专利名称：通过调控膜联蛋白-1对自身免疫疾病的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过调控膜联蛋白-I(Armexin-I)的活性治疗T细胞介导的疾病的方法。
背景技术：
自身免疫疾病是免疫系统功能失常引起的慢性致残病变。在大部分情况中，它们是通过T细胞对存在于抗原呈递细胞(APCs)的MHC分子环境中的自身抗原失控的应答所启动的。已经公开了几种参与自身免疫疾病发病机制的因素，包括环境，遗传和病毒因素， 具有一个总体特征T细胞的过度反应性(hyperresponsivity)。糖皮质激素(GCs)常用于治疗多种慢性自身免疫疾病，因为它们具有同时阻断固有和适应性免疫应答的能力。近10年的研究，或本发明人和其他研究团队所进行的研究都表明，GC对固有免疫反应的炎症效应是由被称为膜联蛋白-I(Anx-Al)的蛋白所介导的。 已证实这种蛋白在大量细胞类型中发挥自稳调节，包括中性白细胞(neutrophils)，巨噬细胞和内皮细胞。然而，经常被忽视的一方面是Anx-Al在适应性免疫反应中的作用。考虑到 Anx-Al已被提出作为一种GC药理效应的第二信使，令人激动不已。本发明人之前已指出了 Anx-Al通过调控T细胞受体(TCR)信号的强度，在T细胞中发挥自稳作用(D' Acquisto et al.，Blood 109 :1095-1102,2007) 而且，本发明人已指出高水平的Anx-Al会降低T细胞激活的阈值并偏好分化成Thl细胞，而Anx-Al缺陷型小鼠显示出受损的T细胞激活和增强的向Th2细胞的分化 (D' Acquisto et al.，Eur. J. Immunol. 37 :3131-3142,2007)。WO 2005/027965描述了所发现的通过凋亡中性白细胞递送抗炎症信号至树突细胞的机制，并鉴别了干扰此过程的抗体。特别是，WO 2005/027965描述了鉴别作为信号分子的Anx-1，据称其被凋亡中性白细胞表达，以抑制树突细胞的激活和成熟。WO 2005/027965 提出了称为DAC5(凋亡细胞检测器Nr. 5，Detector of Apoptotic Cell)的抗体通过树突细胞的吞噬作用来识别并阻断呈递于凋亡中性白细胞表面上的Anx-I的抗炎症作用。而WO 2005/027965指出了通过靶向这种凋亡细胞并通过引发炎症应答将其清除来治疗多种疾病的可能性，但并未论述Anx-I在T细胞激活中的作用。WO 2005/027965声称膜联蛋白在正经历凋亡的细胞上表达(参见例如第8页，第 6-7和四-30行)，以及这种膜联蛋白呈递于这些细胞的表面上(参见例如第6页，第10-11 行和第8页，第16-17行)。然而，两个独立的研究(Maderna et al.，J Immunol.，174 3727-3733,2005 ；Scannell et al.，J Immunol.，178 :4595_4605，2007)显示了凋亡细胞包括中性白细胞会释放膜联蛋白-1，而不会表达蛋白并将其呈递在细胞表面。因为膜联蛋白-1是从细胞释放的，所以无法主张DAC5仅仅鉴别在其表面表达蛋白的凋亡细胞，因为抗体也会鉴别释放的膜联蛋白-1。而且，WO 2005/027965主张了将在其细胞膜上表达膜联蛋白_1的凋亡中性白细胞与用LPS激活的树突细胞共孵育，导致了 TNF- α分泌的抑制和激活标记物⑶83，⑶86和HLA-DR的上调，以及在该培养物中添加DAC5转变了表达膜联蛋白_1的凋亡中性白细胞的抑制作用(第5页，第31行至第6页第8行)。来自本发明人的数据(Huggins et al., FASEB J. 2008，印刷中)证实了用LPS刺激会使树突细胞释放Αηχ-1，因而WO 2005/027965 所述的DAC5会与外化在中性白细胞上的Anx-I以及树突细胞释放的膜联蛋白_1结合。而且，本发明人发现了在树突细胞中缺乏膜联蛋白-1会造成成熟/激活标记物的增强表达和炎症细胞因子，例如TNF-α和IL-I β和IL-12的产生。因此，WO 2005/027965所述的抗体DAC5应该会影响树突细胞的成熟和激活，和之后的免疫应答的调控。为了支持这些，本发明人显示了将Anx-Al树突细胞和天然的T细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)中共培养，表现出诱导T细胞增殖或IL-2和IFN-Y产生的能力明显降低。因而，阻断Anx-Al在树突细胞中功能的试剂应该会降低它们刺激强有力的T细胞介导免疫应答的能力。因此，WO 2005/027965中涉及的抗体不适合用于治疗在该专利申请中所涉及的疾病。
发明内容
