扇贝多糖在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用的制作方法

专利名称：：扇贝多糖在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种扇贝多糖在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用，属医药
技术领域：
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背景技术：
：单纯疱疹病毒(HSV)是一种常见的人类传染病病毒，主要感染口、眼、唇的皮肤和粘膜、中枢神经系统、生殖器、内脏器官等，引起口唇疱疹、脑炎、角膜结膜炎、生殖器疱疹等疾病。尤其孕妇感染HSV后，易发生流产，造成胎儿先天畸形和智力低下，约40%60%的新生儿在通过产道被HSV-2感染后，出现高热、呼吸困难和中枢神经系统病变，其中60%70%受染新生儿可因此而死亡，幸存者中后遗症可达95%。现已证实HSV感染与先天性畸形、流产、宫颈癌、唇癌、脑炎、新生儿疾病、性病等10余种疾病的发生有关。目前国内外被认可并应用于临床的仅有疱疹净、阿昔洛韦、阿糖腺苷等少数几种药物，因其药靶均为DNA合成酶，常出现交叉耐药现象。同时因病毒具有细胞内寄生以及复制时依赖宿主细胞功能的特性，因此药物在杀伤病毒感染细胞的同时，往往对正常的宿主细胞带来损伤，引起多种不良反应。近年来，在寻找高效低毒的天然抗病毒药物的过程中，海洋生物多糖抗病毒的药用价值日益受到人们的重视。陆续发现红藻多糖、褐藻糖胶、螺旋藻硫酸多糖及海带多糖对不同病毒有抑制作用。扇贝多糖(也称扇贝糖胺聚糖GlycosaminoglycanfromScallop，S-GAG)是由扇贝在加工干贝后所剩余的废弃物——扇贝内脏团中提取出的硫酸多糖成分，属于天然药物。扇贝多糖呈微黄色粉末状，无臭无味、易潮解、易溶于水，为类肝素样氨基多糖，所含的氨基己糖主要为氨基半乳糖，己糖醛酸以艾杜糖醛酸为主；其硫酸基与羧酸基的比值为1.691。本发明人经研究发现扇贝多糖对单纯疱疹病毒I型有明显的抑制作用，并且其毒性低，在抗单纯疱疹病毒感染方面有良好的应用前景。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的缺点，旨在提供一种扇贝多糖在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用。为了实现上述发明目的，本发明的扇贝多糖在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用，其特征在于通过下述方法纯化并限定其分子量范围用蒸馏水配成含质量百分比为5%的扇贝多糖溶液，用活性炭吸附、加热；经离心、抽滤，除去活性炭及其吸附的蛋白质及色素；将抽滤液先后应用IOOk和5k滤膜超滤；将滤液冷冻干燥后得浅黄色粉末状、分子量为5kIOOk的纯化扇贝多糖；将经纯化的扇贝多糖研磨过80目筛，与药用淀粉按11-10重量比例混勻制成50mg或IOOmg规格的胶囊；或将经纯化的扇贝多糖研磨过80目筛，按湿法制粒工艺制成50mg或IOOmg规格的片剂。本发明所述的扇贝多糖在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用，在扇贝多糖纯化和限定其分子量范围操作步骤中，加入质量百分比的活性炭搅拌，加热温度为80°c。本发明所述的扇贝多糖是天然产物，是由扇贝在加工干贝后所剩余的废弃物——扇贝内脏团中提取出的活性成分。服用方法治疗单纯疱疹病毒感染时可用胶囊或片剂，每人每日100150mg，可分2-3次饭后服用。本发明的扇贝多糖在制备抗单纯疱疹病毒药物中应用的有益效果如下一、在体外抗单纯疱疹病毒I型试验中，分别以非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和以人宫颈癌(Hela)细胞作为宿主细胞，采用体外细胞培养的方法，检测不同浓度扇贝多糖对单纯疱疹病毒I型(HSV-ISM44株)的抑制作用。结果显示扇贝多糖在25-1600yg/ml浓度范围内对非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和宫颈癌(Hela)细胞均无明显毒性；扇贝多糖(25100μg/ml)能有效保护经HSV-I感染的Vero细胞和Hela细胞，使细胞活性增强，并减弱HSV-I导致的细胞病变效应(CPE)。试验发现扇贝多糖可抑制病毒的复制，阻断HSV-I对细胞的侵入，但是未发现其对HSV-I有直接杀伤作用。