使用金属卟啉治疗丙型肝炎感染的制作方法

专利名称：使用金属卟啉治疗丙型肝炎感染的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗丙型肝炎感染的方法和制剂。
背景技术：
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的肝的血源性传染病。HCV是包括肝硬化和肝癌在内的急性肝炎和慢性肝疾病的主要原因。据估计丙型肝炎在全世界感染了超过1 亿8千万人，在美国感染了 4百万人。在美国丙型肝炎是肝移植的主要原因，每年在美国约 10，000 20，000例死亡归因于HCV感染。HCV是正链RNA病毒，长度为约9. 6kb,并且是黄病毒科(Flaviviridae)中丙型肝炎病毒属的唯一已知成员。HCV编码具有约3010个氨基酸的单个多聚蛋白，该多聚蛋白然后被加工成结构蛋白(C、E1、E2)和非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。所述非结构病毒蛋白启动负链RNA的合成，该负链RNA充当产生新正链病毒基因组的复制模板。 非结构蛋白5A(NS5A)是HCV蛋白的重要成分，是447个氨基酸的磷酸化锌_金属蛋白，具有极为未知的功能。最近的研究表明，NS5A在HCV的复制中起着重要作用，既通过调节病毒RNA复制直接起作用，也通过调节宿主细胞环境以有利于病毒而间接起作用，并且也在 JFHl感染细胞中的丙型肝炎病毒颗粒的组装方面起重要作用。治疗HCV感染的最常见形式是聚乙二醇化干扰素α和抗病毒药三氮唑核苷的组合。治疗期取决于基因型，通常进行M周或48周。治疗的适应症包括罹患经证实的丙型肝炎病毒感染和持续的肝功能测试异常的患者。但是，该治疗在多达46%的受治疗人中不能产生持续的病毒学响应。该治疗还具有从“流感样”综合征到严重的不利事件等令人不快的副作用，所述不利事件包括贫血、心血管事件和诸如自杀或自杀意图等精神病问题。基于聚乙二醇化干扰素α和三氮唑核苷的组合的当前治疗还较昂贵，对于发展中国家的患者通常代价过高。因此，仍然存在对用于治疗HCV感染的新型治疗方法的需要。

发明内容
本发明通过提供经由减少受感染细胞中NS5A细胞的水平来治疗罹患HCV感染的细胞或哺乳动物的方法和制剂，而满足了至少某些上述需要。根据本发明，NS5A蛋白水平的减少通过使用金属卟啉治疗丙型肝炎感染而实现。特别地，本发明基于以下发现NS5A蛋白通过参与多聚蛋白切割、干扰素响应和细胞信号传导途径在HCVRNA复制中起关键作用。 已经发现，诸如锌卟啉等金属卟啉在泛素-蛋白酶体降解途径中诱导HCV NS5A蛋白的翻译后下调。即，金属卟啉可用于激活NS5A蛋白分解代谢的泛素-蛋白酶体途径。结果，金属卟啉可用于在受HCV感染的细胞中显著抑制HCV病毒复制。本发明中，已经发现金属卟啉通过将NS5A蛋白的半衰期从约19. 8小时降低到约 1. 2小时而减少NS5A蛋白的稳定性，并且显著地诱导NS5A的多泛素化。结果，可以显著地减少HCV RNA复制。泛素( )最初被鉴定为真核细胞中的高度保守的小蛋白，由76个氨基酸组成，预测分子量为8. 5kD。已经普遍接受泛素-蛋白酶体降解途径在诸如细胞周期、DNA 修复、胚胎发生、转录的调节以及凋亡等许多细胞过程中是重要的调节系统。在泛素-蛋白酶体途径中，蛋白质底物首先通过与多个泛素分子形成共价键(多泛素化)而被标记以用于降解，然后被26S蛋白酶体(一种2000kDa的ATP-依赖性蛋白水解复合物)水解。因此， 对NS5A蛋白进行多泛素化诱导可以引起HCV RNA复制的减少。还已经发现，金属卟啉可用于在稳定表达HCV蛋白的人类肝细胞瘤细胞中以剂量-依赖性方式下调NS5A蛋白水平。在优选实施方式中，治疗HCV感染的方法包括使用诸如锌中卟啉(ZnMP)或锌原卟啉等锌卟啉治疗受感染细胞。已经发现，ZnMP和SiPP都诱导NS5A的多泛素化并且展示抗病毒活性。已经发现锌卟啉对于治疗HCV感染特别有用，因为其通常易于被完整肝细胞吸收。在一个实施方式中，本发明还涉及用于治疗HCV感染的制剂。在一个具体实施方式
中，本发明提供了包含锌卟啉和白蛋白的制剂。当作为白蛋白复合物施用时，锌卟啉是无毒的，并且优先被肝和脾吸收。在另一实施方式中，已经发现可将金属卟啉与其它抗病毒治疗方法组合使用，从而提供累加效应或协同效应。例如，本发明的制剂可以包括金属卟啉与一种或多种诸如 α -干扰素、β -干扰素和/或Y -干扰素等干扰素的组合。因此，本发明提供用于治疗HCV感染的方法和制剂。


在如上一般性描述本发明后，现在将进一步参照附图，所述附图不一定按比例绘制，并且其中图IA描述了显示在9-13细胞中各种浓度的锌中卟啉对NS5A的影响的蛋白质印迹和附带的条形图；图IB描述了显示在Conl细胞中各种浓度的锌中卟啉对NS5A的影响的蛋白质印迹和附带的条形图；图IC描述了显示在CNS3细胞中各种浓度的锌中卟啉对核心蛋白水平的影响的蛋白质印迹和附带的条形图；图ID描述了显示在被ρΠ -Conl/GND转染的Huh_7/T7细胞中各种浓度的锌中卟啉对NS5A和核心蛋白水平的影响的蛋白质印迹和附带的条形图；图2A描述了显示与DMSO、中卟啉和氯化锌相比，锌中卟啉对NS5A蛋白水平的影响的蛋白质印迹和附带的条形图；图2B描述了显示与锡中卟啉相比，锌中卟啉对NS5A蛋白水平的影响的蛋白质印迹和附带的条形图；图3描述了显示锌螯合剂N，N, N, N-四吡啶基甲基)乙二胺(TEPN)对NS5A 蛋白水平的影响的蛋白质印迹和附带的条形图4A描述了在环己酰亚胺[CHX]( 一种蛋白合成抑制剂)的存在下，锌中卟啉对 