专利名称：H5n1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗的研制及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗，其特征在于表达H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白和NA蛋白。更具体地，重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗是BHG/AAca和AH/AAca。本发明还公开了制备所述重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗的方法和该重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗在制备预防禽流感的疫苗中的应用。
背景技术：
禽流感(Avian Influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)引起的禽类感染和/或疾病综合征，AIV在分类学上属于病毒界(Vira)----正粘病毒科(Orthomyxoviridae)----流感病毒属(Influenza Virus A and B)----禽流感病毒(AvianInfluenza Virus)。禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属的A型流感病毒，基因组由8个单股负链RNA片段组成。其表面结构蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性不同，被划分为不同亚型。血凝素(HA)是禽流感病毒主要的免疫原蛋白，它可诱导机体产生抗体介导的特异性体液免疫应答，抗HA的抗体可以通过干扰病毒与唾液酸受体的结合或者病毒囊膜与内吞体膜的融合过程从而中和病毒的感染。AIV的致病力与其表面结构蛋白HA裂解位点的氨基酸序列密切相关。低致病力AIV的HA裂解位点只有一个碱性氨基酸精氨酸(R)，这一结构决定了这些病毒感染动物后只能在呼吸系统内繁殖，因为只有呼吸道上皮细胞内含有一种精氨酸特异的类似胰酶的蛋白酶，可将裂解位点含单一碱性氨基酸精氨酸的HA0裂解为有活性的HA1和HA2，启动病毒的吸附和复制周期。高致病力H5和H7亚型AIV HA裂解位点含有连续的多个碱性氨基酸残基-RKKR-，可被体内多种细胞内广泛存在的蛋白酶识别和裂解，因此具有广泛的组织嗜性，一旦感染便会造成全身性扩散并导致迅速死亡。与可感染人的H1、H2、H3及H9等亚型流感病毒相比，高致病性的H5和H7亚型AIV对人类的潜在危害更为巨大，因为一旦感染人后即可能全身性扩散和迅速致死。
自从1998年以来，人们就开始利用反向遗传学技术在细胞上拯救流感病毒疫苗株。这一技术对高致病性禽流感病毒疫苗株的拯救最为适用，因为可以利用此技术修饰决定流感病毒高致病性的基因区域，例如可以去除高致病性禽流感病毒HA蛋白上的多个连续的碱性氨基酸裂解位点，使其变成具有低致病性禽流感病毒的HA基因特征，而满足人们的需要。
A/Ann Anbor/6/60 ca(H2N2)(简称AA/ca)冷适应弱毒活疫苗株是在25℃低温培养条件下，由其野生型病毒A/Ann Anbor/6/60(H2N2)在原代鸡胚肾细胞上连续传代培育而成。AA/ca疫苗株具有两种生物学特性，冷适应性(cold-adapted)和温度敏感性(temperature sensitive)(Cox et al.，1988，参见后附参考文献列表。下同)。冷适应性是指AA/ca疫苗株在25℃低温培养条件下能很好地生长，而相应的野生病毒却不能在此条件下生长。温度敏感性是指AA/ca疫苗株在39℃高温培养条件下生长受到限制，而其野生病毒在此条件下却能很好的生长，而病毒的这两种生物学特性是由其内部基因决定的(Jin et al.，2003；Jin et al.，2004)。因此，A/Ann Anbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗株是目前发展弱毒活疫苗最优秀的疫苗株种子。
发明内容
研究表明，一般的重组病毒拥有AA/ca疫苗株的6个内部基因和其他病毒的2个表面糖蛋白基因，获得的这类重组病毒具有冷适应性、温度敏感性、在动物和人类体内表现出致病力减弱性的生物学特性特，却仍具有很好的免疫原性和遗传稳定性。
具体地，鉴于全病毒灭活疫苗免疫原性差、需要添加佐剂、生产比较困难、副反应大、不适合于有慢性疾病的人群、老人和3岁以下儿童的使用。因此，本发明人选用目前发展活疫苗最优秀的疫苗株种子A/Ann Anbor/6/60 ca(H2N2)的6个内部基因作为骨架基因，并选用BHG/05和AH/052株H5N1亚型禽流感病毒的HA和NA基因作为表面基因，利用反向遗传学技术(Hoffmann et al.，2000)和体外全基因组合成技术，在符合用于人流感疫苗生产标准的低代次Vero细胞(非洲绿猴肾细胞，CCTCC GDC-029)上拯救出了2株重组病毒，并分别命名为BHG/AAca和AH/AAca。其中救获的重组病毒表面基因供体的2株H5N1亚型高致病性禽流感病毒均分离于中国大陆，它们的抗原性差异很大，分属于不同的抗原群，并对人类的公共卫生意义构成了威胁。例如，BHG/05毒株是导致2005年在青海省野鸟中大面积爆发H5N1亚型高致病性禽流感、并引起野鸟大面积死亡的分离株(Chen et al.，2006)，也是目前亚洲、欧洲、非洲流行分布最广的候鸟传播代表株，而AH/05(H5N1)病毒是引起人感染并导致死亡的H5N1亚型禽流感病毒分离株。通过分子修饰方法去除了这2株高致病性禽流感病毒HA基因裂解位点的多个连续碱性氨基酸序列，使其均具备了低致病性禽流感病毒的HA基因特征(Subbarao et al.，2003)。
因此，本发明提供以下各项 1.一种重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗，其特征在于表达H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白(基因)和NA蛋白(基因)。
2.根据以上1所述的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗，其中在所述HA蛋白上去除了多个连续的碱性氨基酸裂解位点。优选地，所述HA蛋白缺失了裂解位点的连续多个碱性氨基酸。在一个实施方案中，所述碱性氨基酸如R或K，所述连续多个(优选3个或4个)碱性氨基酸例如为RKR，RRKR或RKKR。
3.根据以上1所述的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗，其表达冷适应疫苗的6个蛋白聚合酶PB2亚基(PB2)，聚合酶PB1亚基(PB1)，聚合酶PA亚基(PA)，核蛋白(NP)，基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)。
4.根据以上3的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗，其中所述冷适应疫苗是H2N2亚型冷适应弱毒疫苗株AA/ca。
5.根据以上1至4中任一项的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗，其中所述HA蛋白和NA蛋白的氨基酸序列来源于H5N1亚型禽流感病毒株BHG/05，或来源于H5N1亚型禽流感病毒株AH/05。由此获得的两株重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗分别是BHG/AAca和AH/AAca。
在本发明的一个优选实施方案中，将AH/05的HA基因的第1036-1061位核苷酸TCCTCTAAGAGAAAGAAGAAGAAAAA突变成CCCTCAACGAGAGACTC，即将HA蛋白的第338-345位氨基酸LRERRRKR突变成QRETR。在本发明的另一个优选实施方案中，将BHG/05的HA基因的第1043-1064位核苷酸AGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGA突变成CGAGAGACTC，即将HA蛋白的第339-346氨基酸RERRRKKR突变成RETR。