本发明提供了能够与膜联蛋白-I(Anx-Al)结合的特异性结合分子在T-细胞介导的疾病的治疗中的用途。根据本发明的第一方面，提供了能够与膜联蛋白-I(Anx-Al)结合的特异性结合分子，其可用于T-细胞介导的疾病的治疗。本发明人之前阐明了 Anx-Al调控T细胞受体(TCR)信号的强度，而且高水平的 Anx-Al降低T细胞激活的阈值并偏好分化成Thl细胞。本发明人目前鉴别了膜联蛋白途径，和保障信号，作为治疗T-细胞介导的疾病的封闭靶点。这些疾病包括那些异常的T细胞激活，例如多种自身免疫疾病，以及那些期望的T细胞偏好分化成Thl而不是Th2细胞的疾病。本发明利用了能够与膜联蛋白-1 (Anx-Al)结合的特异性结合分子。膜联蛋白是一组钙和磷脂结合细胞蛋白，也称为脂皮质蛋白。膜联蛋白家族有13 个成员，包括膜联蛋白Al，膜联蛋白A2和膜联蛋白A5。膜联蛋白Al也称为膜联蛋白_1，并在本文中表示为“Anx-Al”。膜联蛋白-I(Anx-Al)是37_kDa蛋白，最初被描述为糖皮质激素活动的介导子。最近几年的证据显示了 Anx-Al通过调控T细胞受体(TCR)信号的强度在适应性免疫系统特别是T细胞中发挥自稳作用。Anx-Al在体内固有免疫系统细胞中充当炎症的内源下调因子。图IA是显示Anx-Al三维结构的连续剖面图。共有八个编码Anx-Al的人核苷酸序列。其中，仅有四个被翻译因而有四个Anx-Al 同工型(isoform)，被指定为 ANXA1-002，ANXA1-003，ANXA1-004 和 ANXA1-006。这些序列可从 Ensembl 网站(www, ensembl. org)获得，被指定为 0TTHUMT00000052664 (ANXA1-002)， 0TTHUMT00000052665 (ANXA1-003)，0TTHUMT00000052666 (ANXA1-004)禾口 0TTHUMT00000052668 (ANXA1-006)。图 2a 显示了人膜联蛋白-1 (Anx-Al)的一个同工型ANXA1-003的氨基酸和核苷酸序列。而图2b，2c和2d分别显示了同工型ANXA1-002， ANXA1-004和ANXA1-006的氨基酸序列。如图2所观察到的，同工型ANXA1-002，ANXA1-004 和ANXA1-006是ANXA 1-003的短剪接变体(variant)，或是具有少量氨基酸变化的 ANXA1-003 变体。
大量研究表明称为Ac. 2-26的Anx-Al的N末端肽充当了整个蛋白的生物活性替代物(参见例如 Lim et al. , Proc Natl Acad Sci U S A 95，14535-9，1998)。图IB是膜联蛋白重复序列和该生物活性序列的定位的示意图。肽Ac. 2-26是具有图2所示Anx-Al全长氨基酸序列的氨基酸残基2- 序列的乙酰化肽。肽Ac. 2-26的序列如图IC所示，如下ch3co-amvseflkqawfieneeqeyvqtvkAnx-Al及其N末端衍生的生物活性肽通过甲酰肽受体(FPR)家族的成员介导它们的生物作用。Anx-Al通过直接结合并激活该族的成员之一，甲酰肽样受体-Kformyl peptide receptor like-1) (FPRL-1)，从而发挥其对中性白细胞外渗和固有免疫的反调节 (couterregulatory)作用。本发明人之前已经发现了在hrAnx-Al的存在下刺激T细胞会经由刺激 FPRL-I 增加 T 细胞激活(D' Acquisto et al.，Blood 109 :1095-1102,2007).本发明利用了能够与膜联蛋白-I(Anx-Al)结合的特异性结合分子。特异性结合分子所结合的Anx-Al通常是具有图加所示多肽序列的人Anx-Al，或其变体或片段，例如， 具有图2b，图2c或图2d所示的多肽序列的人Anx-Al的同工型之一。特异性结合分子所结合的人Anx-Al片段通常是具有图IC所示序列的多肽。特异性结合分子所结合的Anx-Al 通常是由图加所示核苷酸序列编码的。如本文所用的，术语“变体”是指具有相似氨基酸序列和/或保持相同功能的蛋白。例如，术语“变体”包括含有一个或多个氨基酸添加，删除，置换等等的蛋白或多肽。氨基酸置换通常是保守置换，即用另一个具有大体相似特性的氨基酸置换一个氨基酸，以便整体功能不可能受到严重影响。因而氨基酸甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸通常可以相互置换(具有脂肪族侧链的氨基酸)。在这些可能的置换中，优选地，甘氨酸和丙氨酸可用于相互置换 (因为它们具有相对短的侧链)，而缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸可用于相互置换(因为它们具有更大的疏水性脂肪族侧链)。通常可用于相互置换的其他氨基酸包括苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；赖氨酸，精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺基侧链的氨基酸)；和半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。