专利名称：海藻酸盐/ε-聚赖氨酸/海藻酸盐生物微胶囊的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物微胶囊，特别是涉及一种海藻酸盐/ ε -聚赖氨酸/海藻酸盐生物 微胶囊的制备方法。
背景技术：
20世纪60年代，Chang报道了半透膜微胶囊，指出用其包埋蛋白质、酶等生物活 性物质和细胞，可保持生物物质活性[Chang TMS. Semipermeablemicrocapsules, Science, 1964，146 =524-525]。20世纪80年代初，Lim和Sun针对组织/细胞功能缺损性疾病 (如糖尿病)，成功制备了海藻酸钠/α-聚赖氨酸(alginate/α-polylysine)半透膜微 胶囊(简称α-APA微胶囊)，包封Wistar大鼠胰岛细胞并移植入糖尿病WistarLewis 大鼠体内，分泌释放胰岛素以调控血糖量[Lim F，Sun A M. Microencapsulated islets bioartificialendocrine pancreas, Science，1980，210 :908-910]。由此推动了微囊化 技术相关材料和制备方法研究的快速发展，在细胞移植、药物释放和基因治疗等生物医学 领域的临床前研究中得到广泛应用[Wang W, Liu XD, Ma XJ, et al. Microencapsulation using natural polysaccharides for drug delivery and cell implantation, J. Mater. Chem.，2006，16 :3252-3267]。在众多的生物微胶囊中，海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊使用较 多，其微胶囊膜材料为化学法合成α-聚赖氨酸(赖氨酸残基之间的酰胺键是由α-氨基 和α-羧基缩合而成)，但由于α-聚赖氨酸价格昂贵(300_400US$/g)，加之材料固有的生 物相容性差，具有一定毒性，这极大地限制了海藻酸钠/ α -聚赖氨酸微胶囊在临床上的应 用[Strand B L，Ryan TL, Veld P I，et al. Cell Transplant.，2001，10 :263-275]。1977 年日本学者Siima和&ikai经发酵白色链霉菌制备出一种由多个赖氨酸残基同型单体组 成的聚合物，酰胺键是通过α-羧基和ε-氨基连接而成，故称为ε -聚赖氨酸(ε-PLL) [Shoji shima.，Polylysineproduced by Streptomyces. Agric Biol Chem.，1977,41 1807-1809]。作为一种天然微生物代谢产品，其成本低，环境友好，在体内可分解为赖氨酸 而被完全被消化吸收，没有任何毒副作用[Hiraki J，Ichikawa T，Ninomiya S，et al. Use of ADME studies to confirm the safety of epsilon-polylysine as ^preservative in food. Regulatory Toxicology and Pharmacology，2003，37 :328-340]，在 2004 年已 通过美国FDA认证(CAS登记号为28211-04-3)。ε -聚赖氨酸在聚合度η为25 35， 相对分子量在3. 5KDa 4. 5KDa具有较高抑菌活性，目前广泛用于食品防腐剂、乳化剂， 医药工业的药物载体、抗癌增强剂以及生物芯片包埋剂等领域[Shih IL, Shen MH, Van YT. Microbialsynthesis of poly (epsilon-1ysine)and its various applications, BioresourceTechnology. 2006,97 :1148-1159]，而聚合度 η 大于 35，分子量大于 5KDa 的 ε -聚赖氨酸具有高分子的特性，分子链中存在大量伯氨基，在溶液中氨基质子化，带有大 量正电荷成为阳离子聚合物，可与聚阴离子海藻酸钠在静电作用下形成海藻酸钠/ ε -聚 赖氨酸复合物。用ε-聚赖氨酸替代α-聚赖氨酸制备蛋白质、酶等生物活性物质和细胞 的微胶囊，用于细胞移植、细胞培养、药物释放等在生物医学领域仍属空白。
发明内容
针对上述问题，本发明提出将微生物发酵合成的聚赖氨酸替代化学合成的 α-聚赖氨酸用于生物微胶囊的制备，达到α -聚赖氨酸生物微胶囊的同等性能。海藻酸盐/ ε -聚赖氨酸/海藻酸盐生物微胶囊(ε -APA微胶囊)的制备方法包 括将包埋有细胞/蛋白质/酶/核酸等生物质的海藻酸盐凝胶微球与高聚合多价阳离 子态的ε -聚赖氨酸(ε -PLL)溶液反应，在海藻酸盐凝胶微球表面，通过静电络合反应形 成ε -聚赖氨酸微胶囊膜，再用低浓度海藻酸盐溶液中和微胶囊表面正电荷，最后用有机 金属螯合剂液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，制备成具有免疫隔离性能、药物控释性能的 ε -APA微胶囊，可用于细胞移植、细胞培养或药物释放等生物医学领域。