6.一种生产根据以上1-5任何一项的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗的方法，该方法包括 (1)构建两个表达质粒，所述两个表达质粒分别用于表达H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白和NA蛋白； (2)构建六个表达质粒，所述六个表达质粒分别用于表达冷适应疫苗的6个蛋白PB2，PB1，PA，NP，M和NS； (3)将步骤(1)和(2)中获得的八个表达质粒共转染禽流感病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞； (4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组活疫苗。
7.根据以上6所述的方法，其中在所述HA蛋白上去除了多个连续的碱性氨基酸裂解位点。在一个实施方案中，所述碱性氨基酸如R或K，所述连续多个(优选3个或4个)碱性氨基酸例如为RKR，RRKR或RKKR。
8.根据以上6或7所述的方法，其中所述冷适应疫苗是H2N2亚型冷适应弱毒疫苗株AA/ca。
9.根据以上6或7所述的方法，其中所述HA蛋白和NA蛋白的氨基酸序列来源于H5N1亚型禽流感病毒株BHG/05，或来源于H5N1亚型禽流感病毒株AH/05。
在本发明的一个优选实施方案中，将AH/05的HA基因的第1036-1061位核苷酸TCCTCTAAGAGAAAGAAGAAGAAAAA突变成CCCTCAACGAGAGACTC，即将HA蛋白的第338-345位氨基酸LRERRRKR突变成QRETR。在本发明的另一个优选实施方案中，将BHG/05的HA基因的第1043-1064位核苷酸AGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGA突变成CGAGAGACTC，即将HA蛋白的第339-346氨基酸RERRRKKR突变成RETR。
10.根据以上6-9任一项所述的方法获得的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗。
11.根据以上1-5中任何一项的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗在制备治疗和/或预防禽流感病毒所导致的疾病的药物中的应用，优选所述药物用于治疗和/或预防动物或人的禽流感病毒感染。
本研究利用反向遗传技术在符合人流感疫苗生产标准低代次的Vero细胞上拯救出2株H5N1亚型禽流感病毒的弱毒活疫苗株。实验证实，该疫苗株具有预期的冷适应性和温度敏感性特性，并对鸡和BALB/c小鼠具有致病力高度致弱的特性。
本研究对救获的弱毒活疫苗株在哺乳动物模型BALB/c小鼠上进行免疫效力评价，结果表明这2株弱毒活疫苗株在BALB/c小鼠上均具有良好的免疫原性和保护效力。
图1.AH/AAca重组病毒的PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS基因的RT-PCR扩增。1～8泳道重组病毒AH/AAca的PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M、NS基因的RT-PCR产物；9阴性对照；MDNA分子质量标准； 图2.(A)BHG/AAca重组病毒和BHG/05野生病毒的温度敏感性试验；(B)AH/AAca重组病毒和AH/05野生病毒的温度敏感性试验； 图3.(A)BHG/AAca重组病毒和BHG/05野生病毒的冷适应性试验；(B)AH/AAca重组病毒和AH/05野生病毒的冷适应性试验； 图4.106EID50剂量的BHG/AAca重组病毒与野生病毒BHG/05接种小鼠后的体重变化和存活率； 图5.106EID50剂量的AH/AAca重组病毒和野生病毒AH/05接种小鼠后的体重变化和存活率； 图6.106EID50剂量的重组病毒BHG/AAca或野生病毒BHG/05鼻腔接种小鼠后第3、5天各组织脏器中病毒复制滴度(注原液没有分离到病毒的小鼠脏器给定极限值为100.5EID50/mL)； 图7.106EID50剂量的重组病毒AH/AAca或野生病毒AH/05鼻腔感染小鼠后第3、5天各组织脏器中病毒复制滴度(注原液没有分离到病毒的小鼠脏器给定极限值为100.5EID50/mL)； 图8.(A)BHG/AAca疫苗免疫小鼠在102MLD50剂量的同源病毒BHG/05致死攻击后的体重变化和存活率；(B)BHG/AAca疫苗免疫小鼠在103MLD50剂量的同源病毒BHG/05攻击后的体重变化和存活率；(C)BHG/AAca疫苗免疫小鼠在104MLD50剂量的同源病毒BHG/05致死攻击后的体重变化和存活率； 图9.(A)AH/AAca疫苗免疫小鼠在102MLD50剂量的同源病毒AH/05致死攻击后的体重变化和存活率；(B)AH/AAca疫苗免疫小鼠在103MLD50剂量的同源病毒AH/05致死攻击后的体重变化和存活率；(C)AH/AAca疫苗免疫小鼠在104MLD50剂量的同源病毒AH/05致死攻击后的体重变化和存活率； 图10.BHG/AAca疫苗株单剂量免疫组小鼠和对照组小鼠用同源病毒BHG/05攻击后的病毒复制； 图11.AH/AAca疫苗株单剂量免疫组小鼠和对照组小鼠用同源病毒AH/05攻击后的病毒复制； 图12.BHG/AAca疫苗免疫小鼠用102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01致死攻击后的体重变化和存活率； 图13.BHG/AAca疫苗免疫小鼠在102MLD50剂量的异源病毒AH/05致死攻击后的体重变化和存活率； 图14.AH/AAca疫苗免疫小鼠在102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01致死攻击后的体重变化和存活率； 图15.AH/AAca疫苗免疫小鼠在102MLD50剂量的异源病毒BHG/05致死攻击后的体重变化和存活率； 图16.BHG/AAca疫苗株单剂量免疫的小鼠用102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01和AH/05攻击后病毒复制； 图17.AH/AAca疫苗株单剂量免疫的小鼠用102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01和BHG/05攻击后病毒复制； 图18.BHG/AAca疫苗株加强免疫的小鼠用同源病毒BHG/05攻击后病毒复制； 图19.AH/AAca疫苗株加强免疫的小鼠用同源病毒AH/05攻击后病毒复制； 图20.BHG/AAca疫苗株加强免疫后小鼠用102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01和AH/05攻击后病毒复制； 图21.AH/AAca疫苗株加强免疫后小鼠用102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01和BHG/05攻击后病毒复制。
图22.AH/05病毒的野生型HA基因的序列； 图23.AH/05病毒的突变型HA基因的序列； 图24.AH/05病毒的NA基因序列； 图25.BHG/05病毒的野生型HA基因的序列； 图26.BHG/05病毒的突变型HA基因的序列； 图27.BHG/05病毒的NA基因序列。
具体实施例方式 下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例1H5N1亚型重组病毒的拯救 1材料与方法 1.1病毒株 A/bar-headed goose/Qinghai/3/2005(H5N1)(简称BHG/05)(购自哈尔滨兽医研究所)，A/Anhui/2/2005(H5N1)(简称AH/05)(购自哈尔滨兽医研究所)。
1.2细胞、SPF鸡胚、SPF鸡和BALB/c小鼠 MDCK细胞与低代次Vero细胞(非洲绿猴肾细胞，GDC-029)均购于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学保藏中心)。9-11日龄的SPF鸡胚和4周龄的SPF鸡均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心，所有SPF鸡的感染实验均在负压隔离器中进行。4周龄和6周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司，所有小鼠感染实验均在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的生物安全3级实验室中进行。