使用三个字母和一个字母代码，氨基酸可做如下表示甘氨酸(G或Gly)，丙氨酸 (A或Ala)，缬氨酸(V或Val)，亮氨酸(L或Leu)，异亮氨酸(I或He)，脯氨酸(P或， 苯丙氨酸(F或Wie)，酪氨酸(Y或Tyr)，色氨酸(W或Trp)，赖氨酸(K或Lys)，精氨酸(R 或Arg)，组氨酸(H或His)，天冬氨酸(D或Asp)，谷氨酸(E或Glu)，天冬酰胺(N或Asn)， 谷氨酰胺⑴或Gln)，半胱氨酸(C或Cys)，甲硫氨酸(M或Met)，丝氨酸(S或Ser)和苏氨酸(T或Thr)。若残基可以是天冬氨酸或天冬酰胺，则可以使用符号Asx或B。若残基可以是谷氨酸或谷氨酰胺，则可以使用符号Glx或Z。提及天冬氨酸包括天冬氨酸盐，提及谷氨酸包括谷氨酸盐，除非文中另有特殊规定。也可以针对上述涉及的蛋白的氨基酸序列进行氨基酸删除或插入。因而，例如，对多肽活性不具有实质影响，或至少不会消除这种活性的氨基酸可以被删除。这种删除可能是有利的，因为能够在降低多肽整体长度和分子量的同时仍保持其活性。这可以实现降低特定目的所需要的多肽量，例如，能够降低剂量水平。
也可以针对上述融合蛋白的序列进行氨基酸插入。这可以用来改变物质的特性 (例如，辅助鉴别，纯化或表达)。针对上述给定序列的氨基酸变化可使用任何适宜技术进行，例如，使用定点突变或固态合成。应该认识到在本发明范围内的氨基酸置换或插入可以使用天然存在的或非天然存在的氨基酸进行。无论是使用天然或合成的氨基酸，优选仅存在L-氨基酸。可以使用程序例如CLUSTAL程序来比较氨基酸序列。该程序通过在任一序列适当地插入空白来比较氨基酸序列并寻找最佳比对(optimal alignment)。可以计算氨基酸同一性或相似性(氨基酸类型的同一性和保守性)用于最佳比对。程序如BLASTx会排列出相似序列的最长延伸并给出拟合值。因而可以获得所发现的几个相似区域的比较，每个具有不同得分。在本发明中还考虑了两种同一性分析的类型。本文所述的蛋白和多肽的变体应该保持原始蛋白或多肽的功能。可选地，或除了保持原始蛋白或多肽功能之外，本文所述的蛋白和多肽的变体与本文所述的蛋白或多肽 (特别是图IC或图2所示的多肽序列)通常具有至少60%的同一性(如上所论述的)。通常地，本发明所用的变体与本文所述蛋白或多肽(特别是图IC或图2所示的多肽序列)具有至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少97%或至少99%的同一性。通过以最佳比较为目的的比对序列(如在第一序列中引入缺口以便与序列获得最佳比对)，以及在相应位置比较氨基酸残基或核苷酸，来测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性。“最佳比对”是能获得最高百分比同一性的两个序列的比对。通过在待比较序列中的相同氨基酸残基或核苷酸的数量来测定百分比同一性(即，％同一性=相同位置的数量/位置的总数量X100)。可使用本领域技术人员已知的数学算法完成两个序列之间百分比同一性的测定。用于比对两个序列的数学算法的一个示例是Karlin and Altschul (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-2268 的算法，改良为 Karlin and Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877。Altschul，et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410 的 NBLAST和XBLAST程序引入这种算法。可用NBLAST程序实施BLAST核苷酸搜索，得分= 100，字长=12以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序实施BLAST 蛋白搜索，得分=50，字长=3以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带缺口的比对，可利用Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Res. 25 3389-3402中所述的缺口 BLAST。可选地，可使用PSI-Blast实施迭代搜索(iterated search)，其检测分子之间的距离关系(Id.)。在利用BLAST，缺口 BLAST，和PSI-Blast程序时，可以使用各个程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http//www. ncbi. nlm. nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一示例是Myers and Miller, CABIOS (1989)的算法。作为CGC序列比对软件包一部分的ALIGN程序版本)引入了这种算法。