone)和FARESTON 托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上 腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特 (aminoglutethimide)、MEGASE 醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN 依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RJVISOR 伏罗唑(vorozole)、FEMARA 来曲唑(letrozole)和 ARIMIDEX 阿那曲唑 (anastrozole)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡 米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨 (troxacitabine) (1，3_ 二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉 异常(abherant)细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、 Raf和H-Ras ；核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如ANGIOZΥΜΕ 核酸)和HER2表达 抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗 和VAXID 疫苗；PROLEUKIN rlL-2 ； LURTOTECAN 拓扑异构酶 1 抑制剂； ABARELIX rmRH;长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(见美国专 利No. 4，675，187)；及任何上述物质的药学可接受的盐、酸或衍生物。术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对患病细胞 的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质(例如小 分子)的前体或衍生物形式。参见例如WiIman,“Prodrugs in CancerChemotherapy”， Biochemical Society Transactions,14, pp. 375—382,615thMeeting Belfast (1986)禾口
17Stella等，"Prodrugs :A Chemical Approach to TargetedDrug DeIivery",Directed Drug Delivery, Borchardt 等，编，pp. 247-267，HumanaPress (1985)。本发明的前体药物包括但 不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽 前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含内酰胺前体药物、含任选取代 苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞 毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形 式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。“分离的”，在用于描述本文中所公开的各种多肽时，意指已经鉴定且与/自表达它 的细胞或细胞培养物分开和/或回收的多肽。多肽的天然环境的污染性成分指通常会干扰 其诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在 优选的实施方案中，将多肽纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的 N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用考马斯蓝或优选银染色的非还原性或还 原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然多肽的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分 离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制 备。“分离的”多肽编码核酸或其它多肽编码核酸指已经鉴定且与多肽编码核酸的天 然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的多肽编码核酸 分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的多肽编码核酸分子因此与存在于天 然细胞中时的特定多肽编码核酸分子有区别。然而，分离的多肽编码核酸分子包括通常表 达该多肽的细胞中所包含的多肽编码核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色 体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA 序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位 点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。 例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分 泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编 码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它 与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且 在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过 在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核 苷酸衔接头或接头。如本文中所定义的，“严格条件”或“高严格条件”可以定义如下(1)对于洗涤使用 低离子强度和高温，例如0. 015M氯化钠/0. 0015M柠檬酸钠/0. 1 %十二烷基硫酸钠，50°C ； (2)在杂交期间使用变性剂，诸如甲酰胺，例如，50% (ν/ν)甲酰胺及0.1%牛血清清蛋白 /0. Ficol 1/0. 聚乙烯吡咯烷酮/具有750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠 缓冲液PH 6. 5，42°C，或(3)在使用50%甲酰胺，5x SSC(0. 75M NaCl，0. 075M柠檬酸钠)， 50mM磷酸钠(pH6. 8)，0. 焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑精DNA (50 μ g/ ml)，0. 1% SDS和10%硫酸右旋糖苷的溶液中于42°C杂交过夜，于42°C在0. 2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，接着是于55°C由含有EDTAWO. Ix SSC组成的10分钟高 严格洗涤。本文所述氨基酸序列是连续的氨基酸序列，除非另有说明。在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性 与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括具 有不同于抗体抗原识别和结合位点(即是“异源”的)的期望结合特异性的氨基酸序列和 免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受体或 配体(诸如VEGFR或纤连蛋白配体)的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫 球蛋白恒定域序列可以从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG_4亚型、 IgA(包括IgA-I和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。常常包含衍生自特异性结合靶物的序列的噬 菌体展示选择的序列且其融合至免疫球蛋白Fc部分的肽体(ρ印tibody)可以视为本文中 的免疫粘附素。术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖例如单克隆抗体(包括激动性、拮抗性和中 和性抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多克隆抗体、单链抗体、及抗体片段(见下 文)，只要它们特异性结合天然多肽和/或展现出本发明的生物学活性或免疫学活性。依照 一个实施方案，抗体结合寡聚体形式的靶蛋白，例如三聚体形式。依照另一个实施方案，抗 体特异性结合蛋白质，该结合可受到本发明单克隆抗体(例如本发明保藏的抗体等)的抑 制。短语抗体的“功能性片段或类似物”指与所指抗体具有共同的定性生物学活性的化合 物。例如，本发明抗体的功能性片段或类似物可以是能特异性结合VEGF或α5β1的功能 性片段或类似物。在一个实施方案中，所述抗体能阻止或实质性降低VEGF诱导细胞增殖的 能力。“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其 天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其 它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry 法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得 至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下 的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成 分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至 少一个纯化步骤来制备。基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四 聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，因此包含 10个抗原结合位点；而分泌型IgA抗体可聚合而形成包含2-5个基本的4链单元及J链的 多价装配物)。在IgG的情况中，4链单元通常是约150，000道尔顿。每条轻链通过一个共 价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于 重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有 一个可变域(Vh)，接着是三个(对于α和Y链)或四个(对于μ和ε同种型)恒定域 (Ch)。每条轻链在N-末端具有一个可变域(VJ，接着是其另一端的一个恒定域(CJ。\与 Vh排列在一起，而Q与重链第一恒定域(ChI)排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链 和重链可变区之间形成界面。一个Vh和一个\ 一起配对而形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见例如《Basicand Clinical Immunology》，第8版，Daniel P. Stites, Abba I. Terr 禾口 Tristram G. Parslow(编)，Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994，第71页和第6章。根据其恒定域氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的L链可归入两种截然不同类 型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定域(Ch)氨基酸序列，免疫球蛋 白可归入不同的类别或同种型。有五类免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称 作α、δ、ε、Υ和μ的重链。根据Ch序列和功能的较小差异，、和α类可进一步分为 亚类，例如人类表达下列亚类=IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。术语“可变的”指可变域中的某些区段在抗体间序列差异广泛的实情。V结构域介 导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均勻分布于可变域 跨越的Iio个氨基酸。事实上，V区由15-30个氨基酸、称作框架区(FR)的相对不变异的 区段及将框架区分开的每个长度为9-12个氨基酸、称作“高变区”的极度变异的较短区域 组成。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形 成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高 变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位 点的形成(参见 Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunologicallnterest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991))。 ’g 定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细 胞毒性(ADCC)中抗体的参与。术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包 含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如\中的残基24-34 (Li)、50-56 (L2)和 89-97 (L3)附近及％中的残基31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102 (H3)附近(在一个实施方 案中，Hl在残基31-35附近)；Kabat etal.，见上文)和/或那些来自“高变环”的残基(例 如 Vl 中的残基 26-32 (Li)、50-52 (L2)和 91-96 (L3)及 Vh 中的残基 26-32 (Hl) ,53-55 (H2) 和 96-101 (H3) ；Chothia and Lesk，J. Mol. Biol. 196 :901_917 (1987))。本发明中的 HVR 区 包括下述位置轻链可变域的24-36 (LHVRl)、46_56 (LHVR2)、和89-97 (LHVR3)及重链可变 域的 26-35 (HHVRl)、47-65(HHVR2)和 93-102 (HHVR3) (Kabat 编号系统，Kabat et al.，见上 文 1991)。贯穿本说明书和权利要求书，Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约 是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat等，见上文(1991))。“EU编号 系统”或“EU指数”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat等，见 上文(1991)中报道的EU指数，明确收入本文作为参考)。除非本文中另有说明，提及抗体 可变域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及 抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成 群体的各抗体个体是相同的，除了可以以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克 隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不 同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特 异性之外，单克隆抗体的优势在于它们可以在未受到其它抗体污染的情况中合成。修饰语
