针对clfa蛋白质的单克隆抗体和在治疗或预防感染中的利用方法

专利名称：针对clfa蛋白质的单克隆抗体和在治疗或预防感染中的利用方法
技术领域：
本发明一般涉及已经针对聚集因子A(或ClfA)产生的抗体，在金黄葡萄球菌和其 他葡萄球菌细菌中表达的表面定位蛋白质，特别是涉及针对ClfA蛋白质的单克隆抗体和 它的活性片段或来自它的纤维蛋白原结合区如Clf40，Clf33，或ClfA N3的活性片段或蛋 白质，和它们在抑制ClfA蛋白质与纤维蛋白原或纤维蛋白的结合和治疗或预防金黄葡萄 球菌感染中的用途。
背景技术：
成功地寄居于寄主是大多数微生物引起动物和人中的感染所需要的过程。微生 物黏连是可以最终导致疾病的一系列事件的第一个关键步骤。通过细菌表面上存在的特 异的黏附素附着于调节植入的生物材料如导管，人工关节和血管移植体的寄主的组织或血 清，致病微生物寄居于寄主。NSCRAMM (识别黏附基质分子的微生物表面成分)是识别和 特异地结合寄主细胞外基质中的不同成分的一个细胞表面黏附素家族。一旦细菌成功地黏 附和寄居于寄主组织，它们的生理就改变很大，分泌了损伤成分如毒素和蛋白质水解酶。另 外，黏附细菌经常产生生物薄膜并且快速地变成对大多数的抗生素的杀死作用更具抗性。金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起一系列的感染，范围从皮肤的损伤 如损伤感染，脓包，和疖到威胁生命的症状，包括肺炎，败血性关节炎，败血病，心内膜炎和 生物材料相关的感染。已知金黄葡萄球菌表达了许多不同的NSCRAMM，可以单独或一起简化 微生物在特异的寄主组织成分上的黏附。MSCRAMM提供了抗体，特别是单克隆抗体的免疫攻 击的良好的靶。存在适当的抗NSCRAMM高亲和力抗体可以具有双边缘攻击，第一是可以预 防微生物黏附的抗体，第二是提高简化有机体通过调理吞噬细胞的杀死作用从体内快速清 除的NSCRAMM抗体的水平。但是，仍然存在的问题是鉴定和利用关于来自金黄葡萄球菌的NSCRAMM 如ClfA 蛋白质的信息，产生有效的单克隆抗体，因为不同的NSCRAMM 的结合特性和它们的感染性 中的作用和细菌感染的传播是不同的。特别是，开发可以结合ClfA和可以用于抑制或损伤 葡萄球菌ClfA与纤维蛋白原或纤维蛋白，从而用于预防或治疗葡萄球菌感染的方法中的 单克隆抗体已经是一个问题了。所以，在感染疾病领域的一个极大的愿望仍然是开发特别 是通过抑制或损伤细菌结合纤维蛋白原或纤维蛋白的能力成功地治疗和预防许多葡萄球菌感染的单克隆抗体和其他组成。发明概述因此，本发明的一个目的是提供可以结合金黄葡萄球菌ClfA蛋白质，所以用于治 疗或预防葡萄球菌感染的方法中的单克隆抗体。也是本发明的一个目的是提供能够结合ClfA，并且是从金黄葡萄球菌ClfA蛋白 质的结合亚区，包括Clf40，Clf33和ClfA N3蛋白质或它们的活性部分产生，待用于治疗或 保护葡萄球菌感染的单克隆抗体。同样是本发明的一个目的是提供Clf40，Clf33和ClfA N3蛋白质的可以通过抑制 或损伤ClfA蛋白质与纤维蛋白原或纤维蛋白结合预防葡萄球菌黏附的单克隆抗体。本发明的另一个目的是提供可以识别ClfA蛋白质的纤维蛋白原结合A区并且所 以可以用于治疗，预防，鉴定或诊断葡萄球菌感染的方法中的抗体和抗血清。本发明的另一个目的是提供编码本发明的单克隆抗体的可变的轻序列和可变的 重序列的氨基酸序列和核酸序列。本发明的另一个目的是提供保护抵抗金黄葡萄球菌感染并且可以进行其他类型 的葡萄球菌感染的交叉反应的ClfA的单克隆抗体。借助本发明提供的这些和其他目的包括分离和利用ClfA蛋白质和/或它的结合 亚区，包括蛋白质Clf40，Clf33和ClfA N3的预防和治疗葡萄球菌感染的单克隆抗体。所 以本申请叙述了抗ClfA，借助每个金黄葡萄球菌菌株表达的一个表面定位蛋白质的单克隆 抗体的发现，生产，鉴定和体内评估。本文出现的数据明确地证明了，抗ClfA和它的亚区如 Clf40, Clf33和N3的单克隆抗体可以用于治疗或保护金黄葡萄球菌的感染。所以，根据本发明发现和分离抗ClfA单克隆抗体可以用于损伤或抑制ClfA蛋白 质与纤维蛋白原或纤维蛋白的结合，所以用于治疗或预防葡萄球菌感染的方法中。根据本 发明，根据分离的ClfA蛋白质亚区和其中产生的抗体的适当的组成和疫苗，以及它们的利 用方法也受到关注。阅读本申请书和/或通过引证而合并于本文的文献，本公开的发明的精神和范围 内的这些实施方案和其他或选物和修改对于本领域技术人员将是容易理解的。附图的简要说明

图1是当利用兔抗鼠Fc(RAM-Fc)抗体将本发明的单克隆抗体13_1或13_2与条 片结合时，用于测量ClfA结合和随后结合/抑制纤维蛋白原的双核心分析图。图2是本发明的嵌合单克隆抗体12-9的双核心分析图。图3是显示与金黄葡萄球菌(菌株Newman)结合的单克隆抗体嵌合体12_9的流 动细胞分析的图。图4是显示ClfA与本发明的嵌合和人化单克隆抗体12-9的结合亲和力的图。图5是显示保护抗金黄葡萄球菌小鼠致死攻击模型的图。图6是显示利用本发明的单克隆抗体，整个细胞抑制金黄葡萄球菌黏附固定的纤 维蛋白原的图。图7是显示利用本发明的12-9小鼠，12-9嵌合和12_9人化单克隆抗体竞争结合 金黄葡萄球菌的图。图8是显示⑶R1，⑶R2和⑶R3区域中的保守序列的本发明的单克隆抗体的可变
5重链和可变轻链序列的描述。优选实施方案的详细说明根据本发明，提供了可以结合金黄葡萄球菌的ClfA蛋白质的单克隆抗体，这些 单克隆抗体已经产生，抗活性结合亚区蛋白质，包括已经由本发明人分离和纯化的Clf40， Clf33 JPClfA N3区。本发明的这些单克隆抗体已经显示能治疗或保护金黄葡萄球菌感
^fe ο过去，McDevitt等人(McDevitt et al，1994，分子微生物学，11，237-248)鉴定了 来自金黄葡萄球菌菌株Newman的92kDa的表面蛋白质，证明是与细菌的依赖纤维蛋白原的 聚集有关的，这现在公开在美国专利号6，177，084，其被通过在此引述而合并于本文。该基 因命名为ClfA，克隆和测序了，公开在美国专利号6，008，341，其通过在此引述而合并于本 文，该区中出现了 896个如DNA序列描述的氨基酸的蛋白质，介导了细菌与纤维蛋白原包衣 的表面的黏附，从而鉴定ClfA为MSCRAMM 。ClfA基因包括细胞质去，跨膜区，锚在细胞壁 上的区，和连接细胞锚区和NH2-末端区A(独特的520个残基区段组成)的一个区(命名为 R)。NSCRAMM的纤维蛋白原结合区已经定位于区域A内的218个残基区段。McDevitt等人 (McDevitt et al.，1995，分子微生物，16，895-907)已经报道，ClfA的区域A对于聚集表现 型是足够的。但是，过去，没有人能够生产金黄葡萄球菌ClfA蛋白质的单克隆抗体。因此，本发 明涉及可以结合ClfA蛋白质或它的结合亚区，包括Clf40，Clf33和ClfA N3蛋白质并且所 以当利用的量能有效预防或治疗感染时，可以用于预防和治疗葡萄球菌感染的方法中的分 离的和/或纯化的单克隆抗体。这些单克隆抗体可以利用例如，Kohler and Milstein,自然 256 :495-497 (1975)，或其他本领域已知的适当方法来生产，另外可以本领域已知的方法制 备成嵌合的，人化的，或人单克隆抗体。另外，这些单克隆抗体可以从单链，如轻或重链来制 备，另外可以从保留整个抗体的结合特征(例如，特异性和/或亲和性)的抗体的活性片段 来制备。活性片段是指具有与结合ClfA蛋白质的完全抗体相同的结合特异性的抗体片段， 术语“抗体”用于本文包括所述的片段。另外，利用本发明的单克隆或多克隆抗体制备的抗 血清也受到关注，并且可以许多本领域技术人员认识到的适当方法制备。如上指示，ClfA可以许多本领域已知的适当方法来制备，如已经确立的上述 Kohler and Milstein方法，可以用于生产单克隆抗体，在一个这样的方法中，可以用纯化 的重组ClfA蛋白质，或分离的亚区蛋白质如Clf40，Clf33或ClfA N3，或其活性部分来腹 膜内一星期一次注射小鼠一个较长的时期，接着测试从免疫小鼠得到的血液确定与纯化的 ClfA的反应性。在鉴定了小鼠与ClfA的反应后，将来自小鼠脾的淋巴细胞与小鼠骨髓细胞 融合，测试对抗ClfA的抗体阳性的杂交瘤，然后分离，培养，接着纯化和同型。为了产生本发明的单克隆抗体，所以优选的是利用重组制备的ClfA，Clf40，Clf33 或N3蛋白质，利用本领域已知的常规方法来生产这些抗体。例如，一个这样的方法利用了 大肠杆菌表达载体PQE-30，作为克隆和表达重组蛋白质和肽的表达载体。利用PCR，从金黄葡萄球菌基因组DNA扩增ClfA的A区(代表AA 40-559的Clf40 或代表AA 221-550的Clf33)，亚克隆进大肠杆菌表达载体PQE-30 (Qiagen)，允许表达含 有6个组氨酸残基的重组融合蛋白质。随后将该载体转化进大肠杆菌菌株ATCC 55151，生 长在15升的发酵罐中直到最佳密度(0D_)为0. 7，用0. 2mM异丙基-Ι-beta-D半乳糖苷(IPTG)诱导4小时。利用AG技术中空过滤装置(孔大小为0. 45um)收获细胞，在_80°C冷 冻细胞糊。以IlOOpsi的压力并两次通过French Press，在IXPBS (10ml缓冲液/lg细胞 糊)溶解细胞。在17，OOOrpm旋转溶解的细胞30分钟，除去细胞碎片。上清液通过用0. IM NiCl2装载的5毫升HiTrap螯合柱(Pharmacia)。在装载后，用5倍柱体积的IOmM Tris, pH 8.0, IOOmM NaCl(缓冲液A)洗涤柱。用超过30个柱体积的0-100%梯度的IOmM Tris, pH 8.0, IOOmM NaCl，200mM咪唑(缓冲液B)洗脱蛋白质。在约13%缓冲液B (_26mM咪唑) 洗脱Clf40或Clf 33。检测在280nm处的吸光值。在IXPBS中透析含有Clf40或Clf 33的 部分。然后，将蛋白质通过除去内毒素过程。将这一过程中利用的缓冲液通过5毫升的 MonoQ琼脂糖柱(Pharmacia)制成无内毒素的。将蛋白质平均分在4个15毫升的管中。每 个管的体积用缓冲液A加到9毫升。在每个管中加入1毫升10%的曲通X-114，在4°C旋转 温育1小时。将管放置于37°C的水浴分离各相。在2，OOOrpm旋转试管10分钟，回收每个 试管的上层水相，重复用去垢剂萃取。合并来自第二次萃取的水相，通过5毫升的IDA螯合 柱(Sigma)，用0. IM NiCl2洗涤，除去残留的去垢剂。用9个柱体积的缓冲液A洗涤柱，然 后用3个柱体积的缓冲液B洗涤蛋白质。将洗脱液通过5毫升的Detoxigel柱(Sigma)，并 且流通回收，再加到柱上。回收第二次通过时的流通液，在IXPBS中透析。分析纯化的产物 的浓度，纯度，和内毒素水平，然后对小鼠给药。在本文中，用这一方法得到的Clf40的氨基酸序列表示为SEQID NO :2，是具有SEQ ID NO :1所述的序列的核酸，或其间并物编码的。另外，用这一方法得到的Clf33的氨基酸 序列在本文中表示为SEQ ID NO :4，是具有SEQ ID NO :3所述的序列的核酸或其间并物编 码的。根据本发明，在分离了 ClfA蛋白质或它的活性亚区如Clf40，Clf33或ClfA N3后， 可以用许多适当方法生产这些蛋白质的单克隆抗体。例如，在一个优选的方法中，利用纯化 的Clf40和Clf33蛋白质生产一组小鼠单克隆抗体。简要地说，一组Balb/C小鼠接受了一 系列的50g Clf40或Clf33蛋白质溶液或混合如下所述的佐剂的皮下免疫 在最后加强后3天，除去脾，撕碎放进单细胞悬浮液中，回收淋巴细胞。然后，将淋 巴细胞与SP2/0-Agl4骨髓瘤细胞系(ATCC#1581)融合。细胞融合，随后根据来自现代免疫 学方案(第二章，2单元)的单克隆抗体方案来进行平铺和饲喂。 然后，利用标准的ELISA实验，筛选从融合产生的任何克隆中的特异的抗Clf40抗 体的产生。扩展阳性克隆，进一步实验。开始时鉴定15个阳性克隆，通过有限稀释进一步 鉴定。