时效关系研究显示，扇贝多糖的抗病毒效应与给药时间有关，在持续给药24小时72小时后扇贝多糖均能有效保护Vero细胞，随着用药时间的延长，其抗病毒作用增强。二、在体内抗单纯疱疹病毒I型试验中显示，扇贝多糖(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)能明显延长HSV-I感染小鼠的平均存活时间，降低小鼠的死亡率；病理检测结果显示，扇贝多糖能减轻HSV-I感染小鼠各组织器官的病理损害。三、对HSV-I感染小鼠免疫功能的影响实验结果显示，扇贝多糖(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)能显著增强HSV-I感染小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性，促进脾淋巴细胞转化增殖，并能增加小鼠的胸腺指数，说明该药能提高HSV-I感染小鼠的免疫功能。试验结果表明，扇贝多糖在体内外均有抗单纯疱疹病毒I型作用，可抑制病毒的复制并阻断病毒侵入细胞，其抗病毒作用与其增强机体免疫功能有关。具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明及其效果做进一步的阐述。实施例1抗单纯疱疹病毒制剂的制备用蒸馏水配成含质量百分比为5%的扇贝多糖溶液，加入质量百分比的活性炭搅拌，加热温度为80°C，经离心，收集上清液，弃去沉淀；对上清液进行抽滤，进一步除去活性炭及其吸附的蛋白质及色素，得清液；将清液先后应用IOOk和5k滤膜超滤，得分子量为5kIOOk的滤液；将滤液冷冻干燥，即制得浅黄色粉末状、分子量为5kIOOk的纯化扇贝多糖。将经纯化的扇贝多糖研磨过80目筛，与药用淀粉按11-10重量比例混勻制成50mg或IOOmg规格的胶囊。或将经纯化的扇贝多糖研磨过80目筛，按下述方法制成50mg或IOOmg规格的片剂。片剂的制备扇贝多糖50mg乳糖50mg淀粉95mg硬脂酸镁5mg共200mg各自称量出上述各种成分，将扇贝多糖结晶粉碎过80目筛的粉末、乳糖、淀粉混合，用湿式法制粒，干燥，整合后与硬脂酸镁混合，压片，制成每片重量200mg的片剂。胶囊的制备扇贝多糖50mg淀粉145mg硬脂酸镁5mg共200mg各自称量出上述各种成份，与过80目筛的扇贝多糖结晶粉末混合均勻，慎充胶囊，制成每个纯重200mg的胶囊剂。实施例2扇贝多糖体外抗单纯疱疹病毒I型效应的研究以非洲绿猴肾细胞为宿主细胞的体外抗单纯疱疹病毒I型实验1材料扇贝多糖(GAG)青岛大学医学院药理学教研室扇贝多糖课题组提供的粉剂，实验时用无血清DMEM培养基配成不同浓度的溶液。非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，由农业部动物检疫所惠赠，于DMEM基础培养液中加入10%的新生牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，置5%CO2孵箱中37°C培养。每三天传代一次。标准单纯疱疹病毒I型(HSV-I)SM44株由中国协和医科大学提供。在Vero细胞中传代经过三次冻融后离心(3000rpm，lOmin)，取上清，分装后_86°C保存。DMEM干粉培养基Hyclone公司产品；胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)杭州四季青生物工程材料有限公司，批号030909；青霉素钠(Penicillin):山东瑞阳制药有限公司，批号06071701；硫酸链霉素(Str印tomycin)山东鲁抗医药股份有限公司，批号060114；胰蛋白酶(Trypsin1:250):AMRESC0公司，批号1299A77；乙二胺四乙酸二钠(EDTA)青岛海泰生物技术有限公司分装；D-Hanks液美国Hyclone公司，批号AMJ17160F;四甲基偶氮唑盐(MTT):Sigma公司；酸性异丙醇上海亨达化学试剂有限公司。ELx800型酶联免疫检测仪美国BioTek公司2实验方法2.1药物预处理将扇贝多糖用DMEM培养液配制成8mg/mL母液，0.22μm孔径滤膜过滤灭菌，4°C冰箱保存备用。实验时用DMEM培养液将药物稀释到所需浓度。2.2实验分组实验分为正常细胞对照组，病毒对照组，扇贝多糖各浓度组(1600μg/ml、800μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml)。2.3病毒毒力测定(TCID5tl的测定)病毒毒力测定用病毒的致50%组织感染量(50%tissuecultureinfectivedose,TCID50)表示病毒毒力。