20“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗 体可通过最初由Kohler等Nature 256 =495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过 重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见例如美国专利No. 4，816，567)。“单 克隆抗体”还可使用 Clackson 等 Nature352 :624_628 (1991) ；Marks 等 J. Mol. Biol. 222 581-597(1991)中记载的技术或使用下文实施例中列出的方法从噬菌体抗体库分离。单克隆抗体在本文中包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特 定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍 生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体 的片段，只要它们展现出本发明的生物学活性(参见美国专利No. 4，816，567 ；Morrison et al.，PNAS USA 81 :6851_6855 (1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长 类动物(例如旧大陆猴类(Old World Monkey)、猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区 序列的“灵长类化”抗体。“完整抗体”指包含抗原结合位点以及Q和至少重链恒定域CH1、Ch2和Ch3的抗 体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。优选 的是，完整抗体具有一项或多项效应器功能。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗 体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利 No. 5，641，870，实施例 2 ;Zapata et al. , Protein Eng. 8(10) 1057-1062 (1995))；单链抗 体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。表述“线性抗体”一般指 Zapata et al.，Protein Eng, 8 (10) 1057-1062 (1995) 中所描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该区段与互 补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的，或者是单特异性的。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，和一个残 余“Fe”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由一条完整轻链及一条重链的可 变域(Vh)和第一恒定域(ChI)组成。每个Fab片段对于抗原结合是单价的，即它具有一个 抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab' )2片段，它粗略相当于两个通过二 硫键相连的Fab片段，具有二价抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在ChI结构 域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个 半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab’的称谓。 F(ab' )2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。 还知道抗体片段的其它化学偶联形式。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应器功 能是由Fc区中的序列决定的，该区还是受到在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)识别 的部分。变异Fc区”包含由于至少一处本文所定义的“氨基酸修饰”而与天然序列Fc区有 所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区具有与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相 比至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约 10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。在一个实施方案中，变异Fc区在本文 中将与天然序列Fc区拥有至少约80 %的同源性，至少约85 %的同源性，至少约90 %的同源性，至少约95%的同源性或至少约99%的同源性。根据另一个实施方案，变异Fc区在本文 中将与亲本多肽的Fc区拥有至少约80 %的同源性，至少约85 %的同源性，至少约90 %的同 源性，至少约95%的同源性或至少约99%的同源性。术语“含Fc区多肽”指包含Fc区的多肽，诸如抗体或免疫粘附素(见下文定义)。 Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以消除，例如在纯化多肽的过程中 或者通过重组改造编码多肽的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的多肽(包括抗体) 的组合物可包含所有K447残基都被消除的多肽群体、无一 K447残基被消除的多肽群体、或 具有K447残基的多肽与没有K447残基的多肽的混合物。“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密、非共价结 合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中散发出六 个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特 异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别 和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。“单链Fv”，也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成一条多肽链的抗体Vh和\ 结构域的抗体片段。优选的是，sFv多肽在Vh和\结构域之间还包含多肽接头，使得sFv 形成抗原结合期望的结构。关于sFv的综述参见Pluckthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，vol. 113, Rosenburg 禾口 Moore 编，Springer-Verlag, New York, pp. 269-315，1994 ；Borrebaeck 1995，见下文。术语“双抗体”指通过在Vh和八结构域之间使用短接头(约5-10个残基)构建sFv 片段(见上一段)而制备的小型抗体片段，由于接头短，使得V结构域实行链间而非链内配 对，导致二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片 段的异二聚体，其中两种抗体的Vh和\结构域存在于不同多肽链上。双抗体更完整的描述 于例如 EP 404,097 ；W093/11161 ；Hollinger et al.，PNAS USA, 90 :6444_6448 (1993)。非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序 列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基 用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人 灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残 基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的 残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个、通 常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高 变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还包含至少部 分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al., Nature 321:522-525(1986) ；Riechmann etal. , Nature 332:323-329(1988) ；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992)。“物种依赖性抗体”指对来自第一哺乳动物物种的抗原具有强于该抗原来自第二 哺乳动物物种的同系物的结合亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”人类抗 原(即具有不超过约1χ10_7Μ，不超过约1χ10_8Μ，或不超过约1x10_9M的结合亲和力(Kd))， 但是对该抗原来自第二非人哺乳动物物种的同系物具有比其对人类抗原的结合亲和力弱 至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍的结合亲和力。物种依赖性抗体可以是上文定义的各种类型抗体，但是优选人源化抗体或人抗体。在此类实施方案中，根据荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)的 测定，多肽、抗体、拮抗剂或组合物结合“非靶物”蛋白质的程度将小于该多肽、抗体、拮抗剂 或组合物对其特定靶物蛋白质的结合的约10%。对于多肽、抗体、拮抗剂或组合物对靶分 子的结合，术语“特异结合”或“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶物上的表位或对其“特 异”意味着可测量的不同于非特异相互作用的结合。特异结合可通过例如测定分子的结合 并与对照分子的结合比较来测量，所述对照分子通常是结构相似但没有结合活性的分子。 例如，特异结合可通过与对照分子的竞争来测定，所述对照分子与靶物相似，例如过量的未 标记靶物。在这种情况中，若经标记靶物与探针的结合受到过量未标记靶物的竞争性抑制， 则指示特异结合。术语“特异结合”或“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶物上的表位或 对其“特异”在用于本文时可由例如对靶物的Kd为至少约10_4M，至少约10_5M，至少约10_6M， 至少约10_7M，至少约10_8M，至少约10_9M，至少约ΙΟ,Μ，至少约10_"Μ，至少约10_12Μ，或更大 的分子展现。在一个实施方案中，术语“特异结合”指这样的结合，其中分子结合特定多肽 或特定多肽上的表位，而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位。抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体 Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合和补 体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细 胞表面受体下调；和B细胞活化。“天然序列Fc区”包含与自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。 Fc序列的例子记载于例如但不限于Kabat等，见上文(1991)。关于本文中所鉴定的多肽和抗体序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”或“同 源性”定义为对比序列且将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与所比 较多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的 的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比 的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目 的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比 较计算机程序由Genentech公司编写，而且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权 局(US Copyright Office, Washington D. C.，20559)，并以美国版权注册号 TXU510087 注 册。公众可通过 Genentech 公司(South San Francisco, California)得到 ALIGN-2 程序。 ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4. OD上使用。所有序列比较参 数由ALIGN-2程序设定且不变。术语“Fe受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在一个实施方案中， 本发明的FcR指结合IgG抗体的FcR(y受体)，包括FcyRI、FcyRII和Fc γ RIII亚类 的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcyRII受体包括FCY RIIA( “活 化受体”)和FcyRIIB( “抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞 质结构域。活化受体Fc γ RIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基 序(ITAM)。抑制受体Fc γ RIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基 序(ITIM)(参见综述DaSron, Annu. Rev. Immunol. 15 :203_234(1997))。该术语包括同种异型(allotype)，诸如 Fc y RIIIa 同种异型:Fc γ RIIIA_Phel58、Fc y RIIIA-Vall58, Fc YRIIA-R131 和 / 或 Fc YRIIA-H131。FcR 的综述参见 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 457-492(1991) ；Capel et al. , Immunomethods 4:25-34(1994) ；de Haas et al.，J. Lab. Clin. Med. 126 :330_41 (1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未 来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J. Immunol. 117 587(1976) ；Kim et al.，J. Immunol. 24 :249(1994))。术语“FcRn”指新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn在结构上与主要组织相容性复合物 (MHC)相似，由非共价结合的α-链和β 2-微球蛋白组成。新生儿Fc受体FcRn的多种功 能的综述见 Ghetie and Ward(2000) Annu. Rev. Immunol. 18，739-766。FcRn 在免疫球蛋白 IgG自母体被动投递至幼仔和调节血清IgG水平中发挥作用。FcRn可起到补救受体的作 用，即在细胞中和穿越细胞结合和转运完整形式的被胞饮IgG，并挽救它们免于默认的降解 途径。WO 00/42072 (Presta)和 Shields et al. , J. Biol. Chem. 9 (2) :6591_6604 (2001) 记载了对FcR的结合得到改良或消除的抗体变体。将这些出版物的内容明确收入本文作为参考。人IgG Fc区的“CH1结构域”(也称为“Cl”或“HI”结构域)通常自大约氨基酸 118延伸至大约氨基酸215 (EU编号系统)。“铰链区”通常定义为自人IgGl的Glu216至Pro230的区段(Burton，Molec. Immunol. 22 161-206 (1985))。其它IgG同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形 成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgGl序列对比。Fc区的“较低位置处铰链区(lower hinge region) ”通常定义为紧挨着铰链区 C-末端的一段残基，即Fc区的残基233-239。在先前的报告中，FcR结合一般归功于IgG Fc区的较低位置处铰链区中氨基酸残基。人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“C2”或“H2”结构域)通常自大约氨基酸 231延伸至大约氨基酸340。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。而 是，有两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。 推测碳水化合物可能提供结构域_结构域配对的替代且有助于稳定CH2结构域。Burton， Molec. Immunol. 22 161-206(1985)。"CH3结构域”(也称为“C3”或“H3”结构域)包含Fc区中CH2结构域C-末端的 一段残基(即自抗体序列的大约氨基酸残基341至C末端，通常是IgG的氨基酸残基446 或 447)。“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包 括Clq结合、补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、 吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区 与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可使用多种测定法来评估，例如本文中所公开 的。“Clq”指包含供免疫球蛋白Fc区结合的位点的多肽。Clq与两种丝氨酸蛋白酶即 Clr和Cls —起形成复合物Cl，即补体依赖性细胞毒性(⑶C)途径的第一组分。人Clq可 购自例如 Quidel，San Diego, CA。