在直接结合的ELISA中测试单个细胞的克隆的活性，这是一个修改的ELISA，通过流 动细胞计检测纤维蛋白原与CLF40的结合的抑制，整个细菌细胞的结合，和通过双核分析检测Clf40结合的亲和性。在用兔IgG(50mg/ml)封闭蛋白质A位点后，回收金黄葡萄球菌细菌样品(菌株 Barnett, 67-0, ATCC#25923 和 ATCC#49230)，用浓度 2 毫克 / 毫升的 Mab 13-2,12-9,13-1 或PBS单独(对照)洗涤和温育。在用抗体温育后，用作为检测抗体的山羊-F(ab)2-抗-小 鼠-Fu)2-FITC温育细菌细胞。在抗体标记后，通过FACScaliber流动细胞计抽吸细菌细 胞，分析荧光发散(激发波长488，发散波长570)。对于每个细菌菌株，回收10，000个，测 定。用PBS (pH 7. 4)中的1毫克/毫升Clf40溶液包衣高结合的96孔平板，覆盖，和 在室温温育2小时。然后，用PBS，0. 05%吐温20洗涤平板，在室温用BSA溶液封闭1 小时。在洗涤后，加入单克隆抗体上清液，在室温温育平板1小时。然后，洗涤平板，在每个 孔中加入0. lmg/ml人纤维蛋白原溶液。在室温温育平板1小时并且洗涤。以PB S,0. 05% 吐温20，0. 1%BSA中1 750稀释加入羊抗纤维蛋白原AP共轭物，允许在室温温育1小 时。然后，洗涤平板，加入PNPP(显影液)，最后浓度为lmg/ml。在37°C温育平板15-30分 钟，在405nm阅读结果，用PerkinElmer HTS 7000Bio-Assay读数器分析。利用软件中包括的配体捕获方法，在Biacore 3000上进行动力学分析。兔抗-小 鼠-Fc抗体(Biacore)是与CM5条结合的胺。然后，将待分析的单克隆抗体通过条，允许结 合Fc部分。然后，将各种浓度的Clf40或Clf33部分通过条表面，收集数据。利用Biacore 提供的评估软件(3. 1版)，检测Kon和Koff，计算Ka和Kdo正如下面的数据所示，产生针对Clf40或Clf40的活性部分(N2N3或N3区域)的 本发明的单克隆抗体的免疫已经产生了不同的各种反应性和交叉反应方案的单克隆抗体。虽然利用ClfA蛋白质的重组形式产生抗体是优选的，抗体可以从天然分离额和 纯化的ClfA蛋白质或区域产生，可以用如上所述的得到这样的抗体的相同方法，利用天然 的ClfA蛋白质或活性区域产生单克隆或多克隆抗体。可以利用重组的或天然的纯化ClfA 蛋白质或它的活性区域，利用其他的常规方法生产本发明的ClfA抗体，正如本领域的技术 人员认识到的。正如本领域技术人员认识到的，为了治疗或预防葡萄球菌引起的感染，也可以将 本发明的抗体配制成适当的药物组合物对人或动物患者给药。含有本发明的抗体的药物组 合物或其有效片段可以与任何适当的药物载体，赋形剂或本领域常用的载体，包括如盐水， 葡萄糖，水，甘油，乙醇，其他治疗化合物和其结合体联合配制。正如本领域技术人员认识到 的，特别的载体，赋形剂或利用的载体将根据患者和患者的状况来变化，正如本领域技术人 员认识到的，许多种给药方式都适于于本发明的组合物。本申请书公开的任何药物组合物 的适当的给药方法包括，但不限于局部地，口服，阴道，静脉内，腹膜内，肌肉内，皮下，鼻内 和经皮给药。对于局部给药，将组合物配制成油膏，奶液，凝胶，洗液，滴剂(如眼滴剂和耳滴 剂)，或溶液(如嘴洗液)形式。伤口或外科抹剂，缝线和气雾剂可以浸渍本组合物。本组 合物可以含有常规添加剂，如防腐剂，溶剂，促进渗透，和润肤剂。局部配方也可以含有常规 载体如奶液或油膏基质，醇或油醇。抗体组合物的其他形式，和关于组合物的其他信息，关于其他NSCRAMM 的方法 和申请通常也可以用于本发明，包括ClfAMSCRAMM 的抗体，并且公开在例如美国专利
86，288，214 (Hook et al.)，引入作为参考。针对ClfA蛋白质或它的有效亚区如Clf40，Clf33或N3产生的本发明的抗体组合 物也可以与适当的佐剂，以增强针对共轭物的免疫原应答的有效量一起给药。适当的佐剂 例如可以包括铝(磷酸铝或氢氧化铝)，在人中广泛使用，其他佐剂如皂甙和它的纯化成分 QuiA, Freund完全佐剂，RIBBI佐剂，和其他用于研究和兽医应用的佐剂。其他化学定义的 制剂如胞壁酰二肽，单磷酸脂A，磷酸脂共轭物如Goodman-Snitkoff et al.免疫学杂志， 147 410-415(1991)中所述的，其通过在此引述而合并于本文，和在蛋白脂质体内的共轭 物的包囊如Miller et al.，J. Exp. Med. 176 1739-1744 (1992)，其通过在此引述而合并于 本文，和蛋白质在脂载体中的包囊如Novasome 脂载体(Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, NH)也可以利用。所以在任何事件中，利用本发明的抗体组合物在葡萄球菌上的ClfA和寄主细胞 和组织上的纤维蛋白原之间调节，抑制结合的相互作用，或替代已经变成与寄主细胞和组 织结合的纤维蛋白原的葡萄球菌。因此，本发明在开发预防或治疗葡萄球菌感染的组合物 和方法中，和抑制葡萄球菌与寄主组织和/或细胞的结合中有特别的应用。根据本发明，提供了预防或治疗葡萄球菌感染的方法，包括给药有效量的ClfA蛋 白质或它的活性亚区如Clf40，Clf33或N3的抗体治疗或预防感染。另外，这些多克隆抗体 已经显示可用于破坏葡萄球菌与纤维蛋白原或纤维蛋白的结合，并且所以证明在治疗或预 防葡萄球菌如金黄葡萄球菌中是有效的。进一步，本发明的抗体双倍地有效在于 它们已经 显示在许多种金黄葡萄球菌菌株中有交叉反应性，所以能提高基于本发明的单克隆抗体的 组合物的效率。因此，根据本发明，以任何上述常规方法给药本发明的抗体(如，局部，肠胃外，肌 肉内等等)，将提供治疗或预防人或动物患者中葡萄球菌感染的非常有用的方法。有效量是 指利用的水平，如抗体效价将是足以预防细菌的黏附，，抑制葡萄球菌与寄主细胞的结合， 所以可用于治疗或预防葡萄球菌感染。正如本领域技术人员认识到的，有效治疗或预防葡 萄球菌感染需要的抗体效价水平将根据患者的特征，状况，和/或已经存在的葡萄球菌的 感染的严重性而变化。除了利用ClfA蛋白质的抗体和该蛋白质的A区中的区域如上所述治疗或预防金 黄葡萄球菌感染，本发明也关注这些抗体的各种利用方法，包括检测金黄葡萄球菌的存在 来诊断葡萄球菌感染，是否患者或医学仪器也感染了。根据本发明，检测存在葡萄球菌感染 的一个优选的方法包括得到怀疑被一个或多个葡萄球菌种类或菌株感染的样品，如取自个 体，例如一个人的血液，唾液，组织，骨，肌肉，软骨或皮肤的样品。然后，溶解细胞，萃取，沉 淀和扩增DNA。在分离样品后，可以进行利用本发明的抗体的诊断测试检测金黄葡萄球菌的 存在，这样的检测样品中的细菌的存在的测试技术是本领域技术人员已知的，包括如放射 免疫测试，Western印迹分析和ELISA测试。通常，根据本发明，诊断金黄葡萄球菌感染的 方法是受到关注的，其中已经根据本发明在怀疑感染金黄葡萄球菌的样品中加入ClfA蛋 白质抗体，抗体结合了样品中的ClfA蛋白质就指示有金黄葡萄球菌。因此，本发明的抗体可以用于特异地检测葡萄球菌图谱蛋白质，预防葡萄球菌的 感染，治疗正在的感染，用作研究工具。术语“抗体”如本文所用包括单克隆，多克隆，嵌合， 单链，双特异，猿化，人化或灵长类化抗体，以及Fab片段，如维持抗体与ClfA蛋白质的结合特异性的那些片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物。因此，本发明关注如上所述的 抗体的单链如可变重链和轻链的用途。这些类型的抗体或抗体片段的通性是本领域技术人 员已知的。在目前的情况中，ClfA蛋白质的单克隆抗体已经产生，分离并且显示能保护葡 萄球菌的感染。任何上述抗体可以直接用可检测标记来标记以鉴定和定量葡萄球菌。用于免疫 测试的标记通常是本领域技术人员已知的，包括酶，放射性同位素和荧光，发光的和色素 物质，包括带颜色的颗粒如胶质金或乳汁小珠。适当的免疫实验包括酶联免疫吸附实验 (ELISA)。或者，抗体可以间接地通过与具有免疫球蛋白亲和力的标记物质反应来标记。抗 体可以与第二个物质结合，并且用已标记的与结合抗体的第二个物质有亲和力的第三个物 质来检测。例如，抗体可以结合生物素，利用标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白来 检测抗体生物素结合物。同样，抗体可以与半抗原结合，利用标记的抗半抗原抗体检测抗 体_半抗原结合物。这些和其他标记的抗体和实验结合物的方法是本领域技术人员已知 的。如上所述的ClfA抗体也可以用于生产设备或实验室分离附加量的蛋白质，如通 过亲和层析。例如，本发明的抗体也可以用于分离附加量的ClfA蛋白质或它的活性片段。本发明的分离抗体或其活性片段也可以用于开发抗葡萄球菌感染的消极免疫的 疫苗。另外，当作为药物组合物对伤口给药或用于体外和体内包衣医学装置或多聚体生 物物质时，本发明的抗体可以用于那些已经有葡萄球菌感染的情况中，因为这些抗体具有 进一步限制和抑制金黄葡萄球菌与纤维蛋白原或纤维蛋白结合从而限制感染的程度和传 播的能力。另外，抗体可以根据需要进行修饰，以致在一些情况中，它在给药的患者中免 疫原性很小。例如，如果患者是人，抗体可以通过将杂交瘤起源的抗体的补体确定区移 植进人的单克隆抗体来“人化”，如 Jones et al.，Nature321 =522-525(1986)或 Tempest et al. Biotechnology 9 :266_273 (1991)所述，或通过改变接触免疫球蛋白的可变区的 小鼠框架残基的表面来“veneered”，模拟同源的人框架部分，如Padlan，分子免疫学，28 489-498(1991)所述，这些参考文献都通过在此引述而合并于本文。甚至，当需要时，本发明 的单克隆抗体可以结合适当的抗生素给药，进一步增强本组合物对抗细菌感染的能力。用本文所述的抗体，蛋白质和活性片段包衣的医学装置或多聚体生物物质，包括， 但不限于纤维，缝线，替代心脏阀，心脏辅助装置，硬的和软的接触镜，眼内镜植入体(前室 或后室)，其他植入体如角膜嵌体，角质修补，血管stents，epikeratophalia装置，青光眼 分流器，视网膜纱布，巩膜带扣，牙科嵌体，甲状腺塑料装置，血管移植体，软的和硬的组织 嵌体包括，但不限于泵，电子装置，包括刺激物和记录器，听觉嵌体，起搏器，人工喉，牙科植 入体，乳房植入体，阴茎植入体，颅骨/面腱，人工关节，腱，韧带，半月板，和盘，人工骨，人 工器官包括人工胰脏，人工心脏，人工假肢，和心脏阀；stents，金属丝，引导金属丝，静脉内 和中央静脉导管，激光和气球成形术装置，血管和心脏装置(管，导入管，气球)，室辅助器， 血管透析成分，血液氧化物，尿道/尿管/泌尿装置(Foley导管，stents，试管和气球)，气 道导管(气管内的和气管造口管和切口)，内饲管(包括鼻胃的，胃内的和空肠的管)，伤口 引流管，用于引流体腔的管如胸膜的，腹膜的，颅的，心包腔，血袋，试管，血收集管，真空容 器，针筒，针头，吸管，吸管尖，和血管。