将HSV-I病毒原液进行连续10倍的递次稀释，稀释浓度为ΙΟ"110_9；将Vero细胞接种于无菌96孔板，长成单层后，每孔接种不同浓度的病毒稀释液100μ1，吸附1.5h后换维持液继续培养，每个稀释度6个复孔，并设6孔正常细胞对照。每日在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)。记录病变程度和孔数，待细胞病变稳定，以感染细胞的病变不再发展，而对照细胞仍完好为准，判定结果。计算病变细胞占全部细胞的百分率及平均细胞病变百分率。根据Reed-Muench法计算病毒的TCID5(1。2.4药物对Vero细胞的毒性测定将Vero细胞悬液稀释成1X105/mL，接种于培养板中，24h后换为含不同浓度的扇贝多糖(1600、800、400、200、100、50、25μg/ml)的维持液，每药物浓度设6个复孔，于5%CO2孵育箱中37°C连续培养72h。并先后加入MTT和二甲基亚砜(DMSO)，用酶联免疫检测仪于波长570nm处测定各组细胞的吸光度(A值)，并计算Vero细胞存活率％=药物组平均吸光度值/正常对照组平均吸光度值X100%。2.5药物对HSV-I的直接杀伤作用将不同浓度的扇贝多糖(100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml)与等量100TCID5(1HSV_I病毒液混合后，置37°C作用4h后，将孵育液加入单层Vero细胞孔中，每孔200μ1，37°C吸附1.5h，弃上清换为2%DMEM维持液，每孔200μ1，继续培养72h，每日在倒置显微镜下观察记录由病毒引起的细胞病变(CPE)。同时设病毒对照组、正常细胞对照组，每组设6个复孔。72h后，当病毒对照组细胞病变达75%以上时，采用MTT法测各组细胞A值。2.6药物对HSV-I复制的抑制作用将Iootcid50HSV-I病毒液接种到单层Vero细胞孔中，每孔100μι，37°c吸附1.5h，弃病毒液换含不同浓度的扇贝多糖(100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml)维持液，每孔200μ1，继续培养72h。观察测定指标同上，并计算药物抗病毒有效率(effectiverate,ER%)=(药物组的平均吸光度值-病毒对照组的平均吸光度值)/病毒对照组的平均吸光度值X100%。2.7药物对HSV-I侵入细胞的阻断作用将不同浓度的扇贝多糖(100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml)直接加到单层Vero细胞孔中，每孔200μ1，每个药物浓度设6个复孔，另设正常细胞对照组，于5%CO2孵育箱中37°C连续培养6h后，弃上清液。然后将IooTCID5ciHSV-I病毒液接种到单层Vero细胞孔中，每孔ΙΟΟμ1，37°C吸附1.5h后，弃病毒液换为不含扇贝多糖的2%DMEM维持液，每孔200μ1，继续培养72h，观察测定指标同上，并计算药物抗病毒有效率。2.8药物对HSV-I的综合作用将不同浓度的扇贝多糖(100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml)与等量100TCID5(1HSV_I病毒液混合后直接接种到单层Vero细胞孔中，每孔200μ1混合液，37°C吸附1.5h，弃上清换为含同前浓度的扇贝多糖维持液，每孔200μ1，继续培养72h，每日在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)并记录结果。记录标准同上。同时设病毒对照组、正常细胞对照组。每组设6个复孔。72h后，当病毒对照组细胞病变达75%以上，MTT法测A值，并计算药物抗病毒有效率。2.9扇贝多糖抑制病毒复制作用的时效关系不同药物处理时间时扇贝多糖对病毒的抑制作用将IOOTCID5ciHSV-I病毒液接种到单层Vero细胞孔中，每孔100μ1，37°C吸附1.5h，弃病毒液换含浓度为100μg/ml的扇贝多糖维持液，每孔200μ1，于5%CO2孵育箱中37°C分别培养12h，24h，48h，72h后取出扇贝多糖维持液，换为不含扇贝多糖的2%DMEM维持液继续培养。每日在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)并记录结果。记录标准同上。同时设病毒对照组、正常细胞对照组，每组设6个复孔。自给药72h后，当病毒对照组细胞病变达75%以上时，MTT法测A值，并计算药物抗病毒有效率(effectiverate,ER%)。3结果3.1病毒毒力测定按Reed-Muench法测得病毒的TCID5tl为10_4人实验用病毒浓度为100TCID5(1。3.2药物对细胞毒性测定镜下显示，经扇贝多糖处理过的细胞形态规则，排列紧密有序，无脱落、融合和圆缩等现象，与正常细胞的形态无明显差别。