ε -APA微胶囊制备的具体步骤包括1)制备包埋有细胞/蛋白质/酶/核酸等生物质的海藻酸盐凝胶微球(简称A微 胶囊)；2)将步骤1)中的A微胶囊浸入ε -聚赖氨酸(ε _PLL)溶液中，将ε _聚赖氨酸 用于海藻酸盐胶囊的缓释的包被膜，A微胶囊与ε-PLL溶液体积比范围为1 5 1 40， 反应1-20分钟，反应温度在4-37°C，此时得到ε -APA微胶囊取出用生理盐水洗涤；3)将步骤幻中的ε -AP微胶囊浸入碱金属海藻酸盐溶液中，碱金属海藻酸盐阴离 子与ε-AP微囊膜表面残余未反应的氨基阳离子反应完全，ε-AP微胶囊与碱金属海藻酸 盐溶液体积比范围为1 5 1 40，反应1-20分钟，反应温度在4-37°C，此时得到ε-APA 微胶囊，取出用生理盐水洗涤；4)将步骤幻中的ε -APA微胶囊浸入有机金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的 海藻酸盐凝胶，ε-APA微胶囊与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1 5 1 20，反应 1-20分钟，反应温度在4-37°C，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的ε -APA微胶囊。2、其中，用于成膜反应的ε-聚赖氨酸为微生物发酵合成的，高聚合多价阳离子 均聚物，分子量分布为5KDa lOOKDa，酰胺键是通过α -羧基和ε -氨基连接而成，其结构
式为
权利要求
1.海藻酸盐/ε -聚赖氨酸/海藻酸盐生物微胶囊制备，其特征在于将包埋有生物质 的海藻酸盐凝胶微球与高聚合多价阳离子态的ε -聚赖氨酸溶液反应，在海藻酸盐凝胶微 球表面，通过静电络合反应形成ε -聚赖氨酸微胶囊膜，再用低浓度海藻酸盐溶液中和微 胶囊表面正电荷，最后用有机金属螯合剂液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，制备成具有免 疫隔离性能、药物控释性能的ε-APA微胶囊。
2.按照权利要求1所述的制备，其特征在于 ε -APA微胶囊制备的具体步骤包括1)制备包埋有生物质的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；2)将步骤1)中的A微胶囊浸入ε-聚赖氨酸溶液中，将ε-聚赖氨酸用于海藻酸盐 胶囊的缓释的包被膜，A微胶囊与ε-PLL溶液体积比范围为1 5 1 40，反应1_20分 钟，反应温度在4_37°C，此时得到ε -AP微胶囊取出用生理盐水洗涤；3)将步骤幻中的ε-AP微胶囊浸入碱金属海藻酸盐溶液中，碱金属海藻酸盐阴离子 与ε -AP微囊膜表面残余未反应的氨基阳离子反应完全，ε -AP微胶囊与碱金属海藻酸盐 溶液体积比范围为1 5 1 40，反应1-20分钟，反应温度在4-37°C，此时得到ε-APA 微胶囊，取出用生理盐水洗涤；4)将步骤幻中的ε-APA微胶囊浸入有机金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的海藻 酸盐凝胶，ε-APA微胶囊与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1 5 1 20，反应1_20 分钟，反应温度在4_37°C，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的ε -APA微胶囊。
3.按照权利要求1所述的制备，其特征在于用于成膜反应的ε_聚赖氨酸为微生物 发酵合成的，高聚合多价阳离子均聚物，分子量分布为5KDa lOOKDa，酰胺键是通过α -羧 基和ε -氨基连接而成，其结构式为
4.按照权利要求1所述的制备，其特征在于制备的包埋有生物质的海藻酸盐凝胶微 球为二价金属钙、钡或锌的海藻酸盐水凝胶。
5.按照权利要求1所述的制备，其特征在于用于中和表面电荷的碱金属海藻酸盐为 钾盐或钠盐，分子量分布为IOOKDa 500KDa，海藻酸盐溶液的配制方法是海藻酸盐溶于 0. 1-0. 9% (w/v)NaCl 溶液中，海藻酸盐浓度为 0. 01-0. 5% (w/v)。
6.按照权利要求1所述的制备，其特征在于参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为 55mmol/L 的柠檬酸钠或 100mmol/L 的 EDTA。
7.按照权利要求1所述的制备，其特征在于所述生物质为细胞、蛋白质、酶或核酸。
8.按照权利要求1所述的制备，其特征在于该方法制备的ε-APA微胶囊可以作为细胞的固定化载体或蛋白/酶/核酸等生物药物的控释载体。
全文摘要
本发明涉及生物微胶囊，特别是涉及一种海藻酸盐/ε-聚赖氨酸/海藻酸盐生物微胶囊(ε-APA微胶囊)的制备方法。高聚合多价阳离子态的ε-聚赖氨酸，可与带有阴离子的物质有强的静电作用力，基于这一特性，将ε-聚赖氨酸用作微囊膜材料，在海藻酸盐微胶囊外做成缓释性能的包被膜，来改变生物微胶囊的通透性、免疫隔离性，将ε-APA微胶囊用于细胞移植、细胞培养、药物释放等生物医学领域。
文档编号A61K47/34GK102101037SQ20091026545
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月18日
发明者于炜婷, 张英, 朱静, 马小军 申请人:中国科学院大连化学物理研究所