1.3质粒载体 pBD载体(Zejun Li，Hualan Chen，Peirong Jiao，Guohua Deng，Guobin Tian，YanbingLi，Erich Hoffmann，Robert G.Webster，Yumiko Matsuoka，and Kangzhen Yu.MolecularBasis of Replication of Duck H5N1Influenza Viruses in a Mammalian Mouse Model.J.Virol.7912058-12064.)由陈化兰研究员构建，将单向转录质粒载体pPolIsapIRib中包含聚合酶I启动子-SapI克隆位点-鼠源核酶序列的XbaI酶切片段，反向插入pCI(Promega)质粒的XbaI位点，形成RNA聚合酶II启动子(CMV)→病毒RNA转录终止信号序列Rib→流感病毒基因组cDNA(5’→3’)→人RNA聚合酶I启动子→mRNA转录终止PolyA信号序列(SV40)构成的双向转录表达质粒载体，利用该载体可同时转录出流感病毒负链vRNA和正链mRNA。
质粒pBD-BHG-HA-deletion，pBD-BHG-NA，pBD-AH-HA-deletion，pBD-AH-NA的构建过程如下。pBD-BHG-HA-deletion和pBD-BHG-NA的具体构建过程为以BHG/05病毒的cDNA为模板，分别以两对引物HA1F/MutHA1R和MutHA2F/HA2R(见表A)用高保真聚合酶Pfx进行PCR反应，扩增出HA1和HA2片段。分别以rTaq聚合酶于37℃作用10min，用小量胶回收试剂盒回收HA1和HA2片段后，分别以XhoI进行酶切。将经过酶切的HA1、HA2两片段和pMD-18T载体(商购自Takara)以3∶3∶1的比例混合，于16℃以T4DNA连接酶作用5h，转化JM109感受态大肠杆菌，挑取阳性菌，提取质粒，测序。以序列正确的阳性质粒T-MutHA为模板，以引物HA1F/HA2R进行PCR扩增，得到BHG-HA-deletion基因片段。以A/BHG/QH/3/05的cDNA为模板，利用引物NAF/NAR进行PCR扩增，得到BHG-NA基因片段。BHG-HA-deletion和BHG-NA基因片段在1mM dCTP和dTTP存在条件下以T4DNA聚合酶处理，回收用于连接反应。pBD载体以SapI核酸内切酶于37℃下作用3h，回收后在1mM dGTP和dATP存在条件下用DNA Polymerase I Kleonw处理，回收得到pBD-sap-kle。将处理后的BHG-HA-deletion和BHG-NA基因片段分别与pBD-sap-kle进行连接，转化，提取质粒，测序确认，得到pBD-BHG-HA-deletion和pBD-BHG-NA。
从AH/05构建pBD-AH-HA-deletion和pBD-AH-NA的过程与pBD-BHG-HA-deletion，pBD-BHG-NA的构建方法一样，以AH/05病毒的cDNA为模板，获得AH-HA-deletion和AH-NA基因片段，并以相同方法与pBD-sap-kle连接得到pBD-AH-HA-deletion和pBD-AH-NA。
表A转染质粒构建所用到的引物
AH/05病毒的野生型HA基因的序列参见图22，在本发明中构建的上述突变型HA基因(即pBD-AH-HA-deletion中表达的缺失编码碱性氨基酸的HA基因序列)的序列参见图23，AH/05病毒的NA基因序列(即pBD-AH-NA中表达的HA基因序列)参见图24。
BHG/05病毒的野生型HA基因的序列参见图25，在本发明中构建的上述突变型HA基因(即pBD-BHG-HA-deletion中表达的缺失编码碱性氨基酸的HA基因序列)的序列参见图26，BHG/05病毒的NA基因序列(即pBD-BHG-NA中表达的HA基因序列)参见图27。
1.4主要试剂和仪器 DNA Polymerase I Klenow大片段、T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶Sap I、Xho I和Not I购自NEB公司；Nsi I购自MBI公司；EcoR I、XbaI、HindIII、BamH I、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和rTaq DNA聚合酶购于大连宝生物工程有限公司；RNA提取试剂TRIzol，鼠源反转录酶(MLV)试剂盒、DTT、RNaseOUT、Pfx高保真DNA聚合酶、转染试剂盒LipofectamineTM 2000和无血清培养基Opti-MEM购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒与小量质粒提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；测序反应试剂盒(CEQTM DTCS Quick Start Kit)购自BECKMAN公司；转染质粒提取试剂盒(Perfectprep Plasmid Mini)购自Eppendorf公司。受体破坏酶(RDE)购自Sigma公司。
1.5内部基因组DNA的合成 冷适应疫苗代表株A/Ann Anbor/6/60ca(H2N2)的内部6个基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)(序列分别如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ IDNo.4，SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示)全长DNA序列由南京金斯特科技有限公司合成。
1.6重组pBD转染质粒的构建 将合成的DNA序列分别利用6对特异引物(见表1)进行PCR扩增，得到AA/ca病毒株内部基因6个片段的全基因序列(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)，之后以SapI位点克隆于pBD载体中，分别获得转染质粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M和pBD-NS。所有阳性克隆均经测序验证。
表1RT-PCR扩增AA/ca病毒株的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因所用引物
1.7H5N1亚型重组病毒的拯救 将病毒株BHG/05的pBD-BHG-HA-deletion和pBD-BHG-NA转染质粒与源自AA/ca病毒株的pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M和pBD-NS转染质粒组合。另外，将病毒株AH/05的pBD-HA-deletion和pBD-NA转染质粒与源自AA/ca病毒株的pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M和pBD-NS转染质粒组合。每一组合的8种质粒各取0.6g加入250L无血清培养基，混匀；取12LLipofectamineTM 2000溶于250L无血清培养基，混匀后在室温静置5min；然后将LipofectamineTM 2000与转染质粒混合均匀，室温孵育30min。在此期间用无血清培养基洗涤低代次Vero细胞两次，然后每孔加入1mL无血清培养基，最后将LipofectamineTM 2000-质粒混合液加入细胞培养孔中，置于37℃CO2培养箱中培养24h，吸弃转染液，加入含10％胎牛血清和100U/mL的青霉素和链霉素的新鲜培养基继续培养48h。仔细吹落培养板上的细胞，将培养液及细胞混合物接种8枚10日龄SPF鸡胚，37℃鸡胚孵化箱孵化48h，收集尿囊液，测定其有无血凝活性，没有血凝活性的尿囊液再盲传一代，将有血凝活性的尿囊液稀释105倍，接种10枚10日龄SPF鸡胚扩增病毒，48h后收集尿囊液，分装，-70℃保存。
2结果 2.1合成DNA序列鉴定结果 将合成的6个内部基因进行序列测定，并用DNAStar软件中的Seqman进行拼接，结果表明合成的序列和我们的标准序列完全一致，没有任何突变和缺失。
2.2重组pBD阳性质粒的鉴定结果 将处理好的pBD载体与PCR产物按1∶4～1∶6比例混合，在16℃条件下，用T4DNA连接酶连接6h，然后按常规方法转化JM109大肠杆菌感受态细胞，挑菌，提质粒，进行核酸凝胶电泳鉴定和PCR鉴定。鉴定为阳性的质粒用小量质粒提取试剂盒提取质粒用于测序反应。测序结果表明pBD质粒上外源基因序列完全来源于标准序列，没有任何的氨基酸突变和缺失。