同时MTT检测结果也显示扇贝多糖各浓度组细胞增殖活性与正常对照组差异无显著性(P>0.05)。表明扇贝多糖在25-1600μg/ml范围内对Vero细胞无毒性作用。实验结果还显示，随着浓度升高，扇贝多糖对Vero细胞有促增殖作用，细胞存活率明显增高，其中浓度为1600μg/ml时作用最为明显，与正常细胞对照组相比有显著差别(P<0.05)。见表1.1。表1.1不同浓度的扇贝多糖对Vero细胞增殖活性的影响(η=6)、组别A值细胞存活率正常细胞对照组0.592±0.09扇贝多糖25pg/ml0.601±0.07101.52%扇贝多糖50pg/ml0.609土0.05102.87%扇贝多糖100pg/ml0.609土0.04102.87%扇贝多糖200pg/ml0.669±0.13113.00%扇贝多糖400ng/ml0.680土0.14114.86%扇贝多糖SOOpg/ml0.692±0.09116.89%扇贝多糖1600ng/ml0.791±0.05°133.64%a:P<0.05与正常细胞对照组相比3.3药物对HSV-I的直接杀伤作用镜下显示，HSV-I感染所致的Vero细胞CPE特征为细胞肿胀、变圆、细胞间融合、脱落、碎裂。扇贝多糖各浓度组的Vero细胞均出现典型的CPE；同时MTT结果也显示各药物组细胞增殖活性与病毒对照组差异无显著性(P>0.05)，表明实验浓度的扇贝多糖不能直接灭活HSV-I，见表1.2。3.4药物对HSV-I侵入细胞的阻断作用与病毒对照组相比，经过扇贝多糖预处理过的各组细胞活性明显增强(P<0.01)，CPE特征明显减轻，扇贝多糖对细胞的保护程度与其浓度成正相关，随着浓度的增加，其抗病毒有效率也随之提高。结果表明，扇贝多糖能有效地阻断HSV-I对细胞的侵入，起到预防感染的作用。见表1.2。表1.2扇贝多糖对HSV-I侵入Vero细胞的阻断作用和HSV-I直接杀伤作用U士s,η=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>a:P<0.01，与正常细胞对照组相比.b:P<0.01，与病毒对照组相比；3.5药物对HSV-I复制的抑制作用与病毒对照组相比，扇贝多糖各浓度组细胞的CPE特征明显减弱，细胞活性增强(P<0.01),抗病毒有效率达50%以上，而且有浓度依赖性。结果表明25100μg/ml浓度的扇贝多糖能明显抑制HSV-I的复制。见表1.3。3.6药物对HSV-I的综合作用病毒对照组细胞同样出现典型的CPE特征，细胞增殖活性明显低于正常细胞(P<0.01)。扇贝多糖(25100yg/ml)能有效的保护感染的细胞，使细胞活性增强(P<0.01)，而且随着药物浓度的增加，抗病毒有效率逐渐增加。其中浓度为100yg/ml的扇贝多糖作用最为明显，药物抗病毒有效率达到52.60%。显示出不同浓度的扇贝多糖均能保护经HSV-I感染的细胞。见表1.3。表1.3扇贝多糖对HSV-I复制的抑制作用和对HSV-I的综合作用(5η=6)\对HSV-I复制的影响‘对HSV-I的综合作用CPEAfiER%CPEAMER%病毒对照组+++0.172±0.03"+++0.286土0.04a正常细胞对照组一0.395土0.03—0.517土0.06扇贝多糖25|ig/ml++0.258±0.05b50.00%++0.396土0.02*38.40%扇贝多糖50ng/ml++0.279±0.03b62.21%++0.422±0.06*47.20%扇贝多糖lOOpg/ml+0.317±0.0484.30%+0.437±0.04b52.60%a:P<0.01，与正常细胞对照组相比.b=P<0.01，与病毒对照组相比；3.7扇贝多糖不同作用时间对病毒的抑制效应扇贝多糖在持续用药24h、48h、72h后细胞的CPE特征明显减弱，细胞增殖活性增强(P<0.01)，而且随着药物作用时间的延长，保护作用逐渐增强。当药物作用72h时，药物抗病毒有效率达88.64%，与扇贝多糖作用12h、24h组有显著性差别(P<0.01)。见表1.4。表1.4扇贝多糖不同作用时间对病毒的抑制效应($irS，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>a:P<0.01，与正常细胞对照组相比.b:P<0.01与病毒对照组相比；实施例3扇贝多糖体外抗单纯疱疹病毒I型效应的研究以人宫颈癌细胞(Hela细胞)为宿主细胞的体外抗单纯疱疹病毒实验1材料1.1药品与病毒同实施例2。1.2细胞人宫颈癌细胞(Hela细胞)，由青岛大学微生物教研室惠赠。2实验方法同实施例2。3结果3.1药物对细胞毒性测定结果扇贝多糖(50-800μg/ml)处理过的Hela细胞形态及增殖活性与空白对照组细胞的无明显差别(P>0.05)。