NS5A蛋白水平的影响的蛋白质印迹，从而确定在经锌中卟啉处理的肝细胞中NS5A蛋白的大致半衰期；图4B描述了显示在框图A中条带的强度的条形图；图4C是说明锌中卟啉对NS5A蛋白半衰期的影响的图示；图5A是显示在用ZnMP和不同浓度的环氧酶素(印oxomicin)或MG132处理的9_13 细胞中NS5A蛋白水平所受影响的蛋白质印迹；图5B是显示在用ZnMP和不同浓度的环氧酶素或MG132处理的9_13细胞中NS5A 蛋白水平所受影响的标准化条形图；图5C是显示在不存在ZnMP时在用环氧酶素或MG132处理的9_13细胞中NS5A蛋白水平所受影响的蛋白质印迹；图6A说明了描述在ZnMP处理之后且在免疫沉淀(IP)之前NS5A的降解，显示了 NS5A被^MP下调；图6B说明了描述与对照相比的ZnMP处理后NS5A多泛素化的免疫沉淀和免疫印迹(出)分析；图6C说明了描述在框图B中NS5A蛋白被免疫沉淀的免疫印迹(出)分析；图7A是描述在Conl细胞中ZnMP对HCV RNA的剂量效应的条形图；图7B描述了显示在Con 1细胞中锌中卟啉对HCV蛋白水平的影响的蛋白质印迹和附带的条形图；图7C描述了显示在被pra-Conl/GND转染的Huh_7/T7细胞中各种浓度的锌中卟啉对NS5A和核心蛋白水平的影响的蛋白质印迹和附带的条形图；图7D描述了显示在被pra-Conl/⑶D转染的Huh_7/T7细胞中各种浓度的锌中卟啉对NS5A和核心蛋白水平的影响的蛋白质印迹和附带的条形图；图8A描述了显示在基于JFHl的细胞培养系统中处理4小时后ZnMP对NS5A和核心蛋白水平的影响的蛋白印迹分析；图8B描述了显示在基于JFHl的细胞培养系统中处理4小时后ZnMP对NS5A和核心蛋白水平的影响的条形图；图8C描述了显示在基于JFHl的细胞培养系统中处理M小时后ZnMP对NS5A和核心蛋白水平的影响的蛋白印迹分析；图8D描述了显示在基于JFHl的细胞培养系统中处理M小时后ZnMP对NS5A和核心蛋白水平的影响的条形图；图8E是描述在被J6/JFH1RNA转染的Huh-7. 5细胞中ZnMP对HCV RNA复制的影响的条形图；图8F是描述在被J6/JFH1HCV感染的Huh-7. 5细胞中ZnMP对HCV RNA复制的影响的条形图；图9A描述了显示在9-13细胞中α干扰素对NS5A蛋白水平的影响的蛋白质印迹和附带的条形图；图9Β描述了显示在9-13细胞中锌中卟啉对NS5A蛋白水平的影响的蛋白质印迹和附带的条形图9C描述了显示在9-13细胞中α干扰素和锌中卟啉对NS5A蛋白水平的组合效应的蛋白质印迹和附带的条形图；和图10是描述ZnMP对细胞毒性的剂量和时间进程效应。
具体实施例方式在下文中将参照附图更全面地描述本发明，其中显示了本发明的某些但不是全部的实施方式。事实上，这些发明可以以许多不同的形式体现，并且不应该视为限制于本文提出的实施方式；相反，提供了这些实施方式来使得本公开满足适用的法定要求。全文中相似的数字表示相似的要素。本发明涉及使用金属卟啉治疗丙型肝炎病毒感染的方法。在一种实施方式中，本发明涉及治疗被HCV感染的细胞的方法，特别是涉及使用金属卟啉治疗患者中的丙型肝炎病毒感染的方法。本发明的实施方式还涉及用于治疗丙型肝炎病毒感染的包含金属卟啉的药物制剂。在优选实施方式中，本发明涉及使用锌卟啉治疗丙型肝炎病毒感染的方法。本发明的发明人发现，金属卟啉可用于通过抑制HCV复制来治疗HCV感染。NS5A 通过参与多聚蛋白切割、干扰素响应和细胞信号传导途径而在HCV的复制中起关键作用。 本发明中，据信通过使用金属卟啉控制宿主细胞中HCV NS5A蛋白的量而减少HCV复制。虽然不希望受理论限制，据信金属卟啉通过介导NS5A蛋白的泛素-蛋白酶体降解途径而抑制 HCV感染细胞中的HCV病毒复制。结果，感染细胞中NS5A蛋白的量可以得到显著减少，由此减少HCV RNA复制。本发明中，已经发现金属卟啉通过将NS5A蛋白的半衰期从约19. 8小时降低到约 1. 2小时而减少NS5A蛋白的稳定性，并且显著地诱导NS5A的多泛素化。结果，可以显著地减少HCV RNA复制。泛素( )最初被鉴定为真核细胞中的高度保守的小蛋白，由76个氨基酸组成，预测分子量为8. 5kD。已经普遍接受泛素-蛋白酶体降解途径在诸如细胞周期、DNA 修复、胚胎发生、转录的调节以及凋亡等许多细胞过程中是重要的调节系统。在泛素-蛋白酶体途径中，蛋白质底物首先通过与多个泛素分子形成共价键(多泛素化)而被标记以用于降解，然后被26S蛋白酶体(一种2000kDaATP-依赖性蛋白水解复合物)水解。因此，对 NS5A蛋白进行多泛素化诱导可以引起HCV RNA复制的减少。还已经发现，锌卟啉可用于在稳定表达HCV蛋白的人类肝细胞瘤细胞中以剂量-依赖性方式下调NS5A蛋白水平。在一种实施方式中，将NS5A蛋白的半衰期减少到约0. 5小时 3小时，优选将其减少到约0. 8小时 1. 5小时，更优选减少到约1小时 1. 2小时。如上所述，NS5A蛋白半衰期的减少对HCV的复制能力具有显著影响。金属卟啉是大环化合物，分别具有连接吡咯的一个碳原子或一个氮原子的桥，从而形成其中金属离子插入到四吡咯环的特征性四吡咯环结构。卟啉结构还可以包括与其连接的各种配体和部分。合适的金属的实例可以包括，但不限于Fe、Co、Zn、Mn、Cr、Ni、Mg和 Cu。在优选实施方式中，用于本发明的金属卟啉选自由锌中卟啉、锌原卟啉、亚铁血红素和钴原卟啉或其组合组成的组。其它可用于本发明的金属卟啉的有机金属衍生物包括例如， 锌次卟啉、双乙二醇锌次卟啉(zinc deuteroporphyrinbisglycol)、钴原卟啉、钴中卟啉、 钴次卟啉、双乙二醇钴次卟啉、亚铁血红素、铁中卟啉、铁次卟啉和双乙二醇铁次卟啉。