2.3救获重组病毒的PCR鉴定结果 将2种组合质粒分别转染低代次Vero细胞(非洲绿猴肾细胞，GDC-029，来自CCTCC)后72h，将转染细胞及培养液经尿囊腔接种10日龄的SPF鸡胚，48h后测定鸡胚尿囊液的血凝活性。有血凝活性的尿囊液提取RNA，经RT-PCR扩增，进行核酸凝胶电泳，回收测序。测定的序列与pBD重组质粒上的序列比较，发现各株救获病毒的基因组均没有任何核苷酸的变化，表明救获病毒的RNA完全来源于8质粒。并将救活的2株重组病毒分别命名为AH/AAca和BHG/AAca。救获的AH/AAca重组病毒的PCR产物核酸电泳结果见图1，救获的重组病毒见表2。
表2救获重组病毒及基因来源一览表
实施例2救获重组病毒AH/AAca和BHG/AAca的生长特性和生物学活性 1材料与方法 1.1材料 同实施例1。
1.2救获的2株重组病毒的温度敏感性(temperature sensitive)测定 温度敏感性(Ts)是比较病毒株在适合的生长温度33℃和高温39℃生长条件下在MDCK(狗肾细胞，NBL-2，来自ATCC)细胞上的复制滴度。如果在39℃高温条件下，病毒在MDCK细胞上的生长滴度比其在33℃合适的生长温度下的生长滴度降低100倍以上时，那么就认为这个病毒具有温度敏感性特征，反之亦然。
将救获的2株H5N1亚型重组病毒在冰上作10倍倍比稀释，即100L病毒+900L含有2g/mL TPCK胰蛋白酶(购自Invitrogen公司)的PBS，混匀；吸取100L稀释的病毒液至下一管900L PBS中，混匀，依次类推，直到稀释到10-9。将稀释好的病毒加到事先准备好的每孔含有大约70-80％密度的MDCK细胞96孔细胞培养板上，每个稀释度平行接种4个细胞孔，每孔100L，在37℃吸附2h，将上清吸掉，加入含有2g/mL TPCK胰蛋白酶的低血清DMEM培养基。用同样的方法接种另一块96孔板。将接种完的两块细胞板分别放在33℃或39℃的CO2培养箱，孵育48h后，用血凝试验检测每个温度下病毒的复制情况，用Reed-Muench方法(殷震，动物病毒学，科学出版社(第二版))计算半数组织培养感染剂量(TCID50)。
以同样的方法检测2株野生病毒在33℃与39℃下的复制情况。然后比较救获的重组病毒和野生病毒在33℃与39℃的TCID50。
1.3救获的2株重组病毒的冷适应性(cold-adapted)测定 冷适应性(cold-adapted)是比较病毒株在34℃适合的生长温度条件下和在25℃低温生长条件下在鸡胚上的复制滴度。在25℃低温条件下，如果病毒在鸡胚上的生长滴度与其在34℃度生长条件下的生长滴度的差值在100倍之内，就认为这个病毒具有冷适应性特征，反之亦然。
分别将救获的2株重组病毒和相应的2株野生病毒在冰上作10倍倍比稀释，即100L病毒+900L PBS，混匀，吸取100L的病毒稀释液到下一管900L PBS中，混匀，依次类推，一直稀释到10-9。将稀释好的病毒每个稀释度接种4枚10日龄的SPF鸡胚，将接种好的鸡胚放置于25℃低温培养箱孵化72h。并且以同样的方法接种另一份鸡胚，并放置于34℃鸡胚孵化箱孵化72h。用血凝试验检测病毒在各孵化温度下的增值滴度，用Reed-Muench方法计算EID50，并比较救获的重组病毒和野生病毒在25℃与34℃孵化条件下的增值滴度。
1.4鸡胚半数感染量(EID50)的测定 将救获的重组病毒和野生病毒用灭菌PBS作10倍倍比稀释至1010，将105-1010各稀释度分别接种4枚SPF鸡胚，37℃鸡胚孵化箱孵化48h，通过测定感染鸡胚尿囊液的血凝活性来判断个病毒的复制滴度，利用Reed-Muench方法计算EID50。
1.5SPF鸡鼻腔感染试验及排毒检测试验 分别用灭菌PBS稀释救获的2株重组病毒备用尿囊液，使病毒终浓度达到106EID50/100L，经鼻腔感染6羽4-6周龄SPF鸡，每只100L(含106EID50病毒)。感染后第3和第5天采集咽式子和泄殖腔拭子，用非免疫鸡胚进行病毒滴定，用血凝试验检测重组病毒的排毒情况。并观察感染后鸡的发病、死亡情况，连续观察15天，采血并分离血清，用血凝抑制试验(HI)检测血清转阳情况。
1.6BALB/c小鼠的致病性试验 用灭菌PBS将2株重组病毒和2株野生病毒(BHG/05和AH/05)的尿囊液分别稀释到106EID50/50L，置于冰上。待BALB/c小鼠被CO2轻度麻醉后，每只小鼠经鼻腔滴注50L含106EID50病毒的稀释液，每株病毒滴注8只小鼠，接种后3、5天各剖杀3只，采集鼻咽部、脑、脾、肾和肺用于病毒分离滴定。其余5只连续观察14天，并记录体重变化。
1.6.1小鼠脏器病毒分离滴定 在所采集的每一脏器中加入1mL PBS，充分研磨，4℃下12000rpm离心10min，吸取上清液，用灭菌的含青链霉素的PBS进行10倍倍比稀释，将不同稀释度的病毒分别经尿囊腔接种3枚10日龄非免疫鸡胚，37℃继续孵化48h，通过测定感染胚尿囊液的血凝活性来判断其是否感染及其感染滴度，利用Reed-Muench法计算病毒含量。
1.6.2BALB/c小鼠的免疫试验 用灭菌PBS将救获的2株重组病毒尿囊液稀释到106EID50/50L，置于冰上。待BALB/c小鼠用CO2轻度麻醉后，每只小鼠经鼻腔滴注50L含106EID50病毒的稀释液，免疫后4周采血，分离血清、血清样品用受体破坏酶(RDE)处理，用于血凝抑制抗体(HI)和中和抗体(NT)检测。一部分小鼠在免疫4周后按同样的方法和剂量进行加强免疫一次，加强免疫4周后采血，分离血清、处理，并用于血清抗体检测。
1.6.3血凝抑制抗体的测定试验 血清样品用受体破坏酶(RDE)处理后，加入96孔微量V型板上并作2倍倍比稀释直到212，加入预配好的4单位抗原，轻轻震荡96孔微量板，使抗原抗体充分混匀，在室温下作用30min，加入0.5％的鸡红血球，室温下静置15min，观察血凝结果并记录。
1.6.4中和抗体测定试验 1)病毒的TCID50测定 将3株野生病毒(DKGX/35/01、BHG/05、AH/05，均购自哈尔滨兽医研究所)的尿囊液用细胞维持液作10倍倍比稀释直到10-8，置于冰上，将各个稀释度病毒液接种于密度为80％左右的MDCK细胞，每孔100L病毒液，每个稀释度平行接种4孔细胞，将接种好的细胞培养板在37℃、5％的CO2培养箱里培养48h。用血凝试验检测病毒的复制滴度，并用Reed-Meunch方法计算结果。
2)中和试验 将小鼠血清用受体破坏酶(RDE)处理后，然后用血清维持液作2倍倍比稀释，开始稀释度为1∶10，直到1∶2560。然后加入等体积事先配好的100TCID50的病毒稀释液，混匀，在室温下作用1h，将各个血清稀释度混合液接种密度为80％左右的MDCK细胞，每孔100L，平行接种3个细胞孔。病毒对照用维持液代替血清，血清对照为最低稀释度的血清加入等体积的维持液。将细胞培养板置于37℃、5％的CO2培养箱培养48h后。用血凝试验检测病毒在MDCK细胞上的复制滴度，并用Reed-Meuch方法计算小鼠血清的中和抗体滴度。
1.6.5攻毒保护试验 1)小鼠单剂量免疫后用同源病毒和异源病毒的攻击试验 免疫组的小鼠用救获的2株弱毒活疫苗株BHG/AAca和AH/AAca分别经鼻腔免疫，对照组的小鼠鼻腔接种灭菌PBS。单剂量免疫后4周，BHG/AAca和AH/AAca疫苗株免疫的一部分小鼠分别鼻腔感染100，1000和10000小鼠半数致死剂量(MLD50)的同源病毒BHG/05与AH/05，对照小鼠也分别鼻腔感染100，1000和10000MLD50剂量的BHG/05与AH/05病毒，每组11只小鼠。攻毒后3天每组剖杀3只，采集鼻咽部、脑、脾、肾和肺用于病毒分离滴定。其余8只连续观察14天，并记录体重变化。单剂量免疫后4周，另一部分免疫的小鼠和对照组小鼠鼻腔感染100MLD50剂量的另外两株异源病毒，即BHG/AAca免疫组小鼠用DKGX/35/01和AH/05攻击；AH/AAca免疫组小鼠用DKGX/35/01和BHG/05病毒攻击。每组11只小鼠，攻毒后3天剖杀3只，采集鼻咽部、脑、脾、肾和肺用于病毒分离滴定。其余8只连续观察14天，并记录体重变化。
2)小鼠加强免疫后同源病毒和异源病毒的攻击试验 加强免疫4周后，按上述方法用相应的同源病毒和异源病毒对免疫组和对照组小鼠进行攻击。攻毒后3天剖杀3只，采集鼻咽部、脑、脾、肾和肺用于病毒分离滴定。每组11只小鼠，其余8只连续观察14天，并记录体重变化。