表明扇贝多糖在50-800μg/ml范围内对Hela细胞无毒性作用。见表1.5。表1.5不同浓度的扇贝多糖对Hela细胞增殖活性的影响(飞±srη=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.2药物对HSV-I的直接杀伤作用镜下观察和MTT检测结果显示，扇贝多糖50200μg/ml各浓度组Hela细胞的CPE特征和细胞增殖活性与病毒对照组差异无显著性(P>0.05)，说明以上各浓度扇贝多糖在Hela细胞内也不能直接灭活HSV-I，见表1.6。3.3药物对HSV-I侵入细胞和病毒复制的抑制作用经过扇贝多糖预处理和后处理的各组Hela细胞活性明显增强(P<0.01)，CPE特征明显减轻，而且扇贝多糖对细胞的保护程度与其浓度成正相关，抗病毒有效率随浓度的增加而提高。结果表明，扇贝多糖能有效地阻断HSV-I对Hela细胞的侵入，起到预防感染的作用，同时还能抑制病毒的复制，其中浓度为200yg/ml的扇贝多糖作用最为明显，抗病毒复制的有效率高达92.11%。见表1.6、1.7。表1.6扇贝多糖对HSV-I侵入Hela细胞的阻断作用和对HSV-I直接杀伤作用(2土s,η=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>a:P<0.05，与正常细胞对照组相比.b=P<0.05，与病毒对照组相比·3.4药物对HSV-I的综合作用与病毒对照组相比，扇贝多糖(200μg/ml、100l·!g/ml、50l·!g/ml)能有效的保护感染的Hela细胞，使细胞活性增强(P<0.01)。而且随着药物浓度的增加，细胞的CPE特征逐渐减弱，药物抗病毒有效率逐渐增加。其中浓度为200yg/ml的扇贝多糖作用最为明显，药物抗病毒有效率达到82.4%。见表1.7。表1.7扇贝多糖对Hela细胞内HSV-I复制的抑制作用和对HSV-I的综合作用(王±s,η=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>a:P<0.01，与正常细胞对照组相比.b=P<0.01，与病毒对照组相比·实施例4扇贝多糖(GAG)对HSV-I感染小鼠保护作用的研究1材料和试剂1.1药品GAG青岛大学医学院药理学教研室提供阿昔洛韦粉剂规格0.25g，湖北潜江制药股份有限公司，批号20060305Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)Sigma公司，BOSTER分装中性树胶加拿大进口分装，上海化学试剂厂1.2动物清洁级昆明小鼠，雌雄各半，质量20士2g，青岛大学医学院实验动物中心提供。1.3病毒标准单纯疱疹病毒I型(HSV-I)SM44株由中国协和医科大学提供。在Vero细胞中传代，毒种于_86°C保存。按Reed-Muench法测得病毒的TCID5tl为10_47。实验用病毒浓度为100TCID5。。1.4主要仪器和设备Leitzl515型切片机西德Leitz公司TC2323型CO2培养箱美国FormaScientific公司光学显微镜日本Olympus公司01YMPUSFl.8型数码相机日本Olympus公司超净工作台苏净集团安泰公司电子计算机病理图像分析系统北京航空航天大学，北京协和医院2实验方法2.1小鼠病毒模型的建立给小鼠接种病毒将HSV-I在Vero细胞中连续传代，收集病毒。按Reed-Muench法测得病毒的TCID5tl为10_47。将HSV-I病毒原液稀释成为IOOTCID5ci浓度，在无菌条件下给予小鼠腹腔注射病毒悬液0.2ml/只。2.2分组及给药将48只小鼠按质量随机分成6组空白对照组(0.9%生理盐水)；病毒对照组；SS-GAG低剂量组(10mg/kg)；SS-GAG中剂量组(20mg/kg)；SS-GAG高剂量组(40mg/kg)；阿昔洛韦组(0.lg/kg)，均为腹腔注射给药，连续给药11天。自开始给药的第4天给小鼠接种病毒(空白对照组除外)。2.3病毒感染小鼠体重、生命延长率和死亡率的测定每两天称量一次小鼠的体重，观察各组小鼠接种HSV-I病毒后体重的变化和全身的反应，包括活动状态、肌张力、毛发、排便、摄食、呼吸等。记录各组小鼠的存活时间、死亡率，并计算生命延长率。生命延长率％=乡合l^i〒肖寸照1〒肖对照组平均存活天数2.4统计学处理数据以表示，多个均数间比较采用方差分析，然后进行两两比较的q检验。采用SPSS12.O软件操作，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有显著性统计学意义。