本发明提供通过对有需要的患者施用治疗有效量和/或预防量的含有金属卟啉或其药学可接受盐的制剂而治疗和/或缓解HCV感染的方法。“治疗有效量”是指对哺乳动物施用的活性成分(例如，金属卟啉或其药学可接受盐)的量对于治疗和/或缓解HCV感染是有效的。在优选实施方式中，本发明涉及治疗和/或缓解人类患者中的HCV感染的方法。在一种实施方式中，本发明的金属卟啉制剂的剂型(组合物)可以含有每单位约 0. 1 20mg/kg体重/天的活性成分，特别是每单位约10 80毫克活性成分，例如每单位约 14 75毫克、20 70毫克、35 65毫克、40 50毫克或约40 45毫克活性成分。在一种实施方式中，单位剂量的金属卟啉通常含有约5mg lOOOmg，优选含有约30mg 500mg， 特别是 5011^、10011^、15011^、20011^、25011^、30011^、35011^、40011^、45011^或 50011^。在一种实施方式中，含有金属卟啉的制剂可以每天施用1次或多次，例如每天2 次、3次或4次，对于70kg成体的总剂量通常为IOOmg 3000mg。作为另一种选择，单位剂量可以含有2mg 20mg金属卟啉，并且如果需要，可以多次施用，从而给予前述每天剂量。在这些药物组合物中，基于制剂的总重量，通常活性成分的存在量为0. 5重量％ -95重量％。根据各种实施方式，可以以包括经肠和静脉内在内的各种方式对有需要的患者施用本发明的制剂。例如，可以以液体、固体、凝胶或其组合的形式制备本发明的制剂。在优选实施方式中，以诸如片剂或胶囊剂等固体剂型提供本发明的制剂。为了在治疗HCV感染中使用，作为通用指南，金属卟啉的每日口服剂量通常为约 0. lmg/kg 体重 1000mg/kg 体重。例如，对于以片剂或胶囊剂形式的口服施用，可以将活性成分与口服的、非毒性的、药学可接受的惰性载剂组合，所述载剂包括但不限于乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇和山梨醇等。另外，当需要或必要时，也可以向混合物中引入合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、诸如葡萄糖或β -乳糖等天然糖、玉米甜味剂、诸如阿拉伯树胶、黄芪胶或藻酸钠等天然和合成胶、羧甲基纤维素、聚乙二醇和蜡等。用于这些剂型中的润滑剂可以包括油酸钠、硬脂酸钠、 硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠等。崩解剂包括，但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土和黄原胶等。在一种实施方式中，以其中金属卟啉与人血清白蛋白以约10 1 1 1摩尔比结合的制剂形式施用金属卟啉。人血清白蛋白的使用有助于增强金属卟啉到肝细胞中的吸收。另外，当作为白蛋白复合物施用时，该制剂是无毒的，并且优先被肝和脾吸收。在某些实施方式中，含有本发明的金属卟啉的制剂还可以与作为可靶向药物的载剂的可溶性聚合物偶联。合适的聚合物可包括例如，聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚(polyhydroxyethylaspartamid印henol) 或取代有棕榈酰残基的聚环氧乙烷-聚赖氨酸。在一种实施方式中，本发明的制剂可以与一类用于实现药物控释的生物可降解聚合物偶联，所述生物可降解聚合物例如聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯、和水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。在本发明的某些实施方式中，本发明的金属卟啉和/或其组合物可用于与至少一种其它治疗剂进行组合治疗。本发明的化合物和/或其组合物以及所述治疗剂可以累加性作用，或更优选的是协同性作用。本发明的化合物和/或其组合物可以与其它治疗剂的施用一起同时施用，或者可以在其它治疗剂施用之前或之后施用。在一种实施方式中，本发明的化合物和/或其组合物可用于与其它抗病毒剂或其它已知可有效治疗或预防HCV的疗法进行组合治疗。作为具体实例，本发明提供了通过施用本发明的金属卟啉化合物和/或其组合物而治疗HCV感染的方法，所述金属卟啉化合物和/或其组合物可以与诸如干扰素-α、三氮唑核苷(参见，例如美国专利第4，530，901 号)、特拉匹韦(Telaprevir)、HCV蛋白酶和聚合酶抑制剂等已知的抗病毒药组合使用。在另一具体实例中，本发明的化合物和/或其组合物可以与诸如α-干扰素、 干扰素和/或Y-干扰素组合使用。所述干扰素可以是未修饰的，或者可以用诸如聚
乙二醇等部分进行修饰(聚乙二醇化干扰素)。许多合适的未聚乙二醇化干扰素和聚乙二醇化干扰素可以商购获得，并且包括例如但不限于诸如购自Schering Corporation, KeniIworth, N. J.的Intron-A干扰素等重组干扰素α -2b ；诸如购自Hoffmann-La Roche, Nut ley, N. J.的Roferon干扰素等重组干扰素α -2a ；诸如购自Boehringer IngelheimPharmaceutical, Inc. , Ridgefield, Conn.的 Berofor α 2 干扰素等重组干扰素 α -2C ；诸如购自 Sumitomo，日本的 Sumiferon 或购自 Glaxo-Wellcome Ltd.，伦敦，英国的Wellferon干扰素α _nl (1赂)等干扰素α-nl (天然α干扰素的纯化共混物)；或者诸如美国专利第4，897，471号和第4，695，623号(特别是其实施例7、8或9)中所述的复合 α 干扰素禾P购自 Three Rivers Pharmaceuticals, Cranberry Township, PA 的特定产品等复合α干扰素；或者由hterferon kiences制造并购自Purdue Frederick Co.，Norwalk, Conn.的商品名为Alferon等干扰素α-n3 (天然α干扰素的混合物)；购自 ScheringCorporation，Kenilworth，N. J.的商品名为 PEGHntron A 的聚乙二醇化干扰素_2b ；和购自Hoffmann-LaRoche，Nutley, N. J.的商品名为Pegasys的聚乙二醇化干扰素 _2a。在一个具体实施方式
