专利名称：：一种抑制嗜水气单胞菌的植物提取物组方的制作方法
技术领域：
：—种抑制嗜水气单胞菌的植物提取物组方，属于天然产物开发与利用
技术领域：
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背景技术：
：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是一种引起水产动物疾病的致病菌，具有广泛的致病性，是鱼类最常见的致病菌，对淡水鱼感染称为细菌性出血病，发病率达到90%以上，死亡率高达65%以上，往往给淡水养殖业造成惨重的经济损失，另外，此病流行非常广，曾在我国20多个省、市、自治区流行，受危害的鱼种类有异育银鲫、白鲫、鲫、团头鲂、鲢、鳙、鲮、鲤、鳜、黄鳝、草鱼、白鲳、加州鲈、银鲴、胡子鲶等多种淡水养殖鱼类。该病被认为是流行地区最广，流行季节最长，危害淡水鱼的种类最多，造成损失最大的一种传染病。目前，由嗜水气单胞菌引起的水产动物的疾病防治多采用抗生素和消毒液，但是，抗生素的滥用造成耐药性的增强，不仅给鱼病的治疗带来困难，对人体也造成巨大的危害。而植物提取物以其天然性、无残留、毒副作用小、不产生耐药性、价格低廉等优点，作为抗生素代替品以解决抗药性和药物残留问题倍受瞩目。因此，从植物资源库中开发更多有效抑菌植物以满足养殖业防病治病的需要是急需解决的项目之一。以往在中草药对嗜水气单胞菌的抑制活性研究中，较多采用单味中药的提取物进行抑菌试验，很少有复合组方的报道。由于单味药药效有限，而影响治疗效果。
发明内容本发明提供了一种抑制嗜水气单胞菌的植物提取物组方，属于天然产物开发与利用
技术领域：
。组方包括五倍子提取物(50%-80%)，茶多酚(10%-30%)，大黄提取物(5%-15%)。利用本发明制备的植物提取物复合组方，由纯天然的植物提取物组合而成，具有抑菌效果显著、无药物残留、不污染水体环境等特点，为由嗜水气单胞菌引起的水产动物疾病提供新的预防和治疗方法，可作为中药制剂和饲料添加剂。本发明植物提取物组方由下列成分组成(重量百分比)五倍子提取物(50%-80%)茶多酚(10%_30%)大黄提取物(5%-15%)本发明的技术方案提供抑制嗜水气单胞菌的植物提取物组方，包括如下步骤1材料1.1供试菌株嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila,TPS-30)由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心惠赠。1.2培养基普通肉汤培养基牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂20g，液体培养基不加琼脂。1.3供试植物样品茶多酚(陆圣康源科技开发有限公司)、五倍子、大黄、黄芩、诃子、金银花、穿心莲、紫锥菊、牛蒡叶、苦参、大蒜。31.4仪器800型离心机(北京医学仪器厂)；SW-CJ-2F超净工作台(苏州净化设备厂)；电子天平(SartoriusCo，Germany);PW_30精密培养箱；UV_2100分光光度仪(尤尼柯(上海)仪器有限公司)。2方法2.l提取物的制备用60%_80%的乙醇，70-801:加热回流提取2-311，反复3次，5(TC旋转蒸发，浓縮后真空干燥得粉剂。将制备的醇提物用30%的乙醇配成0.5mg/ml的浓度，置4t:冰箱中保存待用。2.2菌悬液的制备将菌株融化，用接种针在固体培养基上划线，37t:培养24h后，挑取单个菌落，接种到液体培养基上震荡培养1216h。采用麦氏比浊法将菌液用液体培养基稀释到合适浓度，本实验中菌液浓度为106CFU/mL。2.3抑菌圈测定滤纸片(6mm)经灭菌后，分别浸入提取物，无菌条件下贴在涂有菌液的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，并做空白对照，37t:培养24h后测抑菌圈直径(尽可能地使纸片的含药量一致)，每种提取物8次重复。抑菌圈^20mm，极敏，15-19mm，高敏，10_14mm，中敏，10mm以下，低敏。