2.5病理组织学检测于末次给药后将小鼠摘除眼球取血处死，并于无菌条件下取肝脏、肾脏、脾脏、心脏、脑等组织，置入10%福尔马林溶液中，经石蜡包埋、切片、HE染色，于光镜下进行病理检测。3结果3.1扇贝多糖对HSV-I感染小鼠的疗效观察病毒对照组小鼠感染病毒后第3d出现症状，表现为饮食量减少、倦缩、活动减少、耸毛、瘦弱、体重下降、腹部肿大、衰竭，发病l-3d内死亡，解剖后肉眼观察发现小鼠的肝、肾、脾瘀血。给予不同剂量的扇贝多糖、阿昔洛韦的大部分小鼠发病症状较轻，在发病后2-3d内逐渐恢复正常，或者不出现任何发病症状，发育和生长正常。且小鼠体重均有不同程度的提高。结果表明，扇贝多糖对小鼠有一定的保护作用。见表2.1。表2.1扇贝多糖对HSV-I感染小鼠体重(g)的影响(η=8，；士J<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>a:P<0.01，与正常对照组相比.b0.05，与病毒对照组相比c=P<0.01，与病毒对照组相比3.2扇贝多糖对HSV-I感染小鼠存活时间的影响与病毒对照组相比，扇贝多糖10mg、20mg、40mg/kg各剂量能明显延长小鼠的平均存活时间(P<0.01)，并且能降低感染组小鼠的死亡率，其中，扇贝多糖40mg/kg剂量组与阳性对照组小鼠全部存活。见表2.2。表2.2扇贝多糖各组对HSV-I感染小鼠存活时间的影响(η=8，？±5)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>a:P<0.01与正常对照组相比b:P<0.01与病毒对照组相比3.3扇贝多糖对HSV-I感染小鼠组织器官病理形态学的影响(1)小鼠脑组织的病理变化由病理切片显示，病毒对照组小鼠脑细胞胞体肿胀变圆，胞核偏位，有多核细胞，胞核嗜酸性增强，有淋巴细胞及单核细胞浸润等病毒性脑炎的病理变化。扇贝多糖各剂量组小鼠脑组织相应病变均有明显减轻，仅有少量的细胞变化及炎细胞浸润。其中扇贝多糖高剂量组病变减轻最为明显。(2)小鼠肝脏病理变化肉眼观察，病毒对照组小鼠肝脏充血，水肿明显。扇贝多糖各剂量组及阿昔洛韦组小鼠肝脏仅出现轻度充血、水肿。由病理切片显示，病毒对照组小鼠肝细胞肿胀变圆，嗜酸性增强，炎性浸润。与病毒对照组相比，扇贝多糖中、低剂量组小鼠只出现了少量肝细胞肿胀变圆及的炎细胞浸润，而扇贝多糖高剂量组与阿昔洛韦组均未出现明显的病理变化。(3)小鼠心脏的病理变化肉眼观察，各实验组之间小鼠心脏均未出现明显差别。由病理切片显示，病毒对照组小鼠心脏有间质水肿，有大量炎细胞浸润等急性病毒性心肌炎的病理变化。扇贝多糖各剂量组及阿昔洛韦组的心脏病理变化比较轻微，仅出现轻度水肿及少量的炎细胞浸润，而且各治疗组之间效果差别不明显。(4)小鼠肾脏的病理变化肉眼观察，各实验组之间小鼠肾脏均未出现明显差别。由病理切片显示，病毒对照组小鼠肾脏皮质增厚，纹理模糊，毛细血管丛细胞数目增多，肾小球体积增大，内皮细胞肿胀，有散在的出血点及炎细胞浸润。各治疗组的相应病理变化明显减轻，而且各治疗组之间效果没有明显差异。(5)小鼠脾脏的病理变化肉眼观察，病毒对照组小鼠脾脏有非常明显的充血、水肿表现。扇贝多糖中、低剂量组有轻度的充血水肿表现，扇贝多糖高剂量组及阿昔洛韦组未出现明显的病理变化。由病理切片显示，病毒对照组小鼠脾脏的脾窦扩张、淤血，有散在的出血点。扇贝多糖中、低剂量组仅有轻度的脾窦扩张、淤表现。扇贝多糖高剂量组及阿昔洛韦组未出现明显的病理变化。实施例5扇贝多糖对HSV-I感染小鼠免疫功能的影响研究1材料和试剂同实施例4。2实验方法2.1小鼠病毒模型的建立、分组及给药同实施例4。2.2标本处理小鼠经连续给药11天后，将其摘除眼球取血处死，用无菌注射器吸取腹腔灌洗液，制备腹腔巨噬细胞悬液。无菌取脾脏，用研钵碾碎，200目的钢丝网过滤，PBS液冲洗，制成单个脾淋巴细胞悬液。并分别剥离各组小鼠胸腺、脾脏，称其质量，并计算其胸腺指数和脾脏指数。胸腺指数(脾脏指数)=胸腺或脾^^的质量(g)χ100%小鼠的体重(g)2.3腹腔巨噬细胞(ΡΜΦ)吞噬能力的测定取上述腹腔巨噬细胞悬液，调整细胞浓度至4XlO6Ail后加至96孔板中，置37°C、5%CO2培养箱孵育4h，加0.075%中性红溶液，孵育30min后，加入腹腔巨噬细胞(ΡΜΦ)溶解液，置4°C冰箱过夜，次日置酶标仪570nm处测定各孔吸收度(A值)，吸收度反映了ΡΜΦ内中性红的含量，即腹腔巨噬细胞(ΡΜΦ)吞噬能力。2.4T、B淋巴细胞转化活性的测定取上述脾淋巴细胞悬液，调整细胞数为5X106/ml，加入96孔培养板上，每孔0.2ml。T淋巴细胞转化试验，在孔中加入有丝分裂原ConA(终浓度5g/ml)；B淋巴细胞转化试验，在孔中加入有丝分裂原LPS(终浓度50g/ml)；对照孔不加任何诱导剂，置37°C、5%CO2培养箱培养72h，加入MTT液，4h后每孔加Iml酸性异丙醇，于酶标仪570nm处测A值，用加ConA或LPS孔的A值减去不加ConA或LPS孔的A值代表淋巴细胞的增殖能力。