中，本发明提供用于治疗HCV感染的药物制剂，所述药物制剂包含金属卟啉和干扰素的组合。在一种实施方式中，所述制剂包含每单位约0. lmg/kg体重 20mg/kg体重的金属卟啉，和每单位约0. 5mcg/kg体重 5mcg/kg体重的干扰素。以下实例仅为了说明目的提供，不应该认为其以任何方式限制本发明。实施例以下是用于在治疗HCV感染中对金属卟啉的使用进行评价的试剂和方法的简单描述。试剂和抗体锌中卟啉(ZnMP)购自Frontier Scientific (Logan，UT)。锌原卟啉(ZnPP)购自Frontier Scientif ic (Logan, UT)。锡中卟啉(SnMP)购自Frontier Scientif ic (Logan, UT)。二甲亚砜(DMSO)购自 Fisher Biotech (Fair Lawn, NJ)。鼠抗 HCV NS5A 单克隆抗体购自 Virogen (Watertown，ΜΑ)。兔抗HCV NS5A 多克隆抗体购自 Virogen (ffatertown, MA)。鼠抗HCV 核心单克隆抗体购自 Affinity BioReagent (Golden, CO.)。羊抗人GAPDH 多克隆抗体购自 Santa Cruz (Santa Cruz, CA)。ECL-Plus 购自 Amersham(Piscataway, NJ)。
环氧酶素和MG132 购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。BCA 蛋白检测试剂购自 Pierce (Rockford, IL)。达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle' s medium,DMEM) 和胎牛血清(FBS)购自 HyClone (Logan, UT)。TRIzol 和博莱霉素(zeocin)购自 Invitrogen (Carlsl^ad，CA)。G418 购自 Gibco (Grand Island, NY)。CellTiter-Glo 试剂购自 Promega (Madison，WI)。弓L由 Integrated DNA Technologies (Coralville, ΙΑ)4% 15%梯度SDS-PAGE凝胶和 ImmunBlot PVDF膜购自 Bio-Rad(Hercules，CA)。细胞培养细胞系9-13、CNS3 和 Huh_7/T7 由 Ralf. Bartenschlager 博士(海德堡大学，海德堡，德国)提供。含有复制性HCV非结构区的9-13细胞，稳定地表达HCV NS3 NS5B。CNS3 细胞稳定地表达HCV核心 NS3 (Conl分离物的第1 1233个氨基酸残基；Gene Bank登录号AJ238799)。Huh_7/T7细胞组成型地表达噬菌体T7RNA聚合酶。将所述细胞保持在补充有10 % (体积/体积)FBS和500 μ g/mL G418 (对于9_13细胞)、10 μ g/mL博莱霉素(对于 CNS3细胞)或5 μ g/mL博莱霉素(对于Huh_7/T7细胞)的DMEM中。Conl (亚型lb)全长复制子 Huh-7.5 细胞(Conl 细胞)由 Dr. Charles Μ. Rice (The Rockefeller University, New York, NY)提供。Conl细胞系是含有全长HCV基因型Ib复制子的Huh_7. 5细胞群，所述HCV基因型Ib复制子在多肽的第2204位氨基酸处具有高度适应性的丝氨酸到异亮氨酸的取代。将Conl细胞保持在补充有10% (体积/体积)FBS和0. ImM非必需氨基酸、100 单位/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素以及选择抗生素750 μ g/mL G418的DMEM中。蛋白质印迹使用如Hou等，Zinc mesoporphyrin induces rapid and marked degradation of thetranscription factor Bachl and up—regulates H0—1 (#中口卜导^figIfBachl 的快速显著降解并上调H0-1)，Biochim Biophys Acta 2008 ；1779 :195-203中所述的本实验室的标准策略进行蛋白质印迹。简言之，在4% 15%梯度SDS-PAGE凝胶上分离总蛋白 (3Ομβ 5Ομ0。电泳转移到ImmunBlot PVDF膜上之后，在含有5 %脱脂奶粉和0. 1 % Tween-20的PBS中将膜封闭1小时，然后在4°C与一抗一起温育过夜。如下进行一抗的稀释对于抗HCV NS5A和抗GAPDH抗体稀释1 2000，对于抗HCV核心抗体稀释1 5000。 然后将该膜与辣根过氧化物酶缀合的二抗(稀释为1 10，000) —起温育1小时。最后， 根据制造商策略使用ECL-Plus化学发光系统使结合的抗体可视化。