2结果 2.1救获重组病毒和野生病毒的温度敏感性测定 将2株野生病毒和2株救获的重组病毒分别接种70-80％密度的MDCK细胞，在33℃和39℃培养条件下孵育48h，并用血凝试验检测每个温度下病毒的复制滴度，用Reed-Muench方法计算各个病毒的TCID50。结果表明，BHG/AAca重组病毒与BHG/05野生病毒在33℃和39℃培养条件下的复制滴度相差106倍，AH/AAca重组病毒与野生病毒AH/05在33℃和39℃培养条件下的复制滴度相差106.25倍。因此，救获的2株重组病毒在33℃和39℃培养条件下复制滴度相差均远远大于100倍。而2株野生病毒在33℃和39℃培养条件下的复制滴度基本一致，差值小于100倍。因此救获的各株重组病毒均具有温度敏感性生物学特性，而野生病毒没有此特性(见图2(A)，2(B))。
2.2救获的重组病毒和野生病毒的冷适应性测定结果 将2株野生病毒和2株救获的重组病毒作10倍倍比稀释，将各稀释度接种10日龄的SPF鸡胚，分别在25℃和34℃孵化条件下孵育72h，用血凝试验检测每个温度下病毒的复制滴度，用Reed-Meunch方法计算各个病毒的EID50。结果表明，BHG/AAca和AH/AAca重组病毒在25℃培养条件下的复制滴度和34℃培养条件下的复制滴度基本一致，2株病毒在25℃和34℃两个温度下的病毒复制滴度的差值在100倍以内。与其相应野生病毒在25℃培养条件下几乎不能复制，而在34℃条件下复制很好。因此救获的各株重组病毒均具有冷适应性生物学特性，而与其相应的野生病毒BHG/05和AH/05没有此特性。(详细结果见图3(A)，3(B))。
2.3鸡胚半数感染量(EID50)测定结果 将野生病毒和重组病毒共4株病毒经鸡胚扩增纯化后，收集尿囊液、分装、并储存于-70℃作为实验用种毒。利用前述方法测定这4株病毒的鸡胚半数感染量(EID50)。测定结果表明，4株病毒每1mL尿囊液所含的EID50在108.5-1010之间。(详细结果见表3) 表3救获的重组病毒和野生病毒的EID50测定结果
2.4重组病毒对鸡的致病性试验结果 救获2株重组病毒BHG/AAca和AH/AAca以106EID50/100L经鼻腔感染4-6周龄的SPF鸡后，在感染后第3天和第5天采集鼻拭子和泄殖腔拭子用于病毒滴定，记录发病和死亡情况，连续观察15天，采血并分离血清，用HI试验检测血清转阳情况。实验结果表明，在攻毒后观察期内，救获的2株重组病毒感染鸡后，均不能引起鸡的发病和死亡。通过采集感染鸡的咽拭子和泄殖腔拭子的病毒滴定结果发现，2株重组病毒经鼻腔感染鸡后在第3天和第5天均不排毒。抗体检测试验结果表明，所有重组病毒经鼻腔感染鸡后，在第15天没有引起感染鸡的血清转阳。
将2株重组病毒的备用种毒用灭菌PBS作10倍倍比稀释后，翅静脉接种10羽4-6周龄SPF鸡，每羽鸡接种200L稀释的尿囊液，连续观察15天，并记录发病与死亡情况。实验结果表明，2株重组病毒经翅静脉接种SPF鸡后没有引起鸡的发病和死亡，在观察期间所有接种的鸡保持健康，IVPI均为0。血清检测试验结果表明，在接种鸡后第15天，AH/AAca重组病毒只能引起2只鸡血清转阳，BHG/AAca重组病毒只引起1只鸡血清转阳。详细结果见表4。
表4重组病毒对鸡的致病性实验结果
注“＜“表示原液没有分离到病毒。
2.5重组病毒和野生病毒对BALB/c小鼠的致病性试验结果 将2株野生病毒BHG/05和AH/05与救获的2株重组病毒BHG/AAca和AH/AAca以106EID50/50L剂量经鼻腔感染5只6周龄的BALB/c小鼠后，每天观察小鼠的发病情况、记录各组小鼠的体重变化和死亡情况。
BHG/AAca重组病毒感染小鼠后，在感染后第1天小鼠的体重轻度降低，到第4天完全恢复，观察期内没有出现发病异常现象和死亡情况，存活率为100％。而其相应的野生病毒BHG/05在感染小鼠后第1天引起小鼠体重急剧下降，在感染后第3天，小鼠出现被毛蓬乱、食欲废绝和神经症状，并在感染后第9天之内将小鼠全部致死(详细结果见图4)。
AH/AAca重组病毒感染小鼠后，也在感染后第1天小鼠的体重有轻度降低，并到第4天完全恢复，观察期内没有出现发病症状和死亡情况，存活率为100％。而其相应的野生病毒AH/05在感染小鼠后第1天引起小鼠体重急剧下降，并在感染后第7天之内使小鼠全部致死(详细结果见图5)。
2.6救获的重组病毒与野生病毒在小鼠体内的复制 将救获的2株重组病毒和2株野生病毒以106EID50的剂量鼻腔感染小鼠后，在感染后第3天和第5天每组各剖杀3只小鼠，采集鼻咽部、脑、脾、肾和肺脏等脏器进行病毒滴定。滴定结果如下 BHG/AAca重组病毒感染小鼠后第3天和第5天，只局限在小鼠的呼吸道复制(即鼻咽部和肺脏)，没有进入脑、脾和肾等脏器，其中在感染后第5天的病毒滴度比第3天的滴度低。而BHG/05野生病毒却能在小鼠的全身复制。感染后第3天，在小鼠的肺脏中和鼻咽部分离到高滴度的病毒，同时也在脑、脾、肾脏器中分离到病毒较高的病毒。感染后第5天在脑和肾中病毒滴度升高，肺脏和鼻咽部中病毒滴度有所下降，在脾脏中没有分离到病毒(详细结果见图6)。
AH/AAca重组病毒感染小鼠后第3天和第5天也局限在小鼠鼻咽部和肺脏中复制，并且也在感染后第5天病毒滴度下降。而AH/05野生病毒在却能在小鼠体内呈全身复制。感染后第3天。在所有检测的脏器中均能分离到病毒，其中肺、鼻咽部的病毒滴度最高。在感染后第5天脑和肾脏中病毒滴度升高，而其他3个脏器滴度均有所降低，尤其是脾脏(详细结果见图7)。
2.7单剂量免疫后HI抗体的测定结果 2株弱毒活疫苗以106EID50的剂量经鼻腔免疫6周龄的BALB/c小鼠，单剂量免疫4周后，采血、分离血清、去除血清中非特异性抑制剂，血清抗体用血凝抑制试验(HI)检测。检测结果表明，单剂量免疫4周后，BHG/AAca和AH/AAca疫苗株分别能诱导产生与同源病毒BHG/05和AH/05反应的HI抗体，抗体滴度分别为28.7和26.7，BHG/AAca疫苗株能诱导产生与异源病毒DKGX/35/01和AH/2/05交叉反应的HI抗体，AH/AAca疫苗株能诱导产生与异源病毒DKGX/35/01反应的交叉抗体。(详细结果见表5)。
表5H5N1亚型弱毒活疫苗株单剂量免疫小鼠后诱导产生的HI抗体
2.8单剂量免疫后中和抗体的测定结果 2株弱毒活疫苗以106EID50的剂量经鼻腔免疫6周龄的BALB/c小鼠，单剂量免疫4周后，采血、分离血清，血清抗体用微量中和试验(NT)检测。结果表明，单剂量免疫4周后，2株弱毒活疫苗株均能诱导产生与同源病毒和异源病毒反应的中和抗体。BHG/AAca疫苗株诱导产生与同源病毒BHG/05反应的中和抗体滴度为640，与异源病毒DKGX/35/01和AH/05反应的中和抗体滴度分别为320和40。AH/AAca疫苗株诱导产生与同源病毒AH/05反应的中和抗体滴度为533.3，与异原病毒DKGX/35/01和BHG/05反应的中和抗体滴度分别为240和53.3(详细结果见表6)。
表6H5N1亚型弱毒活疫苗株单剂量免疫小鼠后诱导产生的中和抗体
2.9加强免疫后HI抗体的测定结果 单剂量免疫4周后，免疫组小鼠又收到同样途径和剂量的救获的弱毒活疫苗株的第二次免疫，免疫4周后，采血、分离血清，血清抗体用血凝抑制试验(HI)检测。检测结果表明，加强免疫后4周，2株弱毒活疫苗株诱导产生HI抗体滴度显著的上升，均能诱导产生与同源病毒和异源病毒反应的高滴度HI抗体。BHG/AAca疫苗株诱导产生与同源病毒BHG/05反应的HI抗体滴度为213.3，与异源病毒DKGX/35/01和AH/05反应的HI抗体滴度分别为160和106.7。而AH/AAca疫苗株诱导产生与同源病毒AH/05反应的HI抗体滴度为480，与异源病毒DKGX/35/01和BHG/05反应的HI抗体滴度分别266.7和80(详细结果见表7)。
表7H5N1亚型弱毒活疫苗株加强免疫小鼠后诱导产生的HI抗体
2.10加强免疫后中和抗体的测定结果 加强免疫后4周，2株弱毒活疫苗株在小鼠上诱导产生的中和抗体滴度也显著地升高。BHG/AAca疫苗株诱导产生与同源病毒反应的中和抗体滴度为2133.3，与异源病毒DKGX/35/01和AH/05交叉反应的中和抗体滴度为1573.3和533.3。AH/AAca疫苗株诱导产生与同源病毒AH/05反应的中和抗体滴度为1573.3，与异源病毒DKGX/35/01和BHG/05反应的中和抗体滴度为853.3和533.3。(详细结果见表8)。
表8H5N1亚型弱毒活疫苗株加强免疫小鼠后诱导产生的中和抗体