术语“结合结构域”指多肽中能结合另一分子的区域。在FcR的情况中，结合结构 域可以包含其多肽链(例如其α链)中负责Fc区结合的部分。一种有用的结合结构域是 FcRa链的胞外结构域。具有FcR结合亲和力或ADCC活性“改变”了的变异IgG Fc的抗体或肽体指与亲 本多肽或者与包含天然序列Fc区的多肽相比FcR结合活性(例如Fc γ R或FcRn)和/或 ADCC活性得到增强或减弱的抗体或肽体。“展现出对FcR的结合增加”的变异Fc以高于亲 本多肽或天然序列IgG Fc的亲和力(例如更低的表观Kd或IC50值)结合至少一种FcR。 依照一些实施方案，与亲本多肽相比结合的增强是约3倍，优选约5倍、10倍、25倍、50倍、 60倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、或500倍，或结合改进 约25%到1000%。“展现出对FcR的结合减少”的多肽变体以低于亲本多肽的亲和力(例 如更高的表观Kd或更高的IC50值)结合至少一种FcR。与亲本多肽相比结合减弱约5%、 10%、20%、30%、40%、50%、或 60%、或更多。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞 (例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌 型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀 死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝 对要求的。介导ADCC的主要细胞，即NK细胞，只表达Fc γ RIII，而单核细胞表达Fc γ RI、 Fc YRII 禾口 Fc yRIII。 Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9 457-92 (1991)第 464 页 表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测 定法，诸如美国专利No. 5，500, 362或5，821，337或下文实施例中所记载的。可用于此类测 定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在 体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS (USA) 95 652-656(1998)中所披露的。包含“展现出增强的ADCC”或在存在人效应细胞时比具有野生型IgG Fc的多肽或 亲本多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的变异Fc区的多肽指在具 有变异Fc区的多肽和具有野生型Fc区的多肽(或亲本多肽)在测定中的量基本上相同时 在体外或在体内显著更有效地介导ADCC的多肽。一般而言，此类变体使用本文中所披露的 体外ADCC测定法来鉴定，但是涵盖用于测定ADCC活性的其它测定法或方法，例如在动物模 型中。在一个实施方案中，优选的变体在介导ADCC方面比野生型Fc (或亲本多肽)更加有 效，约5倍到约100倍，例如约25倍到约50倍。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径 的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始 的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J. Immunol. Methods 202 =163(1996)中所记载的。具有改变的Fc区氨基酸序列和增强的或减弱的Clq结合能力的多肽记载于美国 专利No. 6，194，551和WO 99/51642。将这些专利出版物的内容明确收入本文作为参考。还 可参见 Idusogie et al.，J. Immunol. 164 :4178_4184 (2000)。“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。依照一个实施 方案，该细胞至少表达Fc γ RIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细 胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如如本文所述从血液或PBMC 分离。用于测量FcRn结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997，Hinton 2004), M 且记载于下文实施例。人FcRn高亲和力结合多肽对人FcRn的体内结合和血清半衰期可以 在例如表达人FcRn的转基因小鼠或转染人细胞系中，或者在施用了 Fc变异多肽的灵长类 动物中测定。在一个实施方案中，具体而言，具有变异IgG Fc的本发明抗α5β1抗体展现 出比具有野生型IgG Fc的多肽升高的结合亲和力，升高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至 少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少100倍、至少125倍、至少150倍。在一个 具体的实施方案中，对人FcRn的结合亲和力提高了约170倍。关于对FcRn的结合亲和力，在一个实施方案中，所述多肽的EC50或表观Kd(在 ΡΗ6.0)小于luM，更优选小于或等于ΙΟΟηΜ，更优选小于或等于ΙΟηΜ。在一个实施方案中， 关于升高的对Fc γ RIII (F158 ；即低亲和力同种型)的结合亲和力，EC50或表观Kd小于或 等于ΙΟηΜ，而对Fc y RIII (V158 ；高亲和力同种型)，EC50或表观Kd小于或等于3nM。依 照另一个实施方案，若测试抗体和对照抗体结合曲线在中点处的吸光度数值的比例(例如 Α45ο (α#)/Α45ο ( #))小于或等于40%，则抗体对Fc受体的结合相对于对照抗体(例如 Herceptin 抗体)的降低可以认为是相对于对照抗体是显著的。依照另一个实施方案， 若测试抗体和对照抗体结合曲线在中点处的吸光度数值的比例(例如A45(lmi(a#)/A45(lnmWMtt 体))大于或等于125%，则抗体对Fc受体的结合相对于对照抗体(例如Herceptin 抗体) 的升高可以认为是相对于对照抗体显著的。“亲本多肽”或“亲本抗体”指包含产生变异多肽或抗体的氨基酸序列且所述变 异多肽或抗体与之进行比较的多肽或抗体。典型的是，亲本多肽或亲本抗体缺少一处或多 处本文中所公开的Fc区修饰且与本文中所公开的多肽变体相比在效应器功能方面有所不 同。亲本多肽可以包含天然序列Fc区或具有预先存在氨基酸序列修饰(诸如添加、删除和 /或替代)的Fc区。本发明的抗体可以衍生自噬菌体展示。在用于本文时，“文库”或“库”指众多抗体 或抗体片段序列，或者编码这些序列的核酸，这些序列在根据本发明方法导入这些序列的 变异氨基酸组合方面是不同的。“噬菌体展示”是一种将变异多肽作为与外壳蛋白至少一部分的融合蛋白展示在 噬菌体(例如丝状噬菌体)颗粒表面上的技术。噬菌体展示的效用在于能够对随机化蛋 白质变体的大型文库快速且高效分选那些能以高亲和力与靶抗原结合的序列的实情。肽 和蛋白质文库在噬菌体上的展示已经用于对数以百万计的多肽筛选那些具有特异性结合 特性的多肽。多价噬菌体展示法已经用于展示小随机肽和小蛋白，其通过与丝状噬菌体 的基因 III 或基因 VIII 融合来实现。Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 355-362(1992)，及其中引用的参考文献。在单价噬菌体展示中，将蛋白质或肽文库与基因 III或其一部分融合，并在存在野生型基因III蛋白时以低水平表达，使得噬菌体颗粒展示 一个拷贝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。亲合效应(avidity effect)相对于多价噬菌体 得到了降低，使得分选基于内在的配体亲和力，而且使用噬菌粒载体，这简化了 DNA操作。 Lowman and WellsiMethods :A companion toMethods in Enzymology 3:205-0216(1991)。
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“噬菌粒”是具有细菌复制起点(例如ColEl)和噬菌体基因区间拷贝的质粒载体。 噬菌粒可利用任何已知噬菌体，包括丝状噬菌体和λ类噬菌体。质粒一般也包含抗生素抗 性的可选择标志物。克隆入这些载体的DNA区段可以像质粒一样扩增。在给容纳这些载体 的细胞提供生成噬菌体颗粒所必需的所有基因时，质粒的复制模式变成滚环复制，以生成 质粒DNA的一条链的拷贝，并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌体颗 粒。此术语包括这样的噬菌粒，它们包含与异源多肽基因连接成基因融合物的噬菌体外壳 蛋白基因或其片段，使得异源多肽展示在噬菌体颗粒的表面上。术语“噬菌体载体”指包含异源基因且能够复制的双链复制型噬菌体。噬菌体载 体具有容许噬菌体复制和噬菌体颗粒形成的噬菌体复制起点。噬菌体优选是丝状噬菌体， 诸如M13、fl、fd、Pf3噬菌体或其衍生物，或者是λ类噬菌体，诸如λ、21、φ80、φ81、82、 424、434等或其衍生物。对多肽诸如肽体、免疫粘附素、抗体和短肽的共价修饰包括在本发明的范围内。一 种类型的共价修饰包括使多肽的靶氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，该有机衍生化试剂 能够与多肽的选定侧链或者N-或C-末端残基起反应。用双功能剂进行的衍生化可用于例 如使多肽与不溶于水的支持基质或表面交联，以用于纯化抗体的方法，反之亦然。常用的 交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰基)-2_苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯例如与 4_叠氮水杨酸形成的酯、同双功能亚氨酸酯包括二琥珀酰亚氨基酯诸如3，3' -二硫代双 (琥珀酰亚氨基_丙酸酯)、双功能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷和诸如甲 基-3-[(对_叠氮苯基)二硫代]丙酰亚胺酸酯等试剂。其它修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为谷氨酰和天冬氨酰残 基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组 氛酸侧链的 α -氛基的甲基化(Τ. Ε. Creighton，Proteins :Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co. ，San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-$立溝月安的乙酉jHt， 及任何C-末端羧基的酰胺化。其它修饰包括将毒素偶联至拮抗剂诸如美登素和美登木素生物碱类、加利车霉素 和其它细胞毒剂。对多肽的另一类共价修饰包括，以美国专利Nos. 4，640, 835 ；4, 496，689 ； 4，301，144 ；4, 670，417 ；4, 791，192或4，179，337所述方式，将多肽与多种非蛋白质性质的 聚合物之一连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化亚烷基(polyoxyalkylene)。如果有利的话，还可以以形成嵌合分子的方式修饰本发明的多肽，所述嵌合分子 包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的多肽(例如免疫粘附素或肽体)。在一个实施方案中，此类嵌合分子包括多肽与蛋白质转导结构域的融合物，所述 蛋白质转导结构域将多肽靶向投递至多种组织，更具体的说就是穿过血脑屏障，其中使用 例如人免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白质转导结构域(Schwarze et al.，1999，Science 285 1569-72)。在另一个实施方案中，此类嵌合分子包括带有标签多肽的多肽的融合物，所述标 签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于多肽的氨基或羧基末 端。此类带表位标签形式的多肽的存在可使用针对所述标签多肽的抗体来检测。而且，表位 标签的提供使多肽易于使用抗标签抗体或另一类结合所述表位标签的亲和基质通过亲和
27纯化来纯化。多种标签多肽及其各自抗体是本领域已知的。例子包括多组氨酸(poly-his) 或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5 (Field et al.，Mol. Cell. Biol. 8 :2159_2165 (1988)) ；c-myc 标签及其抗体 8F9、3C7、6E10、G4、 B7 ^P 9E10 (Evan et al. , Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616(1985))；及单 纯疱疹病毒糖蛋白 D(gD)标签及其抗体(Paborsky et al.，Protein Engineerings (6) 547-553(1990))。其它标签多肽包括 Flag 肽(Hopp et al.，BioTechnology 6 1204-1210(1988)) ；KT3 表位肽(Martin et al.，Science 255:192-194(1992)) ； α -微管 蛋白表位肽(Skinner et al. ,J. Biol. Chem. 266 15163-15166 (1991))；及 T7 基因 10 蛋白 月太标签(Lutz-Freyermuth et al.，PNAS USA 87 :6393_6397 (1990))。在一个备选实施方案中，嵌合分子可包括多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区 域的融合物。对于二价形式的嵌合分子(例如“免疫粘附素”)，此类融合物可以是与IgG分 子Fc区的融合。本发明的Ig融合物包括大致包含或只包含人的残基94-243、残基33-53 或残基33-52以置换Ig分子内的至少一个可变区的多肽。在一个特别优选的实施方案中， 免疫球蛋白融合物包含IgGl分子的铰链、CH2和CH3，或者铰链、CHl、CH2和CH3区。关于 免疫球蛋白融合物的制备还可参见美国专利No. 5，428，130。本发明提供了用于抑制或预防复发的肿瘤生长或复发的癌细胞生长的方法和组 合物。在各种实施方案中，癌指复发的肿瘤生长或复发的癌细胞生长，其中癌细胞的数目没 有显著减少，或者增多了，或者肿瘤体积没有显著缩小，或者增大了，或者癌细胞体积或数 目未能有进一步缩小/减少。确定癌细胞是否是复发的肿瘤生长或复发的癌细胞生长可以 通过本领域关于测定治疗对癌细胞有效性知道的任何方法在体内或在体外进行。对抗VEGF 治疗有抗性的肿瘤是复发的肿瘤生长的一个例子。本文中所公开的多肽、抗体、拮抗剂、或组合物的“有效量”指足以实现明确规定的 目的的量。“有效量”可凭经验且以已知方法，联系规定的目的来确定。