专利名称：抗cd147抗体、方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗⑶147抗体和它们作为治疗剂的用途。相关领域CD147为免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，其在各种组织中的大量不同细胞上表达。它最初命名为人Basigin (对基础免疫球蛋白超家族的命名)，并在约1991年首次克隆。(Miyauchi 等人，《生物化学杂志》(J Biochem)(东京)110 :770_774(1991) ；Kanekura 等人，《细胞结构和功能》(Cell. Struct Funct) 16 =23-30(1991) ；Miyauchi等人，生物化学杂志(J Biochem)(东京)110 :770_774 (1991))。bsg 基因产物 CD147，也称为 EMMPRIN(“细胞外基质金属蛋白酶诱导因子”)同种型II (NCBI登录号NP_940991)，为长度为269个氨基酸的多肽原(SEQ ID NO :1，图1)，其具有长度为22或24个氨基酸的信号肽，183个氨基酸的胞外域，从第208位残基至第228位残基的跨膜域，以及从第229位残基至第269位残基的胞内域。根据经过审核的NCBI记录，胞外域(EOT)由两个免疫球蛋白样结构域组成从第22位残基至第103位残基的C2型结构域和从第105位残基至第199位残基的V样结构域(图1)。还报道了多个剪接变体。CD147为功能多样的分子，其在胎儿发育、视网膜功能以及T细胞成熟中起作用。已显示它为亲环素的细胞表面受体。它表达于组织重构的区域中肿瘤、子宫内膜、 胎盘、皮肤和血管生成区域(参见Iacono等人，2007年，《实验与分子病理学》(Exp Mol. Path) 83 283-295)，并且刺激基质金属蛋白酶(MMP)和VEGF的生成。CD147在单核细胞分化时诱导并且表达于人动脉粥样硬化斑块中(Major TC,Liang L、Lu X,Rosebury W、Bocan ΤΜ，2002年，《动脉硬化，血栓形成与血管生物学》(ArteriosclerThromb Vasc Biol.) 22: 1200-1207)。已显示，⑶147通过诱导MMP，并且通过癌周间质细胞旁的尿激酶型纤溶酶原激活系统，促进不同肿瘤类型的侵袭和转移。CD147还涉及血管生成、抗失巢凋亡、乳酸外排、多药耐药性以及癌细胞中的细胞增殖。CD147过量表达和/或功能与其他病理过程，例如炎症反应、肺纤维化、类风湿性关节炎、红斑狼疮、心力衰竭、阿尔茨海默病以及淋巴细胞中的人类免疫缺陷病毒和冠状病毒的侵染循环有关。(参见Ruiz等人，J.《生物化学》(Biol. Chem.)，第 283 (9)卷，5554-5566，2008)。此外，CD147 的裂解和 CD147 片段的脱落可能涉及⑶147活性片段的调节或释放(Egawa等人，2006，《生物化学》(J Biol Chem)281(49) 37576-85)。抗CD147抗体已有报道。鼠抗体IgM Mab, CBLl (Billings等人，《杂交瘤》 (Hybridoma) 1 :303_311，1982 ；美国专利 No. 5330896 和 5643740)在耐类固醇的急性移植物抗宿主病中进行了检测(Heslop等人，《柳叶刀》(The Lancet) 346 :805_806 ；Deeg等人，2001《血液》(Blood) 98 :2052_8)。还开发了在ECD的跨膜域附近结合到与CBLl (aka ABX-CBL)的表位重叠的表位的类似人Mab (US2007048305A1)。(Koch等人 (InternatImmunol 11 (5) 777-786，1999)绘出了与T细胞和B细胞激活相关的CD147表位的图谱，公布按照CD147制备的一组抗体中只有最高亲和力的单克隆抗体(MEM-M6/6)能通过MAB抗⑶3、0KT3而有效阻止人T-细胞激活和增殖。已证实肿瘤细胞衍生的人⑶147、 EIIF4 的小鼠抗体(Ellis，1989《癌症研究》(Cancer Res) 49 :3385_91 ；Biswas 等人，Cancer Research 55，434-439，1995)能够阻断来自人成纤维细胞的肺癌CD147诱导的胶原酶(基质金属蛋白酶-1或MMP-1)活性。在制备缺失N端Ig结构域的突变型E⑶时，显示出EIIF4 抗体与CD147的结合丧失(Biswas, C.等人，《癌症研究》(Cancer Res) 55，434-439，1995)。 