本领域技术人员能够理解的是，术语“已包衣“或“正包衣”，如本文所用指将抗体 或活性片段，或从其起源的药物组合物应用到装置的表面，优选地是接触葡萄球菌感染的 外表面。装置的表面不需要全部覆盖蛋白质，抗体或活性片段。在一个优选的实施方案中，抗体也可以用作将用于提供治疗或预防葡萄球菌感染 的适当抗体的消极疫苗。正如本领域技术人员已知，可以包装疫苗用于许多适当方法中给 药，如肠胃外的(即，肌肉内，皮内，或皮下)给药，或鼻咽的(即，鼻内0给药。一个这样的 方式是疫苗肌肉内注射进例如，三角肌，但是特别的给药方式将取决于待处理的细菌感染 和患者的状况的特征。疫苗优选地结合药物可接受载体来简化给药，载体通常是水，缓冲 盐，有或没有防腐剂。疫苗可以冻干，在给药的时候再悬浮，或在溶液中。给药本发明的抗体组合物的优选剂量是将对预防或治疗葡萄球菌感染有效的量， 一个技术人员能容易地认识到，这一量将极大地取决于感染的特征和患者的状况。如上指 示，用于本发明的抗体或药物试剂的“有效量“是指非毒性但足够量的试剂，以致产生需要 的预防或治疗效果。正如下面指出的，准确量的抗体或需要的特定的试剂在一个主体和另 一个主体之间是不同的，取决于种类，年龄，和受试者的一般状况，带治疗的症状的严重性， 特定的载体或利用的佐剂，和它的给药方式等等。因此，任何特定抗体组合物的“有效量”将 根据特定的情况变化，适当的有效量可以在每个应用情况中由本领域的技术人员利用唯一 途径所用来确定。剂量应该调节到适于组合物给药的个体，将根据年龄，体重和个体的代谢 情况改变。组合物另外可以含有稳定剂或药物可接受防腐剂，如硫柳汞(乙基(2-巯基苯 甲酸盐-S)，汞钠盐)(Sigma化学公司，St Louis, M0)。当利用适当的标记或其他适当的可检测生物分子或化学物时，本文所述的单克隆 抗体利用的目的如体内和体外的葡萄球菌感染的诊断或葡萄球菌的检测。实验室研究也 可以通过这样的抗体来简化。各种类型的标记和将标记与本发明的抗体结合的方法是本领 域技术人员已知的，如下面所述。抗体例如可以直接或通过螯合与放射性标记结合，如，但不限于32P，3H, 14C，35S, 125L131I0检测标记的方法有闪烁计数，gamma衍射光谱或放射自显影。生物发光标记，如萤 火虫荧光素衍生物也可以利用。生物发光物质可以共价地与蛋白质通过常规方法结合，并 且当酶如荧光素酶催化与ATP的反应引起生物发光分子放射光质子时可以检测标记的蛋 白质。荧光原也可以用于标记蛋白质。荧光原的例子包括荧光素和衍生物，藻红素，别藻兰 蛋白，藻兰蛋白，罗丹明和Texas红。荧光原通常用荧光检测器检测。在细胞中的配体的定位可以通过如上所述地标记抗体，和根据本领域技术人员已 知的方法如免疫荧光显微镜检测标记来确定，方法如Warren and Nelson所述(Mol. Cell. Biol. ，7 1326-1337,1987)。如上指示，本发明的单克隆抗体或其活性部分或片段是特别可以用于干扰有关感 染的葡萄球菌病原体和哺乳动物寄主之间的最初的物理相互作用的，如细菌与哺乳动物细 胞外基质蛋白质如纤维蛋白原的黏附，并且这一物理相互作用的干扰可以用于治疗患者和 预防或减少内住的医学装置的细菌感染，以使它们使用时安全。在本发明的另一个实施方案中，提供了可以用于分离和鉴定葡萄球菌的试剂盒， 其中包括适当形式的本发明的抗体，如单个容器中的冻干粉，然后加入怀疑含有葡萄球菌 的水溶液样品而变成有活性。这样的试剂盒通常将包括含有适当形式的抗体和适当的免
11疫检测试剂的适当容器，允许鉴定复合物与本发明的ClfA抗体的结合。例如，免疫检测试 剂可以含有适当的检测信号或标记，如生物素或产生可检测颜色等等的酶，通常可以与抗 体连接，或可以在其他适当的方法中使用，当抗体与抗原结合时提供可检测的结果。简要地说，结合ClfA蛋白质或其活性片段的本发明的抗体所以在治疗或预防人 和动物患者和医学或其他内居装置的葡萄球菌感染中特别有用。因此，本发明涉及鉴定和 分离可以结合ClfA的抗体的方法，可以用于治疗葡萄球菌感染的方法中，包括调理吞噬细 胞性地杀死该细菌。利用本方法鉴定和/或分离的抗体，如ClfA抗体可以结合ClfA蛋白 质，和可以预防或治疗葡萄球菌感染，是本发明的一部分。
实施例提供的下面的实施例用于举例说明本发明的优选的实施方案。本领域的技术人员 应该理解，这些实施例中公开的技术按照本发明人发现的代表技术能在本发明的实践中起 良好的作用，所以可以考虑构成它的实践的优选模式。但是，本领域的技术人员应该能够根 据本公开对特定的实施方案进行许多改变，并且仍然可以在不脱离本发明的精神和范围内 得到类似或相似的结果。实施例1 :Clf40和Clf33的分离和测序利用PCR，从金黄葡萄球菌Newman基因组DNA扩增ClfA的区域(Clf40代表AA 40-559或Clf33代表AA 221-550)，并且亚克隆进大肠杆菌表达载体PQE-30 (Qiagen)，允许 表达含有6个组氨酸残基的重组融合蛋白质。随后，将这一载体转化进大肠杆菌菌株ATCC 55151，生长在15升的发酵罐中到最适光密度(OD6J为0.7，用0.2mM异丙基-Ι-beta-D半 乳糖苷(IPTG)诱导4小时。利用AG技术中空纤维装置(孔大小0. 45um)收获细胞，在-80°C 冷冻细胞糊。在IXPBSdOml缓冲液/Ig细胞糊)中以IlOOpsi两次通过French Press溶 解细胞，在17，OOOrom旋转溶解的细胞30分钟除去细胞碎片。将上清液通过用0. IM NiCl2 装载的5毫升HiTrap螯合柱(Pharmacia)。在装载后，用5个柱体积的IOmM Tris pH8. 0， IOOmM NaCl(缓冲液 Α)洗涤柱。用 0-100% 梯度的 IOmM Tris, pH8. 0, IOOmM NaCl,200Mm 咪唑(缓冲液B)，量超过30个柱体积来洗脱蛋白质。Clf40或Clf33洗脱在约13%缓冲液 B ( 26mM咪唑)处。检测了 280nm处的吸光值。在IXPBS中透析含有Clf40或Clf33的 部分。然后，将蛋白质通过内毒素除去过程。通过一个5毫升的单Q琼脂糖柱 (Pharmacia)将在这一过程中利用的缓冲液制成无内毒素。将蛋白质均分在4个15毫升的 试管中。用缓冲液A将每个管的体积加到9毫升。在每个管中加1毫升10%的曲通X-114， 在4°C旋转温育1小时。将试管放置于37°C水浴，分离各相。试管在2，OOOrpm旋转10分 钟，从每个试管中收集上层，重复用去垢剂萃取。合并来自第二次萃取的水相，通过5毫升 的IDA螯合柱(Sigma)，用0. IM NiCl2装载，除去其余的去垢剂。用9个柱体积的缓冲液 A洗涤柱，然后用3个柱体积的缓冲液B洗脱蛋白质，将洗脱液通过5毫升的Detoxigel柱 (Sigma)，回收流通液，再加到柱上。回收来自第二次的流通液，在IXPBS中透析。分析纯化 的产物的浓度，纯度和内毒素水平，然后对小鼠给药。蛋白质和核酸序列包括如下。Clf40氨基酸序列包括在SEQID NO :2，这是核酸序 列SEQ ID NO 1编码的，也是其间并物编码的。Clf33氨基酸序列包括如下为SEQ ID NO 4，这是核酸序列SEQ ID NO :3编码的，也是其间并物编码的。实施例2.利用Clf40和Clf33讲行单克降抗体牛产利用纯化的Clf40或Clf33蛋白质生产一组小鼠单克隆抗体。简要地说，一组 Balb/C小鼠接受一系列的溶液中的50ug Clf40或Clf33蛋白质，或混合如下所述的表1中 的佐剂进行的皮下免疫。表1 在最后加强后3天，移取脾脏，撕碎放入单细胞悬浮液中，收集淋巴细胞。然后，将 淋巴细胞与SP2/0-Agl4骨髓瘤细胞系(ATCC#1581)融合。细胞融合，随后根据现代免疫学 方案第二章，2单元(Current Protocols in immunology)的单克隆抗体生产方案进行平铺 和饲喂。然后，利用标准的ELISA实验对从融合产生的任何克隆筛选特异的抗Clf40抗体 的生产。扩展阳性克隆，进一步实验。起初鉴定15个阳性克隆，限制稀释克隆进一步鉴 定。在直接结合ELISA中测试单细胞克隆的活性，是一个检测纤维蛋白原与CLF40的结合 的抑制的修改的ELISA，通过流动细胞计检测整个细菌细胞的结合，通过Biacore分析检测 Clf40结合的亲和力。测试结果包括在下面的表II 表II
CLFA 单 克隆 抗 体结合动力学FBG结合 的抑制与金黄葡萄球菌 BARNETT的结合与金黄葡萄 球菌67-0的结 合与金黄葡萄球菌 ATCC#25923 的结合与金黄葡萄球菌 ATCC #49230 的结合F12-9K0N7.74X1O5 Koff4. 46X10"4 Kd5. 76X1 O"1050-7 0%72%62%60%94%F13-1KonI . IlXlO5 Koff6. 13X10"3 Kd5. 5 1 X 1 O"80-15 %9%F13-2KonI . 19X105 Koff2. 81X10"4 Kd2. 3 5X1 O"940-6 0%59%65%55%93%与全细菌的结合收集金黄葡萄球菌样品(菌株Barnett，67-0，ATCC#25923andATCC#49230)，洗涤， 用Mab 13-2，12-9，13-1或PBS单独(对照)，浓度2mg/ml，在用兔IgG(50mg/ml)封闭蛋白 质A位点后温育。在用该抗体温育后，用作为检测抗体的山羊-F⑷2-抗鼠-F(ab)2_FITC温育细菌细胞。在抗体标记后，通过FACScaliber流动细胞计抽吸细菌细胞，分析荧光的发散(激发波 长488，发散波长570)。对于每个细菌菌株，收集10，000个事件，测量。抑制(ELISA)用PBS (pH7. 4)中的lug/ml的Clf40溶液包衣高结合的96孔平板，覆盖，在室温下 温育2小时。然后，用PBS，0.05%吐温20洗涤平板，用BSA溶液在室温下封闭1小时。 在洗涤后，加入单克隆抗体上清液，在室温下温育平板1小时。然后洗涤平板，将0. lmg/ml 人纤维蛋白原溶液加入到每个孔中。在室温下温育平板1小时，洗涤。以PBS，0.05%吐温 20，0. 1%BSA中1 750稀释度加入羊抗纤维蛋白原AP共轭物，允许在室温下温育1小时。 然后洗涤平板，以最后浓度lmg/ml加入pNPP(显影液)。在37°C温育平板15-30分钟，在 405nm 读出结果，利用 PerkinElmer HTS 7000Bio_Assay 读数器分析。动力学分析在Biacore 3000上用软件中包括的配体捕获方法进行动力学分析。兔抗小鼠 Fc抗体(Biacore)是与CM5条结合的胺。然后，将待分析的单克隆抗体通过条带，允许与 Fc部分结合。然后，将各个浓度的Clf 40或Clf33蛋白质通过条带表面，收集数据。利用 Biacore提供的评估软件(3. 1版)，测量K。n和K。ff，计算Ka和KD。实施例3 :Clf40和Clf33的其他研究利用PCR，从金黄葡萄球菌Newman基因组DNA扩增ClfA的A区(Clf40代表AA 40-559，Clf33-N2N3区代表AA 221-550或Clf_N3区代表AA370-559)，亚克隆进大肠杆菌 表达载体PQE-30 (Qiagen)，允许表达含有6个组氨酸残基的重组融合蛋白质。这一载体随 后转化进大肠杆菌菌株ATCC 55151，生长在15升的发酵罐中直到光密度(OD6J为0. 7， 用0.2mM异丙基-Ι-beta-D半乳糖苷(IPTG)诱导4小时。用AG技术的中空纤维装载(孔 大小0. 45mm)收集细胞，在_80°C冷冻细胞糊。在1XPBS(10毫升缓冲液/1克细胞糊)，以 IlOOpsi两次通过French Press溶解细胞。在17，OOOrpm旋转溶解的细胞30分钟除去细 胞碎片。将上清液通过用0. IM NiCl2装载的5毫升HiTrap螯合柱(Pharmacia)。在装载 后，用5个体积的IOmM Tris,pH8.0, IOOmM NaCl (缓冲液Α)洗涤柱。用超过30个柱体积的 0-100%梯度的IOmM Tris, pH8. 0, IOOmM NaCl，200mM咪唑(缓冲液B)洗脱蛋白质。在 13%缓冲液B ( 26mM咪唑)洗脱Clf蛋白质。检测在280nm处的吸光值。在IXPBS中透 析含有Clf40或Clf33的部分。然后，将蛋白质通过内毒素除去过程。通过5毫升的单Q琼脂糖柱(Pharmacia)将 这一过程中使用的缓冲液制成无内毒素的。将蛋白质均分在4个15毫升的试管中。用缓 冲液A将每个试管的体积加到9毫升。在每个试管中加入1毫升10%的曲通X-114，在4°C 旋转温育1小时。将试管放置于37°C的水浴分离各相。在2，OOOrpm旋转试管10分钟，从 各个试管收集上层水相，重复用去垢剂萃取。合并来自第二次萃取的水相，通过5毫升的用 0. IM NiCl2装载的IDA螯合柱(Sigma)，除去其余的去垢剂。用9个体积的缓冲液A洗涤 柱，然后用3个体积的缓冲液B洗脱蛋白质。将洗脱液通过5毫升的Detoxigel柱(Sigma)， 收集流通液，再加到柱上。收集来自第二道的流通液，在IXPBS中透析。分析纯化的产物的 浓度，纯度和内毒素水平，然后对小鼠给药。单克隆抗体生产利用纯化的Clf40，Clf33或N3蛋白质生产一组小鼠单克隆抗体。简要地说，一组