术语“治疗有效量”指在哺乳动物(aka患者)中有效“治疗”疾病或病症的本发明 抗体、多肽、或拮抗剂的量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数目；缩小肿 瘤体积或重量；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即 一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻 与癌症有关的一种或多种症状。就药物可预防现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程 度而言，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。在一个实施方案中，治疗有效量是生长 抑制量。在另一个实施方案中，治疗有效量是延长患者存活的量。在另一个实施方案中，治 疗有效量是改进患者无进展存活的量。在伤口愈合的情况中，术语“有效量”或“治疗有效量”指药物有效加速或改进受 试者中的伤口愈合的量。治疗剂量指对患者展现出治疗效果的剂量，而亚治疗剂量指对所 治疗的患者不展现出治疗效果的剂量。“慢性伤口 ”指不愈合的伤口。参见例如Lazarus et al.，Definitions andguidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130 =489-93 (1994) 0慢性伤口包括但不限于例如动脉溃疡、糖尿病性溃疡、压 迫性溃疡、静脉溃疡等。急性伤口可以发展成慢性伤口。急性伤口包括但不限于由例如热 伤、外伤、手术、大面积皮肤癌切除、深部真菌和细菌感染、血管炎、硬皮病、天疱疮、中毒性表皮坏死松解症等引起的伤口。参见例如Buford，Wound Healing and Pressure Sores, Healingffell. com, 2001年10月24日出版。“正常伤口”指经历正常伤口愈合修复的伤口。本发明多肽、抗体、拮抗剂或组合物的“生长抑制量”指能够在体外或在体内抑制 细胞，尤其是肿瘤，例如癌细胞生长的量。本发明多肽、抗体、拮抗剂或组合物为了抑制赘生 性细胞生长的“生长抑制量”可以凭经验和通过已知方法或本文中提供的例子来确定。本发明多肽、抗体、拮抗剂或组合物的“细胞毒性量”指能够在体外或在体内引起 细胞，尤其是肿瘤，例如癌细胞破坏的量。本发明多肽、抗体、拮抗剂或组合物为了抑制赘生 性细胞生长的“细胞毒性量”可以凭经验和通过本领域已知方法来确定。“自身免疫病”在本文中指因个体自身组织引起的和针对个体自身组织的疾病 或病症或其共分离(co-segregate)或表现或者由此产生的疾患。自身免疫性疾病或病 症的例子包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎诸如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、 痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、感染性关节炎、莱姆 (Lyme)关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节炎和幼发型类风湿性关节炎， 骨关节炎，慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)，变形性关节炎，慢 性原发性多关节炎，反应性关节炎，和强直性脊柱炎)，炎性过度增殖性皮肤病，银屑病诸 如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑病，皮炎包括接触性皮炎、慢性接 触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎，χ连锁的高IgM综 合征，荨麻疹诸如慢性特发性荨麻疹包括慢性自身免疫性荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，青少 年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化诸如系统性硬 化、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼(spino-opticaDMS、原发性进行性MS和复发性消退 性(relapsingremittir^MS、进行性系统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化 (sclerosis disseminata)和共济失调性(ataxic)硬化，炎性肠病(IBD)(例如克罗恩 氏(Crohn)病，结肠炎诸如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, colitis ulcerosa)、微 观(microscopic)结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠 炎，和自身免疫性炎性肠病)，坏疽性脓皮症，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，巩膜外层 炎)，呼吸窘迫综合征包括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，整个或部分葡萄 膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液学病症，类风湿性脊椎炎，突发性听觉丧失， IgE介导的疾病诸如过敏反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen) 脑炎和边缘系和/或脑干脑炎，葡萄膜炎诸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄 膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎， 具有和没有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免 疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN、膜性增殖性GN(MPGN)包括I型和II 型、和急进性GN，变应性疾患，变应性反应，湿疹包括变应性或特应性湿疹，哮喘诸如支气 管哮喘(asthma bronchiale, bronchial asthma)和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和 慢性炎性应答的疾患，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，系统性红 斑狼疫(SLE) (systemic Iupuserythematosus, systemic lupus erythematodes)诸如皮 肤SLE、亚急性皮肤红斑狼疮、新生儿狼疮综合征(NLE)、播散性红斑狼疮、狼疮(包括狼疮 肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、盘状狼疮、狼疮脱发)，幼发型(I型)糖尿病包括儿 科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成人期发作的糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答， 结核病，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病，粒细胞 缺乏，血管炎病包括血管炎(包括大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏 (Takayasu))动脉炎)，中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和结节性多动脉炎)，微 观(microscopic)多动脉炎，CNS血管炎，坏死性、皮肤性或超敏感性血管炎，系统性坏死性 血管炎，和ANCA相关血管炎诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或综合征(CSS))，颞 动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，库姆斯(Coombs)阳性贫血，戴-布 二氏(Diamond Blackfan)贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性 贫血(AIHA),恶性贫血(pernicious anemia, anemia perniciosa),阿狄森氏(Addison) 病，单纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性粒 细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞渗出的疾病，CNS炎性病症，多器 官损伤综合征诸如那些败血症、外伤或出血继发的，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小 球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，贝切特氏(Bechet或Behcet)病，卡斯尔 曼氏(Castleman)综合征，古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征，雷诺氏(Reynaud)综合 征，斯耶格伦氏(Sjogren)综合征，史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征，类天疱疮诸如 大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱 疮型天疱疮和红斑性天疱疮)，自身免疫性多内分泌病，莱特氏(Reiter)病或综合征，免 疫复合物肾炎，抗体介导的肾炎，慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经病，血 小板减少症(例如心肌梗死患者发生的)包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免 疫或免疫介导的血小板减少症诸如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP， 睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退症，甲 状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎诸如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏 (Hashimoto)病、慢性甲状腺炎(桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎，自身 免疫性甲状腺病，特发性甲状腺功能减退症，格雷夫斯氏(Graves)病，多腺性综合征诸如 自身免疫性多腺体综合征(或多腺性内分泌病综合征)，瘤外综合征包括神经学瘤外综合 征诸如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特(Lambert-Eaton)综 合征，僵体或僵人综合征，脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis, encephalomyelitisallergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力，小脑变 性，神经性肌强直，视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，和感觉神经病，席汉氏 (Sheehan)综合征，自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性 肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，淋巴样间质性肺炎，梗阻性细支气管炎(非移植)对 NSIP，格-巴二氏(Guillain-Barre)综合征，贝格尔氏(Berger)病(IgA肾病)，特发性 IgA肾病，线性IgA皮肤病，原发性胆汁性肝硬化，肺硬变，自身免疫性肠病综合征，乳糜泻， 腹部疾病，口炎性腹泻(麸质肠病)，顽固性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白血 症、肌萎缩侧索硬化(ALS)(卢格里克氏(Lou Gehrig)病)，冠状动脉病，自身免疫性内耳 病(AIED)或自身免疫性听觉丧失，视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，多软骨炎诸如顽固性 或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，淀粉样变，巩膜炎，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋巴 细胞增多包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和性质未确定的 单克隆丙种球蛋白病(MGUS))，周围神经病，瘤外综合征，通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病，孤独症，炎性肌病，局灶性节段性肾 小球硬化(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝脏病学 病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特氏(Schmidt)综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老 性痴呆，脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病，糖尿病肾病，德雷斯勒氏(Dressier)综合征， 斑秃，CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏(Raynaud)现象、食道运动功能障碍、指端硬化 和毛细管扩张)，男性和女性自身免疫性不孕不育，混合性结缔组织病，恰加斯氏(Chagas) 病，风湿热，习惯性流产，农民肺，多形红斑，心脏切开术后综合征，柯兴氏(Cushing)综合 征，养鸟者肺，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞性血管炎，阿尔波特氏(Alport)综 合征，肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风，疟疾，利什 曼病，锥虫病(kypanosomiasis)，血吸虫病，蛔虫病，曲霉病，Sampter氏综合征，卡普兰 氏(Caplan)综合征，登革，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺 纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)，胎儿成红细胞增多症，嗜曙红细胞性筋膜炎(faciitis)、舒尔曼氏(Shulman) 综合征，费尔提氏(Felty)综合征，flariasis，睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状 体炎、虹膜睫状体炎或Fuch氏睫状体炎，亨诺-许兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人 免疫缺陷病毒(HIV)感染，艾柯病毒感染，心肌病，阿尔茨海默氏(Alzheimer)病，细小病 毒感染，风疹病毒感染，种痘后综合征，先天性风疹感染，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Ban·) 病毒感染、腮腺炎，埃文斯(Evans)综合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏(Sydenham) 舞蹈病，链球菌后肾炎，闭塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)，甲状腺毒症， 脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞性多肌痛，内分泌性眼病，慢性超敏感性肺炎，干燥性角膜结膜 炎，流行性角膜结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血-再灌注损 伤，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道疾病，硅沉着病，口疫，口疮性 口炎，动脉硬化性病症，无精子发生(aspermiogenese)，自身免疫性溶血，伯克氏(Boeck) 病，冷球蛋白血症，杜普伊特伦氏(Dupuytren)挛缩，晶体过敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica)，变应性小肠炎(enteritis allergica)，麻风节结性红斑，特发性 