2.4二倍稀释法用二倍稀释法测定各提取物的最低抑菌浓度(MinimumlnhibitoryConcentration,MIC)。采用二倍稀释法对药液进行梯度稀释，最后一管不加提取物作空白对照，然后加入细菌悬液，37t:培养30h。625nm测定吸光值，无菌生长的试管中的药物浓度即为该药物的最小抑菌浓度(MIC)，每组3个重复。从各种药物的MIC和高于MIC浓度的各试管中，吸取50iU培养基，转接种于固体培养基上，37t:培养2d后，观察有无菌落形成，无菌落形成的相应试管中的药物浓度，即为该种药物对该菌株的最小杀菌浓度(Minimumbactericidalconcentration,MBC)，每组3个重复；2.5正交t值法优化组合复方及剂量配比选用抑菌效果佳的提取物，利用正交t值法，以最小抑菌浓度为检测指标，进行组方和剂量优化，实验分三步。第一步，正交t值法优化组方原则将筛选出来的提取物其中每种为一个因素，每种提取物均有给药和不给药两个水平，设水平1为给药，水平2为不给药(见表1)。试验按正交t值法L12(211)主药分析表进行试验安排(见表2)，，各组通过二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，每组3个重复。数据越小，抑菌效果越好。表1复方植物提取物因素水平表(mg)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表2应用正交t值法进行主药分析的各组配方的设计因素ABCDEFGHI了K67891011111111111111A-FA-GD-KC-KB-KA-K211122222211ABCABC了KCJKBCJKABCJK311221212122ABEABEGEGIEGIBEGIABEGI组412212112212ADFADFGDFGJDFGJDFGJADFGJ512221121221AEFEFEFHKEFHKEFHKAEF服612112221122ACDACDDHICDHICDHIACDHI721122111222BCBCFGFGHCFGHBGHCFBCFGH别821212122121BDFBDFDFIKDFIKBDFIKBDFIK921211221212BDEBDEDEHJDEHJBDEHJBDEHJ102211121222—1CDECDEGDEGKCDEGKCDEGKCDEGK1122121122112CEFCEFEFIJCEFIJCEFIJCEFIJ1222222211111—GGHIJKGHIJKCHIJKGHIJK第二步，辅药交互作用的正交t值法用正交表着重分析辅药彼此间的交互作用，以最小抑菌浓度(MIC)为检测指标，每组3个重复。第三步，正交t值法优化剂量配比各因素确定后，采用正交表进行剂量选择，以原用剂量为中剂量，适当增减，以最小抑菌浓度(MIC)为检测指标，每组3个重复。3结果3.1滤纸方法(琼脂扩散法)ll种植物醇提取物对嗜水气单胞菌的抑菌圈测定结果(表3)表明，在O.5g/ml的浓度下，茶多酚、五倍子抑菌作用最明显，分别属于极敏和高敏药物，大黄、黄岑、诃子提取物次之，属于中敏药物，其余提取物没有抑菌效果。故选用有抑菌效果的提取物进行最小抑菌浓度和最小杀菌浓度实验，来做进一步验证。表311种醇提取物对嗜水气单胞菌的抑菌圈(直径/mm)提取物抑菌圈直径提取物抑菌圈直径茶多酚reapo/yp/ze"o/20.63±0.52大蒜gar"c无效五倍子Gc〃aC7w'"mn's17.75±0.73苦参Soptora无效人黄14.17±0.41牛蒡叶bwctocA/ee无效黄吝Scw/e〃arZa12.67±0.82金银花//o/jepwcAr/e无效诃子rewn'Mfl/Zac/je&w/a12.05±0.82紫锥菊五cA/wice"无效穿心莲^"t/ragrapto/朋/cw/a/a无效3.2二倍稀释法不同提取方法对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定结果(见表4)表明，五倍子、茶多酚的提取物抑菌作用明显，大黄、黄芩、诃子提取物次之，与抑菌圈测定结果相符。