Ku等人(Scan J Immunol 65 (5) 435-443，2007)鉴别了描述为CD147相关的MMP轴抑制剂的MAB，并且通过使用截短的⑶147序列鉴别了⑶147 MMP诱导活性相关的N端关键残基 (22A 至 50V)。因此，虽然⑶147的特定抗体和其他拮抗剂是已知的，但包括两个免疫球蛋白结构域的所述蛋白的复杂性如何影响各种生物活性还未彻底阐明。对于治疗与在各种组织上的CD147展示和/或激活相关的各种疾病而言，结构域特异性拮抗剂可能证实为有用的治疗候选剂。例如，能阻断CD147诱导MMP或VEGF活性产生的治疗剂在癌症治疗中可能是有利的。因此，需要提供向人CD147提供具有特异性的人抗体，以在治疗中使用来减轻或消除CD147依赖性疾病的症状，以及获得优于已知抗体或其片段的改善。
发明内容
本发明提供能够阻断与CD147相关的一个或多个生物活性相关的活性的抗 ⑶147单克隆抗体，所述活性包括但不限于血管生成、VEGF的产生、基质金属蛋白酶的产生 (MMP-1、MMP-2和MMP-9)，并且所述抗体在人CD147上具有特异性结合位点。本发明的一个方面为与人CD147蛋白反应分离的抗体，所述人CD147蛋白具有单克隆抗体的抗原结合能力，所述单克隆抗体具有如在SEQ IDNO :9、11、13和15中所示的轻链互补决定区(CDR)的氨基酸序列，和如在SEQ ID NO :10、12、14和16中所示的重链⑶R 的氨基酸序列。本发明的另一个方面为与CD147蛋白表位反应的分离的抗体，CD147蛋白表位位于SEQ ID NO 1表示的CD147蛋白第65-75位残基。本发明的另一个方面为具有重链CDRl、CDR2和CDR3 (Hc-CDRl、Hc_CDR2禾口 Hc-CDR3)氨基酸序列以及轻链CDR3 (Lc_CDR3)的分离的抗体，所述氨基酸序列分别选自以 SEQ ID NO :10、12和14示出的序列，所述轻链⑶R3如化学式(I)所示Gln Gln Xaa1 Tyr Ser Xaa2 Pro Xaa3 Thr(I)其中 Xaa1 为 Tyr 或 Asp ；Xaa2 为 Tyr 或 Ser ；Xaa3 为 Phe 或 Tyr或无；以及Xaa4为Thr或Phe ；以及轻链CDRl (Lc-CDRl)和轻链CDR2 (Lc_CDR2)氨基酸序列，所述序列分别选自SEQ ID NO :9和11中所示的序列本发明的另一个方面为分离的抗体，其具有Hc-CDRl、Hc-CDR2和Hc-CDR3的以SEQ ID NO 10示出的氨基酸序列，以及以SEQ ID NO 9所示的Lc-CDRl、Lc_CDR2和Lc_CDR3氨基酸序列分离的抗体。本发明的另一个方面为具有以SEQ ID NO :12显示的Hc-CDRl、Hc-CDR2和HC-CDR3 氨基酸序列以及以SEQ ID NO 11显示的Lc-⑶Rl、Lc-⑶R2和Lc-⑶R3氨基酸序列的分离抗体。本发明的另一个方面为具有以SEQ ID NO :14显示的Hc-CDRl、Hc-CDR2和Hc-CDR3 氨基酸序列以及以SEQ ID NO 13显示的具有Lc-CDRl、Lc_CDR2和Lc _CDR3氨基酸序列的分离的抗体。本发明的另一个方面为具有以SEQ ID NO :16显示的Hc-CDRl、Hc-CDR2和Hc-CDR3 氨基酸序列以及以SEQ ID NO 15显示的Lc-⑶Rl、Lc-⑶R2和Lc-⑶R3氨基酸序列的分离的抗体。本发明的另一个方面为编码本发明的抗体的分离的多核苷酸。在另一方面，本发明涉及这样的抗体其与抗体4A5和5F6限定的共同表位结合， 和/或其与抗体4A5或5F6竞争来结合到CD147，或其具有由抗体4A5和5F6显示的其他功能结合特性，例如避免在SEQ ID NO :1表示的第65-74位残基处发生D2交换)。此类抗体包括例如那些与抗体4A5或5F6竞争，并以解离常数(Kd) 10_7M或更小，例如10_8M或更小、 ICT9M或更小、IO-kiM或更小或甚至更低(例如IiT11M或更小))与⑶147结合的抗体。本发明提供特异性结合域，所述特异性结合域衍生自示例性抗体序列，所述抗体序列能够与本文所定义的结合到人CD147，并且阻断与CD147相关的一个或多个生物活性相关的活性，所述活性包括但不限于血管生成、VEGF产生和基质金属蛋白酶产生(MMP-1、 MMP-2和/或MMP-9产生)。特异性结合域为那些指定为可变区和CDR残基的结构域，其在 SEQ ID N0:9-16中指定。本发明还包括衍生自SEQ ID NO :9_16的抗体，例如人源化或重构抗体或抗体结合域，所述抗体或抗体结合域保留了以KD为ICT7M或更小的亲和力免疫特异性结合到人⑶147的能力，并与抗体2H3、4A5、5F6竞争结合到⑶147，并阻断⑶147的生物活性。