专利名称：一种重组腺病毒的制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制剂，尤其涉及一种重组腺病毒的制剂。
技术背景
重组腺病毒作为基因治疗领域常用的复制载体，临床用药要求其在保存、运输及 使用过程中保持完整的二十面体病毒壳体结构，维持较高的活病毒数量和感染复制能力。 然而，腺病毒在高温、低PH、氧化等条件下极不稳定，容易降解。例如，US7202078公开了下 述技术内容，当重组腺病毒浓度高于lE12vp/ml时，病毒颗粒通常会聚集成丝状，引发衣壳 蛋白裂解，致使感染活性降低。
在实际的临床应用中，传统方法主要选择在_80°C -20°C的低温条件下保存和运 输重组腺病毒药物，虽然这种方法能够比较有效地保持腺病毒的结构和活性，但由于需要 采用大量的用于保持低温的材料和设备，导致这种保存和运输的成本高昂，且操作存在诸 多不便，并存在较大风险。
鉴于这些原因，研究者开始考虑从制剂角度提高用于基因治疗的重组腺病毒贮存 的稳定性，开发能在2 8°C甚至25°C下较好地保持腺病毒活性的制剂。
例如，US6689600、US723539UUS20080107631A 公开了包括 Tris 缓冲液、甘油、甘 露醇、蔗糖、MgCl2、吐温-80的重组腺病毒制剂，这些制剂能在2-8°C保存浓度为lEllvp/mL 的腺病毒，并维持其6个月的稳定性，但没有考察该制剂是否可以保存lE12vp/mL及更高浓 度腺病毒的稳定性。
又如，US7456009和US7351415公开了由Tris缓冲液、非离子表面活性剂吐 温-80、二价阳离子MgCl2、糖类、NaCl、EDTA或无水乙醇组成的制剂，该制剂能在2_8°C较好 保存ΙΕΙΟνρ/rmL腺病毒的活性，也但没有描述该制剂可以保存lE12vp/mL及更高浓度腺病 毒的稳定性。
又如，US2006/0205080A、CN101163794A 公开 了包含 Tris 缓冲液、甘氨酸、 MgCl2，及丙二醇、DMSO、PEG、蔗糖、甘油、四氢呋喃乙二醇醚等组成的制剂，该制剂用于保存 lE12vp/mL腺病毒，可以较好地保持腺病毒的活性。
可见，这些现有技术公开的改良制剂通过优化重组腺病毒制剂的组成，在较大程 度上，改善了腺病毒的保存浓度和保存温度。但是，这些改良制剂尚不能用于保存浓度高于 2E12vp/ml的腺病毒制剂，且在2_8°C条件下，不能在较长时间内O年以上)保持制剂中重 组腺病毒的活性。而临床上为了提高疗效，需要浓度不低于2E12vp/ml的重组腺病毒制剂。 因此，如何进一步改良重组腺病毒制剂的组成，来改善该制剂的稳定性及保存浓度、保存温 度和保存时间，成为一个亟待解决的技术问题。发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一种能够在较高温度下、较长时间内 保存高浓度重组腺病毒的药物组合物。本发明组合物不仅提高了制剂中重组腺病毒的稳定高浓度重组腺病毒制剂的稳定性，并延长了其保存时间。本发明目的在于 提供一种重组腺病毒制剂，所述制剂含有重组腺病毒、Tris缓冲液、丙二醇和精氨酸。
进一步，所述iTris缓冲液的浓度为ImM-lOOmM，优选为5mM-50mM，更优选为10mM。
进一步，所述丙二醇的浓度为5W/V% -20W/V%，优选为10W/V% _15W/V%。
进一步，所述精氨酸的浓度为50mM-250mM，优选为100mM-200mM，更优选为150mM。
进一步，所述制剂中还含有抗氧化剂。其中，优选所述的抗氧化剂选自亚硫酸钠、 硫代硫酸钠、谷胱甘肽、硫代水杨酸、半胱氨酸盐酸盐、二硫代甘醇酸、硫脲、硫代山梨醇或 硫代葡萄糖的任一种或其组合，更优选为谷胱甘肽。
进一步，所述谷胱甘肽的浓度为5mM-100mM，优选为10mM-50mM，更优选为20mM。
进一步，所述制剂中还含有抗氧增效剂。其中，优选所述的抗氧增效剂为枸橼酸 钠、琥珀酸钠或次磷酸钠的任一种或其组合，更优选为枸橼酸钠。
进一步，所述枸橼酸钠的浓度为5mM-100mM，优选为10mM-50mM，更优选为30mM。
进一步，本发明的制剂由重组腺病毒、IOmM的1^化，101八％丙二醇和IOOmM的精 氨酸组成，用HCl调节ρΗ7· 4-8. 6。
进一步，本发明的制剂由重组腺病毒、IOmM的Tris，101八％丙二醇、IOOmM的精氨 酸、20mM的谷胱甘肽组成，用HCl调节pH7. 4-8. 6。
进一步，本发明的制剂由重组腺病毒、IOmM的1^8，101八％丙二醇、IOOmM精氨 酸、20mM的谷胱甘肽、30mM的枸橼酸钠组成，用HCl调节pH7. 4-8. 6。