使用Kodak 1DV3. 6的基于计算机的成像系统(Rochester，NY)来测定蛋白质印迹后获得的各特定条带的相对光密度。将数据表达为对照(对应于使用载体-处理的细胞获得的值)的百分比，将对照赋值为1。pH(-Conl/⑶D 或 pFK-Conl/GND 的转染pH(-Conl/⑶D 和 pFK-Conl/GND 构建体由 R. Bartenschlager 博士(海德堡大学， 海德堡，德国)馈赠。ρΠ -Conl/GND构建体是pra-Conl/⑶D的复制缺陷性变体，具有单个氨基取代，该取代将NS5B聚合酶活性位点的GDD基序改变为GND。按照以下方法所述进行 pra-Conl/⑶D或pra-Conl/GND的转染。简言之，在转染前一天将稳定表达T7RNA聚合酶的Huh_7/T7细胞接种在M孔板中，并使其生长至高达80%汇合度。根据制造商说明利用 Lipofectamine 禾口 Plus Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)使用 0. 8 μ g/ 孑L的 pFK-Conl/ GDD或pFK-Conl/GND将细胞转染48小时。体外转录、HCV RNA转染和感染HCV 感染性克隆体 pJ6/JFHl 由 C.Rice 博士(the Rockefeller University, NewYork, NY)提供。如Lindenbach等所述，使用来自感染性J6 (基因型2a)的核心-NS2基因区和来自感染性JFHl (基因型2a)的NS3-NS5B基因区构建全长嵌合基因组。为了产生HCV J6/JFH1 RNA,使用^CbaI使pJ6/JFHl质粒线性化，并通过乙醇沉淀、利用蛋白酶K消化和苯酚-氯仿提取进行纯化。将该线性化质粒用作使用MEGAscriptT7试剂盒(Ambion，Austin， TX)进行体外转录的模板。对于HCV RNA转染，在转染前一天在将Huh-7. 5细胞平板接种至 M孔板中，并在70% 80%汇合度时对其进行转染。通过使用2 μ g/孔的HCV RNA和如L/ 孑L的 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)以 1 2 的 RNA/lipofectamine 比将细胞转染48小时。对于HCV感染，收集来自用HCV RNA转染48小时的细胞的细胞培养上清液，使其过滤通过0. 20 μ m过滤器，并在M孔板中感染天然Huh-7. 5细胞72小时。免疫沉淀(IP)根据制造商策略进行免疫沉淀。简言之，在冷的放射免疫沉淀检测(RIPA)缓冲液 (50mM Tris-HCl[pH 7.4]、150mM NaClUmM EDTA、0. 25%脱氧胆酸钠、IGEPALCA-630、 ImM PMSFUmM NaFUmM Na3VO4以及抑肽酶、亮抑酶肽和胃酶抑素各1 μ g/ml)中收获细胞。 在4°C使用蛋白A/G琼脂糖对样品预净化10分钟，随后在温和旋转的同时在4°C与一抗一起温育过夜，然后在4°C与蛋白A/G珠一起温育1小时。使珠旋转沉降并用RIPA缓冲液洗涤两次。在4% 15% SDS-PAGE凝胶上通过电泳分离蛋白样品，并将其转移到PVDF膜，使用抗泛素抗体如前针对蛋白质印迹分析所述检测缀合的泛素。定量RT-PCR从经处理细胞提取总RNA，并按照Hou等所述合成cDNA。使用来自 Bio-Rad (Hercules, CA)的 MyiQ 单色实时 PCR 检测系统和 iQ SYBR Green Supermix 实时PCR试剂盒(Bio-Rad)进行实时定量RT-PCR。将不使用模板的样品和不使用逆转录酶的样品算作阴性对照，如同预期，阴性对照产生可以忽略的信号(Ct值>35)。在同一样品中在对GAPDH的量进行标准化后通过比较性Ct分析计算倍数变化值。蛋白质半衰期的确定在存在或不存在10 μ M ZnMP时使9_13细胞与100 μ g/mL环己酰亚胺(CHX) —起温育。使用抗HCV NS5A和抗GAPDH抗体进行蛋白质印迹。通过光密度分析测定蛋白质印迹的条带强度。使用GAPDH带作为内部对照来校正蛋白质加载量。细胞活力检测使用CellTiter- Glo Reagent通过基于对ATP存在的定量确定活细胞的数量而测定ZnMP对受治疗细胞的细胞毒性的影响，所ATP的存在表明存在代谢活性的细胞的存在。在处理前M小时以2500细胞/孔 5000细胞/孔将细胞平板接种至96孔板。一式三份地将细胞用指定浓度的ZnMP处理2小时、6小时和M小时，向细胞培养基的各孔添加等体积的 CellTiter-Glo 试剂。在来自 Bio-Tek (Winooski，VT)的 SynergyHT 微孔板阅读器上读出发光，积分时间设定为0. 25秒 1秒。将发光的降低认为是细胞的细胞毒性指标。统计分析最初分析表明结果是正常分布的。因此，使用参数统计方法。使用学生t检验或 ANOVA(如果合适)来分析样品之间的差异。<0.05的P值认为是统计学上显著的。实验至少重复3次且结果相似。所有实验包括至少一式三份的用于各处理组的样品。显示来自单个实验的代表性结果。使用来自SAS Institute (Cary, NC)的JMP 4. 0. 4软件进行统计分析。实施例1在该实施例中，研究了 HCV蛋白对ZnMP的下调。对暴露于不同浓度的ΖηΜΡ(0、 1 μ Μ、5 μ Μ、10 μ Μ) 4小时的9-13细胞和Conl细胞中的NS5A蛋白水平、CNS3细胞中的核心蛋白水平和用ρΠ -Conl/GND (编码Conl的复制缺陷性变体的质粒)转染的Huh_7/T7细胞中的NS5A和核心蛋白水平进行了评价。处理后，收获细胞，并且分离总蛋白。