面瘫，慢性疲乏综合征，风湿热(febris rheumatica)，哈-里二氏(Hamman-Rich)病，感 觉神经性听觉丧失，阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)，性腺功能减 退，局限性回肠炎(ileitisregionalis)，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯性 (traverse)脊髓炎，原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmia symphatica)， 肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa)，胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮症，奎 尔万氏(Quervain)甲状腺炎，获得性脾萎缩，由于抗精虫抗体的不育症，非恶性胸腺瘤， 白癜风，SCID和爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Ban·)病毒相关疾病，获得性免疫缺陷综合征 (AIDS)，寄生虫病诸如利什曼虫，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的疾患， 白细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应 答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原_抗体复合物介导的疾病，抗肾小球 基底膜病，变应性神经炎，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性粘液水肿，自身免疫性萎 缩性胃炎，交感性眼炎，风湿病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，周 围神经病，自身免疫性多腺性综合征I型，成人期发作的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)， 全秃，扩张型心肌病，获得性大疱性表皮松解(印idermolisis bullosa acquisita，EBA)，血色素沉着，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或 慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎，上颂窦炎或蝶窦炎，嗜曙红细胞相关病症诸如嗜曙红细胞增 多症、肺嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏(Loffler)综合 征、慢性嗜曙红细胞性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含有嗜 曙红细胞的肉芽肿，过敏反应，血清阴性脊椎关节炎病，多内分泌自身免疫病，硬化性胆管 炎，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝酵母病，布鲁顿氏(Bruton)综合征，婴儿期一过性 低丙种球蛋白血症，威斯科特-奥尔德里齐(Wiskott-Aldrich)综合征，共济失调性毛细 管扩张，与以下各项有关的自身免疫性病症胶原病、风湿病、神经病学疾病、缺血再灌注紊 乱、血压应答降低(reduction in blood pressure response)、血管功能障碍、毛细管扩张 (antgiectasis)、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血和伴随血管化的疾病，变应性超 敏感性病症，肾小球肾炎病，再灌注损伤，心肌或其它组织的再灌注损伤，具有急性炎性成 分的皮肤病，急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症，粒细胞输血相关综合征，细 胞因子诱发的中毒，急性重度炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，肺硬变，糖尿病性视网膜病， 糖尿病性大动脉病症，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎，和子宫内膜异位症。术语“检测”意图包括测定物质的存在与否或对物质的量定量。该术语如此指将 本发明的材料、组合物、和方法用于定量和定性测定。一般而言，用于检测的具体技术对于 本发明的实施不是至关重要的。例如，依照本发明的“检测”可以包括观察α5基因产物、β 基因产物(例如 mRNA分子)、或者α 5或α 5 β 1多肽的存在与否；α 5或α 5 β 1多肽水平或结合至靶物的 量的变化；α5或α 5β1多肽的生物学功能/活性的变化。在一些实施方案中，“检测”可 以包括检测野生型α 5或α 5 β 1水平(例如mRNA或多肽水平)。检测可以包括对与对照 相比介于10%和90%之间任何数值、或介于30%和60%之间任何数值、或超过100%的变 化(升高或降低)的定量。检测可以包括对介于2倍和10倍之间(含两端值)任何数值 或更大(例如100倍)的变化的定量。“标记物”在用于本文时指与抗体直接或间接偶联的可检测化合物或组合物。标记 物自身可以是通过自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶 标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。III.抗 α5β1 抗体本文中提供了能结合人α5β1且竞争性抑制抗α5β1抗体结合人α 5 β 1的抗 体。因而，本发明的一个实施方案提供了包含SEQ ID N0:l、2、3、或4任一所列轻链可变域 (VL)序列和SEQ ID NO :5、6、7、8、或9任一所列重链可变域(VH)序列的抗体。还涵盖所保 藏杂交瘤的抗体的人形式抗体或嵌合形式抗体。依照一个实施方案，所述抗体能以介于500ηΜ和IpM之间的Kd结合人α 5β 1。依 照另一个实施方案，所述抗体不结合ανβ3或ανβ5或ανβ 。依照另一个实施方案，所 述抗体包含人IgG，例如人IgGl或人IgG4的Fc序列。在另一个实施方案中，Fc序列已经 改变或者有其它方式变化，使得它缺乏抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)效应器功能，这 常常与它们对Fc受体(FcR)的结合有关。可改变效应器功能的Fc序列变化或突变有许多 例子。例如，W000/42072 和 Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2) :6591_6604 (2001)记载了 具有提高的或降低的FcR结合的抗体变体。将这些出版物的内容明确收入本文作为参考。所述抗体可以是Fab、Fab，、F(ab)，2、单链FV(SCFV)、FV片段；双抗体(diabody)和线性抗 体的形式。同样，所述抗体可以是能结合α 5β1的多特异性抗体，而且是α5β1拮抗剂， 但是还能结合一种或多种其它靶物并抑制其功能(例如VEGF)。所述抗体可以偶联至治疗 剂(例如细胞毒剂、放射性同位素和化疗剂)或标记物，后者用于检测患者样品中的α 5β 1 或者通过成像(例如放射性同位素、荧光染料和酶)用于检测体内α5β1。还涵盖编码抗α 5β 1抗体的核酸分子、包含编码两种可变域之一或二者的核酸 分子的表达载体、及包含所述核酸分子的细胞。这些抗体可用于本文所述疗法和用于检测 (例如通过FACS、免疫组化(IHC)、ELISA测定法)患者样品中的或患者中的α5β1蛋白。Α.单克隆抗体单克隆抗体可使用例如杂交瘤方法来制备，诸如那些由Kohler andMilstein, Nature, 256 =495(1975)记载的，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No. 4,816, 567)来 制备，或者可以通过下文实施例所述的方法来生成。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫仓 鼠、小鼠、或其它适宜的宿主动物以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将 特异性结合所述免疫剂。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫剂通常包括感兴趣蛋白质的多肽或融合蛋白或者包含该蛋白质的组合物。一 般而言，若想要人起源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(PBL)；或者，若想要非人哺乳动物 来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与 永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies principles and Practice, New Yourk，Academic Press，1986，pp. 59-103)。永生化细胞系通常是经转化的 哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛、和人起源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤 细胞系。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中培养，所述培养基优选含有抑制未融合的永生 化细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖 转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷 (HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选的永生化细胞系是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平表 达抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。更优选的永生化细胞系是鼠骨髓瘤系，其 可以从例如索尔克研究所细胞分配中心(Salk InstituteCell Distribution Center, San Diego, California, USA)和美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA)获得。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也 已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor，J. Immunol. 133 =3001(1984) ；Brodeur et al.， Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987，pp.51-63)。然后可以对杂交瘤细胞正在其中培养的培养液测定针对多肽的单克隆抗体的存 在。可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫 吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。此类技术和测 定法是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107 220(1980)的 Scatchard 分析来测定。在鉴定出想要的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标 准方法进行培养(Goding，见上文)。适于这一目的的培养基包括例如Dulbecco氏改良
33Eagle氏培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在哺乳动物中作为腹水进行体 内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-S印harose、羟磷灰石层析、凝 胶电泳、透析或亲和层析，自培养液或腹水分离或纯化亚克隆分泌的单克隆抗体。单克隆抗体还可以通过重组DNA方法来制备，诸如美国专利No. 4，816，567中所记 载的。编码本发明单克隆抗体的DNA可以容易的使用常规规程分离和测序(例如通过使 用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以本发明的杂交瘤细 胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转 染到原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以修饰DNA，例如通 过替代即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利No. 4，816，567 ； Morrison et al.，见上文)，或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球 蛋白编码序列共价连接。可以用此类非免疫球蛋白多肽替代本发明抗体的恒定域，或者可 以用它们替代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变域，以创建嵌合二价抗体。所述抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域已知的。例如，一 种方法牵涉重组表达免疫球蛋白轻链和经修饰的重链。所述重链一般在Fc区中任何位点 处截短以防止重链交联。或者，将相关半胱氨酸残基用另一种氨基酸残基替代或者删除以 防止交联。体外方法也适用于制备单价抗体。消化抗体以生成其片段，特别是Fab片段，可以 使用但不限于本领域已知技术来实现。B.人抗体和人源化抗体抗体可以是人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式指通常最低 限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如 Fv.Fab.Fab'、F(ab' )2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白 (受体抗体)中的CDR残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如 小鼠、大鼠或家兔的CDR残基替换的抗体。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基 用相应的非人残基替换。人源化抗体还可包含在受体抗体和输入CDR或框架序列中都没有 发现的残基。通常，人源化抗体可以包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其 中所有或基本上所有CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，且所有或基本上所有FR是人免疫 球蛋白共有序列的FR。人源化抗体优选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是 人免疫球蛋白的恒定区(Jones et al.，Nature 321 :522_525 (1986) ；Riechmann et al.， Nature 332 :323_329(1988) ；Presta, Curr. Op.Struct. Biol. 2 :593_596(1992))。用于人源化非人抗体的一些方法在本领域和下文实施例中有描述。通常，人源化 抗体中引入了一个或多个来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输 入”残基，它们通常取自“输入”可变域。依照一个实施方案，人源化可基本上遵循Winter 及其同事的方法进行(Jones et al. , Nature 321:522-525(1986) ；Riechmann et al.， Nature 332:323-327(1988) ；Verhoeyen et al. ,Science 239 1534-1536 (1988))，即用啮 齿类CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是这样的抗体(美 国专利No. 4，816，567)，其中基本上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些⑶R残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类 似位点的残基替代的人抗体。作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成这样的转基因动 物(例如小鼠)，它们在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体 完整全集。