2.5统计学处理同实施例4。3结果3.1扇贝多糖对HSV-I感染小鼠胸腺指数、脾指数的影响与病毒对照组相比，扇贝多糖10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg能显著提高HSV-I感染小鼠的胸腺指数(P<0.01)，而且与扇贝多糖剂量呈正性相关关系。其中，扇贝多糖40mg/kg组小鼠的胸腺指数明显高于阳性药物对照组(P>0.05)，但扇贝多糖各剂量组对HSV-I感染小鼠的脾指数没有影响。见表3.1。表3.1扇贝多糖对HSV-I感染小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响(n=8，？±s)M胸腺指数(mg/10g)脾指数(mg/10g)正常对照组31.37士6.9476.23土8,68病毒对照组17.50±1.83“83.5土7.63扇贝多糖(10mg/kg)31.37士2.32689.64±6.57扇贝多糖(20mg/kg)36.22±7.13*94.41±6.69扇贝多糖(40mg/kg)46.18土5.59δ101.13±9.31阳性药物对照组_34.64士7.43&_89.79土17.76α:Ρ<0.01，与正常对照组相比b:Ρ<0.01，与病毒对照组相比3.2扇贝多糖对HSV-I感染小鼠腹腔巨噬细胞(ΡΜΦ)功能的影响通过ΡΜΦ吞噬中性红试验发现，扇贝多糖在1040mg/kg浓度时明显能提高小鼠ΡΜΦ的吞噬能力，与病毒对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。提高的程度与扇贝多糖剂量呈正性相关关系。其中，扇贝多糖40mg/kg组明显高于阳性药物对照组，表明扇贝多糖能增强小鼠的免疫功能，而且比阳性药物阿昔洛韦更有优势。见表3.2。表3.2扇贝多糖对HSV-I感染小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响(η=8J士组别ΜΦ吞噬能力正常对照组0.213土0.027病毒对照组0.102±0.013fl扇贝多糖(IOmg^g)0.279土0.035*扇贝多糖(20mg/kg)0.303±0.026δ扇贝多糖(40mg/kg)0.357士0.032b阳性药物对照组0.257±0.0396\a:P<0.Ol与正常对照组相比.b:P<0.01，与病毒对照组相比3.3扇贝多糖对HSV-I感染小鼠脾淋巴细胞功能影响病毒对照组小鼠脾淋巴细胞功能活性明显低于与正常对照组(P<0.01)，扇贝多糖10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg均能够提高HSV-I感染小鼠的脾淋巴细胞的转化增殖活性，与病毒对照组相比有显著性差异(P<0.01)。说明扇贝多糖能显著提高细胞免疫功能，对HSV-I引起的免疫抑制有拮抗作用。结果见表3.3。表3.3扇贝多糖对HSV-I感染小鼠脾淋巴细胞功能影响(η=8，5土^)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>a:P<0.01与正常对照组相比b:P<0.01，与病毒对照组相比实施例6扇贝多糖的急性毒性试验1试验材料动物KM小鼠(二级)，体重18_22g，由青岛市实验动物中心提供，合格证号SCXK(鲁)20030010。药物扇贝多糖。2试验方法1、动物分组KM小鼠50只，体重18_20g，，雌雄兼有，随机分为5组，每组10只；试验前禁食12h，自由饮水；控制室温在20士2°C。2、药品的配备扇贝多糖用生理盐水配制成水溶液供试验使用。3、给药方法一次性灌胃给药(ig)，剂量分别为3.10，2.37，1.78，1.33，0.75g.kg-l，组间比为k=0.75，ig容积0.6ml/只。观察给药后7d动物的一般表现。4、半数致死量(LD5tl)测定记录各组动物7d的死亡和存活情况，计算死亡率，采用孙氏改良法计算LD5Q。3试验结果1、扇贝多糖的急性毒性试验动物的一般表现中毒动物表现为活动减少、行走不稳等。存活动物观察7d，生长良好，体重增加，尸检，心肝肾脑等组织肉眼观察未发现异常变化。2、半数致死量(LD50)的测定为用药后7d的死亡率，采用孙氏改良法计算，扇贝多糖对小鼠经口一次用药的LD5tl=1726士376mg·kg_l(95%可信区间为13502102mg·kg-1)根据世界卫生组织(WHO)对外源化学物的五级毒性分级标准，扇贝多糖为低毒药物。