为此，本发明的目的在于提供一种重组腺病毒制剂，所述制剂含有重组腺病毒、 I-IOOmMTris缓冲液、保护剂。其中，所述的保护剂选自多羟基化合物或二甲基亚砜的任一 种或其组合，优选多羟基化合物选自丙二醇、丙三醇、聚乙二醇400的任一种或其组合，更 优选为丙二醇，最优选浓度为5-20W/V%的丙二醇。
本发明的另一目的在于提供一种重组腺病毒制剂，所述制剂含有重组腺病毒、 I-IOOmMTris缓冲液、5-20W/V%的丙二醇、氨基酸类化合物。其中，优选所述的氨基酸类化 合物选自甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸或脯氨酸的任一种或其组合，更优选为精 氨酸，最优选浓度为50-250mM的精氨酸。
本发明的另一目的在于提供了一种重组腺病毒制剂，所述制剂含有重组腺病毒、 I-IOOmMTris缓冲液、5-20W/V%的丙二醇、精氨酸、抗氧化剂。其中，优选所述的抗氧化剂选 自亚硫酸钠、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、硫代水杨酸、半胱氨酸盐酸盐、二硫代甘醇酸、硫脲、硫 代山梨醇或硫代葡萄糖的任一种或其组合，更优选为谷胱甘肽，最优选浓度为5-100mM的 谷胱甘肽。
本发明的另一目的在于提供了一种重组腺病毒制剂，所述制剂含有重组腺病毒， I-IOOmMTris缓冲液，5-20W/V%的丙二醇、50-250mM精氨酸、5-100mM的谷胱甘肽、抗氧增 效剂。其中，优选所述的抗氧增效剂为枸橼酸钠、琥珀酸钠或次磷酸钠的任一种或其组合， 更优选为枸橼酸钠，最优选浓度为30mM的枸橼酸钠。
进一步，本发明制剂的组成为，含有I-IOOmM的Tris缓冲液、5-20W/V%的丙二醇、 50-250mM的精氨酸、5_100mM的谷胱甘肽、5_100mM的枸橼酸钠。
进一步，本发明的制剂组成为，含有IOmM的1Tris缓冲液、10W/V%的丙二醇、IOOmM 的精氨酸、20mM的谷胱甘肽、30mM的枸橼酸钠。
本发明制剂主要应用于保存基因治疗的重组腺病毒，还可应用于保存任何野生型 重组腺病毒或其他用途的重组腺病毒。具体地说，包括所有利用重组DNA技术构建的复制 缺陷型腺病毒或增殖型腺病毒，以及所有的人或动物的野生型腺病毒或其突变腺病毒。
采用国际通用的TCID50法检定的病毒滴度值和紫外法检定的病毒颗粒数之比值 (即比活度)来评价本发明的重组腺病毒的稳定性。
本发明采用TCID50方法测定重组腺病毒滴度，其原理是将经过系列稀释的病毒 样品感染293细胞，将每个稀释度所感染一定数量的细胞孔培养10天，在显微镜下观察各 细胞孔中的细胞状况，统计病变细胞孔，利用TCID50计算公式，计算病毒滴度。
TCID50/ml = 10_[^d(s_0-5)]+b
其中，L 为最低稀释度的对数；d 为稀释对数之间的差；s 为病变阳性孔比率之 和；b 为病毒接种量，换算为每毫升体积的倍数的对数。
本发明采用分光光度法检测腺病毒的颗粒数，其原理是理论上，野生型5型腺病 毒的成分是87%蛋白质和13%DNA。因此，腺病毒颗粒的浓度可直接用紫外分光光度计 测量。蛋白质的色氨酸和酪氨酸残基在277nm处有紫外吸收，而双链线性DNA在^Onm有 最大吸收值。本法采用含有0.1% SDS(十二烷基硫酸钠)的制剂缓冲液，将病毒衣壳分 解成蛋白质和DNA，再利用双链线性DNA在260nm处具有最大吸收值，在有去垢剂时，颗粒 浓度与^Onm吸光值成比例，用分光光度计于^Onm处测定供试品的吸光度值，采用公式 (1AU = 1. lX1012VP/mL)计算病毒颗粒数。测试病毒颗数的适用范围为，供试品病毒颗粒 数彡 2Χ10"νΡ/ιΛ。
本发明重组腺病毒稳定性的判断指标为比活度，即病毒比活度=病毒滴度/病毒 颗粒数X 100%。
国家药品食品监督管理局(SFDA)在《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导 原则》中规定，临床重组腺病毒比活度应高于3. 3%;张晓志等(《中华医学杂志》，2004年， 第84卷第10期)，在“重组腺病毒临床级基因治疗制品的质量控制”中提到，评价腺病毒制 剂的稳定性时，制剂中腺病毒的比活度应该大于3. 3%。
除非另有说明，本发明所述百分含量均为重量体积百分比。
本发明所用的对照制剂为“ARCA”，为US 2006/0205080Α, CN200680013299所公开 的通常用于保存腺病毒的制剂缓冲液，包含IOmM的1^化、1%甘氨酸、11111的1%(12、5(%蔗 糖、0. 05%的吐温-80。