2.11单剂量免疫的小鼠用同源病毒攻击后的体重变化和死亡结果 分别用BHG/AAca和AH/AAca疫苗株以106EID50剂量经鼻腔免疫3组6周龄的BALB/c小鼠，3组对照小鼠接种灭菌PBS。单剂量免疫4周后，把每一免疫组小鼠和对照组小鼠分别分成3组，每组8只。分别用BHG/05和AH/05三株同源野生病毒以102MLD50、103MLD50和104MLD50剂量进行致死攻击，连续观察15天，记录体重变化和死亡情况。结果如下 1)BHG/AAca疫苗免疫组 以102MLD50剂量的同源病毒BHG/05攻击BHG/AAca疫苗免疫组和对照组小鼠后，所有免疫组小鼠的体重在攻毒后呈上升趋势，在观察期间没有出现小鼠发病和死亡现象，存活率为100％，该疫苗株对102MLD50剂量的同源病毒致死攻击能提供100％的保护。而对照组小鼠的体重在攻毒后第3天开始下降，并在第12天之内小鼠全部死亡。
以103MLD50剂量的同源病毒BHG/05攻击免疫组和对照组小鼠后，免疫组小鼠的体重在第3天有轻度的下降，但在第4天就恢复并在以后的观察期内一直缓慢的上升，在观察期内免疫小鼠没有发病和死亡现象，存活率为100％，该疫苗株对103MLD50剂量的同源病毒致死攻击提供100％的保护。而对照组小鼠的体重在攻毒后第3天明显开始下降，并持续到第10天，小鼠最终全部死亡。
以104MLD50剂量的同源病毒BHG/05攻击免疫组和对照组小鼠后，免疫组小鼠的体重在攻毒后第2天出现下降趋势，并在第5天完全恢复并开始升高，没有导致小鼠的死亡，该疫苗株对104MLD50剂量的同源病毒致死攻击提供100％的保护。然而，对照组小鼠的体重在攻毒后第2天急剧下降，并在第8天之内使小鼠全部致死。(详细结果见图8(A)、8(B)、8(C))。
2)AH/AAca疫苗免疫组 以102MLD50剂量的同源病毒AH/05攻击AH/AAca疫苗免疫组和对照组小鼠后，免疫组小鼠的体重在观察期间一直呈上升趋势，并没有引起小鼠的发病和死亡，存活率为100％，该疫苗株对102MLD50剂量的同源病毒致死攻击提供100％的保护。但是，对照组小鼠的体重在攻毒后第2天开始下降，在第11天之内小鼠全部死亡。
以103MLD50剂量的同源病毒攻击免疫组和对照组小鼠后，免疫组小鼠的体重没有下降，在观察期内也没出现小鼠发病和死亡现象，存活率为100％，该疫苗株对103MLD50剂量的同源病毒致死攻击提供100％的保护。而对照组小鼠的体重在攻毒后第2天明显下降，并在第9天之内小鼠全部死亡。
以104MLD50剂量的同源病毒攻击免疫组和对照组小鼠后，免疫组小鼠的体重在攻毒后第2天有轻度的下降，在第5天完全恢复并开始升高，没有导致小鼠死亡，存活率为100％，该疫苗株对104MLD50剂量的同源病毒致死攻击提供100％的保护。然而，对照组小鼠的体重在攻毒后第2天急剧下降，并在第9天之内小鼠全部死亡。(详细结果见图9(A)、9(B)、9(C)。) 2.12单剂量免疫的小鼠用同源病毒攻击后的脏器滴定结果 分别用BHG/AAca和AH/AAca疫苗株以106EID50剂量免疫3组6周龄的BALB/c小鼠，3组对照组接种无菌的PBS。单剂量免疫4周后，把免疫组小鼠和对照组小鼠分别分成3组，每组3只，分别用BHG/05和AH/05同源野生病毒以102MLD50、103MLD50和104MLD50的剂量攻击，攻毒后3天剖杀3只，采集鼻咽部、脑、脾、肾和肺等脏器用于病毒分离滴定。
1)BHG/AAca免疫组 以102MLD50剂量的同源病毒BHG/05攻击BHG/AAca疫苗免疫组和对照组小鼠。小鼠脏器滴定结果表明，免疫组小鼠对此剂量的同源病毒攻击产生了完全的保护，在免疫组小鼠的所有检测脏器中没有分离到病毒。而在对照组小鼠的多个脏器中分离到病毒，在小鼠的肺脏中检测到高滴度的病毒，病毒滴度为106.75EID50，并在其鼻咽部、脑和脾脏中能检测到低滴度的病毒。
以103MLD50剂量的同源病毒BHG/05攻击BHG/AAca疫苗免疫组和对照组小鼠。小鼠脏器滴定的结果表明，免疫组小鼠对此剂量的同源病毒攻击不能产生完全的保护，在其肺脏和鼻咽部检测到病毒，而在其他脏器中检测到不病毒。而病毒在对照组小鼠的体内呈全身复制，并在小鼠的肺脏和鼻咽部检测到高滴度的病毒，病毒滴度分别为107EID50和104EID50，同时也在小鼠脑、脾和肾脏中检测到病毒。
以104MLD50剂量的同源病毒BHG/05攻击BHG/AAca疫苗免疫组和对照组小鼠。检测结果表明，免疫组小鼠对此剂量的同源病毒攻击也不能产生完全的保护，在小鼠的肺脏和鼻咽部能检测到病毒，而在其他脏器不能检测到病毒。而病毒在对照组小鼠体内呈全身复制，在肺和鼻咽部能分离到高滴度的病毒，病毒滴度分别为106.6EID50和105EID50，并且在脑、脾和肾等脏器中也能检测到病毒复制。(详细结果见图10) 2)AH/AAca免疫组 以102MLD50剂量的同源病毒AH/05攻击AH/AAca疫苗免疫组和对照组小鼠。病毒滴定结果表明，免疫组小鼠对此剂量的同源病毒攻击产生了完全的保护，在免疫组小鼠的所有检测脏器中没有分离到病毒。而在对照组小鼠的多个脏器中能检测到病毒，并在肺脏中能检测到高滴度的病毒，滴度为107EID50，同时在脑、脾、肾和鼻咽部中也能检测到低滴度的病毒。
以103MLD50剂量的同源病毒AH/05攻击AH/AAca疫苗免疫组和对照组小鼠。病毒滴定结果表明，免疫组小鼠对此剂量的同源病毒攻击几乎产生了完全的保护，在小鼠的肺脏中能检测到很低滴度的病毒，而在其他脏器中不能检测到病毒。而在照组小鼠的多个脏器中检测到病毒，并在小鼠的肺脏、鼻咽部和脑中分离到高滴度的病毒，病毒滴度分别为106.6EID50、104.4EID50和103.5EID50，并且在小鼠肾脏中检分离到病毒。
以104MLD50剂量的同源病毒AH/05攻击AH/AAca疫苗免疫组和对照组小鼠。病毒滴定结果表明，免疫组小鼠对此剂量的同源病毒攻击也不能产生完全的保护，在小鼠的肺脏和鼻咽部能检测到低滴度病毒，而在其他脏器不能检测到病毒。而病毒在对照组小鼠体内呈全身复制，并在肺、鼻咽部和脑中分离到高滴度的病毒，病毒滴度分别为107.4EID50、103.9EID50和103.4EID50，同时也能在脾和肾脏中也检测到病毒复制。(详细结果见图11) 2.13单剂量免疫的小鼠用异源病毒攻击后的体重变化和死亡结果 分别用BHG/AAca和AH/AAca疫苗株以106EID50剂量免疫2组6周龄的BALB/c小鼠，2组对照组接种无菌的PBS。单剂量免疫4周后，把免疫组的小鼠和对照小鼠分别分成3组，每组8只。BHG/AAca免疫组和对照组的小鼠分别用102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01和AH/05攻击；AH/AAca免疫组和对照组的小鼠分别用102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01和BHG/05攻击。连续观察15天，记录体重变化和死亡情况。实验结果如下。
1)BHG/AAca免疫组 BHG/AAca免疫组小鼠用异源病毒DKGX/35/01攻击时，免疫组小鼠体重在攻毒后没有下降，没有小鼠发病和死亡现象，存活率为100％，对异源病毒DKGX/35/01的攻击提供100％的保护。而对照组的小鼠在异源病毒DKGX/35/01攻击后第7天体重开始急剧下降，并在第12天之内小鼠全部死亡(详细结果见图12)。
当BHG/AAca免疫组的小鼠用异源病毒AH/2/05攻击时，免疫组小鼠的体重在攻毒后第3天有轻度下降，到第5天完全恢复并开始升高，没有出现小鼠发病和死亡现象，存活率为100％，对异源病毒AH/05的攻击也能提供100％的保护。而对照组小鼠在异源病毒BHG/05攻击后第2天体重急剧下降，一直持续到第12天小鼠全部死亡(详细结果见图13)。
2)AH/AAca免疫组 AH/AAca免疫组的小鼠用异源病毒DKGX/35/01攻击时，免疫组小鼠体重在攻毒后保持上升趋势，没有出现小鼠发病和死亡现象，存活率为100％，对异源病毒DKGX/35/01的攻击提供100％的保护。而对照组的小鼠在异源病毒DKGX/35/01攻毒后第7天体重开始急剧下降，并在第12天之内使小鼠全部致死(详细结果见图14)。
当AH/AAca免疫组的小鼠用异源病毒BHG/05攻击时，免疫组小鼠的体重在攻毒后没有下降，也没有小鼠的发病和死亡，存活率为100％，对异源病毒BHG/05的攻击提供100％的保护。而对照组的小鼠在异源病毒BHG/05攻毒后第3天体重急剧下降，一直持续到第10天小鼠全部死亡(详结果见图15)。