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删 除导致内源性抗体生成的完全抑制。将大量人种系免疫球蛋白基因转移到此类种系突变 小鼠中将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，PNAS USA 90: 2551 (1993) Jakobovits etal.，Nature 362 255-258 (1993) ；Bruggemann et al.，Year in Immunol. 7 33 (1993)；美国专利 No. 5，545，806，5，569，825，5，591，669 ；5，545，807 ； WO 97/17852。或者，可以如下生成人抗体，即将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例 如内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的小鼠。在攻击时，观察到人抗体的生成在所 有方面与在人中看到的密切相似，包括基因重排、装配、和抗体全集。这种方法记载于例如 美国专禾Ij No. 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；和 5，661，016， 及 Marks et al.，Bio/Technology, 10 :779_783(1992) ；Lonberg et al.，Nature,368 856-859(1994) ；Morrison, Nature, 368 812-813 (1994) ；Fishwild et al. , Nature Biotechnology,14 845-851 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology,14 826(1996)； Lonberg and Huszar, Intern, Rev.Immunol. , 13 65-93(1995)。或者，噬菌体展示技术(McCaffertyet al.，Nature 348 :552_553 (1990))可用 于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变域(V)基因全集生成人抗体和抗体片段。 依照这种技术的一个实施方案，将抗体可变域序列以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌 体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗 体片段。噬菌体展示可以以多种形式进行，例如下文实施例部分所述，或者综述参见例如 Johnson, Kevin S. andChiswell, David J. , Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson et al. ,Nature 352 624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库中分离出大量不同的抗 噁唑酮抗体。可基本上遵循Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1991)或Griffith et al.，EMBO J. 12 :725_734 (1993)所记载的技术，由未免疫人供体构建V基因全集和分离针 对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No. 5，565，332和5，573,905。如上所述，还可通过体外激活B细胞来生成人抗体(参见美国专利No. 5，567，610 和 5，229，275)。人抗体还可以使用本领域已知的多种技术来生产，包括噬菌体展示库 (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. ,227 381(1991) ；Marks et al. , J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985)和 Boerner et al.，J. Immunol.，147 (1) :86_95 (1991))。C.多特异性抗体多特异性抗体指对两种或更多种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人 抗体或人源化抗体(例如，双特异性抗体对至少两种抗原具有结合特异性)。例如，结合特 异性之一可以是针对α 5β 1蛋白质，结合特异性之另一可以是针对任何其它抗原。依照一个优选的实施方案，另一抗原是细胞表面蛋白或受体或受体亚基。例如，所述细胞表面蛋白 可以是天然杀伤(NK)细胞受体。如此，依照一个实施方案，本发明的双特异性抗体可结合 α 5β 1 禾口 VEGF 二者。用于构建双特异性抗体的合适方法是本领域公知的。例如，双特异性抗体的 重组生产基于两对免疫球蛋白重链/轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性 (Millstein and Cuello, Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随 机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其 中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤来进行正确分子的纯化。类 似的规程披露于 WO 93/08829 及 Traunecker et al. , EMBO 10:3655-3659(1991)。可以将具有期望结合特异性(抗体_抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白 恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域 进行融合。优选的是，在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒 定区(CHl)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开 的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见 例如 Suresh et al. , Methods in Enzymology 121 :210(1986)。还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。 例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al. , J. Immunol. 148(5) 1547-1553(1992)。将来自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗 体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗 体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger et al.，PNAS USA 90: 6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段 包含通过接头相连的VH和VL，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。 因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此 形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv (sFv) 二聚体构建双特异性抗体片段的 另一种策略。参见 Gruber et al.，J. Immunol. 152 :5368 (1994)。设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al., J. Immunol. 147 60(1991)。D.异源偶联抗体异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。此类抗体建议用于例如将免疫系统 细胞靶向不想要的细胞(美国专利No. 4，676，980)及用于治疗HIV感染(W0 91/00360 ；WO 92/200373 ；EP 03089)。设想了可在体外使用合成蛋白质化学的已知方法制备抗体，包括那 些涉及交联剂的方法。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。 适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚氨酸 甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美国专利 No. 4，676，980 中所公开的。E.效应器功能工程改造可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，从而增强例如抗体在治疗癌症中 的效力。例如，可向Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此 生成的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体 依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见 Caron etal.，J. Exp. Med. 176 :1191_1195 (1992)和Shopes, J. Immunol. 148 :2918_2922 (1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使 用如 Wolff et al.，Cancer Research 53:2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来 制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见 Stevenson et al. , Anti-Cancer Drug Design 3 :219_230(1989)。可以进行Fc区序列中的突变或改变以改进FcR结合(例如Fc y R、FcRn)。依照 一个实施方案，本发明的抗体具有至少一项改变的选自下组的效应器功能:ADCC、⑶C、和改 进的FcRn结合，所述改进与天然IgG或亲本抗体相比。数种有用的特定突变的例子记载于 例如 Shields，RL et al. (2001) JBC276 (6) 6591-6604 ；Presta, L. G. , (2002) Biochemical Society Transactions 30(4) 487-490 ；WO 00/42072。依照一个实施方案，Fc受体突变是选自下组的至少一个位置的替代Fc区的238、 239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、 285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、 324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、 389、398、414、416、419、430、434、435、437、438 或 439，其中 Fc 区的残基编号方式依照 EU 编 号系统。在一些实施方案中，Fc受体突变是D265A替代。在一些实施方案中，Fc受体突变 是N297A替代。美国专利No. 7，332，581列出了别的合适的突变。F.免疫偶联物本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗 剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放 射偶联物)。上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及 其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根 毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石 竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂 草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogel 1 in)、 局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素 (trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括212Bi、mI、mIn、 90Y 和 186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀 酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己 二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双 叠氮化合物(诸如双(对_叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮 苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如 1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238 1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基 二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。在另一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤 预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶 联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲合素)。G.免疫脂质体本文中所公开的抗体还可配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体可通过本领域已 知方法来制备，诸如 Epstein et al.，PNAS USA 82 3688(1985) ；Hwang et al.，PNAS USA 77 =4030(1980)；美国专利No. 4，485，045和4，544，545。循环时间延长的脂质体披露于美 国专利 No. 5，013，556。可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物 通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，产生具有期 望直径的脂质体。可如Martin et al. , J. Biol. Chem. 257 286-288 (1982)中所述，将本发 明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。还任选在脂质体中包含抗肿瘤剂、 生长抑制剂、或化疗剂(诸如多柔比星(Doxorubicin))。参见Gabizon et al.，J. National Cancer Inst. 81(19) 1484(1989)。IV.使用抗α 5 β 1抗体的治疗方法可以对受试者(例如哺乳动物，诸如人)施用本发明的抗α5β1抗体来治疗涉 及异常血管发生和/或血管通透性或渗漏的疾病和病症，包括例如癌症、眼病、和免疫病症 (例如自身免疫性病症)。施用可以通过任何合适路径，包括例如静脉内、肌肉内、或皮下。在一些实施方案中，与第二、第三、或第四药剂(包括例如抗肿瘤剂、生长抑制剂、 细胞毒剂、或化疗剂)组合地施用本发明的抗α 5 β 1抗体来治疗涉及异常血管发生和/或 血管通透性或渗漏的疾病或病症。在一些实施方案中，抗α 5β1抗体偶联有别的药剂。在一些实施方案中，与VEGF拮抗剂组合地施用抗α 5 β 1抗体。抗α 5 β 1抗体和 别的药剂(例如VEGF拮抗剂)可以伴随或序贯施用。或者，受试者可以用所述VEGF拮抗 剂治疗，随后施用所述α 5 β 1拮抗剂，例如用VEGF拮抗剂治疗，直至受试者对VEGF拮抗 剂治疗没有响应，然后受试者用α5β1拮抗剂治疗。依照一个实施方案，受试者在癌是非 侵入性的时候用VEGF拮抗剂治疗，而在癌是侵入性的时候用α5β1拮抗剂治疗。有些与 无病患者或对照相比天然经历升高的α 5 β 1水平或者响应VEGF拮抗剂疗法而经历升高的 α 5β 1水平的患者可以是尤其对此联合疗法有响应的。本发明涵盖还包括治疗剂(例如抗 肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂和细胞毒剂)的组合(combination)。例如，有待用化疗(例 如伊立替康)和α 5β1拮抗剂治疗的患者或已经用化疗和α 5β1拮抗剂治疗过的患者可 受益于VEGF拮抗剂疗法。或者，已经用化疗和VEGF拮抗剂治疗过的患者可受益于α5β1 拮抗剂疗法。在一个优选的实施方案中，所述抗VEGF抗体是Avastin 抗体。在另一个优 选的实施方案中，所述抗α5β1抗体是本文所述抗α5β1抗体。涵盖包含VEGF拮抗剂、 α 5 β 1拮抗剂、任选和化疗剂的试剂盒。癌症治疗可以通过例如但不限于肿瘤消退、肿瘤体积或大小收缩、距进展的时间、 存活持续时间、无进展存活、整体响应率、响应持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性 来评估。因为本文所述抗血管发生剂靶向肿瘤血管结构而不必是赘生性细胞本身，所以它 们代表了一类独特的抗癌药，并因此可以要求独特的对药物的临床应答的测量和定义。例
