专利名称：：猪圆环病毒Ⅱ型灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明属于兽医生物新医药
技术领域：
,涉及一种猪圆环病毒II型灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
：自1991年以来，PCV2感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸疾病综合征(PRDC)、猪皮肤和肾病综合征(PDNS)等多种疾病(总称为猪圆环病毒病，PCVDs)给全球养猪业造成了巨大的损失。病毒感染产生的免疫抑制能够导致现有疫苗免疫失败，造成多种病原混合(或继发)感染，并使疾病流行更加严重。在田间，PMWS主要出现于断奶仔猪，猪群表现为进行性消瘦、发育障碍、皮肤苍白，淋巴结肿大和黄疽，其发病率为3%—50%，死亡率为8%—35%;PRDC主要出现于育肥后期，其临床症状主要为非常严重的咳嗽和呼吸困难，迁延难治且使用抗生素无效，其发病率可达30—70%，死亡率可达4一6。/。，发病猪群生产性能显著降低；PDNS主要发生于断奶猪和育肥猪，最常见的临床症状为皮肤出现红疹，常见于后躯、后肢、背侧耳廓和腹部，其发病率可达2—14%，死亡率可达15—40%。目前，PCVDs的治疗原则主要是对症治疗和减少合并感染，但效果并不理想。有研究表明，PCV2中和抗体可抑制病毒复制，中和抗体水平愈高则病毒复制速度愈慢，PCVDs的发生机率也愈低。还有研究提示，高滴度的母源PCV2抗体可以预防仔猪感染PCV2。由此可见特异性疫苗可用于控制本病。近年来，人们一直在致力于PCV2疫苗的开发应用研究，并开发出了各种形式的PCV2疫苗，特别是灭活疫苗对猪有一定的免疫保护作用，但是应用效果仍不理想，主要表现在(1)抗原浓度较低PCV2在细胞中的生长滴度较低，一般仅为103TCID5()/ml左右，而疫苗产量和抗原剂量又是PCV2灭活疫苗得以大规模应用的关键，因此降低生产成本、提高疫苗质量与产量成为目前急待解决的棘手问题；(2)疫苗生产工艺较粗糙每个病毒都有适合自己的最佳生产工艺，而在PCV2灭活疫苗的制备过程中多数人忽略了对生产工艺的优化和完善，因而直接降低或破坏了PCV2抗原的免疫活性，导致了免疫效果的降低。
发明内容针对当前PCV2疫苗在应用方面存在的不足，本发明提供一种病毒滴度高、免疫原性好、免疫持续期长的猪圆环病毒II型灭活疫苗(DBN—SX07株)。用本发明的疫苗免疫猪，可较早产生均一且有效的免疫力，明显缩短PCV2感染窗口期，延长免疫持续期，从而减少加强免疫次数，降低免疫成本。本发明的另一目的在于提供该猪圆环病毒II型灭活疫苗的制备方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一种猪圆环病毒II型灭活疫苗，该疫苗的毒种为猪圆环病毒II型DBN—SX07株，保藏号为CGMCCNo.3064，上述毒种经垸化剂灭活后作为抗原，按比例加入油佐剂乳化配制而成。本发明中用于灭活病毒的烷化剂可为P—丙内酯、甲醛和戊二醛等垸化剂，但为更好的达到本发明的效果，本发明优选0.5%。一1%。的甲醛溶液。本发明的猪圆环病毒II型灭活疫苗，抗原与油佐剂的比例为1:1一1:5。其中，油佐剂包含卯一98wt。/。的白油、2—10wt。/。的司本一80。将重量百分比为90—98%白油与2—10%司本一80混合，100毫升混合液中加入l一2克硬脂酸铝即得本发明的油佐剂。本发明还提供了该猪圆环病毒II型灭活疫苗的制备方法，其步骤如下(1)生产用毒的制备取猪圆环病毒II型DBN—SX07株毒种接种PK15a，按常规条件培养、收获，作为生产用毒；(2)生产用毒的灭活将烷化剂按比例加入生产用毒中，37'C条件下灭活16—24小时，期间振荡4—5次；(3)乳化按比例加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗。其中，本发明所用的猪圆环病毒II型DBN—SX07株由福州大北农生物技术有限公司分离和鉴定，为当前中国流行毒株。该毒株已于2009年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.3064，分类命名为猪圆环病毒II型AwW"e"'rcov/r"stype2。