专利名称：：咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯的医药用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于药学领域，涉及咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的医药用途，特别是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：Phytochemistry，2000;55:927-931首次公开从植物中分离得到新化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯及其化学结构，但没有披露其生物活性。中国专利申请(公开号CN1879672A)公开了咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯体外抑制人结肠癌细胞(HCT-8)、人胃癌细胞(BGC-823)、人卵巢癌细胞(A-2780)生长和体内抗小鼠Si80的作用。但披露的瘤种和肿瘤株不够全面，为更好的预测本化合物的临床抗肿瘤作用，有必要进一步揭示其对其它瘤种和更多的瘤株的活性，从而进一步揭示咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯抗肿瘤的医药用途。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯在制备抗肿瘤药物中的应用，以及一种含有咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的抗肿瘤药物组合物。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯、其前药或者药学上可以接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤选自消化系统肿瘤，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，中枢神经系统肿瘤，黑色素瘤或白血病；所述消化系统肿瘤选自胃癌，结肠癌，肝癌或者胰腺癌。一种抗肿瘤药物组合物，包含治疗有效量的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯、其前药或者药学上可以接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂或者载体，其特征在于所述的肿瘤选自消化系统肿瘤，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，中枢神经系统肿瘤，黑色素瘤或白血病；所述消化系统肿瘤选自胃癌，结肠癌，肝癌或者胰腺癌。本发明所述的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯药学上可以接受的盐可以是由化合物带正电荷的部分，与具有相反电性的带负电荷的有机或者无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、三氟乙酸、柠檬酸或者马来酸的酸根加成的盐；或者是由化合物带负电荷的部分，例如羰基，与正电荷的碱或者碱土金属例如钠、钾、钙、镁形成的盐，或者与带正电荷的有机碱例如甲胺、二甲胺、三甲胺所成的盐。本文所定义的治疗有效量，是指可对人和/或动物产生功能或者活性的且可被人和/或动物接受的量。本文所定义的药学上可接受的赋形剂或者载体，是指用于治疗给药的赋形剂或者载体，它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。治疗有效量的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯、其前药或者药学上可以接受的盐的用量介于0.001-500mg/kg体重/天之间，任何介于上述范围内的用量皆为本发明的有效量。优选的，本发明的化合物的用量介于0.05-300mg/kg体重/天之间；更优选的，本发明的化合物的用量介于0.01-100mg/kg体重/天之间。所述的"治疗有效量的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯、其前药或者药学上可以接受的盐"可用于肿瘤的单一用药或者联合用药治疗。本领域技术人员能够理解，在实际给药时的用量可高于或者低于上述剂量范围。针对某一对象(如哺乳动物或者人)的"治疗有效量"和具体治疗方案可受诸多因素的影响，包括给药对象的年龄、体重、一般情况、性别、饮食、给药时间、疾病进程以及收治医生的判断等。本发明所述的药物组合物可以是适合口服给药的剂型例如片剂或者胶囊，也可以是例如以无菌溶液、悬浮液或者乳液用于胃肠外注射(包括静脉内、皮下、肌肉内、血管内或输注)，也可以是例如以软膏或者乳膏用于局部给药，也可以是例如以栓剂直肠给药，还可以是通过直接注射进肿瘤中或者经定位输入的途径给药。本发明所述的药物组合物还可以经内窥镜、气管内、损伤部位、经皮、静脉内、皮下或者腹膜内输注。通常本发明所述的药物组合物可以以常规方法使用本
技术领域：
已知的常规赋形剂或者载体制备。药学上可以接受的固体赋形剂或者载体包括淀粉、玉米淀粉、乳糖、蔗糖、碳酸钠、磷酸钙、憐酸二醇、碳酸钙、藻酸、微晶纤维素、明胶；药学上可以接受的液体载体包括例如无菌水、聚乙二醇、非离子表面活性剂(如羟丙基纤维素)和油例如玉米油、花生油、芝麻油、橄榄油或者液体石蜡；只要适合活性成分的特性和所需要的特定给药方式。在制备所述药物组合物中通常使用的佐剂也可以被包括，例如调味剂、色素、防腐剂(如乙基或丙基-羟基苯甲酸酯)和抗氧化剂例如维生素E、维生素C、BHT禾卩BHA。片剂可以不包衣或者包衣以改变它们的崩解和随后活性成分在胃肠道内的吸收或者增强它们的稳定性和/或外观，在所述后两种情况下可以使用本
技术领域：
已知的常规包衣剂和方法。用于口服的药物组合物还可以是硬胶囊的形式，其中活性成分与惰性固体赋形剂例如碳酸钙、磷酸钙、微晶纤维或者高岭土，或是软胶囊的形式，其中活性成分与水或者油例如玉米油、花生油、芝麻油、橄榄油或者液体石蜡混合。适于注射的药物组合物形式包括无菌水溶液、分散液或者无菌粉(用于临时制备无菌注射液或者分散液)。在所有情况下，这些形式必须是无菌的且必须是流体易于从注射器排出。在制备和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物如细菌和真菌的污染和影响。载体可以是溶剂或者分散介质，例如水、醇、它们的适当混合物和植物油。中国专利申请(公开号CN1879672A)公开了MTT法测定咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯(CADPE)对人结肠癌细胞(HCT-8)、人胃癌细胞(BGC-823)、人卵巢癌细胞(A-2780)生长抑制作用，结果证明咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯能显著抑制上述三种肿瘤细胞的生长。对S^o腹水型肿瘤小鼠，咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯有明显的抗肿瘤作用，抑瘤率在30%和85%之间。上述体外实验和小鼠肿瘤模型实验的结果只能提示咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯具有开发成抗肿瘤药物的前景。