本发明通过上述体内外实验，结果表明1、扇贝多糖在251^/1111、501^/1111、1001^/1111浓度时能保护被HSV-I感染的非洲绿猴肾细胞(Vero)，使细胞增值活性增强，HSV-I导致的病变效应减弱，并抑制病毒的复制，阻断病毒的吸附作用(P<0.01)。但未发现其对HSV-I有直接杀伤作用。扇贝多糖在25-1600μg/ml浓度范围内对Vero细胞无明显毒性(P>0.05)。2、时效关系研究显示，扇贝多糖的抗病毒效应与给药时间有关，在持续给药2472小时后扇贝多糖能保护HSV-I感染的Vero细胞，使细胞活性增强，随着用药时间的延长，其抗病毒作用增强(P<0.01)。3、扇贝多糖在50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml浓度时能保护被HSV-I感染的人宫颈癌(Hela)细胞，减弱HSV-I导致的病变效应，抑制病毒的复制，阻断病毒的吸附作用，使细胞增值活性增强(P<0.05,P<0.01)。未发现其对HSV-I有直接杀伤作用。扇贝多糖在50-800μg/ml浓度范围内对Hela细胞无明显毒性(P>0.05)。4、扇贝多糖在10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg剂量时能明显延长HSV-I感染小鼠的平均存活时间，并且能显著降低小鼠的死亡率(P<0.01)。5、病理结果显示，扇贝多糖在10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg剂量时能减轻HSV-I感染小鼠的心、脑、肝、脾、肾等组织器官的病理损害。6、扇贝多糖在10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg浓度时能显著增强感染HSV-I小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性(P<0.01)，促进脾淋巴细胞转化增殖(P<0.01)，并且能显著提高感染HSV-I小鼠的胸腺指数(P<0.01)。上述研究结果显示，扇贝多糖体内外给药均有一定的抗单纯疱疹病毒I型作用。可与其抑制病毒复制和阻断病毒侵入细胞，其抗病毒作用与其增强机体免疫功能有关。7、扇贝多糖对小鼠经口一次用药的半数致死量LD5tl是1726士376mg·kg-l(95%可信区间为13502102mg·kg_l)，故扇贝多糖为低毒药物，副作用小，安全性高。权利要求扇贝多糖在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用。2.根据权利要求1所述的扇贝多糖在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用，其特征在于扇贝多糖通过下述方法纯化并限定其分子量范围用蒸馏水配成含质量百分比为5%的扇贝多糖溶液，活性炭吸附、加热；经离心、抽滤；将抽滤液先后应用100k和5k滤膜超滤；将滤液冷冻干燥后得浅黄色粉末状、分子量为5k100k的纯化扇贝多糖；将经纯化的扇贝多糖研磨过80目筛，与药用淀粉按11-10重量比例混勻制成50mg或lOOmg规格的胶囊；或将经纯化的扇贝多糖研磨过80目筛，按湿法制粒工艺制成50mg或lOOmg规格的片剂。3.根据权利要求1所述的扇贝多糖在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用，其特征在于加入质量百分比的活性炭搅拌，加热温度为80°C。4.根据权利要求1所述的扇贝多糖在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用，其特征在于扇贝多糖为天然产物，是由扇贝在加工干贝后所剩余的废弃物——扇贝内脏团中提取出的活性成分。全文摘要本发明涉及一种扇贝多糖在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用。用蒸馏水配成含质量百分比为5％的扇贝多糖溶液，活性炭吸附、加热；经离心、抽滤；将抽滤液先后应用100k和5k滤膜超滤；将滤液冷冻干燥后得浅黄色粉术状、分子量为5k～100k的纯化扇贝多糖；将经纯化的扇贝多糖研磨过80目筛，与药用淀粉按1∶1-10重量比例混匀制成50mg或100mg规格的胶囊；或将经纯化的扇贝多糖研磨过80目筛，按湿法制粒工艺制成50mg或100mg规格的片剂。本发明所述的扇贝多糖为天然产物，其毒性低，副作用小，安全性高，具有良好的抗单纯疱疹病毒作用。文档编号A61P31/22GK101829141SQ20101018158公开日2010年9月15日申请日期2010年5月25日优先权日2010年5月25日发明者刘赛,鞠传霞申请人:青岛大学