本发明的重组腺病毒的制备方法可以采用本领域通常的重组腺病毒制备方法所 得，一般来说包括细胞复苏、种子细胞制备、病毒感染、扩增、细胞裂解、澄清过滤、浓缩换 液、原液制备等过程
本发明的重组腺病毒制剂的制备方法可以采用本领域通常制备重组腺病毒的方 法，一般来说包括如下步骤将原液进行换液、检测浓度、用配比好浓度的制剂辅料来稀释、 除菌、分装得到成品。
本发明的另一目的在于提供重组腺病毒制剂用于制备基因治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的重组腺病毒制剂具有下述优点
1)本发明的重组腺病毒制剂能够在较高温度甚至25°C )下保存较高浓度 的重组腺病毒，甚至是浓度高于2E12vp/mL的重组腺病毒。5
2)本发明的制剂具有很好的稳定性，能够在2_8°C下较长时间内保存较高浓度的 重组腺病毒，24个月内仍能较好保存2E12vp/mL重组腺病毒。
图1在2_8°C条件下，2E12vp/mL重组腺病毒保存在本发明的重组腺病毒制剂中， 在O-M个月的比活度变化，所述的重组腺病毒制剂的组成为，有IOmM的Tris缓冲液、IOff/的丙二醇、IOOmM的精氨酸、20mM的谷胱甘肽、30mM的枸橼酸钠。
图2在2_8°C条件下，本发明制剂与参比制剂用于保存2E12vp/mL重组腺病毒，其 比活度随时间的变化情况。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方 案，并非限定本发明的实质。
实施例IdH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响
为了研究pH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响，在25°C条件下，我们研究了 ρΗ6· 8-8. 6范围内，ρΗ值分别为6. 8、7. 2、7. 4、7. 6、7. 8、8. 2、8. 6时，ρΗ值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响。
通过检测制剂中重组腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了 ρΗ值对制 剂中重组腺病毒稳定性的影响，结果见表1。
表IpH值对制剂中重组腺病毒稳定性的影响
权利要求
1.一种重组腺病毒的药物制剂，所述制剂含有重组腺病毒、TriS缓冲液、丙二醇和精氨酸。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒药物制剂，所述Tris缓冲液的浓度为 ImM-lOOmM，优选为 5mM-50mM，更优选为 10mM。
3.根据权利要求1所述的重组腺病毒制剂，所述丙二醇的浓度为5W/V%-20W/V%，优 选为 10W/V% -15W/V%。
4.根据权利要求1所述的重组腺病毒制剂，所述精氨酸的浓度为50mM-250mM，优选为 100mM-200mM，更优选为 150mM。
5.根据权利要求1-4任一项所述的重组腺病毒制剂，所述制剂中还含有抗氧化剂。
6.根据权利要求5所述的重组腺病毒制剂，所述的抗氧化剂选自亚硫酸钠、硫代硫酸 钠、谷胱甘肽、硫代水杨酸、半胱氨酸盐酸盐、二硫代甘醇酸、硫脲、硫代山梨醇或硫代葡萄 糖的任一种或其组合，优选为谷胱甘肽。
7.根据权利要求6所述的重组腺病毒制剂，所述谷胱甘肽的浓度为5mM-100mM，优选为 10mM-50mM,更优选为 20mM。
8.根据权利要求6-7任一项所述的重组腺病毒制剂，所述制剂中还含有抗氧增效剂。
9.根据权利要求8所述的重组腺病毒制剂，所述的抗氧增效剂为枸橼酸钠、琥珀酸钠 或次磷酸钠的任一种或其组合，优选为枸橼酸钠。
10.权利要求1-13任一项所述的重组腺病毒制剂用于制备基因治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种重组腺病毒的制剂，所述制剂含有重组腺病毒、Tris缓冲液、丙二醇和精氨酸；另外，制剂还可以含有抗氧化剂如亚硫酸钠、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、硫代水杨酸、半胱氨酸盐酸盐、二硫代甘醇酸、硫脲、硫代山梨醇或硫代葡萄糖的任一种或其组合；该制剂还可以含有抗氧增效剂为枸橼酸钠、琥珀酸钠或次磷酸钠的任一种或其组合。本发明制剂可以在2-8℃长期保存重组腺病毒。
文档编号A61K48/00GK102028954SQ20091016781
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者杨艳艳, 郭勇 申请人:成都康弘生物科技有限公司