本领域已知的用于序列分析的其他算法包括iTorellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci.， 10 3-5 所述的 ADVANCE 和 ADAM ；和 Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 2444-8所述的FASTA。在FASTA内，ktup是设定搜索灵敏度和速度的控制选项。在可选的方法中，变体可以是融合蛋白，其引入了便于纯化的基序，例如通过在所需蛋白或多肽中加上有效标签。可能需要去除“标签”或可能是融合蛋白本身保持足够可用的功能性的情况。如本文所用的“能够与Anx-Al结合的特异性结合分子”是与Anx-Al的结合亲和力大于与其他分子的结合亲和力的分子，即其与Anx-Al特异性结合。能够与Anx-Al结合的特异性结合分子包括抗膜联蛋白-1 (anti-Anx-Al)抗体和适配体(aptamers)。用于本发明的抗-Anx-Al抗体通过阻断T细胞激活而起作用，因而给药它时，可用于治疗T细胞介导的疾病，这些疾病通常是由异常的T细胞激活引起的。anti-Anx-Al抗体可针对例如具有图2所列出的氨基酸序列(通常是图加所列出的氨基酸序列)的人Anx-Al所产生。可选地，anti-Anx-Al抗体可以定向于具有图2所列出的氨基酸序列的人Anx-Al的一个或多个特定表位(印itope)，通常是图加所列出的氨基酸序列。例如，anti-Anx-Al抗体可以定向针对Anx-Al的N末端片段，例如来自图加所列出氨基酸序列的N末端的至少188，100，50或25个氨基酸残基的N末端片段。通常地，用于本发明的anti-Anx-Al抗体是针对被称为Ac246的Anx-Al的N末端片段，其具有图IC 所示的序列，或针对它的至少6个氨基酸的片段。因此，能够与Anx-Al结合的特异性结合分子包括anti-Anx-Al抗体，其是针对具有图IC所示序列的Anx-Al片段Ac246或它的至少6个氨基酸的片段的抗体。在这个实施方式中，anti-Anx-Al是针对图IC所示序列的片段所产生的，该片段是抗原性的且能够刺激抗体的产生，给药该抗体时，可以用于治疗T细胞介导的疾病，这些疾病通常是由异常的T细胞激活引起的。如上所述，特异性序列的活性亚片段可以按说明使用。活性亚片段可含有具有图 IC所列出序列的被称为Ac246的Anx-Al的N末端片段的至少6个连续氨基酸残基(六肽)的片段或由其所组成，该片段包括以下的一个或多个
权利要求
1.一种能够与膜联蛋白-1结合的特异性结合分子，其特征在于，该分子可用于治疗T 细胞介导的疾病。
2.根据权利要求1所述的特异性结合分子，其中，所述特异性结合分子是抗膜联蛋白-ι抗体。
3.根据权利要求2所述的特异性结合分子，其中，所述抗膜联蛋白-1抗体是单克隆抗体或其片段。
4.根据权利要求3所述的特异性结合分子，其中，所述单克隆抗体是人源化的。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的特异性结合分子，其中，所述抗膜联蛋白-1抗体是针对具有图加所示序列的膜联蛋白-1的N末端片段的抗体。
6.根据权利要求4所述的特异性结合分子，其中，所述抗膜联蛋白-1抗体是针对具有图IC所示序列的抗膜联蛋白-1片段Ac. 2-26或该抗膜联蛋白-1片段Ac. 2-26的至少6 个氨基酸的片段的抗体。
7.根据前述任意一项权利要求所述的特异性结合分子，其中，所述T细胞介导的疾病选自由移植物抗宿主病、移植物排斥、动脉粥样硬化、人免疫缺陷病毒、艾滋病、银屑病和自身免疫疾病组成的组。
8.根据权利要求7所述的特异性结合分子，其中，所述自身免疫疾病选自由类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、艾迪生病、格雷夫斯病、硬皮病、多发性肌炎、糖尿病、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、溃疡性结肠炎、寻常天疱疮、炎症性肠病和自身免疫性甲状腺炎组成的组。
9.根据权利要求8所述的特异性结合分子，其中，所述自身免疫疾病选自由类风湿性关节炎、多发性硬化症和系统性红斑狼疮组成的组。
10.根据权利要求7所述的特异性结合分子，其中，所述T细胞介导的疾病选自由动脉粥样硬化、人免疫缺陷病毒、艾滋病、和银屑病组成的组。
11.能够与膜联蛋白-1结合的特异性结合分子在制备治疗T细胞介导的疾病的药物中的用途。
12.—种治疗T细胞介导的疾病的方法，其特征在于，该方法包括将治疗量的能够与膜联蛋白-1结合的特异性结合分子给药至有需要的受试者。
全文摘要
本发明提供了一种特异性结合分子，其能够与膜联蛋白-1(Anx-A1)结合，用于治疗T细胞介导的疾病。
文档编号A61K39/395GK102272156SQ200980153335
公开日2011年12月7日 申请日期2009年12月2日 优先权日2008年12月2日
发明者F·达奎斯托, M·佩雷蒂, R·J·弗劳尔 申请人:玛丽皇后和威斯特-弗尔德学院