在4% 15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白，将其转移到PVDF膜，用抗HCV NS5A、抗HCV核心或GAPDH 特异性抗体进行探测，如上所述通过ECL-Plus化学发光检测对应于NS5A、核心或GAPDH的条带。在图中，将NS5A或核心蛋白水平的量相对于GAPDH(其不随处理而变化)标准化。将仅用载体处理的细胞的值设定为等于1。从一式三份样品将数据表示为平均值士SE。*与仅载体不同，P < 0. 05。如图IA和IB的蛋白质印迹所示，在9-13细胞和Conl细胞中暴露于ZnMP的细胞以剂量依赖性方式引起NS5A蛋白水平的显著降低。另外，锌卟啉的影响是选择性和特异性的从图IC和图ID中可以看出，ZnMP对于CNS3细胞和用pH(-Conl/GND转染的Huh_7/T7 细胞中的HCV核心蛋白水平没有可检测的影响。附带的条形图显示金属卟啉的施用可以显著地减少NS5A蛋白的水平。例如，对于剂量为约1 μ M的卟啉NS5A蛋白水平减少约60%， 对于剂量为约5μ M的卟啉NS5A蛋白水平减少约80% 90%。特别地，可以看出施用剂量为10 μ M的锌卟啉在4小时后将NS5A蛋白减少约90% 95%。另外，观察到蛋白水平不受10 μ M游离中卟啉或SiCl2的影响。图2Α中，比较了锌口卜啉相对于DMSO、中卟啉和氯化锌对NS5A蛋白水平的影响。在该实施例中，使9-13细胞暴露于ZnMP、游离中卟啉(Meso)或&iC124小时，然后提取总蛋白。使用抗HCV NS5A和抗GAPDH特异性抗体进行蛋白质印迹。可以看出ZnMP使NS5A蛋白的水平降低，单独的中卟啉和锌对NS5A蛋白水平具有相对较少(如果有的话)的影响。最近据报道，另一种竞争性HO抑制剂锡中卟啉(SnMP)在NIH 3T3细胞中下调 Bachl蛋白水平和诱导HO-I基因表达。图2B中，比较了 SiMP和SnMP在9_13细胞中对下调NS5A的影响。将9-13细胞用10 μ M ZnMP或用10 μ M SnMP处理指定时间(0小时、2小时、4小时、6小时)，然后使用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的收获缓冲液收获细胞。将50 μ g 总蛋白加载到4% 15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，转移到PVDF膜并用抗NS5A和抗GAPDH 特异性抗体检测，然后用ECL Plus化学发光显影。如图2B中所示，在暴露于ZnMP仅2小时后ZnMP显著快速地减少NS5A蛋白水平。相反，未观察到SnMP对NS5A蛋白水平的可检测影响。将NS5A蛋白的相对量相对于GAPDH的相对量(其不随处理而变化)标准化。将仅用载体处理的细胞的值设定为等于1。从一式三份样品将数据表示为平均值士SE。*与仅载体不同，P < 0. 05。
实施例2实施例2中，研究锌螯合剂，N，N，N，N-四(2_吡啶基甲基)乙二胺(TEPN)对NS5A 蛋白水平的影响。在ZnMP处理前30分钟用指定浓度的TEPN处理9_13细胞，随后将细胞暴露于ZnMP或暴露于作为对照的单独载体(DMS0)4小时。提取总蛋白。通过蛋白质印迹测定NS5A和GAPDH蛋白水平。条形图显示定量结果。将NS5A蛋白的相对量相对于GAPDH 的相对量(其不随处理而变化)标准化。将来自单独载体的NS5A的带强度设定为等于1。 *与仅载体不同，P < 0. 05。如图3中所示，在9-13细胞中锌螯合剂不影响ZnMP-介导的 NS5A蛋白水平的显著下调。实施例3实施例3中，研究了 ZnMP对NS5A蛋白的下调从而确定该下调是否在翻译后水平发生。使用100ug/mL环己酰亚胺(CHX)并且使用或不使用10 μ M ZnMP对9_13细胞处理指定时间(0h、0.5h、lh、2h、4h)，然后收获细胞并分离总蛋白。在4% 15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白，将其转移到PVDF膜，使用抗HCV NS5A或抗GAPDH特异性抗体来通过蛋白质印迹检测NS5A或GAPDH蛋白水平。如图4A和4B中所示，在用ZnMP和环己酰亚胺 (CHX)处理的9-13细胞中的NS5A蛋白水平极大且快速地降低。在不用ZnMP处理的9_13 细胞中的NS5A蛋白水平也被CHX降低，但是降低的程度小得多。浓度为IOyMWZniflMf NS5A蛋白的半衰期(tl/2)从19. 8小时减少至1.2小时(图4C)。在图4B和图4C中，通过密度测定法将图4A中条带的强度定量。将来自未处理样品(Oh)的NS5A的条带强度设定为1。实施例4在哺乳动物中已经发现两种不同的蛋白降解系统溶酶体系统和泛素-蛋白酶体系统。蛋白酶体依赖性降解途径是主要的蛋白水解途径之一。为了理解ZnMP对NS5A蛋白的降解是否是蛋白酶体依赖性的，用ΖηΜΡ(5μΜ、10μΜ)和所选择的蛋白酶体抑制剂(环氧酶素(5 μ MUO μ Μ) *Μ6132(10μΜ、20μΜ))处理9-13细胞。在ZnMP处理前用指定浓度的MG132或环氧酶素处理9-13细胞30分钟。随后将细胞暴露于ZnMP或作为对照的单独载体4小时。提取总蛋白。如上所述通过蛋白质印迹测定NS5A和GAPDH蛋白水平。图5Α是显示在用ZnMP (5 μ Μ、10 μ Μ)和不同浓度的环氧酶素(5μΜ、10μΜ)或 Μ6132(10μΜ,20μΜ)处理的9_13细胞中NS5A蛋白水平的所受影响的蛋白质印迹。图5Β 是图5Α中所示结果的标准化条形图。据发现单独的环氧酶素或MG132不影响9-13细胞中的NS5A蛋白水平。