因此，本发明的一个方面涉及人源化抗体，其包含人源化重链和人源化轻链，其中(1)人源化重链可变区包含三个来自小鼠2H3、4A5、5F6或2C8重链的互补决定区 (CDR)和来自人受体抗体重链的骨架，可任选地具有一个或多个人骨架残基取代；以及(2)人源化轻链可变区包含三个来自小鼠2H3、4A5、5F6或2C8轻链的互补决定区和来自人受体抗体轻链的骨架，所述骨架可任选地具有一个或多个人骨架残基取代；以及人源化抗体特异性结合到人⑶147。在另一个实施例中，人源化抗体可由一个或多个⑶R组成，所述⑶R进一步通过取代或缺失一个或多个残基进行工程化改造，例如与2H3、4A5、5F6或2C8的一个或多个⑶R 的相似性达到90%、95%、98%或99. 5%的那些CDR。另一个实施例涉及通过向需要此治疗的受试者施用治疗有效量或预防有效量的本发明的一种抗体或本发明的抗体的混合物，来治疗或预防与CD147生物活性相关的病理症状。在另一个实施例中，提供抗原表位作为疫苗的组分。上述的表位包含SEQ ID NO 1表示的第65-74位残基或仍可被本发明的抗体识别的这些残基的保守性变化，这些表位可用于主动免疫宿主，以激发抗⑶147抗体的产生，该抗⑶147抗体能抗争或预防与⑶147 生物活性相关的病理症状。
图1示出 了人CD147同种型2的结构域图谱和以单字母氨基酸代码表示的前肽序列。图2为示出了⑶147 E⑶和如FC构造的亚结构域(N结构域为第19-117位残基， C结构域为第95-204位残基)在NHLF中以浓度依赖方式刺激MMP-I产生的相对活性的曲线图。图3为示出了⑶147 E⑶和如FC构造的亚结构域(N结构域为第19-117位残基， C结构域为第95-204位残基)在NHLF中以浓度依赖方式刺激VEGF产生的相对活性的曲线图。图4示出了 Akt-v，即Akt依赖性信号通路抑制剂对用来刺激㈧VEGF或⑶MMP-1 分泌的⑶147E⑶或亚结构域Fc构造的影响。图5示出了与MDA-MB-231活细胞㈧结合但不与NHLF活细胞⑶结合的鼠抗体 (10μ g/ml mlgGl)的柱状图。图6为示出了所选的纯化鼠抗体(mlgGl)阻断NHLF中⑶147 (⑶147)刺激的MMP-I 产生的相对能力的曲线图。图7示出了表明所选鼠抗体(mlgGl)阻断人肿瘤和人成纤维细胞共培养物中 MMP-2和MMP-9产生的相对能力的酶谱。图8为显示通过重组抗⑶147抗体2H3 (mIgG2a)和5F6 (hlgGl)减毒的人肿瘤和人成纤维细胞共培养物中MMP-2释放的酶谱。图9 为示出了抗 CD147 抗体 2H3 (mIgG2a)和 5F6 (hlgGl)抑制来自 NHLF 的 CD147 诱导的VEGF的柱状图。图10为示出了在用PANC-I (人胰腺肿瘤细胞)移植的基质栓中第8天血红蛋白 (Hb)含量的柱状图，所述PANC-I得自在第1天和第4天接受10mg/kg Mab腹腔注射后的裸
鼠°图11示出了在接受效应子阳性同种型(E+)的重组抗⑶147抗体2H3 (mIgG2a)和 5F6 (hlgGl)或PBS的小鼠中肿瘤体积随时间的变化。图12示出了与4A5(顶部)或5F6 (底部)结合区络合的Aspl9-Asnll7构造的简化H/D交换图。图 13 以 ELISA 法示出了 2H3 Mab 与 4A5 或 5F6 竞争结合 Aspl9-Glul92_Fc 构造的竞争性结合分析的曲线图。序列表简述
权利要求
1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其竞争结合到CD147上的表位，所述 CD147上的表位被选自2H3、4A5和5F6的单克隆抗体结合，所述2H3、4A5和5F6具有SEQ ID NO :9、11和13中的一个表示的轻链互补决定区(OTR)的氨基酸序列和SEQ ID NO :10、 12和14中的一个表示的重链⑶R的氨基酸序列。
2.一种分离的抗体，其包含重链CDRUCDR2和CDR3 (Hc-CDRl、Hc_CDR2和Hc_CDR3)氨基酸序列和轻链⑶R3 (Lc-⑶R3)，所述氨基酸序列分别选自以SEQ ID N0:10、12和14示出的序列，所述轻链CDR3如化学式(I)中所示Gln Gln Xaa1 Tyr Ser Xaa2 Pro Xaa3 Thr (I)其中 Xaa1 为 Tyr 或 Asp ；Xaa2 为 Tyr 或 Ser ；Xaa3 为 Phe 或 Tyr 或无；以及 Xaa4 为 Thr 或Phe;以及轻链CDRl (Lc-CDRl)和轻链CDR2 (Lc_CDR2)氨基酸序列，所述序列分别选自 SEQ ID NO :9和11中所示的序列。
3.一种分离的抗体，其具有SEQ ID NO: 10所示的Hc-⑶Rl氨基酸序列、Hc-⑶R2氨基酸序列和Hc-⑶R3氨基酸序列以及SEQ ID NO 9所示的Lc-⑶Rl氨基酸序列、Lc-⑶R2氨基酸序列和Lc-⑶R3氨基酸序列。