38如，二维分析中大于50%的肿瘤收缩是宣告响应的标准截留(cut-off)。然而，本发明的 α5β1拮抗剂和VEGF拮抗剂可以引起对转移性扩散的抑制而没有原发肿瘤的收缩，或者 可以仅仅发挥抑制肿瘤效果。因而，可采用测定治疗功效的方法，包括例如测量血管发生的 血浆或尿液标志物和通过放射学成像测量响应。取决于待治疗的适应症和本领域熟练医师所熟悉的与剂量给药有关的因素，以有 效治疗该适应症同时最小化毒性和副作用的剂量施用本发明的抗体。为了治疗癌症、自身 免疫病或免疫缺陷病，治疗有效量可以在例如50mg/剂到2. 5g/m2的范围内。在一个实施 方案中，所施用的剂量是大约250mg/m2到大约400mg/m2或500mg/m2。在另一个实施方案 中，剂量是大约250-375mg/m2。在又一个实施方案中，剂量范围是275_375mg/m2。对年龄相关黄斑变性(AMD)治疗的评估包括但不限于进一步视力丧失速率的降 低或进一步视力丧失的阻止。对于AMD疗法，体内功效可以通过例如下述一项或多项来测 量评估最好矫正视力(BCVA)自基线到期望时间的均值变化；评估在期望时间与基线相比 视力损失小于15个字母的受试者比例；评估在期望时间与基线相比视力获得超过或等于 15个字母的受试者比例；评估在预期时间Snellen视力相当于20/2000或更差的受试者比 例；评估NEI视觉功能问卷(Visual Functioning Questionnaire)；评估预期时间CNV的 大小和CNV渗漏的量，通过荧光素血管造影术评估；等等。V.药物配制剂抗α 5β 1抗体可以与合适的载体或赋形剂一起配制，使得它们适合于施用。合 适的抗体配制剂通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂 (Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 16 版，0sol，A.编(1980))混合来获得,处 于冻干配制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对 接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血 酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索 氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸的甲酯或丙酯；邻苯二 酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质， 诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如 甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括 葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA ；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐 反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如 TWEEN 、PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。例示性的抗体配制剂记载于WO 98/56418，在此 明确收入作为参考。适于皮下施用的冻干配制剂记载于WO 97/04801。此类冻干配制剂可 用合适的稀释剂重建至高蛋白质浓度，重建的配制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动 物。本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选 那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，可能希望进一步提供抗肿瘤剂、生长抑 制剂、细胞毒剂、或化疗剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。此类 其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量、疾病或病症或治疗的类型、及上文讨 论的其它因素。这些通常是以与本文所述相同的剂量，以本文所述施用路径而使用的，或是 迄今所采用的剂量的大约1_99%。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如 分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统 中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类 技术披露于例如 Remington' sPharmaceutical Sciences,第 16 版，Osol，A.编(1980)。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚 合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括 聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利 No. 3，773，919)、L_谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解 的乳酸_乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成 的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。脂转染剂(Iipofectin)或脂质体也可用于将本发明的多肽和抗体或组合物投递 到细胞中。在使用抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白质的结合结构域的最小抑制性片 段。例如，基于抗体的可变区序列，可设计保留结合靶蛋白质序列的能力的肽分子。此类 肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术生成(参见例如Marasco et al.，PNAS USA 90 7889-7893(1993))。活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如 分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统 中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类 技术公幵于例如 Remington' sPharmaceutical Sciences，见上文。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合 物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括 聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利 3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸、-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降 解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPR0NDEP0T (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成 的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等 聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗 体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37°C的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学 活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果 发现聚集机制是经由硫醇_ 二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、 由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实 现。VI.使用抗α 5 β 1抗体的诊断和成像方法经标记的、特异性结合α 5β 1多肽的抗α 5β 1抗体及其衍生物和类似物可用 于诊断目的，以检测、诊断、或监测与α 5β1的表达、异常表达和/或活性有关的疾病和/ 或病症。例如，本发明的抗α5β1抗体可用于原位(in situ)、体内(invivo)、离体(ex vivo)、和体外(in vitro)诊断测定法或成像测定法。用于检测α 5β 1多肽的表达的方法，包括(a)使用一种或多种本发明抗体测定个 体的细胞(例如组织)或体液中多肽的表达，并(b)将基因表达水平与标准基因表达水平进行比较，由此所测定基因表达水平与标准表达水平相比的升高或降低指示异常表达。本发明别的实施方案包括诊断动物(优选哺乳动物，诸如人)中与α5β1表达 或异常表达有关的疾病或病症的方法。所述方法包括检测哺乳动物中的α5β1分子。在 一个实施方案中，在施用VEGF拮抗剂后，诊断包括(a)对哺乳动物施用有效量的经标记抗 α5β 1抗体，(b)在施用后等待一段时间，容许经标记α 5 β 1抗体优先在受试者中α 5 β 1 分子表达的部位集中(及未结合的经标记分子清除至背景水平)；(c)测定背景水平；并 (d)检测受试者中的经标记分子，其中检测到经标记分子高于背景水平指示受试者患有与 α 5β 1表达或异常表达有关的特定疾病或病症。背景水平可以通过多种方法来测定，包括 将检测到的经标记分子的量与事先为特定系统测定的标准曲线比较。本发明的抗α 5β1抗体还用于测定生物学样品中的蛋白质水平，其中使用本领 域技术人员知道的经典免疫组织学方法(参见例如Jalkanen, et al.，J. Cell. Biol. 101 976-985(1985) Jalkanen, et al.，J. Cell. Biol. 105 :3087_3096 (1987))。可用于检测蛋 白质基因表达的其它基于抗体的方法包括免疫测定法，诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA) 和放射免疫测定法(RIA)。合适的抗体测定法标记物是本领域知道的，包括酶标记物，诸 如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(1311、1251、1231、1211)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟 (ι )、锝(99Tc、9，c)、铊(201Ti)、镓(6W7Ga)、钯(103Pd)、销(99Mo), 氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177LU、159Gd、149Pm、14°La、175Yb、166H0、9°Y、47SC、186Re、188Re、142Pr、1(l5Rh、 97Ru ；鲁米诺；荧光标记物，诸如荧光素和罗丹明；及生物素。本领域已知的技术可应用于本发明的经标记抗体。此类技术包括但不限于使用 双功能偶联剂(参见例如美国专利 No. 5，756，065 ；5, 714, 631 ；5，696，239 ；5，652，361 ； 5，505，931 ；5，489，425 ；5，435，990 ；5，428，139 ；5，342，604 ；5，274，119 ；4，994，560 ； 5，808，003)。依照一个具体的实施方案，α 5 β 1多肽表达或过表达是在施用VEGF拮抗剂治疗 剂后的诊断或预后测定法中测定的，即评估在细胞表面上存在的α 5 β 1水平(例如经免疫 组化测定法，使用抗α5β1抗体)。或者/另外，可以测量细胞中编码α5β1多肽的核酸 或mRNA的水平，例如经荧光原位杂交，使用基于核酸的探针，其对应于编码α 5β 1的核酸 或其互补序列(FISH ；参见W098/45479,公布于1998年10月)、Southern印迹、Northern 印迹、或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如实时定量PCR(RT-PCR)。还可以通过测量生物学 流体诸如血清中的脱落抗原来研究α 5β1过表达，例如使用基于抗体的测定法(还可参 见例如美国专利No. 4，933，294，公告于1990年6月12日；W091/05264,公布于1991年4 月 18 日；美国专利 No. 5，401，638，公告于 1995 年 3 月 28 日；及 Sias et al.，J. Immunol. Methods 132 :73_80 (1990))。在上述测定法以外，多种体内和离体测定法可供熟练从业人 员使用。例如，可以将哺乳动物身体内的细胞暴露于抗体，其任选用可检测标记物标记，例 如放射性同位素，并可以评估抗体的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自先前 暴露于抗体的哺乳动物的样品(例如活检或其它生物学样品)。VII.制品和试剂盒本发明的另一个实施方案是包含可用于治疗癌症(例如肿瘤)、眼病(例如湿性 AMD)或自身免疫病和相关疾患的物质的制品。所述制品可以包括容器及容器上或与容器相 联系的标签或包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种