表4醇提取物对嗜水气单胞菌的MIC和MBC的测定(mg/ml)醇提物MIC醇提物MBC茶多酚7fe(3/o/;;/7/eno/0.390茶多酚reapo脉A6wo/0.780五倍子Ga〃aC7n'"e"sZs0.097五倍子Ga〃aC7j/"emv's0.195大黄朋m6ot"60,780大黄朋mW61.560黄,5fc她〃(3r/(31.560黄吝Sc她〃a"'a3.125诃子rerm!."(3"ac/ie6"/a1.560诃子renni'加/i'ac/je6w/a3.1253.3正交t值法优化复合组方和剂量配比3.3.1正交t值法优化复合组方复合组方的正交t值法L12(211)的组方原则(见表5)显示，B五倍子提取物有明显的抑菌效果，故为主药。茶多酚、诃子、大黄、黄芩提取物为辅药。本方抗菌作用最佳组合为AACAEJ茶多酚，五倍子)。表5主药分析表各组方最小抑菌浓度结果(Pg/ml)组别ABCDEMIC(n=3)均数ss21111113393393393390021112214314314314300311212234234234234004122214174174174170051221152052052052000612122625312312416.7180.7132656721121m11711711700821221156156156156009212121561561561560010221128258258258250011221115205201040693300901321222222〕45]Ml344.95190.8422.28461.16373.67n=3Mml=365.22>2=122788M2389.4574.34296.6249.94354.94Se=Q>2/n)-1/2=202.3D44.45383.54-125.06-211.96-20.47t=|D|/Sef=G(n-l)=ll(3-1)=22t0.221.890.621.050.09ta05=1.958+2.45/(f-l)=2.07P-----to.01=2.58+4.8/(f-l)=2.81注数值越小，作用越强。1水平用药；2水平不用。Ml:用某药各组的指标测定值的均数；M2:未用某药各组的指标测定值的均数。D=M2-M1。63.3.2辅药交互作用的正交t值法辅药交互作用抑菌结果见表6，表中显示茶多酚、大黄(AB);大黄、黄吝(BC);大黄、诃子(BD)三组组合有协同作用，茶多酚、黄芩(AC);茶多酚、诃子(AD);黄芩、诃子(CD)有拮抗作用。因为B药和任一种药都有协同作用，故选用B药。表6辅药交互作用分析表各组方最小抑菌浓度结果(Pg/ml)A茶多酚B大黄C黄芩D诃子FactorsA7fe"po/yp力ewo/B尺/wZ^;^C^cw^〃(3n'"D7b7w/wa//ac力eZw/a<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注数值越小，作用越强。l水平用药，2水平不用。AB、BC及BD间有协同作用([l1]均小于[12]和[21]，以'表示协同)，AC、AD、CD有拈抗作用([ll]均大于[12]或，以"表示拈抗)。3.3.3正交t值法优化剂量配比剂量优化见表7，表中显示五倍子为主药，茶多酚和大黄为辅药。最佳组合为aac2，即提取物间最佳剂量配比为五倍子茶多酚大黄=(50%-80%):(10%-30%):(5%-15%)(w/w/w)，该优化组在正交表中9组组合之内，最小抑菌浓度为78ug/ml，抑菌效果优于任何单因素水平。表7剂量优化分析表各组方最小抑菌浓度结果(Pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>73132939393930083213939318612453.692882.62933219797979700Ml406297343n=3Mm=l12.782>2=8647.86M2295404331Se=(2>2/n)-1/2=53.69M3314314341G=9L=3f=G(n-l)=9(3-1)=18S59.3757.56.43t=(L)"/2xSa/Set1.921.850.207t005=1.73+2.66/(f-l)=1.88P*--t0(n=2.147+4.88/(f-l)=2.43注:数值越小，作用越强。