环氧酶素(5μΜ、10μΜ)和MG132 (10 μ Μ、20 μ Μ)完全消除了在暴露于较低浓度的ZnMP (5 μ Μ)的细胞中的NS5A的降解。相反，用ZnMP (10 μ Μ)和环氧酶素(5 μ Μ、 10 μ Μ)或者SiMP (10 μ Μ)和MG132 (10 μ Μ、20 μ Μ)处理的细胞显示SiMP对NS5A的降解被显著逆转，表明了蛋白酶体依赖性降解途径参与ZnMP介导的NS5A分解。在这些实施例中使用的环氧酶素的最高浓度为10 μ Μ,因为暴露于20 μ M环氧酶素的细胞不能良好地生长， 表明该浓度的环氧酶素对细胞具有毒性。图5Β中，通过密度测定法将图5Α中条带的强度定量，并从三个实验计算相对平均强度士SE，并进行绘图。将NS5A蛋白的量相对于GAPDH 的量(其不随处理而变化)标准化。将来自单独载体的NS5A的条带强度设定为等于1。* 与仅载体不同，P < 0. 05。实施例5
该实施例研究ZnMP是否诱导NS5A的多泛素化从而了解ZnMP介导NS5A蛋白的降解的机制。不使用或使用IOyM ZnMP处理9-13细胞4小时。提取总蛋白以用于随后的蛋白质印迹或免疫沉淀分析。使用抗HCV NS5A抗体进行免疫沉淀。利用使用抗HCV NS5A 抗体的免疫沉淀和使用抗泛素抗体的免疫印迹检查NS5A的泛素缀合[多泛素化NS5A(Ub) n-NS5A]。免疫沉淀前的NS5A蛋白水平的免疫印迹分析显示NS5A被ZnMP下调(图6A)。 图6B中，比较ZnMP处理后或仅载体(DMSO)处理后NS5A的泛素化。在凝胶的左方标明分子量标记的位置(以千道尔顿计)。括号表示多泛素化NS5A。星号表示交叉反应的免疫球蛋白重链。图6C显示使用抗NS5A抗体进行的免疫印迹分析，表明在框图B中使NS5A蛋白免疫沉淀。括号表示含有NS5A的迁移率较低的条带。这些条带可以表示泛素化NS5A。结果表明ZnMP诱导NS5A的多泛素化，这有助于NS5A被锌中卟啉降解。
实施例6为了评价ZnMP介导的NS5A的降解是否在抑制HCV复制中起作用，使用不同浓度的ZnMP处理Conl全长HCV复制子Huh-7. 5细胞24小时。提取总RNA和总蛋白。通过 qRT-PCR对HCV病毒RNA进行定量，通过蛋白质印迹测定HCV核心蛋白、NS5A蛋白和GAPDH 蛋白的水平。将数据表示为平均值士SE，η = 3。*与仅载体(ΖηΜΡ,ΟμΜ)不同，P <0.05。 单独对照载体不改变HCV复制子RNA的量，而使用ZnMP的处理引起病毒RNA水平(图7Α) 和HCV蛋白水平(图7Β)的剂量依赖性降低，表明ZnMP介导的NS5A快速降解可以引起HCV RNA复制的减少，以及随后HCV蛋白表达的降低。然后会质疑NS5A是否是ZnMP的确实靶标， 以及ZnMP对HCV RNA复制和核心蛋白水平的影响是否继发于ZnMP介导的NS5A的快速降解。为此目的，我们在Huh-7/T7细胞中使用从DNA质粒pra-Conl/GND表达的HCV蛋白进行平行实验，而其表达与病毒RNA聚合酶无关，但是与T7RNA聚合酶有关。在24小时ZnMP处理后，ZnMP以剂量依赖性方式显著地降低NS5A蛋白水平，而HCV核心蛋白水平保持不受影响(图7C)。此外，还观察到ZnMP引起在其中HCV蛋白从Huh-7/T7细胞中的pH(-Conl/⑶D 表达并且其中HCV蛋白的表达与病毒RNA聚合酶部分相关的系统中核心的减少(图7D)，但是，与其中HCV蛋白的表达与病毒RNA聚合酶相关的Conl复制子系统中的效果相比，核心的减少要少得多。实施例7该实施例研究在新型基于JFHl (基因型2a)的HCV细胞培养系统中ZnMP是否下调NS5A蛋白并且展示抗病毒活性。通过Lipofectamine 2000使用2 μ g/孔的J6/JFH1RNA 转染Huh-7. 5细胞。48小时后，用指定浓度的ZnMP或作为对照的DMSO处理细胞4小时或 24小时，收获细胞并且提取总RNA和总蛋白。通过qRT-PCR对HCVRNA进行定量，通过蛋白质印迹测定HCV核心蛋白、NS5A蛋白和GAPDH蛋白水平。ZnMP引起NS5A蛋白水平的快速显著的降低，而核心蛋白水平在ZnMP处理4小时后不受影响，且在暴露于ZnMP 24小时后显示出降低(图8A-8D)。为了进一步检查ZnMP是否在经J6/JFH1转染并感染的细胞培养系统中抑制HCV RNA复制/感染，分析了 ZnMP处理后的HCV RNA表达。在HCV转染的细胞中，10 μ M ZnMP将HCVRNA水平显著降低约70%，在HCV-感染的细胞中显著降低约90% (图 8Ε 禾口 8F)。实施例8该实施例探索了 ZnMP与干扰素的组合影响，从而确定与ZnMP或IFN单独的结果相比，是否存在干扰素(IFN)与ZnMP组合的累加效应或协同效应。用10 μ MZnMP或IFN α、 或者二者的组合处理9-13细胞不同的时间(0小时、2小时、4小时、6小时、10小时、24小时)，然后使用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的收获缓冲液收获细胞。将50 μ g蛋白加载到 4% 15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，转移到PVDF膜并用抗NS5A和抗GAPDH特异性抗体探测，然后用ECL Plus试剂显影。将NS5A蛋白的相对量相对于GAPDH的相对量(其不随处理而变化)标准化。将仅用载体处理的细胞的值设定为等于1。从一式三份样品将数据表示为平均值士SE。*与仅载体不同，P < 0. 05，#与IFN单独或ZnMP单独不同，P < 0. 05。从图9A中可以看出，IFN处理M小时显著降低了 NS5A蛋白水平，而在用IFN处理少于10小时的细胞中未检测到对NS5A蛋白水平的影响。