4.一种分离的抗体，其具有SEQ ID NO: 12所示的Hc-⑶Rl氨基酸序列、Hc-⑶R2氨基酸序列和Hc-⑶R3氨基酸序列以及SEQ ID NO 11所示的Lc-⑶Rl氨基酸序列、Lc-⑶R2氨基酸序列和Lc-⑶R3氨基酸序列。
5.一种分离的抗体，其具有SEQ ID NO: 14所示的Hc-⑶Rl氨基酸序列、Hc-⑶R2氨基酸序列和Hc-CDR3氨基酸序列以及SEQ ID NO :13所示的Lc-CDRl氨基酸序列、Lc_CDR2氨基酸序列和Lc-⑶R3氨基酸序列。
6.一种分离的抗体，其具有SEQ ID NO: 16所示的Hc-⑶Rl氨基酸序列、Hc-⑶R2氨基酸序列和Hc-CDR3氨基酸序列以及SEQ ID NO :15所示的Lc-CDRl氨基酸序列、Lc_CDR2氨基酸序列和Lc-⑶R3氨基酸序列。
7.一种分离的重组抗CD147抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含人恒定区，其中所述抗体或抗原结合片段(i)具有与4A5Mab相同的表位特异性，所述表位特异性如在CD147 上通过H/D交换来确定，包括SEQ ID N0:11和12，以及(ii)以至少1 X ICT7M的Kd与人 ⑶147的所述表位结合。
8.一种人源化抗体，其包含人源化重链和人源化轻链，其中a)所述人源化重链可变区包含来自所述小鼠4A5重链(SEQID N0 12)的三个互补决定区(CDR)和来自人受体抗体重链的骨架，以及b)所述人源化轻链可变区包含来自所述小鼠4A5轻链(SEQID NO=Il)的三个互补决定区和来自人受体抗体轻链的骨架；以及c)其中所述人源化抗体特异性地结合到MDA-MB-231细胞表面上的CD147抗原。
9.根据权利要求1-8中任何一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与人⑶147的所述结合抑制人⑶147的病理活性。
10.一种抑制肿瘤生长的方法，其包括使肿瘤与有效量的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分接触，所述单克隆抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO :1表示的第64-75位氨基酸的表位结合，并且所述单克隆抗体或其抗原结合部分在存在人MDA-MB-231细胞的情况下抑制从人成纤维细胞中产生MMP-2。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述肿瘤选自结肠癌、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、 鳞状上皮细胞癌和肺癌。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分被全身施用。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体被位点特异性地施用。
14.一种抑制血管生成的方法，其包括使组织与有效量的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分接触，所述单克隆抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO:l(DALPGQKTEF) 表示的第64-75位氨基酸的表位结合，并且所述单克隆抗体或其抗原结合部分在存在人 MDA-MB-231细胞的情况下抑制从人成纤维细胞产生MMP-2。
15.一种免疫易感染与病理CD147生物活性相关的病症的受试者的方法，所述方法包括施用包含SEQ ID NO :1 (DALPGQKTEF)表示的第64-75位残基的多肽。
16.一种制品，其包含药用制剂，所述药用制剂包含权利要求1-8中任一项所述的抗体。
全文摘要
本发明提供对人CD147具有免疫特异性的抗体，所述抗体能够阻断与恶性疾病相关的CD147的生物活性，所述生物活性为例如通过肿瘤细胞对来自成纤维细胞的MMP的刺激、VEGF的释放以及血管生成的促进。本发明的抗体可用于治疗恶性疾病以及CD147活性发挥致病作用的那些疾病，例如眼、肺和心血管系统的疾病。
文档编号A61K39/395GK102316898SQ200980139278
公开日2012年1月11日 申请日期2009年8月19日 优先权日2008年9月29日
发明者B·斯温基-昂德伍德, L·颜, M·R·坎宁安, Y·唐 申请人:森托科尔奥索生物科技公司