1水平用药；2水平不用。*P<0.05。具体实施例方式以下给出实施例，对本发明作进一步说明。实施例1抑菌活性的测定(1)取五倍子提取物(50%-80%)、茶多酚(10%-30%)、大黄提取物(5%-15%)混合，以嗜水气单胞菌为供试菌种，分别采用滤纸片法和二倍稀释法测定该组方的抑菌效果，每个实验三个重复。抑菌效果抑菌圈直径为26.42mm，最小抑菌浓度为78ug，最小杀菌浓度为156ug。实施例2预防性给药试验在80cmX60cmX50cm的水族箱内进行，每天换水1/3，水温25。C左右。试验鱼为鲫鱼，体重50g，暂养水族箱中7d，认定为健康鱼后开始试验。饵料中添加0.5%-1%的复合提取物饲喂，饲养20d后开始攻毒试验。试验分别设置注射嗜水气单胞菌给药、不给药注射嗜水气单胞菌阳性对照组以及不给药不注射嗜水气单胞菌阴性对照组，每个试验组各放养鲤鱼20条。观察1周，统计各组的死亡率。每组三个重复。注射嗜水气单胞菌几小时后，部分试验鱼体色开始变黑，之后陆续有鱼死亡，死鱼呈典型的淡水养殖鱼类出血性败血症症状局部损伤、坏死、腹部膨胀、腹腔内有淡黄色或红色腹水，眼眶出血，内脏、肠红肿，脾、肾变黑。预防结果试验鱼阳性对照组死亡率为55.00%，给药的试验组死亡率为5.00%。实施例3治疗性给药试验在80cmX60cmX50cm的水族箱内进行，每天换水1/3，水温25。C左右。试验鱼为鲫鱼，体重50g，暂养水族箱中7d，认定为健康鱼后开始试验。攻毒试验分别设置注射嗜水气单胞菌给药、不给药注射嗜水气单胞菌阳性对照组以及不给药不注射嗜水气单胞菌阴性对照组，每个试验组各放养鲤鱼20条。攻毒后用饵料中添加0.5%-1%的复合提取物饲喂，观察l周，统各组的死亡率。每组三个重复。注射嗜水气单胞菌几小时后，部分试验鱼体色开始变黑，之后陆续有鱼死亡，死鱼呈典型的淡水养殖鱼类出血性败血症症状局部损伤、坏死、腹部膨胀、腹腔内有淡黄色或红色腹水，眼眶出血，内脏、肠红肿、脾、肾变黑。治疗结果试验鱼阳性对照组死亡率为60.00%，给药的试验组死亡率为10.00%。权利要求一种抑制嗜水气单胞菌的植物提取物组方，其特征在于它主要含有下列重量比的植物提取物为原料，配剂而成方五倍子提取物(50％-80％)，茶多酚(10％-30％)，大黄提取物(5％-15％)。提取物的制备包括以下步骤用60％-80％的乙醇，70-80℃加热回流提取2-3h，反复3次，50℃旋转蒸发，浓缩后真空干燥得粉剂。2.如权利要求1所述，其特征是植物提取物组方可用于预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的水产动物的疾病。3.如权利要求1所述，其特征是植物提取物组方可用于饲料添加剂，可用作淡水鱼、淡水虾类、淡水蟹和养殖蛙的饲料添加剂。4.如权利要求l所述，其特征是植物提取物组方还可以添加任何附加剂如粘合剂、防腐剂、湿润剂、稀释剂、活性剂等中的一种或多种或它们的某种组合。5.如权利要求1所述，其特征是植物提取物组方可作为饲料添加剂，所述的载体可为麦麸、淀粉、石粉等中的一种或多种或它们的某种组合。6.如权利要求1所述，其特征是植物提取物组方其剂型可以为注射剂、颗粒剂、散剂、粉剂、喷雾剂、溶液剂、固体剂等适合药用的各种剂型。全文摘要本发明提供了一种抑制嗜水气单胞菌的植物提取物组方，属于天然产物开发与利用
技术领域：
。组方包括五倍子提取物(50％-80％)，茶多酚(10％-30％)，大黄提取物(5％-15％)。利用本发明制备的植物提取物复合组方，由纯天然的植物提取物组合而成，具有抑菌效果显著、无药物残留、不污染水体环境等特点，为由嗜水气单胞菌引起的水产动物疾病提供新的预防和治疗方法，可作为中药制剂和饲料添加剂。文档编号A61K9/08GK101721489SQ20091026484公开日2010年6月9日申请日期2009年12月24日优先权日2009年12月24日发明者卢春霞,吕文平,王洪新申请人:江南大学