14Balb/C或SJL小鼠接受了一系列溶液中的或混合表III中所述的佐剂的1_10毫克蛋白质 的皮下免疫表 III
RIMMS
注射_^_量(mg)途径_佐剂
#1 0 5皮下 FCA/RIBI
#2 2 1皮下 FCA/RIBI
#3 4 1皮下 FCA/RIBI
#4 7 1皮下 FCA/RIBI
#5 9 1皮下 FCA/RIBI
常规 注射 初次 力口强#1 力口强# 2
天
量(mg)
5
14
28
途径
皮下 腹膜内 腹膜内
佐剂
FCA
RIBI
RIBI
力口强#3 421腹I莫内RIBI在杀死(RMMS)时，或在加强(常规)后，收集血清，在ELISA测试中针对NSCRAMM 或对全部细胞(金黄葡萄球菌呵表皮葡萄球菌)滴定。在最后加强后3天，移取脾脏或淋 巴结。撕碎放入单细胞悬浮液，收集淋巴细胞。然后，将淋巴细胞与SP2/0-Agl4骨髓瘤细 胞系(ATCC#1581)融合。细胞融合，随后根据现代免疫学方案(第二章，2单元)的单克隆 抗体生产方案进行平铺和饲喂。然后，利用标准的ELISA实验筛选特异的抗Clf40，SdrG或FnbpA抗体生产中融合 产生的任何克隆。扩展阳性克隆，进一步实验。进一步在直接的结合ELISA中测试候选物 的活性，这是一个修饰的ELISA，测量纤维蛋白原与CLF40的结合，通过流动细胞计测试全 部细菌细胞的结合，通过Biacore分析测试Clf40结合/纤维蛋白原_Clf40结合的抑制。Biacore 分析通过分析，流动速度仍然恒定在IOml/分钟。在注射ClfA 40之前，通过RAM-Fc结 合将测试抗体吸收到条带上。在0时间，将浓度30mg/ml的Clf40注射到条带上3分钟，接 着离解2分钟。这一时期的分析是测量Mab/ClfA相互作用的相对结合呵离解动力学。在 第二时期的分析中，测量了 Mab结合ClfA与纤维蛋白原的相互反应和结合的能力。将浓度
15100mg/ml的纤维蛋白原注射到条带上，在3分钟后取一个报告点。与全细菌的结合收集细菌样品(Newman)，洗涤，用浓度2mg/ml的Mab或PB S单独(对照)，在 用兔IgG(50mg/ml)封闭蛋白质A位点后温育。在用抗体温育后，用作为检测抗体的山 羊-F(ab)2_抗_小鼠-F(ab)2_FITC温育细菌细胞。在抗体标记后，通过FACScaliber流动细 胞计抽吸细胞，分析荧光发散(激发波长488，发散波长570)。对于每个细菌菌株，收集 10. 000个事件，测量。抑制(ELISA)用PBS中的lug/mlClf40溶液包衣高结合的96孔平板，覆盖，在室温下温育2小 时。然后用PBS，0. 05%吐温20洗涤平板，用BSA溶液在室温下封闭1小时。在洗涤后， 加入单克隆抗体上清液，在室温下温育1小时。然后洗涤平板，在每个孔中加入0. lmg/ml 人纤维蛋白原溶液。在室温下温育平板1小时，洗涤。以在PBS，0. 05%吐温20，0. 1% BSA 中1 750稀释度加入羊抗纤维蛋白原AP共轭物，允许在室温下温育1小时。然后，洗涤 平板，以最后浓度lmg/ml加入pNPP (显影液)。在37°C温育平板15-30分钟，在405nm读 出结果，利用Perkin Elmer HTS 7000Bio_Assay读数器分析。t施彻丨4 用Clf40的个部分免,疮产牛H有不同/i应方式的单克降杭体下面的表IV显示了用本发明的活性区的免疫测试结果。这些活性区包括Clf40， Clf33(构成了 ClfA A区的N2N3区)，和ClfAN3区单独。
在这一表中显示的结果显示，用Clf40或Clf40的各部分(N2N3或N3)生产抗体
的免疫产生了各种不同反应方案的单克隆抗体，展示了与各种葡萄球菌菌株有基本的交叉反应性。实施例5 利用Biacore诜择封闭ClfA结合纤维蛋白原的高亲和力MabBiacore 分析通过图1所示的实验，流速仍然恒定在lOml/min。在注射ClfA 40之前，通过 RAM-Fc结合将946RU的Mab 13_1和768RU的Mab 13_2吸收到条带上。在图上的O时间， 在3分钟内将浓度30mg/ml的ClfA 40注射到条带上，接着离解2分钟。在ClfA注射时间 结束时，13-lMab结合58RU的ClfA，13_2Mab结合168RU的ClfA。这一时期的实验测量了 Mab/ClfA相互反应的相对结合和离解动力学。在实验的第二时期测量了 Mab结合ClfA相 互反应和结合纤维蛋白原的能力。在100mg/ml浓度的纤维蛋白原注射到条带上，在3分 钟后，64RU的纤维蛋白原结合ClfA，结合Mab 13_1，但ORU的纤维蛋白原结合Mab 13-2的 ClfA。实施例6 抗金黄葡萄球菌菌株Barnett和金黄葡萄球菌ATCC15923的Mabl3. 2的 比较抗体规模和纯化在RPMI/DMEM，含有2mM丙酮酸钠，4mML谷氨酸和2X青霉素-链霉素的IX Nutridoma-SP介质中生长杂交瘤细胞到2-3升培养体积。然后通过离心收获杂交瘤上清 液。通过0.45uM滤器过滤上清液，利用蛋白质G层析亲和纯化IgG。用0. IM甘氨酸，pH2.7 洗脱单克隆抗体，立即用1-10个体积的2M Tris, pH8. O中和。然后，对IX D-磷酸缓冲盐， PH7. 4透析纯化的IgG。如果需要，浓缩纯化的抗体，等分试样冷冻。金黄葡萄球菌菌株从冷冻的甘油储备液取金黄葡萄球菌细胞，并且将其接种在单血液琼脂平板上， 并且在37°C生长24小时。然后将单个菌落转移到新的血液琼脂平板上。接种80个平板制 备50毫升的最后的冷冻储备液。然后，在37°C接种平板24小时。接种后，从刮每个平板的 表面上的菌落到含有10毫升IXPBS (20个平板一个试管)的4个50毫升的试管中，温和旋 转从刮菌器上除去细菌。然后，将另外10毫升的IXPBS加到10毫升的细菌悬浮液中，剧烈 离心，简化琼脂碎片从细菌中的分离。在3500xg，4°C下离心10分钟。在D-PBS中洗涤细 菌，再悬浮于50毫升冷冻培养基中。将细菌储备液通过在乙醇/干冰浴中快速冷冻放置于 1毫升的等分器中，并且放置于-80°C的冷冻器中。冻融1毫升的储备液等分试样，制备10_5 到 ο—11的稀释系列来确定冷冻储备液的浓度(CFU/ml)。在血液琼脂平板上双倍放置稀释 液，在37°C温育16-18小时。确定CFU/ml (CFU/ml =(平均#克隆X稀释因子)/0. 050ml)， 平均每个稀释液确定平均的CFU/ml。在注射时，冻融每个菌株的等分试样，一个菌株合并一 个试管，并且离心。动物，性别，种类，数目，年龄和来源从Taconic质量实验室动物和研究服务中心(Germantown，NY)购买雌性Balb/C 小鼠(5-6星期的年龄)。允许动物在实验之前至少驯养14天。然后，检查小鼠，在有海绵 垫的聚碳酸鞋盒状笼子里放入5个小鼠/笼。在实验室动物的护理和使用的NIH指导中的 要求的畜牧业标准下，将所有小鼠放置于12小时的光暗循环中。鉴定和随机化在使用药量之前，通过尾纹鉴定各个鉴定所有动物。在开始处理之前，称重各个动
19物，评估它们的健康。随机取小鼠，利用根据不同的体重分到各处理组。ClfA特异单克隆抗体(Mab)，同种利用Becton Dickenson的小鼠同型的细胞计小珠排列对ClfA特异小鼠单克隆抗 体进行同型化。根据制造商方案，利用流动细胞计确定同型。13. lClf40Mab, IgG,13. 2Clf40Mab, IgG,12. 9Clf33Mab, IgG,对照ATTC 1771，IgG从生命技术公司(Cat No. 10010-023 ；Lot NO. 1078749)购买磷酸缓冲盐， ρΗ7· 4 (PBS)。实验设计表V处理攻击 体内动物数据通过用0. 5mg的单克隆抗体13_2，同型对照单克隆抗体CRL-1771，或PB S腹膜内 注射(IP;0.5ml)处理小鼠。在给药IgG后18小时，用单个静脉内(IV)注射金黄葡萄球 菌菌株Barnett或金黄葡萄球菌ATCC 25923攻击小鼠。接着12天后杀死所有其余的小 鼠。检查处理组之间相对生存时间的明显差别。接受Mab 13-2的小鼠的83% (10/12)， 接受CRL-1771的动物的13% (2/15)，和接受PBS的动物的0 % (0/15)可以在金黄葡萄 球菌 Barnett (13-2vs.PBS，ρ < 0.0001 ；13-2vs. CRL-1771, ρ = 0.0009)的细菌攻击中生 存。利用Manetel-Cox(Iogrank)实验中的Kaplan-Meier生存分析对动物数据进行统计 学分析。在金黄葡萄球菌ATCC 25923是攻击细菌的实验中，给药Mabl3-2的小鼠的67% (8/12)生存，在CRL -1771处理小组中27% (4/12)生存，在PBS小组中只有7% (1/15)生 存(13-2vs. CRL-1771，ρ = 0. 02 ； 13_2vs. PBS，0. 0002)。这些结果清楚地表明，MSCRAMM 特 异单克隆抗体提供了明显的抗金黄葡萄球菌菌株致死感染的水平。实施例7 分离和测序可变区序列A.单克隆抗体13-2利用Fast Track 2· 0 试剂盒(Invitrogen ;cat#K4500)从 ClfA 13-2 杂交瘤 性别分离信使RNA。简要地说，用PBS洗涤在含有10% FBS的DMEM-10培养基中培养的 1. 4xl08杂交瘤细胞，离心沉淀，然后在含有蛋白质/Rnase降解物的去垢剂中溶解。通 过在oligo-dT纤维素柱上亲和纯化分离PolyA+mRNA。对可变重链和可变轻链，在含有 20pmol的3，寡聚核苷酸小鼠特异引物(Novagen ;cat#69796and 69812)的cDNA合成试 剂盒(Novagen ；cat#69001_3)中利用5ug的mRNA和逆转录酶进行第一链cDNA的合成。利用PCR试剂系统(生命技术；cat#10198-018)和小鼠可变重链和轻链特异引物系列 (Novagen ;cat#70081-3，各5pmol)，通过聚合酶链式反应(PCR) 30个循环(开始94°C加 热，然后94°C 1分钟，50°C 1分钟和72°C 1分钟)扩增cDNA部分(5到50ng)。在乙酸钠 缓冲液中，在的超纯琼脂糖凝胶中电泳分级分离PCR产物，用溴化乙锭染色观察。从凝 胶中切出与推测大小匹配的PCR片段，用BIO IOlGeneclean旋转柱(cat#1101_400)纯化， 连接进pCR2. I-TOPO(Invitrogen)质粒，接着转化进感受态TOPlO大肠杆菌(Invitrogen ； cat#K4500) ο 在利用 QIApr印 Spin Minipr印试剂盒(QIAGEN ;cat#27106)分离质粒 DNA 后，通过限制内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳鉴定具有插入片段的阳性克隆，接着利用M13 正向和M13反向引物在ABI自动序列仪上测序。结果如下13-2VLA-1 (可变轻链序列) AACATTAGTATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGTAACTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAAATCAGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTACTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAACAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGCACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAANIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQKNYLAffYQQKPGQSPKLLIYffASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCHQYLSSHTFGGGTKLEIK 代表⑶R的氨基酸下面划线13-2VHC-3 (可变重链序列)CAGGTGCATCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCTGGATTCTCATTATCCAGATATAATATACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGGTGGTGAAAACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGCGCCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAQVHLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYNIHWVRQPPGKGLEffLGMIffGGENTDYNSALKSRLSISKDNSKSQYFLKMNSLQTDDTAMYYCASAYYGNSffFAYffGQGTLVTVSA 代表⑶R的氨基酸下面划线B.