图9B中，可以看出在处理仅2小时的细胞中ZnMP诱导NS5A蛋白水平的快速显著的下调，而用ZnMP处理10小时和M小时后NS5A蛋白略微增加。如图9C中所示，与单独ZnMP或IFN的结果相比，INF和ZnMP的组合揭示出在经M小时处理的细胞中对NS5A蛋白表达的累加效应。因此，可以看出INF和 ZnMP的组合与任一种单独治疗相比，对于治疗HCV感染具有累加效应和/或协同效应。另外，可以看出该效应是长期持久的测试，从少至2小时治疗到超过M小时。实施例9在该实施例中，评价金属卟啉的细胞毒性。在处理前M小时将9-13细胞接种于 96孔板。将细胞与指定浓度的ZnMP 一起温育0小时、2小时、6小时、24小时，在Synergy HT微孔板阅读器上添加CellTiter-Glo 试剂以用于CellTiter-Glo发光细胞活力检测， 积分时间设定为0. 25秒 1秒。将发光的降低认为是细胞的细胞毒性指标。*与载体不同，P <0.05，数据表示一式三份测定的平均值士SE。从图10中可以看出，在9-13细胞中 ZnMP (1 μ M 10 μ M)处理2小时 24小时或SiMP (20 μ Μ)处理2小时 6小时对细胞活力没有显著影响，而浓度为20μ M的ZnMP引起显著的细胞毒性(ρ < 0. 05)。因此，使用的 ZnMP浓度对于至多6小时为不超过20 μ Μ,或对于至多24小时为至多10 μ Μ。得益于前述说明书和附图中提出的教导，本发明所属领域技术人员会想到本文提出的本发明的许多改进和其它实施方式。因此，应该理解本发明不限于所公开的具体实施方式
，也旨在将改进和其它实施方式包括在所附权利要求的范围内。但本文使用的特定术语仅是以一般的描述性意义使用，而不是为了进行限制。
权利要求
1.一种治疗罹患丙型肝炎病毒感染的哺乳动物的方法，所述方法包括使被丙型肝炎病毒(HCV)感染的细胞中的NS5A蛋白水平减少。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括增强所述NS5A蛋白的多泛素化的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括通过利用金属卟啉治疗受感染细胞而抑制HCV的步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述金属卟啉选自由锌中卟啉、锌原卟啉、钴中卟啉、钴中卟啉和其组合组成的组。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述NS5A蛋白的半衰期减少至约0.5小时 3小时。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述NS5A蛋白的半衰期减少至约1小时 1.2小时。
7.一种用于治疗有需要的宿主中的丙型肝炎病毒感染的方法，所述方法包括对所述宿主施用治疗有效量的金属卟啉。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述金属卟啉选自由以下物质组成的组锌中卟啉、 锌原卟啉、亚铁血红素、锌次卟啉、双乙二醇锌次卟啉、钴原卟啉、钴中卟啉、钴次卟啉、双乙二醇钴次卟啉、亚铁血红素、铁中卟啉、铁次卟啉和双乙二醇铁次卟啉。
9.如权利要求7所述的方法，其中使受HCV感染的细胞中NS5A蛋白的量减少约60% 95%。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述金属卟啉包含白蛋白复合物。
11.如权利要求7所述的方法，所述方法还包括施用干扰素的步骤。
12.如权利要求7所述的方法，所述方法还包括将受HCV感染的细胞中的NS5A蛋白的半衰期减少至约1小时 1. 2小时的步骤。
13.如权利要求7所述的方法，其中金属卟啉的施用量是约0.1毫克/千克宿主体重 20毫克/千克宿主体重。
14.如权利要求7所述的方法，所述方法还包括口服施用所述金属卟啉的步骤。
15.一种用于治疗有需要的患者中的HCV感染的方法，所述方法包括对所述宿主施用治疗有效量的活性成分，所述活性成分选自由以下物质组成的组锌中卟啉、锌原卟啉、亚铁血红素、锌次卟啉、双乙二醇锌次卟啉、钴原卟啉、钴中卟啉、钴次卟啉、双乙二醇钴次卟啉、亚铁血红素、铁中卟啉、铁次卟啉和双乙二醇铁次卟啉。
16.如权利要求15所述的方法，所述方法还包括施用干扰素的步骤。
17.如权利要求15所述的方法，所述方法还包括将受HCV感染的细胞中的NS5A蛋白的半衰期减少至约1小时 1. 2小时的步骤。
18.如权利要求15所述的方法，其中金属卟啉的施用量是约0.1毫克/千克患者体重 20毫克/千克患者体重。
19.一种用于治疗HCV感染的药物制剂，所述药物制剂包含约10毫克 80毫克的锌原卟啉，所述锌原卟啉以约10 1 1 1的摩尔比与人血清白蛋白结合。
全文摘要
本发明涉及使用金属卟啉治疗丙型肝炎感染。特别地，本发明基于以下发现NS5A蛋白通过参与多聚蛋白切割、干扰素响应和细胞信号传导途径而在HCV RNA复制中起关键作用。已经发现，诸如锌卟啉等金属卟啉在泛素-蛋白酶体降解途径中诱导HCV NS5A蛋白的翻译后下调。即，金属卟啉可用于激活NS5A蛋白分解代谢的泛素-蛋白酶体途径。结果，金属卟啉可用于在HCV感染细胞中显著抑制HCV病毒复制。
文档编号A61K31/70GK102170784SQ200980139272
公开日2011年8月31日 申请日期2009年10月2日 优先权日2008年10月3日
发明者侯卫红, 赫伯特·L·帮科夫斯基 申请人:夏洛特-梅克伦堡医院管理局D/B/A卡罗莱纳医学中心