本发明中的猪圆环病毒II型DBN—SX07株基因组由1767个碱基组成，含有ORFl和ORF2编码区，与已知序列的其它PCV2毒株序列有差异。该毒株具有如下特性(1)动物回归试验结果表明，攻毒猪(S/5)可出现明显的PCV2病毒血症和一过性的体温升高，且攻毒后21天迫杀解剖可见多种淋巴组织出现不同程度的肿大和充血，肺出现不同程度的水肿和肉变，肾发黄表面有坏死灶等；(2)具有良好的细胞增殖活性，按常规方法培养，其病毒滴度可达106J)TCID5o/ml以上；(3)具有较广的抗原谱，可与来自中国20省市的PCV2抗体阳性猪血清进行有效的中和。本发明的猪圆环病毒II型灭活疫苗及其制备方法有益效果如下(1)免疫效果好、成本低用常规病毒培养方法培养猪圆环病毒II型DBN一SX07株，其病毒滴度可达10^^5TCID5。/ml，显著高于目前文献报道水平，用此毒种制备的本发明疫苗，免疫效果好、生产成本低；(2)猪圆环病毒II型DBN—SX07株抗原谱较广，可以应用于中国大部分地区；(3)猪圆环病毒II型DBN—SX07株具有良好的免疫原性，能够诱导产生较高水平的特异性抗体，产生较文献报道水平高l一2个滴度的PCV2ELISA抗体，可有效预防PCV2的感染，保护率可达卯％以上；(4)将猪圆环病毒II型DBN—SX07株按本发明的制备方法配制成灭活疫苗，与文献报道的猪圆环病毒II型灭活疫苗进行效力比较。结果表明，用本发明的猪圆环病毒II型疫苗免疫猪，可较早(提前约l周)产生良好的免疫效果，明显縮短PCV2感染窗口期，延长免疫持续期(延长约1个月)，减少加强免疫次数，降低免疫成本。具体实施例方式实施例l猪圆环病毒II型DBN—SX07株灭活疫苗的制备(1)生产用毒的制备取所需数量的、细胞覆盖率达到80。/。以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，以5%(V/V)的比例接入猪圆环病毒II型DBN—SX07株毒种，37'C吸附1小时后加入维持液进行培养。24小时后用300mM的D—氨基葡萄糖于37'C处理20min,经无菌PBS(pH7.4)两次洗涤后加入维持液于37'C下旋转培养48小时后反复冻融3次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于一40'C以下。(2)生产用毒的灭活将检验合格的病毒液按0.5%。(V/V)的比例加入甲醛溶液，混匀后置37'C灭活16小时，期间振荡4一5次。(3)乳化将灭活后的生产用毒按1:1的比例(抗原油佐剂)加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗。所用的油佐剂配制为卯wt^白油和10wt冗司本一80组成的油佐剂混合液中加入硬脂酸铝，其中硬脂酸铝加入量为1克/ioo毫升油佐剂混合液。本实施例共制备出3批猪圆环病毒II型DBN—SX07株灭活疫苗，批号分别定为200701、200702、200703，制备的疫苗物理性状检验、安全检验、效力检验等均合格。其中，所用毒种的质量标准-①病毒含量取病毒液用无血清培养基做10倍系列稀释，选取10—s、10_6、10—73个稀释度，分别接种96孔细胞板，每个稀释度接种5孔，37'C吸附1小时后加入维持液进行培养。24小时后用300mM的D—氨基葡萄糖于37'C处理20min，经无菌PBS(pH7.4)两次洗涤后加入维持液培养48小时，同时设不接种病毒的细胞为空白对照。运用间接免疫荧光法(IFA)测定每个稀释度含有荧光的孔数，最后按Reed—Muench计算TCID邻。每毫升病毒含量应a060TCID50。②免疫原性将病毒含量20^TCID5o/ml的病毒培养液按O.P/。(V/V)的比例加入甲醛，灭活后按实施例中所述方法制成疫苗。选取3—4周龄PCV2抗原抗体阴性的健康仔猪10头，其中5头耳后根肌肉注射疫苗lml，14天后以同样方式再次注射，另5头接种安慰剂作为阴性对照，同样条件下饲养。二免后15天，所有猪肌肉注射DBN—SX07株病毒培养液(病毒含量为lO^TCIDso/ml)3ml，每天测温观察并隔周采集血清进行血清学检测，攻毒后21天迫杀解剖。对照猪(S/5)在攻毒后应出现明显的PCV2病毒血症和一过性的体温升高，且攻毒后21天迫杀解剖可见多种淋巴组织出现不同程度的肿大和充血，肺出现不同程度的水肿和肉变，肾发黄表面有坏死灶等。