单克隆抗体12-9利用Fast Track 2. 0 试剂盒(Invutrogen ；cat#K4500)从 ClfA 12-9 杂交瘤 细胞分离信使RNA。简要地说，用PBS洗涤含有10% FBS的DMEM-10培养基中培养的 1.4x10s个杂交瘤细胞，离心沉淀，然后在含有蛋白质/Rnase降解剂的去垢剂中溶解。通 过在Oligo-dT纤维素柱上亲和纯化分离mRNA。对于各个可变重和可变轻链，利用含有20pmol 3，寡聚核苷酸小鼠特异引物(Novagen ;cat#69796and 69812)的cDNA合成试剂盒 (Novagen ；cat#69001_3)中利用5ug mRNA和逆转录酶完成第一链cDNA的合成。利用PCR 试剂系统(生命技术公司；cat#10198_018)和小鼠可变重和轻链特异引物系列(Novagen ； cat#70081-3，各5pmol)循环30次(开始94°C，然后94°C 1分钟，50°C 1分钟和72°C 1分 钟)的PCR链式反应(PCR)扩增cDNA部分(5到5ng)。在乙酸钠缓冲液中1 %的超纯化 琼脂糖凝胶中电泳分级分离PCR产物，用溴化乙锭染色观察。从凝胶中切出匹配预定大小 的 PCR 片段，利用 BlOlOlGeneclean 旋转柱(cat#1101-400)纯化，连接进 pCR2. 1-T0P0 质 粒(Invitrogen)，接着转化进感受态TOP 10大肠杆菌(Invitrogen ；cat#K4500)。在用 QIAprep Spin Minipreo试剂盒(QIAGEN ;cat#27106)分离质粒DNA后，通过限制性内切酶 消化和琼脂糖凝胶电泳鉴定含有插入片段的阳性克隆，接着利用M13正向和M13反向引物 在ABI自动序列仪上测序。得到的序列如下12-9VLA-I (可变轻链序列)AACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAAATCAGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAANIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQKNYLAffYQQKPGQSPKLLIYffASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSYTFGGGTKLEIK 代表⑶R的氨基酸下面划线12-9VHC-I (可变重链序列)CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGACCTGGCCTGGTGGCACCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCGCTATCTCTGGGTTCTCATTATCCAGATATAGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGGTGGTGGAAACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATGTATTACTGTGCCAGAAAAGGGGAATTCTACTATGGTTACGACGGGTTTGTTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCAISGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEffLGMIffGGGNTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARKGEFYYGYDGFVYffGQGTLVTVSA 代表⑶R的氨基酸下面划线C.单克隆抗体35-220利用Fast Track 2. O 试剂盒(Invitrogen ；cat#K4500)从 ClfA35_220 杂交瘤细 胞中分离信使RNA。简要地说，用PBS洗涤含有10% FBS的DMEM-IO培养基中培养的1. 4xl08杂交瘤细胞，离心沉淀，然后在含有蛋白质/Rnase降解剂的去垢剂中溶解。对于各个可 变重和可变轻链，在含有20pmol的3，寡聚核苷酸小鼠特异引物(Novagen ；cat#69796and 69812)的cDNA合成试剂盒(Novagen ；cat#69001-3)中，利用5mg的mRNA和逆转录酶完成 第一链cDNA的合成。利用PCR试剂系统(生命技术公司；cat#10198-018)和小鼠可变重 和轻链特异引物系列(NOVagen;Cat#70081-3，各5pmol)进行聚合酶链式反应(PCR) 30个 循环(开始94°C加热，然后94°C 1分钟，50°C 1分钟72°C 1分钟循环)扩增cDNA的部分 (5到50ng)。在乙酸钠缓冲液中的超纯度琼脂糖凝胶中电泳分级分离PCR产物，用溴 化乙锭染色观察。从凝胶中切出与预定大小匹配的PCR片段，用BIO IOlGeneclean spin 柱(cat#l 101-400)纯化连接进pCR2. 1-T0P0质粒(Invitrogen)，接着转化进感受态TOPlO 大肠杆菌(Invitrogen ；cat#K4500)。在利用 QIAprep Spin Miniprep 试剂盒(QIAGEN ； cat#27106)分离质粒DNA后，通过限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳鉴定含有插入片段
的阳
0193
0194
0195
0196
0197
0198
0199
0200 0201 0202
生克隆，接着在ABI自动序列仪上用M13正向和M13反向引物测序。 得到的序列如下 35-220VLD-4 (可变轻链序列DNA)
AACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAA GGTCACTATGAGCTGTAGGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAAATCAGAA GAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTACACTGCTGA TCTACTGGGCATCCACTAGGGAAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGT GGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCT GGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGA CCAAGCTGGAAATAAAA 35-220VLD-4 (可变轻链序列)
0207
0208
0209
0210 0211 0212
0213
0214
0215
0216
0217
0218 0219
0203]NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCRSSQSVL0204]YSSNQKNYLAWYQQKPGQSPTLLIYWASTR0205]ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLA0206]VYYCHQYLSSYTFGGGTKLEIK
代表CDR的氨基酸下面划线 35-220VHC-1 (可变重链 DNA)
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCTCACAGAGCC
TGTCCATCACATGCACTGTCTCTGGGTTCTCATTATCCAGATATAGTGTACACT
GGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGG
TGGTGGAAACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCACCAA
GGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGA
CACAGCCATGTACTACTGTGCCACCGCCTACTATGGTAACTCCTGGTTTGCTTA
CTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
35-220VHC-1 (可变重链序列)
QVQLKESG 5 GLVAPSQSLSI TCTVSGFSLSRYSVHWVRQ 5 PGKGLEWLGMI WGGGNTDYNSALKSRLS ][TKDNSKSQVFL KMNSLQTDDTA
23
MYYCAT AYYGNSffFAY WGQGTLVTVSA 代表⑶R的氨基酸下面划线D.单克隆抗体35-006可变区序列的分离和测序利用Fast Track 2. 0 试剂盒(Invitrogen ；cat#K4500)从 ClfA35_006 杂交 瘤细胞分离信使RNA。简要地说，用PBS洗涤含有10% FBS的DMEM-10培养基中培养的 1.4x10s个杂交瘤细胞，离心沉淀，然后在含有蛋白质/Rnase降解剂的去垢剂中溶解。通 过在oligo-dT纤维柱上亲和纯化分离Poly A+mRNA。对于各个可变重链和可变轻链，在含 有20pmol 3，寡聚核苷酸小鼠特异引物(Novagen ;cat#69796and 69812)的cDNA合成试 剂盒(Novagen ；cat#69001-3)中利用5mg的mRNA和逆转录酶完成第一链cDNA的合成。 利用PCR试剂系统(生命技术公司；cat#10198-018)和小鼠可变重和轻链特异引物系列 (Novagen ；cat#70081_3，各 5pmol)，通过 30 个循环(开始 94°C，然后 94°C 1 分钟，50°C 1 分 钟和72°C 1分钟循环)的聚合酶链式反应(PCR)扩增cDNA部分(5到50ng)。在乙酸缓冲 液中的超纯度琼脂糖凝胶中电泳分级分离PCR产物，通过溴化乙锭染色观察。从凝胶中 切出与预定大小匹配的PCR片段，利用BIO IOlGeneclean旋转柱(cat#1101_400)纯化，连 接进pCR2. I-TOPO(Invitrogen)质粒，接着转化进感受态TOP 10大肠杆菌(Invitrogen ； cat#K4500) ο 在利用 QIApr印 Spin Minipr印试剂盒(QIAGEN ；cat#27106)分离质粒 DNA， 通过限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳鉴定含有插入片段的阳性克隆，接着利用M13 正向和M13反向引物在ABI自动序列仪上测序。得到的序列如下35-006VLD-1 (可变轻链序列 DNA)AACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAAATCAGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGT
GGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTGCTGTCATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCGAGCTGGAAATAAAA35-006VLD-1 (可变轻链序列)NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC K S S Q S V LYSSNQKNYLA WYQQKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYCC HQYLSSYT FGGGTELEIK 代表⑶R的氨基酸下面划线。35-006VHC-1 (可变重链序列 DNA) CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCTGGGTTCTCATTATCCAGATATAGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGGTGGTGGAAGCACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAACATCAGCAA
GGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGAAGGCTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA35-006VHC-1 (可变重链序列)QVQLKESG PGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSR
YSVHWVRQ PPGKGLEWLGMIWGGGSTDYN
SALKSRLN ISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTA
MYYCARRL WYFDVWGAGTTVTVSS 代表⑶R的氨基酸下面划线。实施仿I丨8 在结合动力学中用等当物牛产嵌合12-9个细胞,与小鼠12-9 ^Zi 纖利用从人志愿者取的全部血液分离的人恒定区域(轻链=Kappa ；重链G1，3或4) 生产嵌合12-9 (选择Poly A RNA和PCR扩增第一链cDNA)。对于哺乳动物细胞中的表达， 在重链和轻链可变区序列的5’末端加一个独特的限制位点Bsm 1。在3’末端(与重复的 恒定区的拼接接合)，在轻链可变区加一个Bsiwl位点，在重链可变区加Apal位点。这是通 过设计寡聚核苷酸引物和适当的12-9DNA模板的PCR扩增来完成的，接着进行证实性DNA 测序。利用含有人免疫球蛋白引导分泌序列(Bsml作为克隆位点)pCEP4(Invitrogen， cat#V044-50)来完成嵌合版本的12-9蛋白质的表达，对于轻链表达引导序列是kappa恒 定区，对于重链表达是gamma(l，3或4)恒定区。设计哺乳动物表达质粒表达重和轻链， 分开的hCMV启动子在同一质粒上，或者通过共转染重链和轻链的表达在分开的pCEP4 质粒上。在含有12-9的重和轻链的质粒DNA转染进具有Fugene的HEK293EBNA细胞 (RocheDiagnostic, cat#1814443)后，在潮霉素选择(300ug/ml)下表达功能性嵌合12-9。 收集上清液，通过Biacore分析结合动力学，通过流动细胞计分析与金黄葡萄球菌细胞的
纟口口。图2和3与重组嵌合体12-9代表的结果证实，12-9的重链和轻链的序列重复了作 为杂交瘤上清液特征的原初的12-9的结合动力学和特异性。实施例9 12~9的重链和轻链可变区的人化这一人化过程的焦点是只改变与小鼠中不参与分子的特异性和与ClfA靶抗原的 亲和力的可变区的残基接触的溶剂。这些决定簇的信息利用了 Padlan公开的溶剂获得性 决定簇(这是在保存它们的配体结合特性的同时减少抗体可变区的免疫原性的可能的方 法，分子免疫学，28 (4) ；489-498，1991)，和硅分子模型或算式确定不用于制造这些决定簇 的T细胞表位。该途径代表了一个方法，通过该方法位点特异诱变改变了小鼠的轻和重链的可变 区残基，反映了来自公共数据库的与小鼠同源的人可变区的结构暴露的表面。特异地，将确 定可变的重和轻链的氨基酸指定了 Kabot位置数目和基于Padlan的“暴露”设计，允许将 氨基酸从人构架亚组排列(重链是I-III和轻链是ι-ιν)。为了支持这一分析，对人免疫球 蛋白数据库以及全部的蛋白质数据库进行BLAST研究，其中选择与小鼠序列具有最高同源 性的(种系和成熟)呵与需要的小鼠序列相异的可变区。一旦相异，鉴定与小鼠序列有最高同源性的人亚组。暴露的小鼠氨基酸残基突变了，模拟了最同源的人亚组。在该位置的 亚组中发现不至一个氨基酸的情况中，利用了在与12-9有最高同源性的人种系序列中出 现的氨基酸。通过PCR利用诱变的寡聚核苷酸完成这些变化，接着证实了 DNA测序。
12-9VL-Hu (人化可变轻链序列DNA)GACATTGTGATGACACAGTCGCCAGACTCTCTGGCTGTGTCTCTGGGAGAAAGGGTCACTATGAACTGTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAAATCAGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA12-9VL-Hu (人化可变轻链序列)DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSYLYSSNQKNYLAffYQQKPGQSPKLLIY
ffASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSYTFGGGTKLEIK 代表CDR的氨基酸下面划线，黑体的氨基酸代表人化的变化12-9VH-Hu (人化的可变重链序列DNA)CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGAAGCCCTCACAGACCCTGTCCATCACATGCACCATCTCTGGGTTCTCATTATCCAGATATAGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGGTGGTGGAAACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAAGACAACTCCAAGAACCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGACCGCCGCTGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCAGAAAAGGGGAATTCTACTATGGTTACGACG
GGTTTGTTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC12-9VH-Hu (人化的可变重链序列)QVQLKESGPGLVKPSQTLSITCTISGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEffLGMIffGGGNTDYNSALKSRLSISKDNSKNQVFLKMNSLTAADTAVYYCARKGEFYYGYDGFVYffGQGTLVTVSS 代表CDR的氨基酸下面划线，黑体的氨基酸代表人化的变化实施例10 利用二甲氧基苯青霉素抗性金黄葡萄球菌菌株67-0 (MRSA)，在小鼠脓 毒模型中，比较ClfA单克降抗体，12-9A(INH-M010001)和35-052. 1 (INH-M01016)和同型匹 配对照 CRL1771 抗体，INH-M000029该实施例的目的是利用0. 3mg剂量的抗体和小鼠脓毒模型中的金黄葡萄球 菌67-D，比较同型匹配对照CRL1771抗体(INH-M000029)，鉴定ClfA单克隆抗体， 12-9A(INH-M010001)和 35-052. 1 (INH-M01016)。 *在开始研究时的估计范围对适当的动物腹膜内(i. ρ)注射单克隆抗体给药给予剂量(如下)。在静脉内注射金黄葡萄球菌前约18小时给药抗体。利用单个参数(致死率)测量系统注射。处理攻击 *时间点反映的是细菌攻击后的小时制备，储存和操作金黄葡萄球菌从冷冻的甘油储备液取MRSA菌株67-0细胞，接种到单个血液琼脂平板上，在37°C 生长24小时。然后，将单个菌落转移到新的血液琼脂平板上。然后，在37°C接种平板24小 时。在接种后，从每个平板的表面刮下菌落进含有10毫升IXPBS的4个50毫升试管中(每 个试管20个平板)，同时温和旋转从刮菌2器上除去细菌。然后，在10毫升细菌悬浮液中 再加10毫升1XPBS，剧烈旋转简化从细菌分离任何琼脂碎片。在4°C，3500xg离心沉淀悬 浮液10分钟。在D-PB S中洗涤细菌，再悬浮于50毫升的冷冻培养基中。通过在乙醇/冰 浴中快速冷冻，将细菌储备液放置于1毫升等分管中，放置于-80°C的冷冻器中。通过冻融 1毫升储备液的等分试样确定冷冻储备液的浓度(CFU/ml)，制备10_5到10—11的系列稀释液。 在血液琼脂平板上铺稀释液2份，在37°C温育16-18小时。确定CFU/ml (CFU/ml =(平均 #菌落X稀释因子)/0. 050mls)，均分各个稀释液确定平均的CFU/ml。在注射的日子，冻融 各个菌株的等分试样，合并在一个试管中，离心。然后制备各个储备液的稀释液。ClfA 12-9A 单克隆抗体，INH-MO10001 (LN JAA2E1354)利用蛋白质G亲和层析，从无血清杂交瘤培养基纯化12-9A单克隆抗体(IgG，亚 型)。报道该物质的浓度是7.0mg/ml，内毒素的浓度是1.0EU/mg的蛋白质。物质冷藏在 40C。在注射的日子，将该物质稀释到0. 6mg/ml，通过腹膜内注射对适当的动物给药0. 5ml。 给药的最后剂量是0. 3mg IgG。ClfA 35-052. 1 单克隆抗体，INH-MO1016 (LN JAA2H1422)利用蛋白质G亲和层析从无血清杂交瘤培养基中纯化35-052单克隆抗体(IgG，亚 型)。该物质的报道浓度是4. 2mg/ml，内毒素浓度是1.0EU/mg蛋白质。该物质储存在4°C。 在注射的日子，该物质稀释到0. 6mg/ml，通过腹膜内注射对适当的动物组给药0. 5ml。给药 的最后剂量是0. 3mg IgG。对照CRL 1771 单克隆抗体(INH-M000029，LN JAA2E1337)利用蛋白质G亲和层析从无血清的杂交瘤培养基中纯化CRL 1771单克隆抗体 (IgG,亚型)。该物质的报道浓度是5. Omg/ml,内毒素浓度是0. 2EU/mg蛋白质。该物质储 存在4°C的冰箱中。在注射的日子，将该物质稀释到0. 6mg/ml，通过腹膜内注射给药0. 5ml。 给药的最后剂量是0. 3mg IgG。住所，食物，水和环境在接受后，检测所有动物，将动物组(5个/笼)放入有海绵垫的聚碳酸鞋盒型笼 子中。所有动物可以随意地吃(Harlan/TekladMouse Pelleted Diet#7012)，在12小时 光-暗循环下吸水。所有动物方面的护理呵需要的畜牧条件是根据实验室动物护理和使用