但是，人肿瘤发病机制非常复杂，人和鼠物种间存在巨大差异，咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对其它肿瘤细胞是否有抑制作用、其是否有体内抗人肿瘤的活性、其抗肿瘤的选择性，这些问题都无法通过上述专利申请(公开号CN1879672A)公开的内容来预测，需要大量创造性的实验来一一证明和回答。本发明所述化合物在美国国立癌症研究所(NCI)经过5年研发建立的体外细胞筛选平台(IVCLSP)上对包括白血病、黑色瘤、肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、脑瘤和前列腺癌等9种人肿瘤60种瘤株进行活性筛选，结果证明咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对所有测试的瘤株均有显著的生长抑制作用，ICso浓度在10-5-1(T7M之间，多数瘤株的ICso浓度在1(T6-1(T7M，证明咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯具有比较广谱的抗肿瘤作用。而且体外实验还表明该化合物对正常细胞没有毒性。本发明利用体外肿瘤细胞培养和人体肿瘤裸鼠异种移植模型证明咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯体内对人消化系统恶性肿瘤，贴别是胃癌、结肠癌、肝癌有非常显著的抑制作用，优于化疗药物顺铂。本发明用大量创造性的实验和充足的实验数据证明咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对所筛选的肿瘤都有抑制作用，而且对中国人发病率高的消化系统恶性肿瘤，如胃癌、结肠癌有确实的体内抗肿瘤作用。含有咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯或者其前药、药学上可以接受的盐的抗肿瘤药物组合物极有可能在临床上单独或者与其他抗癌药物一起发挥积极的治疗作用。图1是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的化学合成流程图；图2是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的氢谱图；图3是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的碳谱图；图4是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的结构示意图；图5是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的高效液相色谱图6是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对9种人肿瘤57个瘤株的细胞生长的抑制作用，图中Leukemia:白血病，Non-SmallCellLungCancer:非小细胞肺癌，ColonCancer:结肠癌，CNSCancer:中枢神经系统肿瘤，Melanoma:黑色素瘤，OvarianCancer:卵巢癌，RenalCancer:肾癌，ProstateCancer:前列腺癌，BreastCancer:乳腺癌；图7是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对人胃癌HGC27的细胞毒性；图8是咖啡酸3，4-二轻基苯乙酯对人胃癌AGS的细胞毒性；图9是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对人胃癌MGC803的细胞毒性；图10是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对人胃癌SGC-7901的细胞毒性；图11是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对人胃癌BGC-823的细胞毒性；图12是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对人肝癌QGY7701的细胞毒性；图13是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对人肝癌SMMC7721的细胞毒性；图14是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对人肝癌Bd-7402的细胞毒性；图15是咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯对人肝癌HepG2的细胞毒性；图16是咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯对人结肠癌HCT116的细胞毒性；图17是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对人结肠癌SW-620的敏胞毒性；图18是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对结肠癌SW-620的生长抑制作用(人体肿瘤裸鼠异种移植模型)，CADPE:咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯；CDDP:顺铂；图19是咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯(CADPE)对人肝癌细胞周期传递的抑制作用(A:DMS0溶齐lj对照；B:CADPE25一。具体实施例方式以下结合附图对本发明作进一步详细描述。应当理解为，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或者按照制造厂商提供或者建议的条件。除另有定义或者说明，本文所使用的所有专业与科学术语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或者均等的方法及材料皆可用于本发明中。实施例1咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的合成1、试药3，4-二羟基苯乙酸，咖啡酸，亚硫酰氯(SOCl2)，四氢铝化锂(LiAlH4)，二环己基碳二亚胺(DCC)，无水甲醇，无水四氢呋喃(THF)，酒石酸，无水硫酸钠。2、咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的化学合成流程参照附图1。3、方法(1)3，4-二羟基苯乙醇的合成将3，4-二羟基苯乙酸溶于无水甲醇中，在0t:条件下逐滴加入亚硫酰氯并搅拌15分钟后，于室温下放置16小时并不停搅拌。反应物经减压浓縮后，其残留物溶于无水四氢呋喃中，分歩加入四氢铝化锂后，于室温下放置16小时并不停搅拌。反应物倒入5%酒石酸溶液中，用乙酸乙酯萃取。合并后的乙酸乙酯萃取液经无水硫酸钠脱水后回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用环己垸和乙酸乙酯的混合溶液作洗脱液，分段收集洗脱液，用薄层层析(TLC)在紫外灯下检测每一流份，将含有3，4-二羟基苯乙醇的洗脱液合并后回收有机溶剂得到3，4-二羟基苯乙醇。