41材料制成，诸如玻璃或塑料。一般而言，所述容器装有有效治疗所述疾患的组合物，可以具 有无菌存取口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或带有皮下注射针可刺穿的塞子的药 瓶)。所述组合物中的至少一种活性药剂是本发明的VEGF拮抗剂或α 5β 1拮抗剂或VEGFR 激动剂或α5β1激动剂。所述标签或包装插页指明该组合物用于治疗所述具体疾患。所 述标签或包装插页进一步包含关于对患者施用所述抗体组合物的说明书。还涵盖包含本文 所述联合疗法的制品和试剂盒。包装插页指通常包括在治疗用产品商品化包装中的说明书，它包含有关此类治疗 用产品使用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌和/或警告的信息。在一个实施方案中，包装 插页指明该组合物用于治疗非何杰金氏淋巴瘤。另外，所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药学可接受缓冲液，诸如注射用 抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从 商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。还提供了可用于各种目的的试剂盒，例如用于分离或检测患者中的α 5β 1和/ 或VEGF，任选联合所述制品。为了分离和纯化α 5β 1，所述试剂盒可包含与珠子(例如 sepharose珠子)偶联的抗α 5 β 1抗体。可提供包含用于α 5 β 1和/或VEGF体外检测 和定量的抗体，例如在ELISA或Western印迹中进行的。与制品一样，所述试剂盒包括容器 及容器上或与容器相联系的标签或包装插页。例如，所述容器装有包含至少一种本发明抗 α5β1抗体的组合物。可包括装有例如稀释剂和缓冲液、对照抗体的别的容器。所述标签 或包装插页可提供该组合物的描述以及意图体外或诊断使用的说明书。除非另有说明，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。下文实 施例和整篇说明书中以ATCC编号所鉴别的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection，Manassas，VA)。除非另有说明，本发明使用重 组DNA技术的标准流程，诸如上文及以下教科书中所记载的那些Sambrook et al.，见 上文；Ausubel et al. , Current Protocols inMolecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N. Y. , 1989 ；Innis et al. ,PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N. Y. ,1990 ；Harlow et al., Antibodies :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988 ；Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984 ；Freshney, Animal CellCulture, 1987 ；Coligan et al. , Current Protocols in Immunology，1991。将本文中所引用的所有出版物(包括专利和专利申请)完整收入本文作为参考， 具体包括2006年3月21日提交的美国临时申请No. 60/784，704 ；2006年3月22日提交的 美国临时申请No. 60/785，330 ；和2006年12月22日提交的美国临时申请No. 60/871,743。以下DNA序列根据布达佩斯条约的条款保藏于美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection (ATCC),10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209，USA)，如下所述材料保藏号 保藏日α 5/ β 1 7Η5. 4. 2. 8 ΡΤΑ—7421 2006 年 3 月 7 日本文保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty)及其(布达佩斯条约)实施细则的规定进行的。这保证了自保藏之日起保存保藏的存活培养物30年。保藏物可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得，并服从Genentech 公司与ATCC之间的协议，它保证了在有关美国专利授权后或者在任何美国或外国专利申 请向公众公开后，以两者中居先者为准，公众可永久且不受限制的获得保藏培养物的后代， 而且保证了依据35 U. S. C. 122及依照它的管理章程(包括37 C. F. R. 1. 14，特别要提及 8860G 638)由美国专利和商标局长批准的个人将有资格获得保藏培养物的后代。本申请的受让人已同意，若保藏材料的培养物在合适条件下培养时死亡、丢失或 遭到破坏，则他将在接到通知后迅速用同一培养物的另一份材料更换。所保藏材料的可获 得性并不解释为对违反任何政府机构依据其专利法所授予的权利实施本发明的许可。除非另有说明，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。下文实 施例和整篇说明书中以ATCC编号所鉴别的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection，Manassas，VA)。除非另有说明，本发明使用重 组DNA技术的标准流程，诸如上文及以下教科书中所记载的那些Sambrook et al.，见 上文；Ausubel et al. , Current Protocols inMolecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N. Y. , 1989 ；Innis et al. ,PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N. Y. ,1990 ；Harlow et al., Antibodies :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988 ；Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984 ；Freshney, Animal CellCulture, 1987 ；Coligan et al. , Current Protocols in Immunology，1991。认为前述书面描述足以使本领域技术人员能够实施本发明。提供下述实施例仅出 于例示目的，并非意图以任何方式限制本发明的范围。实际上，根据上面的描述，在本文所 显示和描述之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，而且落在所附权 利要求的范围内。
实施例(1)直接将⑶R嫁接到受体人共有框架上用于此项工作的噬菌粒是单价Fab_g3展示载体，基本上如Lee et al.，J. Mol. Biol. 340 1073-93 (2004)中所记载的。将来自小鼠单克隆抗体7H5序列的高变序列嫁接 到人共有Kl(huKI)和人亚组III共有VH(huIII)域上。为了制备⑶R嫁接物，使用在3 个位置与人亚组III共有VH域不同的受体VH框架R71A、N73T、和L78A (Carter et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285 (1992))。 (2)对人源化7H5. vl的⑶R天冬酰胺的修饰使用针对每个位置的不同寡核苷酸通过Kimkel诱变实现各个位置用其它残基进 行的替代。利用噬菌体竞争ELISA对在噬菌体上单价展示为Fab的所有变体评估对人整联 蛋白α5β1的结合亲和力(IC50)，见图4。图5总结了与亲本人源化7Η5. vl相比损失或 改进的结合亲和力的相对倍数。结合亲和力的IC50值是通过图6中的噬菌体竞争ELISA 测定的。如所示的，选择两种变体h7H5. v2和h7H5. v3来包括⑶R-H2第65位甘氨酸替代， 克隆入hlgGl载体，并使用BIAcore设备评估结合亲和力。在图7中，BIAcore结合分析指 示人源化7H5. v2确实略微改善了结合亲和力至亚纳摩尔水平。(3)对人源化7H5. v2的框架修饰
突变了下述位置h7H5. v2中轻链第46位(T46L)，重链第48位(I48V)、第49位 (G49S)、第 66 位(K66R)、第 67 位(A67F)、第 69 位(L69I)和第 78 位(A78L)。另外，还突变 了重链第30位(T30S)。使用不同寡核苷酸通过Kimkel诱变生成每个位置的突变。利用噬菌体竞争ELISA 评估所有变体。在噬菌体上展示单价Fab。测定对人整联蛋白α 5β 1的结合亲和力(IC50)。 图8显示了与亲本克隆相比，大多数突变仍保留相同水平的结合亲和力，除了具有重链第 49位(G49S)和第78位(A78L)变化的两种变体。因此，通过包括所有下述突变生成了人源化7Η5. ν4和v5 轻链第46位(T46L)， 重链第 30 位(T30S)、第 48 位(I48V)、第 66 位(K66R)、第 67 位(A67F)和第 69 位(L69I)， 只在重链第49位不同。使用BIAcore设备测定了这两种变体的结合亲和力。图9显示了 h7H5. v4保留与其亲本克隆人源化7H5. v2相同水平的结合亲和力。(4)噬菌体竞争ELISA将MAXIS0RP 微量滴定板用PBS中的5 μ g/ml重组人整联蛋白α 5 β 1 (R&D)包 被过夜，然后用PBST缓冲液(PBS中的0. 5% BSA和0. 05% Tween 20)于室温封闭1小时。 将来自培养物上清液的噬菌体与连续稀释的人整联蛋白α 5β 1 —起在PBST缓冲液中在组 织培养微量滴定板中温育1小时，之后将80 μ 1混合物转移至经靶物包被的孔达15分钟以 捕捉未结合的噬菌体。用PBT缓冲液(PBS中的0. 05% Tween 20)清洗板，并添加偶联有 HRP 的抗 Ml3 (Amersham Pharmacia Biotech)(在 PBST 缓冲液中 1 5000)达 40 分钟。用 PBT缓冲液清洗板，并通过添加四甲基联苯胺底物(Kirkegaard and PerryLaboratories, Gaithersburg, MD)来显色。将450nm吸光度作为溶液中靶物浓度的函数来绘图以确定噬 菌体IC5(1。这用作在噬菌体表面上展示的Fab克隆的亲和力估值。(5) IgG生成和通过BIAcore实验进行的抗体亲和力测定将感兴趣克隆(嵌合的7H5，人源化的7H5. vl、v2、v3、v4、和v5)重定格式入人 IgGl pRK载体(Carter et al.，PNAS USA, 89 :4285_4289 (1992))，在 CHO 细胞中瞬时表达，
并用蛋白A亲和层析纯化。亲和力测定是使用BIAC0RE -3000设备通过表面等离振子共振实施的。固定化 是通过使用由制造商提供的方案经由氨基的随机偶联实现的。运行两种不同格式以研究抗 体对人整联蛋白α5β1的结合动力学。在图3Α、7、和9Α中，在CM5传感器芯片上固定化 450个响应单位(RU)左右的抗体，并于25V以30 μ 1/min的流速注射在PBT缓冲液(PBS 中的0. 05% Tween 20)中2倍连续稀释浓度的人整联蛋白α 5 β 1 (300ηΜ至0. 29ηΜ)。在 图3Β和9Β中，在CM5传感器芯片上固定化800个RU左右的人整联蛋白α 5 β 1，并于25°C 以30 μ 1/min的流速注射在PBT缓冲液(PBS中的0. 05% Tween 20)中2倍连续稀释浓度 的抗体。每次注射后，使用PH1.7的IOmM甘氨酸-HCl缓冲液再生芯片。通过减去来自空 白流动室的RU来修正结合响应。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)计算结合速率(kj 和解离速率(k。ff)。以比率 k。ff/ k。n计算平衡解离常数(Kd)。(6)皮肤伤口愈合测定法在研究中使用新西兰白色家兔以证明人源化7H5抗体的功效。使用无菌技术，使 用圆形8mm活检打孔器产生伤口，深度到耳软骨，并用骨膜起子(periosteal elevator)和精细剪刀(fine scissors)除去下面的软骨膜。每天监测每个伤口的总体外观，直至研究 结束。在第0、7、14、21、和28天进行伤口间隙测量。在第28天对所有动物处以安乐死。进 行了两组皮肤伤口愈合实验。第一组使用下述研究组，每组5只动物，每只动物两个伤口 (1)阴性对照 IgG(200yg/30y 1/伤口 每天)；(2)h7H5. v2 (100 μ g/30 μ 1/伤口 每天)；(3)抗 VEGF 抗 体(100 μ g/30 μ 1/伤口每天)；和(4)与抗VEGF抗体(100 μ g/15 μ 1/伤口每天)组合的 1!7!1512(10(^8/15 4 1/伤口每天)。抗体是局部应用的。图10描绘了结果，证明了(1) 单独施用h7H5. V2或抗VEGF抑制伤口愈合；而且⑵组合施用h7H5. v2和抗VEGF抗体增 强单独的抗VEGF抗体对伤口愈合的效果。第二组实验使用下述研究组，每组5只动物，每只动物两个伤口 (1)阴性对照 IgG(200yg/30y 1/伤口 每天)；(2)h7H5. ν4(100 μ g/30 μ 1/伤口 每天)；(3)抗 VEGF 抗 体(100 μ g/30 μ 1/伤口每天)；和(4)与抗VEGF抗体(100 μ g/15 μ 1/伤口每天)组合的 1!7!1514(10(^8/15 4 1/伤口每天)。抗体是局部应用的。图11描绘了结果，证明了(1) 单独施用h7H5. V4或抗VEGF抑制伤口愈合；而且(2)组合施用h7H5. v4和抗VEGF抗体增 强单独的抗VEGF抗体对伤口愈合的效果。在此通过述及完整收录本文中所引用的所有出版物(包括例如专利、已公布的专 利申请、和Genbank编号)用于所有目的，就像明确地和单独地通过述及而收录每篇参考文
献一样。
权利要求
一种抗α5β1抗体，其包含轻链可变域序列和重链可变域序列，该轻链可变域序列包含(1)包含氨基酸序列KASQ-N/S-VGSDVA(SEQ ID NO10)的LHVR1、(2)包含氨基酸序列STSYRYS(SEQ ID NO11)的LHVR2和(3)包含氨基酸序列QQY-N/S-SYPFT(SEQ ID NO12)的LHVR3，该重链可变域序列包含(1)包含氨基酸序列GYTF-T/S-DYYLY(SEQ ID NO13)的HHVR1、(2)包含氨基酸序列GISPS-N/S-GGTTF-N/A-D-N/A-FE-N/G(SEQ ID NO14)的HHVR2和(3)包含氨基酸序列DAYGDWYFDV(SEQID NO15)的HHVR3。
2.一种抗α 5β1抗体，其包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域具有SEQ ID NO :1、2、3、或4任一所列序列或其变体，该重链可变域具有SEQ ID NO :5、6、7、8、或9任一 所列序列或其变体。
3.依照权利要求2的抗体，其中所述轻链可变域具有SEQID NO :3所列序列且所述重 链可变域具有SEQ ID NO :8所列序列。
4.依照权利要求2的抗体，其中所述重链可变域变体序列包含在选自下组的残基处的 氨基酸替代:30、48、49、54、60、62、65、66、67 和 69。
5.依照权利要求2的抗体，其中所述轻链可变域包含在选自下组的残基处的氨基酸替 代:28、46 和 92。
6.依照权利要求4的抗体，其中所述氨基酸替代选自下组T30S、I48V、G49S、N54S、 N60A、N62A、N62S、N65G、K66R、A67F 和 L69I。
7.依照权利要求5的抗体，其中所述轻链可变域包含选自下组的氨基酸替代N28S、 T46L 和 N92S。
8.依照权利要求1、2、或3的抗体，其中所述抗体不结合ανβ3或ανβ5或ανβ1。
9.依照权利要求1的抗体，其中所述抗体包含人IgG的Fc序列。
10.依照权利要求9的抗体，其中所述人IgG是hlgGl或hIgG4。
11.依照权利要求9的抗体，其中所述抗体包含缺乏抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC) 效应器功能的Fc序列。
12.依照权利要求11的抗体，其中所述Fc序列包含D265A替代。
13.依照权利要求1的抗体，该抗体选自下组:Fab、Fab，、F(ab)，2、单链Fv(ScFv)、Fv 片段、双抗体和线性抗体。
14.依照权利要求1的抗体，其中所述抗体是多特异性抗体。
15.依照权利要求1的抗体，其偶联有治疗剂。
16.依照权利要求15的抗体，其中所述治疗剂选自下组细胞毒剂、放射性同位素和化 疗剂。
17.依照权利要求1的抗体，其偶联有标记物。
18.依照权利要求17的抗体，其中所述标记物选自下组放射性同位素、荧光染料和酶。
19.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1的抗体。
20.一种表达载体，其编码权利要求19的核酸分子。
21.一种细胞，其包含权利要求20的表达载体。
22.—种生产抗体的方法，包括培养权利要求21的细胞并自细胞培养物回收抗体。
23.一种组合物，其包含权利要求1的抗体和药学可接受载体。
24.一种在来自患者的样品中检测α 5β 1蛋白质的方法，其通过使权利要求1的抗体 接触样品并检测结合至α 5β 1蛋白质的抗α 5β 1抗体来进行。
25.依照权利要求24的方法，其中在免疫组织化学测定法(IHC)中或在ELISA测定法 中使用抗体。
26.权利要求1的抗体在制备用于在受试者抑制血管发生和/或血管通透性或渗漏的 药物中的用途。
27.权利要求1的抗体在制备用于在受试者治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病 具有异常的血管发生或血管通透性或渗漏。
28.—种在患有疾病的受试者中抑制血管发生和/或血管通透性或渗漏的方法，包括 施用VEGF拮抗剂和权利要求1的抗α 5 β 1抗体。
29.一种用于在受试者治疗癌症的方法，包括施用VEGF拮抗剂和权利要求1的抗 α 5 β 1抗体。
30.一种用于在受试者中治疗眼病的方法，包括施用VEGF拮抗剂和权利要求1的 α 5 β 1抗体。
31.一种用于在受试者中治疗自身免疫性疾病的方法，包括施用VEGF拮抗剂和权利要 求1的α 5 β 1抗体。
32.依照权利要求30的方法，其中所述受试者在患病组织中没有与来自未患病受试者 的组织相比升高的α 5 β 1水平。
33.依照权利要求28-32任一项的方法，其中对所述受试者进一步施用选自下组的治 疗剂抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂和细胞毒剂。
34.依照权利要求28-32任一项的方法，其中所述VEGF拮抗剂对人VEGF的结合能被 .Avastin 抗体竞争性抑制。
35.依照权利要求34的方法，其中所述VEGF拮抗剂是Avastin 抗体。
36.一种组合物，其包含VEGF拮抗剂、权利要求1的抗体和药学可接受抑制剂。
全文摘要
本发明涉及VEGF拮抗剂和新型抗α5β1抗体用于治疗癌症和抑制血管发生和/或血管通透性的用途，包括抑制疾病中的异常血管发生。本发明还涉及包含新型抗α5β1抗体的组合物和试剂盒及制备和使用它们的方法。
文档编号A61P35/00GK101888878SQ200880117702
公开日2010年11月17日 申请日期2008年9月25日 优先权日2007年9月26日
发明者叶伟兰, 吴雁, 格雷戈里·D·普洛曼, 梁伟庆 申请人:健泰科生物技术公司