28的NIH指导的。鉴定和随机化在处理之前，通过尾纹各个鉴定所有的小鼠。在处理之前，单个称重小鼠，再评估 它们的健康。根据不同的体重将小鼠指派到各处理组。数据证明，比较非ClfA特异同型对照(CRL 1771)以及识别ClfA的特异的对照 (35-052)在独立于ClfA-纤维蛋白原结合的位点干扰ClfA-纤维蛋白原黏连的抗ClfA抗 体如12-9的治疗值。实施例η 比较同型对照(CRL 1771),金黄葡萄球菌识别12_9和35-052在3小时中收集金黄葡萄球菌样品(菌株Newman-WT，67_0，560Sal l，203Sal 2， 451Sal 4，206Sal 5，397Sal 6，49，189，203 and 4046)，过夜，洗涤，与浓度 2mg/ml 的 Mab 12-9，35-52或1771单独(对照)在用兔IgG(50mg/ml)封闭蛋白质A位点后温育。含有 Sal命名的金黄葡萄球菌菌株代表5个不同的系，达到65. 68%的所有临床分离物(Booth， et al. ,Infect. Immun. 69，345-353，2001)。并且，用和特异性对照相同的方式分析Newman ClfA: :emr (ClfA敲出)和Newman Spa: kan(蛋白质A敲出)。在用抗体温育后，将细 菌细胞与作为检测抗体的山羊_F(ab)2-抗-小鼠-F⑷2-FITC温育。在抗体标记后，通过 FACScaliber流动细胞计抽吸细菌细胞分析荧光发散(激发波长488，发散波长570)。对 于每个细菌菌株，收集10，000个事件，测定。表VI 金黄葡萄球菌菌株反应性 □指示阳性活性这一数据表现了选择抗ClfA抗体(如12-9)的重要性，即能够识别ClfA分子上 的功能表位，即纤维蛋白原的结合位点。另一系列的金黄葡萄球菌分离物，代表了 11个不同的克隆基因型复合物，经鉴定 与疾病的起因一样常见，是通过多座位序列同型派生的(Day，et al. 2001.金黄葡萄球菌天 然群体中的毒力和生态丰度之间的关联，Science，292 :114_116)。通过如上所述的流动细 胞计测试各个菌株的抗12-9的反应性。表VII. 12-9与金黄葡萄球菌分离物的反应性 这一反应性进一步证明了金黄葡萄球菌分离菌株的ClfA上的12-9表位的保守 性，表明ClfA-纤维蛋白原结合是功能性保守的。t施彻丨12 ^MM^m^mmmmmmm^m^ cifA杭体中的可夺区的同源 性根据抑制ClfA与纤维蛋白原的结合的能力选择抗ClfA抗体的出乎意料的结果是 在轻和重的可变链区的互补决定区(CDR)的氨基酸序列中的相似性。为此，在整个金黄葡 萄球菌细胞抑制纤维蛋白原包衣的平板的基础上选择抗ClfA抗体，其中利用了下面的方 法在实验缓冲液中将需要的抗体在4ug/ml开始系列稀释。同时，洗涤过夜培养的金黄葡 萄球菌(Newman spa: :kan)，用兔IgG封闭，然后用可渗透荧光DNA染色的Syto 13细胞染 色，温育10分钟。将等体积的染色细胞和稀释的抗体混合，在4°C温育30分钟，然后将各个 样品加到人纤维蛋白原包衣/封闭的微滴平板的复制的孔中。在4°C温育平板1小时，洗 涤，在每个孔中加入缓冲液，在荧光平板读数器中读数。克隆抗ClfA单克隆，12-9，13-2, 35-006和35-220以及CRL1771 (非特异对照)的 可变轻和重链，并且测序，以下面的方法派生预定的氨基酸序列用PB S洗涤含有10%的 FBS的DMEM-10培养基中培养的1. 4xl08杂交瘤细胞，离心沉淀，然后在含有蛋白质/Rnase 降解剂的去垢剂中溶解。通过在oligo-dT纤维素柱上亲和纯化分离PolyA+mRNA。对于各个 可变的重和可变的轻链，利用5mg的mRNA和在含有20pmol的3’寡聚核苷酸小鼠特异引物 (Novagen ； cat#69796and 69812)的 cDNA 合成试剂盒(Novagen ； cat#69001-3)中的逆转录 酶完成第一链cDNA的合成。利用PCR试剂系统(生命技术公司；cat#10198-018)和小鼠可变重和轻链特异引物系列(Novagen ；cat#70081_3，各5pmol)进行聚合酶链式反应(PCR) 30 个循环(开始94°C加热，然后94°C 1分钟，500C 1分钟和72°C 1分钟循环)扩增(5到50ng) 的cDNA部分。在乙酸钠缓冲液中的1 %的超纯琼脂糖凝胶中电泳分级分离PCR产物，用溴化 乙锭染色观察。从凝胶中切出与预定大小匹配的PCR片段，利用BIO lOlGeneclean旋转柱 (cat#1101-400)纯化，连接进pCR2. I-TOPO质粒(Invitrogen)。接着转化进感受态TOPlO 大肠杆菌(Invitrogen ;cat#K4500)。在利用 QIApr印 Spin Minipr印试剂盒(QIAGEN ； cat#27106)分离质粒DNA后，通过限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳鉴定含有插入片段 的阳性克隆，接着利用M13正向和M13反向引物，在ABI自动序列仪上测序。如图7所示，数据显示，在确定抑制金黄葡萄球菌与纤维蛋白原的结合的抗ClfA 单克隆的结合特异性的免疫球蛋白链的大多数可变部分中具有相当的保守性。在可变的条 件如制造ClfA抗原，在融合之前的免疫的方法呵序列下，从三个产生融合的不同的杂交瘤 (12，13和35)中发现了这一同源性。特定地，这一数据发现了在结合ClfA的单克隆抗体 的可变的重链的CDRl和CDR2中的同感的保守区，和本发明的抗体的可变的轻链的CDR1， CDR2和CDR3区中的保守区。所以，这一数据显示，含有保守区的抗体的制备应该具有相同 的结合特性，并且将是在本发明的范围内的。因此，根据本发明，利用与图8的同感区中相同的关键的CDR区的可变的情或重 链可以制备与ClfA结合的抗体。特定地，这些抗体将包括具有可变重链的那些，其中CDRl 区包括RYSVH和/或⑶R2区的序列，包括MIVGGGNTDYNSALKS序列，这些抗体也将包括具有 ⑶Rl区的可变的轻链，包括KSSQSVLYSSNQKNYLA序列，是应该包括序列WASTRES的⑶R2区 和/或包括⑶R3区，包括序列HQYLSSYT。t施例13 表汰人化12-9用干予页临床和临床用涂为了同时表达重和轻的免疫球蛋白多肽链，将两个基因克隆进一个质粒，各个基 因都在独立的hCMV-MIE启动子的控制下。这一双基因载体具有一个拷贝的GS可选择标记 (Lonza ；Slough, UK)，用于在一个转染事件中导入寄主细胞中。用Fugene_6 (Roche)，在制 造商建议的条件下转染细胞。测试上清液中短暂或稳定起源的细胞系，与小鼠的和嵌合起 源的12-9比较。这一实施例证明了，人化12-9可以人化，克隆呵在单个表达盒中表达，能够产生 支持商业规模的质量和纯度。序列表<110>约瑟夫· M ·帕蒂杰夫·Τ·哈钦斯保罗·多罗斯基普拉蒂斯科沙·帕特尔安德烈规·霍尔<120>针对CLFA蛋白质的单克隆抗体<130>P07069US04/BAS<140)10/056,052<141>2002-01-28<150)60/308,116
<151>2001-07-30<150)60/298,413<151>2001-06-18<150)60/274,611<151>2001-03-12<150)60/264,072<151>2001-01-26<160>29<170>Patent In version 3. 1<210>1〈211>1560<212>DNA〈213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〈400〉1agtgaaaataagtagcgttatcaaacactacaatcatcatacgacaacgagaattagtgagtaaattcac
actgaagcaagatgtagttagcagtagctgacagttggtaaattatggttcctaaagaatggagatcaagacagactatggaccctgaaaacagcaaaca
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34
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260265270
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<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)
<400>3
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<210>8
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Gly
Leu
80
Ala
Thr
<210>17
<211>336
<212>DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) <400>17
0711]gacattgtgatgacacagtcgccagactctctggctgtgtctctgggaga aagggtcact600712]atgaactgtaagtccagtcaaagtgttttatacagttcaaatcagaagaa ctacttggcc1200713]tggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatctactgggc atccactagg1800714]gaatctggtgtccctgatcgcttcagcggcagtggatctgggacagattt tactcttacc2400715]atcagcagtgtacaagctgaagacctggcagtttattactgtcatcaata cctctcctcg3000716]tacacgttcggaggggggaccaagctggaa336
<210>18
<211>112
<212>PRT
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) <400>18
Met Thr 5
Met
Asp 1
Glu
Ser
Ser
lie
Arg
Asn
Pro 50
Val Val
Thr 20
Lys Asn
Gln 35
Lys Leu Leu
Gln Asn Tyr lie
Ser Pro Asp
Cys Lys
Leu Ala
40 Tyr Trp 55
Ser
25
Trp
Ser 10 Ser
Gln
Tyr Gln Gln
Ala Ser Thr Arg 60
Leu Ala Val Ser Ser Val
Lys
45
Glu
Leu
30
Pro
Leu Gly 15
Tyr Ser
Gly Ser Gly
Gln Val0730]
0731]
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Pro Asp Arg 65
lie Ser Ser Tyr Leu Ser
Phe Ser Val
Ser 100
Gln
85
Tyr
Gly
70
Ala
Ser Glu Thr Phe
Gly Asp Gly
Ser
Leu
Gly 105
Gly Thr 75 Val
Ala
90
Gly
Asp Tyr Thr Lys
Phe Thr Leu Tyr Cys
Leu Glu 110
His
95
lie
Thr
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Gln
Lys
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<211>363
<212>DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) <400>19
0741]caggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtgaagccctcacagac cctgtccatc600742]acatgcaccatctctgggttctcattatccagatatagtgtacactgggt tcgccagcct1200743]ccaggaaagggtctggagtggctgggaatgatatggggtggtggaaacac agactataat1800744]tcagctctcaaatccagactgagcatcagcaaagacaactccaagaacca agttttctta2400745]aaaatgaacagtctgaccgccgctgacacagccgtgtattactgtgccag aaaaggggaa3000746]ttctactatggttacgacgggtttgtttactggggccaagggactctggt cactgtctct3600747]tcc363