2.14单剂量免疫的小鼠用异源病毒的攻击后的脏器滴定结果 分别用BHG/AAca和AH/AAca疫苗株以106EID50的剂量经鼻腔单剂量免疫2组6周龄的BALB/c小鼠，2组对照小鼠接种无菌PBS。免疫4周后，把免疫组的小鼠和对照小鼠分别分成3组，每组3只。BHG/AAca免疫组和对照组小鼠分别102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01和AH/2/05攻击；AH/AAca免疫组和对照组小鼠分别102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01和BHG/QH/3/05攻击。攻毒后3天剖杀3只，采集鼻咽部、脑、脾、肾和肺用于病毒分离滴定。滴定结果如下 1)BHG/AAca免疫组 BHG/AAca免疫组小鼠用102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01攻击时，不能提供完全的复制保护，但只在免疫组小鼠的肺脏中分离到低滴度的病毒。而在对照组小鼠的肺脏中分离到高滴度的病毒，并且在脾脏中也能检测到病毒。
用102MLD50剂量的异源病毒AH/2/05攻毒时，免疫组的小鼠也没有提供完全的复制保护，在其肺脏和鼻咽部分离到病毒。而在对照组小鼠的所有检测脏器中均能分离到病毒，并在其肺脏中分离到高滴度的病毒。(详细结果见图16) 2)AH/AAca免疫组 AH/AAca免疫组的小鼠用102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01攻击时，免疫组小鼠几乎提供了完全的保护，只能在小鼠的肺脏中检测到低滴度的病毒。而能在对照组小鼠的肺脏中分离到高滴度的病毒，并且脾脏也能分离到病毒。
用102MLD50剂量的异源病毒BHG/05攻击时，免疫组小鼠也能提供较好的复制保护，只能在其鼻咽部检测到低滴度的病毒。而在对照组小鼠的多个脏器中能分离到病毒，并在其肺脏和鼻咽部能分离到高滴度的病毒。(详细结果见图17) 2.15加强免疫组用同源病毒攻击后的死亡结果和脏器滴定结果 用BHG/AAca和AH/AAca这2株疫苗株以106EID50免疫6周龄的BALB/c小鼠，单剂量免疫4周后，又分别用相应的疫苗株以同样的剂量经鼻腔途径进行第2次免疫，对照组小鼠再次接种同样体积的PBS。加强免疫4周后，将各免疫组和对照组小鼠分别分成2组，每组11只。分别用BHG/05和AH/05同源病毒以102MLD50、103MLD50和104MLD50的剂量攻击，攻毒后第3天每组剖杀3只小鼠，采集鼻咽部、脑、脾、肾和肺用于病毒分离滴定。剩余的小鼠连续观察15天，记录体重变化和死亡情况。实验结果如下 所有免疫组小鼠分别用不同剂量的同源病毒BHG/05和AH/05攻毒后，均呈现100％保护，即不发病、不死亡，而对照组小鼠在观察期间全部死亡(数据略)。
1)BHG/AAca免疫组 BHG/AAca免疫组小鼠用不同剂量的同源病毒BHG/05攻击时，其对各剂量的同源病毒攻击均能产生完全的复制保护，在免疫组小鼠的所有检测脏器中分离不到病毒。而病毒在对照组小鼠体内呈全身复制，并能在多个组织脏器中分离到高滴度的病毒。(详细结果见图18) 2)AH/AAca免疫组 AH/AAca疫苗免疫组小鼠用不同剂量的同源病毒AH/05攻击时，其也能对各剂量同源病毒产生完全的复制保护，在免疫组小鼠的所有检测组织脏器中没有分离到病毒。而病毒在对照组小鼠体内呈全身复制，在多个脏器中能检测到高滴度的病毒(详细结果见图19)。
2.16加强免疫组用异源病毒攻击后的死亡结果和脏器滴定结果 用BHG/AAca和AH/AAca这2株疫苗株以106EID50的剂量经鼻腔免疫6周龄的BALB/c小鼠，单剂量免疫4周后，又分别用相应的疫苗株以同样剂量经鼻腔途径进行第2次免疫，对照组的小鼠再次接种同样体积的PBS。加强免疫4周后，把免疫组的小鼠和对照组小鼠分别分成3组，每组11只。BHG/AAca免疫组和对照组小鼠分别102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01和AH/05攻击；AH/AAca免疫组和对照组小鼠分别102MLD50剂量的异源病毒DKGX/35/01和BHG/05攻击。攻毒后第3天每组剖杀3只，采集鼻咽部、脑、脾、肾和肺用于病毒分离滴定。剩余的小鼠连续观察15天，记录体重变化和死亡情况。实验结果如下 所有免疫组小鼠分别用另两株异源病毒攻击后都能提供100％的保护，即不发病、不致死，而对照组小鼠在观察期间全部死亡(数据略)。
1)BHG/AAca免疫组 BHG/AAca疫苗免疫组小鼠用异源病毒DKGX/35/01和AH/05攻击时均能提供完全的保护，即在所有免疫组小鼠的所有检测脏器中分离不到病毒。然而在两组对组照小鼠的多个甚至所有组织器官中分离到病毒。(详细结果见图20) 2)AH/AAca免疫组 AH/AAca免疫组的小鼠对异源病毒DKGX/35/01和BHG/05攻击也均能产生完全的复制保护，在所有免疫组小鼠的检测脏器中分离不到病毒。然而能在两组对照组小鼠的多个组织脏器甚至呈所有脏器分离到病毒。(详细结果见图21) 3实验总结 对救获的2株重组病毒在MDCK细胞和SPF鸡胚上分别进行温度敏感性和冷适应性的生物学特性研究，结果表明，2株重组病毒均具有我们预期的、和AA/ca疫苗株相似的温度敏感性和冷适应性生物学特性，即2株重组病毒均在39℃高温条件下生长被限制，在低温25℃条件下能很好的生长。
救获的2株重组病毒以106EID50的剂量经鼻腔感染4周龄的SPF鸡后，在观察期内均不引起鸡的发病和死亡，并且在感染后第3天和第5天在感染鸡的咽喉和泄殖腔均不排毒，所有感染鸡在感染后第15天血清没有出现转阳情况。救获的重组病毒经静脉接种SPF鸡后，均没有导致鸡的死亡，在接种后2周只有0-2羽鸡转阳。因此，我们救获的重组病毒具有对鸡不感染和不致病的生物学特性。这些生物学特性为将来重组病毒作为弱毒活疫苗株的使用提供了生物安全保障，避免了活疫苗株与外界的野生病毒在易感的鸡群中发生重组的可能性，从而带来了生物安全隐患。同时，由于救获的重组病毒对鸡不感染，因而这些重组病毒不能作为禽类疫苗使用。经有关文献报道(Suguitan et al.，2006)，我们拯救的重组病毒在鸡体内不能复制的原因之一是重组病毒的HA基因的碱性裂解位点被删除，使重组病毒首先具备了低致病性的特点；其次的因素可能是由于救获的重组病毒具有温度敏感性生物学特性，即其在39℃高温生长条件下生长被限制(鸡体的体温高达40-41℃)。
救获的2株重组病毒以106EID50剂量感染6周龄的BALB/c小鼠后，在观察期内均不引起小鼠发病、死亡，并且在感染后3天和5天病毒只局限在小鼠的呼吸道复制，BHG/AAca和AH/AAca重组病毒均只在小鼠的鼻咽部和肺脏中复制，并且复制的病毒滴度与相应的野生病毒相比均远远降低。因此，救获的重组病毒对小鼠呈低致病力。而相应的野生病毒BHG/05和AH/05对小鼠都呈现高致病性，在感染后第3天和第5天在小鼠体内均呈全身复制，在其鼻咽部、脑、脾、肾和肺脏中分离到高滴度的病毒，并且在感染后9天之内将小鼠全部致死。由此可见，我们拯救的重组病毒与其相应的野生病毒相比，在BALB/c小鼠上的致病力大大减弱，因而其在哺乳动物模型BALB/c小鼠上具有高度的生物安全性。
为了鉴定这2株重组病毒BHG/AAca和AH/AAca能否作为弱毒活疫苗使用，因此我们首先在哺乳动物模型BALB/c小鼠上对其进行了免疫原性和保护效力的评价。
将2株弱毒活疫苗以106EID50的剂量经鼻腔免疫6周龄的BALB/c小鼠，单剂量免疫4周后，HI抗体检测结果表明，BHG/AAca和AH/AAca疫苗株均能在BALB/c小鼠上诱导产生与同源病毒反应的HI抗体，分别为28.7和26.7，并且BHG/AAca疫苗株能诱导产生与异源病毒DKGX/35/01和AH/05交叉反应的HI抗体；AH/AAca疫苗株能诱导产生与异源病毒DKGX/35/01交叉反应的抗体。中和抗体检测结果表明，BHG/AAca和AH/AAca2株弱毒活疫苗株均能在BALB/c小鼠诱导产生与同源病毒和异源病毒反应的中和抗体。
加强免疫后4周，HI抗体检测结果表明，2株弱毒活疫苗株诱导产生与同源病毒和异源病毒反应的HI抗体滴度均显著的升高。BHG/AAca疫苗株诱导产生与同源病毒反应的HI抗体滴度为213.3，与异源病毒DKGX/35/01和AH/05交叉反应的HI抗体滴度分别为160和106.7。而AH/AAca疫苗株诱导产生与同源病毒反应的HI抗体滴度为480，与异源病毒DKGX/35/01和BHG/05交叉反应的HI抗体滴度分别为266.7和80。中和抗体检测结果表明，2株弱毒活疫苗株在加强免疫后均能诱导产生高滴度的中和抗体。血清抗体检测结果表明，2株弱毒活疫苗株在哺乳动物模型BALB/c小鼠上均具有良好的免疫原性。