(2)咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的合成将咖啡酸和3，4-二羟基苯乙醇溶解于无水四氢呋喃中，然后加入二环己基碳二亚胺。其混合物在室温下搅拌8小时，加入微量蒸馏水继续搅拌15分钟。滤过，滤液在6(TC下减压浓縮得棕色稠状溶液。该棕色稠状溶液经硅胶柱层析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作洗脱液，分段收集洗脱液，用TLC在紫外灯下检测各流份，将含有咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的各流份合并后回收有机溶剂得化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯。所合成的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯为无定形粉末，溶于甲醇和乙醇中，三氯化铁反应阳性；紫外灯下显蓝色荧光。UV(MeOH，Xmax)212，223，251(肩峰)，293，326認；IR(KBr，cm-l)3429，1693，1606,1524，1448，1384，1263，1162，1116，1056;HRESIMS:m/z339.08408[M+Na]+(calcdforC17H16Na06,339.08446)。'H(附图2)和"C-NMR(附图3):数据见表1。表1、咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的氢和碳谱数据(Sppm，inMeOD-d4)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯具有如附图4所示的结构，化学名称为3-(3，4-dihydroxyphenyl)-acrylicacid2-(3，4-dihydroxyphenyl)-ethylester。实施例2咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯含量测定1、仪器高效液相色谱仪。2、试药咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对照品(自制)；甲醇(色谱纯)，乙酸(分析纯)。色谱条件色谱柱"HypersilCI8高效液相色谱柱(250x4.6mm,5|_im);:25C;检测波长326nm;流速1.5mL/min;流动相见表2。表2咖啡酸3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4、对照品溶液的制备精密称取在6(TC真空千燥后的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对照品25.0mg，置25ml容量瓶中，力B70%乙醇20ml，置水浴上微热溶解，放冷，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。5、供试品溶液的制备精密称取在6(TC真空干燥后的如实施例1所述合成的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯样品50mg,置50ml容量瓶中，力n70。/o乙醇35ml，置水浴上微热溶解，放冷，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。6、样品测定取浓度为1.0mg/mL的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯供试品溶液10|aL进样，在前述色谱条件下测定咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的峰面积，并计算咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的含量，HPLC谱图见附图5。本发明用实施例所述方法合成的咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯的含量为93.2%(n=3,SD=0.22)。实施例3咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯(CADPE)体外对人恶性肿瘤白血病、黑色瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、脑瘤和前列腺癌的生长抑制作用咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的体外细胞抗肿瘤活性由美国国立癌症研究所(NCI)测定。其方法采用美国国立癌症研究所(NCI)建立的标准方法(NationalCancerInstitute.DTPHumanTumorCellLineScreen,http:〃dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html)。由NCI经过5年建立的体外细胞筛选项目(IVCLSP)包括白血病、黑色瘤、肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、脑瘤和前列腺癌9种人肿瘤60种瘤株(注我国发病率和死亡率高的肝癌和胃癌未包括在NCI的IVCLSP中)。NCI测定了咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对以上9种人肿瘤57种瘤株的活性，每个细胞株测定5个不同浓度(10—4-10—8M)。实验结果证明咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对所有测试的瘤株均有显著的生长抑制作用，ICso浓度在l(T5-l(T7M之间，多数瘤株的ICso浓度在10'6-1(T7M，实验结果见表3和附图6。表3咖啡酸3，4-二二羟基苯乙酯的体外抗癌活性细胞ic50细Bfnic50jag/mL细胞pg/mL白血病卵巢癌CCRF-CEM0.7470,.236IGROV12.860O.節HL國60(TB)2.5400.794OVCAR-35.1701.635K-5621.5600,.493OVCAR-47.3702.331M0LT陽43.0600,.968OVCAR-5>50>15.80RPMI-82260.6280,.199OVCAR-89.3202.948SR1.4900.,471SK-OV-313.704.333肺癌肾癌A549/ATCC17.705..599786-013.504.270EKVX14.904.,713A4988.0502.546HOP-6229.109.204AC頭2.9400.930HOP-920.7900.250CAK1-110.603.353NCI-H22613.304.207RXF-39315.504.903NCI-H2311.603.669SN12C9.0902.875NCI-H322M28.108.888TK-1028.108.888NCI-H46014.804.681UO-311.7500.554NCI-H5221.2600.399前列腺癌结肠癌DU-1459.7503.084COLO20518.805.946CNS癌HCC-299814.604.