免疫猪(S/5)二免后15天PCV2ELISA抗体应全部为阳性且滴度2:1600，攻毒后应无明显临床症状、PCV2病毒血症及病理变化。③纯净性按《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。④特异性中和试验将毒种用培养基稀释成103TCID5()/ml，与等量PCV2特异性阳性血清混合，37'C中和1小时后，接种PK15a细胞板，接种和培养方法同①，通过间接免疫荧光法(IFA)测定，应无特异性的荧光信号出现。所制备疫苗的质量标准①性状外观乳白色乳剂。剂型为油包水型。取一个清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。稳定性取疫苗10ml加入离心管中，以3000rpm离心15min，应不分层，管底析出的水相应不大于0.5ml。粘度用lml吸管(下口的内径1.2111111，上口内径2.7mm)吸取25'C左右的疫苗lml，令其垂直自然流出，记录流出0.41111所需的时间，应在8秒以内。②无菌检验按《中国兽药典》进行，应无菌生长。③安全检验选取3—4周龄PCV2抗原抗体阴性的健康仔猪10头，分为2组，每组各5头，分别进行一次超剂量(4ml)和单剂量重复(lmlx2)接种的安全性试验，同时设不进行接种的猪5头作为空白对照，同样条件下饲养。每次接种后观察14日。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。④效力检验选取3—4周龄PCV2抗原抗体阴性的健康仔猪10头，其中5头耳后根肌肉注射疫苗lml，14天后以同样方式再次注射，另5头接种安慰剂作为阴性对照，同样条件下饲养。二免后15天，所有猪肌肉注射DBN—SX07株病毒培养液(病毒含量为105力TCIDWml)3ml，每天测温观察并隔周采集血清进行血清学检测，攻毒后21天迫杀解剖。对照猪(S/5)在攻毒后应出现明显的PCV2病毒血症和一过性的体温升高，且攻毒后21天迫杀解剖可见多种淋巴组织出现不同程度的肿大和充血，肺出现不同程度的水肿和肉变，肾发黄表面有坏死灶等。免疫猪(^/5)二免后15天PCV2ELISA抗体滴度应2:1600，攻毒后应无明显临床症状、PCV2病毒血症及病理变化。甲醛、硫柳汞含量测定按《中国兽药典》进行，应符合规定。实施例2猪圆环病毒II型灭活疫苗的制备(1)生产用毒的制备取所需数量的、细胞覆盖率达到80%以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，以5%(V/V)的比例接入猪圆环病毒II型DBN—SX07株毒种，37'C吸附1小时后加入维持液进行培养。24小时后用300mM的D—氨基葡萄糖于37'C处理20min，经无菌PBS(pH7.4)两次洗涤后加入维持液于37'C下旋转培养48小时后反复冻融3次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于一40'C以下。(2)生产用毒的灭活将检验合格的病毒液按0.759(i。(V/V)的比例加入甲醛溶液，混匀后置37'C灭活20小时，期间振荡4一5次。(3)乳化将灭活后的种生产用毒按1:3的比例(抗原油佐剂)加入油佐剂乳化配制成灭活疫苗。所用的油佐剂配制是按照重量百分比计算，为94%白油和6%司本一80组成的油佐剂混合液中加入硬脂酸铝，其中硬脂酸铝加入量为1克/100亳升油佐剂混合液。制备的疫苗物理性状检验、安全检验、效力检验等均合格。所用猪圆环病毒II型DBN—SX07株毒种质量标准和所制疫苗质量标准参见实施例l。实施例3猪圆环病毒II型灭活疫苗的制备(1)生产用毒的制备取所需数量的、细胞覆盖率达到80%以上的细胞转瓶，弃去生长培养基，以5%(V/V)的比例接入猪圆环病毒II型DBN—SX07株毒种，37'C吸附1小时后加入维持液进行培养。24小时后用300mM的D—氨基葡萄糖于37'C处理20min，经无菌PBS(pH7.4)两次洗涤后加入维持液于37'C下旋转培养48小时后反复冻融3次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于一40'C以下。(2)生产用毒的灭活将检验合格的病毒液按1%。(V/V)的比例加入甲醛溶液，混匀后置37'C灭活24小时，期间振荡4—5次。(3)乳化将灭活后的种生产用毒按1:5的比例(抗原油佐剂)加入油佐剂乳化配制成灭活疫苗。