<210>20
<211>121
<212>PRT
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) <400>20
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly 1510
Thr Leu Ser lie Thr Cys Thr lie Ser Gly
Ser Val
Leu Ser lie 20 Trp
Gly Met 50 Ser Arg 65
Lys Met
Val Trp Gly Leu Ser lie
His
35
lie
Arg Gln
Lys Gly
Asn Ser Gly
Cys
Arg
Gly
Ser
70
Thr
Thr 115
Glu 100
Leu
Leu 85
Phe Tyr Val Thr
Thr
Gln
Gly
55
Lys
Ala
Tyr
Val
Pro
40
Asn
Ser
25
Pro
Leu Val Lys Pro Ser Gln 15
Phe Ser Leu Ser Arg Tyr
Gly Asp
Thr AspA sn Ser Ala Asp
Lys Gly Tyr
Lys
75
Ala
Gly Tyr 105 Ser Ser 120
Thr 90
Asp Gly
Asn 60 Asn
Val
Phe
Leu
45
Ser
Ser
30
Glu
Trp Leu
Gln
Tyr Tyr
Val Tyr 110
Ala Leu Lys Val Phe
Cys
95
Trp
Leu
80
Ala
Gly0769]<210>21
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0771]<212>DNA
0772]<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
0773]<400>21
0774]aacattatgatgacacagtcgccatcatctctggctgtgtctgcaggaga aaaggtcact600775]atgagctgtaagtccagtcaaagtgttttatacagttcaaatcagaagaa ctacttggcc1200776]tggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatctactgggc atccactagg1800777]gaatctggtgtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagattt tactcttacc2400778]atcagcagtgtacaagctgaagacctggcagtttattgctgtcatcaata cctctcctcg3000779]tacacgttcggaggggggaccgagctggaa336
0780]
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<210>22
<211>112
<212>PRT
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus <400>22
Met Met Thr Gln Ser Pro Ser 5
Val Thr Met
Asn 1
Glu
Ser
Ser
Pro
65
lie
lie
Lys
Asn
Pro
50
Asp
Ser Tyr Leu
Gln
35
Lys
Arg
Ser
Ser
Thr 20 Lys
Leu
Phe
Val
Ser 100
Asn Leu Thr
Gln
Ser
Tyr
lie
Gly
70
Ala
Gln 85
Tyr Thr
Ser
Cys
Leu
Tyr
55
Ser
Glu
Phe
aureus) Leu
Ala
40
Trp
Gly
Asp
Gly
Ser
25
Trp
Ala
Ser
Leu
Gly 105
Ser 10 Ser
Tyr
Ser
Gly
Gln
Gln
Thr
Thr
75
Val
Ala 90
Gly Thr
Ala
Ser
Gln
Arg 60 Asp
Tyr
Glu
Val Ser Val
Lys
45
Glu
Phe
Cys
Leu
Leu
30
Pro
Ser
Thr
Cys
Glu 110
Ala
15
Tyr
Gly
Gly
Leu
His
95
lie
Gly
Ser
Gln
Val
Thr
80
Gln
Lys
<210>23
<211>345
<212>DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) <400>23
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag cctgtccatc acatgcactg tctctgggtt ctcattatcc agatatagtg tacactgggt tcgccagcct ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaagcac agactataat tcagctctca aatccagact gaacatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta
60 120 180 240
45
<212>PRT<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<400>27Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu151015Ala<210>28<211>7<212>PRT<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<400>28Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser15<210>29<211>8<212>PRT<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<400>29His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr15
4权利要求
一种单克隆抗体，其识别金黄葡萄球菌ClfA蛋白质A区，并结合单克隆抗体13 2识别的表位，单克隆抗体13 2具有氨基酸序列SEQ ID NO6的可变轻链和氨基酸序列SEQ IDNO8的可变重链。
2.一种单克隆抗体，其识别金黄葡萄球菌ClfA蛋白质A区，并结合单克隆抗体13-2识 别的表位，单克隆抗体13-2含有核酸序列SEQ ID NO :5编码的可变轻链序列或其简并物， 和核酸序列SEQ ID NO :7编码的可变重链或其简并物。
3.一种单克隆抗体，其识别金黄葡萄球菌ClfA蛋白质A区，并结合单克隆抗体12-9识 别的表位，单克隆抗体12-9具有氨基酸序列SEQ ID NO: 10的可变轻链和氨基酸序列SEQ IDNO 12的可变重链。
4.一种单克隆抗体，其识别金黄葡萄球菌ClfA蛋白质A区，并结合单克隆抗体12-9识 别的表位，单克隆抗体12-9含有核酸序列SEQ ID NO :9编码的可变轻链序列或其简并物， 和核酸序列SEQ ID NO :11编码的可变重链或其简并物。
5.根据权利要求1到4中任意一项所述的抗体，所述的抗体在人或动物中治疗或预防 金黄葡萄球菌感染。
6.根据权利要求1到4中任意一项所述的抗体，其中所述的抗体抑制葡萄球菌与纤维 蛋白原或纤维蛋白的结合。
7.根据权利要求1到4中任意一项所述的抗体，其中所述的抗体适于在人或动物中肠 胃外地，口服，鼻内，皮下，气雾化或静脉内给药。
8.根据权利要求1到4中任意一项所述的抗体，其中单克隆抗体是选自包括小鼠，嵌 合，人化和人单克隆抗体的类型。
9.根据权利要求8所述的抗体，其中人单克隆抗体是人单克隆抗体12-9，人单克隆抗 体12-9具有氨基酸序列为SEQ IDNO 18的可变轻链和氨基酸序列为SEQ ID NO 20的可变 重链。
10.根据权利要求8所述的抗体，其中人单克隆抗体是人单克隆抗体12-9，单克隆抗 体12-9含有核酸序列SEQ ID NO 17编码的可变轻链序列或其简并物，和核酸序列SEQ ID NO 19编码的可变重链或其简并物。
11.根据权利要求1到4中任意一项所述的抗体，其中抗体是单链单克隆抗体。
12.根据权利要求1到4中任意一项所述的抗体，是针对具有选自包括SEQID N0:2和 SEQ ID NO :4的组的氨基酸序列的蛋白质产生的。
13.根据权利要求12所述的抗体，其中蛋白质具有SEQID NO :1或SEQ ID N0:3或其 简并物的核酸序列编码的氨基酸序列。
14.一种分离的抗血清，其包括有权利要求1到4中任意一项所述的抗体。
15.一种诊断试剂盒，其特征在于包括有权利要求1到4中任意一项所述的抗体，以及 用该抗体检测结合的装置。
16.根据权利要求15所述的诊断试剂盒，其中所述的方法是检测结合，其中包括连接 所述抗体的可检测标记。
17.一种药物组合物，其用于治疗或预防金黄葡萄球菌感染，其包括有效量的权利要求 1到4中任意一项的抗体和药物可接受载体，或赋形剂。
18.一种制备权利要求1-4中任意一项的单克隆抗体的方法，包括产生针对分离蛋白质的杂交瘤并筛选所述杂交瘤对所述标为的反应力，其中所述分离蛋白质选择由金黄色葡 萄球菌Clf40、Clf33和ClfA N3所组成的组中。
19.具有结合氨基酸序列SEQID NO :2的能力的权利要求1-4中任意一项所述的分离 抗体。
20.具有结合由核酸序列SEQID NO :1或其简并物编码的氨基酸序列的能力的权利要 求1-4中任意一项所述的分离抗体。
21.根据权利要求1-4中任意一项所述的分离的抗体，进一步包括生理可接受抗生素。
22.根据权利要求3或4所述的抗体，其中可变重链具有包括序列RYSVH的⑶Rl区。
23.根据权利要求3或4所述的抗体，其中可变重链具有包括序列MIWGGGNTDYNSALKS 的CDR2区。
24.根据权利要求3或4所述的抗体，其中可变重链具有包括序列KSSQSVLYSSNQKNYLA 的CDRl区。
25.根据权利要求1-4中任意一项所述的抗体，其中可变轻链具有包括序列WASTRES的 CDR2 区。
26.根据权利要求3或4所述的抗体，其中可变轻链具有包括序列HQYLSSYT的⑶R2区。
27.根据权利要求1-4中任意一项所述的抗体，是与金黄葡萄球菌的多个菌株有交叉 反应的。
全文摘要
提供了可以用于治疗和预防葡萄球菌如金黄葡萄球菌的感染的可以结合ClfA蛋白质，并且是从金黄葡萄球菌的ClfA蛋白质的结合亚区或活性片段，包括来自它的纤维蛋白原结合区如Clf40蛋白质，Clf33蛋白质，或ClfA N3的活性片段蛋白质产生的单克隆抗体。另外，为了减少或消除变成感染或进一步传播感染的可能性，可以利用本发明的单克隆抗体处理医学仪器。特别是，本发明的抗体是具有优点的，因为通过损伤或抑制金黄葡萄球菌ClfA结合纤维蛋白原或纤维蛋白的能力，它们可以预防细菌与寄主细胞的黏附，所以可以用于治疗或预防葡萄球菌感染的方法中。
文档编号A61K9/72GK101928343SQ20091025022
公开日2010年12月29日 申请日期2002年1月28日 优先权日2001年1月26日
发明者保罗·多罗斯基, 安德烈娅·霍尔, 普拉蒂斯科沙·帕特尔, 杰夫·T·哈钦斯, 约瑟夫·M·帕蒂 申请人:英希比泰克斯公司