■618SF-2686.9302.192HCT-11611.203..543SF-29516.105.09HCT-152.2500,.712SF-5395.8301.844HT2928.509,.015SNB-1915.504.903KM127.9202,.505SNB-759.5003.005SW-62010.203.230U2518.8602.802恶性黑色瘤乳腺癌LOXIMVI6.3802,.018MCF73.861.221MALME-3M18.605883NCI/ADR-RES10.903.448SK-^tEL-23.0200.955MDA-MB-CC■231/AT11.103.511SK-MEL-286.5102.059HS578T9.753.084SK-MEL-58.1202568MDA-MB--4354.011.268UACC-25715.404.871BT-5498.672.742UACC-625.3301■686T-47D11.303.574实施例4咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯(CADPE)对人恶性胃癌细胞的抑制作用培养24小时的人胃癌细胞株HGC27，AGS,MGC803，SGC-7901(低分化)及BGC-823(低分化)在含不同浓度的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯的培养基中再培养72小时。用磺基罗丹明B(SulforhodamineB,SRB)染色分析方法测定细胞活力，用LiveandDeadassay检测死亡细胞。实验结果表明咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯低浓度可显著抑制以上4种肿瘤细胞的增殖；随着浓度的增加，咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯可直接杀死肿瘤细胞(见附图7-11)，而且对正常细胞无毒性。实施例5咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯(CADPE)对人肝癌细胞的抑制作用用实施例4同样的方法测定了咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对人肝癌细胞株QGY-7701、SMMC-7721、Bel-7402禾BHepG2的细胞毒性。试验结果证实咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对所测定过的4株人肝癌细胞均有非常显著的毒性(见附图12-15)。实施例6咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯(CADPE)对人结肠癌细胞的抑制作用用实施例4同样的方法测定了咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对人结肠癌细胞株HCT-116和SW-620的细胞毒性。试验结果与NCI试验完全一致，在低能浓度(10nM)可完全抑制肿瘤细胞生长。随着浓度的增加咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯可直接杀死肿瘤细胞(见附图16-17)。实施例7咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯(CADPE)对裸鼠异种移植人结肠癌的抑制作用人结肠癌(5xl06SW-620)接种于6周龄裸鼠(雌雄各半)背部皮下，于IO天后(此时肿瘤长至100-200mm"动物分为以下3组DMSO溶剂对照组、顺钼(CDDP)治疗组(5mg/kg，ip)和CADPE治疗组(5mg/kg,ip)，每组5只动物，每天给药一次，每2天用测量直径器测量肿瘤大小，连续24天。顺铂可部分抑制人结肠癌SW-620的生长；而咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯可非常显著地抑制人结肠癌的生长(见附图18),作用明显优于化疗药物顺铂。实施例8咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯抑制肿瘤细胞周期传递于S期咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯对所有测定过的肿瘤细胞株包括人胃癌11SGC-7901,人肝癌Bel-7402和人结肠癌SW-620的细胞周期均有非常显著的抑制作用。对人肝癌Bel-7402细胞，溶剂对照组(DMS0)G2期细胞为6.86%，S期细胞为22.2%;咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯10、25、50和100juM组，G2期细胞均为零，S期细胞分别为41.46%、42.02%、48.04禾t!41.8%。以上数据证明，低剂量咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯(10pM)即可完全抑制肿瘤细胞周期传递于S期(见附图19)。权利要求1、咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯、其前药或者药学上可以接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤选自消化系统肿瘤，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，中枢神经系统肿瘤，黑色素瘤或白血病。2、根据权利要求1所述的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯、其前药或者药学上可以接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的消化系统肿瘤选自胃癌，结肠癌，肝癌或者胰腺癌。3、一种抗肿瘤药物组合物，包含治疗有效量的咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯、其前药或者药学上可以接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂或者载体，其特征在于所述的肿瘤选自消化系统肿瘤，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，甜列腺癌，中枢神经系统肿瘤，黑色素瘤或白血病。4、根据权利要求3所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于所述的消化系统肿瘤选自胃癌，结肠癌，肝癌或者胰腺癌。全文摘要本发明公开了咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯、其前药或者药学上可以接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤选自消化系统肿瘤，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，中枢神经系统肿瘤，黑色素瘤或白血病；所述消化系统肿瘤特别是指胃癌，结肠癌，肝癌或者胰腺癌。文档编号A61P35/02GK101502506SQ200910114960公开日2009年8月12日申请日期2009年2月24日优先权日2009年2月24日发明者张治针,连晓媛申请人:连晓媛