所用的油佐剂配制是按照重量百分比计算，为98%白油和2%司本一80组成的油佐剂混合液中加入硬脂酸铝，其中硬脂酸铝加入量为1克/100毫升油佐剂混合液。制备的疫苗物理性状检验、安全检验、效力检验等均合格。所用猪圆环病毒II型DBN—SX07株毒种质量标准和所制疫苗质量标准参见实施例1。实施例4疫苗效力比较试验(1)检验用毒猪圆环病毒II型DBN—SX07株，每毫升病毒含量为l(PTCID邻，攻毒时采用肌肉注射。(2)试验疫苗实施例1制备的批号分别为200701、200702、200703疫苗。(3)效力比较试验应用猪圆环病毒II型灭活疫苗(DBN—SX07株)3批实验室产品进行试验，耳后根肌肉接种3—4周龄PCV2抗原抗体阴性的健康仔猪各10头，每头l.Oml，14日后各组以同样的方式重复注射，另选取10头条件相同的猪，接种安慰剂作为阴性对照。于首次免疫后l周、2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周分别采血测定PCV2抗体滴度，监测PCV2抗体消长情况，并与目前文献报道进行比较。(4)效力比较试验结果猪圆环病毒II型灭活疫苗(DBN—SX07株)首次免疫后3周即可产生均一且有效的保护力，6周PCV2ELISA抗体水平达高峰，并可持续8周，24周后PCV2抗体水平下降到保护线以下。3批疫苗间结果无明显差异，详细结果见表根据国内外文献报道可知，猪圆环病毒II型灭活疫苗首次免疫后4周方可产生均一且有效的保护力，6周PCV2ELISA抗体水平达高峰，并可持续6周，20周后PCV2抗体水平下降到保护线以下。免疫持续期约为4个月。免疫后PCV2抗体的消长情况表明，本发明的疫苗效力具有明显优势①产生保护力的时间较早用本发明的疫苗免疫猪，其产生均一且有效的保护力的时间比文献报道早约1周，因此可明显縮短PCV2感染窗口期；②PCV2抗体高峰持续时间长用本发明的疫苗免疫猪，PCV2抗体高峰持续时间比文献报道长约2周，因此可以更有效的预防PCV2的感染；③免疫持续期较长用本发明的疫苗免疫猪，免疫持续期比文献报道长约l个月，因此可以提供为时更长的有效保护期，减少加强免疫次数。表l本发明疫苗免疫后PCV2ELISA抗体检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1、一种猪圆环病毒II型灭活疫苗，其特征在于毒种为猪圆环病毒II型DBN-SX07株，保藏号为CGMCCNo3064，上述毒种经烷化剂灭活后作为抗原，按比例加入油佐剂乳化配制而成。2、如权利要求1所述的猪圆环病毒II型灭活疫苗，其特征在于所述的垸化剂为0.5%。一1%。的甲醛溶液。3、如权利要求i所述的猪圆环病毒n型灭活疫苗，其特征在于抗原与油佐剂的比例为1:1—1:5。4、如权利要求1所述的猪圆环病毒II型灭活疫苗，其特征在于所述的油佐剂包含卯一98wt。/。的白油、2—10wt。/o的司本一80。5、一种如权利要求1一4任一项所述的猪圆环病毒II型灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤如下(1)生产用毒的制备取猪圆环病毒II型DBN—SX07株毒种接种PK15a，按常规条件培养、收获，作为生产用毒；(2)生产用毒的灭活将烷化剂按比例加入生产用毒中，37'C条件下灭活16—24小时，期间振荡4—5次；(3)乳化按比例加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗。全文摘要本发明属于兽医生物新医药
技术领域：
，涉及一种猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)灭活疫苗及其制备方法。该疫苗所用毒种为猪圆环病毒Ⅱ型DBN-SX07株，保藏号为CGMCCNo3064，该毒株经烷化剂灭活后作为抗原，再加入油佐剂乳化配制而成。使用本发明的PCV2灭活疫苗免疫猪，可较早产生均一且有效的保护力——明显缩短PCV2感染窗口期，延长免疫持续期——减少加强免疫次数。文档编号A61K39/12GK101549155SQ20091008490公开日2009年10月7日申请日期2009年5月27日优先权日2009年5月27日发明者赵亚荣,赵建增,邢海云申请人:福州大北农生物技术有限公司;北京大北农科技集团股份有限公司