然后，对这2株弱毒活疫苗株在BALB/c小鼠上进行了保护效力评价研究。实验结果表明，单剂量免疫后，2株弱毒活疫苗免疫组均能对102MLD50、103MLD50和104MLD50不同剂量的同源病毒的攻击提供100％的保护，即不发病、不致死。而对照组小鼠全部死亡。小鼠脏器滴定结果表明，2株弱毒活疫苗免疫组能对102MLD50剂量的同源病毒攻击产生完全的复制保护，即在免疫组小鼠的所有脏器中检测不到病毒，而在对照组小鼠的多个器官检测到高滴度的病毒。而对103MLD50和104MLD50剂量的同源病毒攻击不能提供完全的复制保护，但是病毒只局限在小鼠的呼吸道复制，不能进入脑、脾和肾等其他脏器。通过比较攻击病毒在2株疫苗免疫组小鼠的呼吸道中的复制滴度，发现AH/AAca疫苗株对高剂量103MLD50和104MLD50的同源病毒攻击提供了较BHG/AAca疫苗株更好的保护，只能在其免疫组小鼠的呼吸道脏器中检测到低滴度的病毒。单剂量免疫后，2组疫苗免疫组的小鼠分别用102MLD50剂量另2株异源病毒攻击，BHG/AAca和AH/AAca疫苗免疫组小鼠均能对相应的异源病毒攻击提供100％的保护，免疫组小鼠不发病、不死亡，而对照组小鼠全部死亡。小鼠脏器滴定结果表明，2组疫苗免疫组小鼠均不能对异源病毒的攻击提供完全的保护，但攻击病毒只局限在免疫组小鼠的呼吸道内复制，且病毒的复制滴度比在对照组小鼠的复制滴度显著降低，而且病毒不能进入脑、脾和肾等脏器。加强免疫4周后，攻毒保护试验结果表明，加强免疫组的小鼠均能对同源病毒和异源病毒的攻击提供100％的保护，即不发病、不致死。而对照组小鼠全部死亡。小鼠脏器滴定结果表明，BHG/AAca和AH/AAca疫苗免疫组的小鼠对同源和异源病毒攻击也能产生完全的保护，即在所有检测脏器中均分离不到病毒。
另外，单剂量免疫后，尽管2株弱毒活疫苗株对高剂量的同源病毒和102MLD50剂量的异源病毒攻击不能提供完全的复制保护，但是病毒只局限在小鼠的呼吸道内复制，且复制的滴度相对于其在对照组小鼠的复制滴度显著降低，也不没有扩散到其他脏器(例如，脑、脾和肾脏)。然而病毒在对照组小鼠的体内呈全身复制，并且脑中的病毒滴度很高，因而导致小鼠死亡。通过比较病毒在各免疫组小鼠体内的复制滴度，发现AH/AAca疫苗株较BHG/AAca疫苗株提供更好的复制保护。在加强免疫后，2株疫苗株对同源和异源病毒的攻击均能提供100％的保护，同时也能提供完全的复制保护。
综上所述，通过免疫原性和免疫效力试验的评价结果，证实本研究构建的2株弱毒活疫苗株BHG/AAca和AH/AAca在哺乳动物模型BALB/c小鼠上具有很好的免疫原性和保护效力，此项研究为预防将来H5N1亚型禽流感病毒在人群中的大流行的疫苗提供了储备。
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序列表
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<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2341
<212>DNA
<213>Avian influenza virus
<400>1
agcgaaagca ggtcaattat attcaatatg gaaagaataa aagaactacg gaatctgatg 60
tcgcagtctc gcactcgcga gatactaaca aaaaccacag tggaccatat ggccataatt 120
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gcaatgaaat atccgattac agccgacaag aggataacag aaatgattcc tgagagaaat 240
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权利要求
1.一种重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗，其特征在于表达H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白和NA蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗，其还表达冷适应疫苗的6个蛋白聚合酶PB2亚基(PB2)，聚合酶PB1亚基(PB1)，聚合酶PA亚基(PA)，核蛋白(NP)，基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)。
3.根据权利要求2的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗，其中所述冷适应疫苗是H2N2亚型冷适应弱毒疫苗株A/AnnArbor/6/60(AAca)。
4.根据权利要求1所述的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗，其中所述HA蛋白缺失了裂解位点的连续多个碱性氨基酸。
5.根据权利要求1至4中任一项的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗，其中所述HA蛋白和NA蛋白的氨基酸序列来源于H5N1亚型禽流感病毒株BHG/05，或来源于H5N1亚型禽流感病毒株AH/05。
6.一种生产根据权利要求1-5任何一项的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗的方法，该方法包括
(1)构建两个表达质粒，所述两个表达质粒分别用于表达H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白和NA蛋白；
(2)构建六个表达质粒，所述六个表达质粒分别用于表达冷适应疫苗的6个蛋白聚合酶PB2亚基(PB2)，聚合酶PB1亚基(PB1)，聚合酶PA亚基(PA)，核蛋白(NP)，基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)；
(3)将步骤(1)和(2)中获得的八个表达质粒共转染禽流感病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；
(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组活疫苗。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述HA蛋白缺失了裂解位点的连续4个碱性氨基酸。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述冷适应疫苗是H2N2亚型冷适应弱毒疫苗株A/AnnArbor/6/60(AAca)。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述HA蛋白和NA蛋白的氨基酸序列来源于H5N1亚型禽流感病毒株BHG/05，或来源于H5N1亚型禽流感病毒株AH/05。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法获得的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗。
11.根据权利要求1-5中任何一项的重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗在制备治疗和/或预防禽流感病毒所导致的疾病的药物中的应用，优选所述药物用于治疗和/或预防动物或人的禽流感病毒感染。
全文摘要
本发明涉及重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗，其特征在于表达H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白和NA蛋白。更具体地，重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗是BHG/AAca和AH/AAca。本发明还公开了制备所述重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗的方法和该重组H5N1亚型禽流感冷适应弱毒活疫苗对预防人类禽流感的应用。
文档编号A61P31/16GK101780275SQ20091000507
公开日2010年7月21日 申请日期2009年1月21日 优先权日2009年1月21日
发明者陈化兰, 姜永萍, 步志高, 李雁冰, 施建忠, 田国彬 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所