专利名称：力生长因子多肽及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生长因子，具体属于力生长因子多肽(MGF41)及其制备方法和用途。
背景技术：
力生长因子(Mechano growth factor，MGF)是Goldspink等发现的一种机械牵 张导致肌肉局部增长的调控因子。肌肉在力的刺激下，胰岛素样生长因子I (Insulin-like growth factor, IGF-I)基因通过选择性剪切产生两种异构体，一种与肝脏型IGF-I相类 似，命名为肌肉型IGF-KIGF-I Ea)；另一种因对力学刺激十分敏感，故命名为力生长因子 (MGF)。研究发现，MGF不仅是一种生长因子，而且还是一种修复因子。MGF的功能，主要与 其C端结构域有关。MGF在正常生理状态下不太常见，但当骨骼肌或心肌在机械负荷加大的 状态下表达增加，参与肌肉损伤后修复的过程。MGF不仅存在于骨骼肌、心肌中，在神经系统 和造骨细胞中也发现其具有修复损伤的作用。近年来研究发现MGF能够明显提高营养不良 肌肉和肌萎缩侧索硬化(ALS)肌肉中干细胞的数量，并起到修复作用；MGF的导入能使营养 不良的肌肉强度提高35%且具有明显的保护神经的作用。因此，MGF作为肌肉萎缩和肌肉 /神经损伤修复的治疗药物具有广泛的应用前景。为了获得MGF，国内外专家已经开展了一些研究工作，但是结果并不理想，由于 MGF不稳定，在工程菌中的表达易形成包涵体，较难拿到纯品。因此寻求一种可替代MGF，并 容易操作获得的产品十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种力生长因子多肽及其制备方法和用途。本发明提供的一种力生长因子多肽(MGF41)是力生长因子C端41个氨基酸的多 肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO=I0本发明提供的编码力生长因子多肽(MGF41)的核苷酸序列由126个核苷酸组成，包 括一个阅读框和终止密码子TAA。其核苷酸序列SEQ ID NO :2。—种含有编码MGF41的核苷酸序列的载体，它是将编码MGF41的核苷酸序列克隆进 表达载体后获得的重组质粒pRSETc-MGF41。一种MGF41工程菌，为原核表达系统，它含有如前所述的载体。是将所述的 PRSETc-MGF41重组质粒转化至一种菌中，例如大肠杆菌BL21 (DE3)，构建成工程菌株，例如 pRSETc-MGF41/BL21。MGF41的制备方法，包括如下步骤A)构建 pRSETc_MGF41 表达载体； B)按照标准法转化大肠杆菌BL21，构建大肠杆菌工程菌株pRSETc-MGF41/BL21，将 工程菌接种在含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C，150r/min振荡培养至OD6tltl为0. 5-0. 7， 加入IPTG使终浓度为0. 5mmol/L，诱导表达5小时； C)收集菌体，破碎细胞，离心，将上清经阳离子交换层析获得目的蛋白，冷冻干燥。
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采用CCK-8法对纯化的MGF41的生物学活性进行研究。实验证明，MGF41具有促成 肌细胞C2C12增殖的活性，该多肽可用于制备促细胞增殖的药物。与现有技术相比本发明的优点和效果本发明MGF41多肽的制备方法简单，一步纯 化即可得到目的蛋白，且该蛋白稳定性较好，并具有很好的促细胞增殖的生物学活性。
图 IMGF41 的 Tricine-SDS-PAGE 图。图2MGF41促细胞增殖活性。
具体实施例方式实施例1:MGF41表达载体的构建以实验室保存的pExSecI-MGF为模板，利用特异性引物Forward primer :gat at gga tcc gctagc get cgc tct gtc cgt gcc cag和Reverse primer :cgc gc ctc gag tta ctt gtg ttc ttc aaa tgt ac进行PCR扩增，所得扩增产物经OMEGA胶回收试剂盒回收目的 基因，然后用Nhe I和Xho I双酶切，酶切产物与经同样双酶切的载体pRSETc通过T4 DNA 连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑取阳性克隆，进行菌落PCR及酶切鉴定。经 DNA测序分析表明，MGF41已克隆至pRSETc，将此重组质粒命名为pRSETc_MGF41。MGF41的表达，纯化及活性测定 将重组质粒pRSETc-MGF41转化大肠杆菌BL21 (DE3)，构建大肠杆菌工程菌株 pRSETc-MGF41/BL21，将工程菌接种在含氨苄青霉素的LB培养基中，分别选用不同的诱导剂 浓度(0. 1-l.Ommol/L)，诱导时间(l_6h)和诱导温度(37°C，30°C，16°C )对目的蛋白进行 表达。通过优化，最终选定在37°C，150r/min振荡培养至OD6tltl为0. 5-0. 7，加入IPTG使终 浓度为0. 5mmol/L，诱导表达5小时，进行目的蛋白的表达。最终收集菌体，破碎细胞，将全 菌和上清进行Tricine-SDS-PAGE分析，结果表明在约5KD处有表达条带，与预计的MGF41的 蛋白分子量大小相同(如图1，泳道3和4)。且目的蛋白大部分以可溶的方式表达。将上述获得的含有可溶表达蛋白上清通过SP Sepharose FF阳离子交换层析柱， PB缓冲液平衡后用含有IOmM-IM NaCl的PB缓冲液洗脱，收集目的蛋白，冷冻干燥即为MGF41 产品。该产品经Tricine-SDS-PAGE分析，为单一条带(如图1，泳道5)，这表明已获得了纯 度较高的MGF41产品。采用CCK-8法对纯化的MGF41的生物学活性进行检测，具体过程如下用DMEM高 糖培养基(含10%胎牛血清)在37°C，含5% CO2的培养箱中培养C2C12细胞，使其贴壁 生长，取对数生长期C2C12细胞，进行血清饥饿24h。用0. 25%胰酶消化贴壁生长的C2C12 细胞，再用不含血清的DMEM培养基重悬细胞，制成细胞悬液，并用血细胞计数板对细胞进 行计数，调整细胞个数为5X IO4个/mL。向96孔板中每孔加入上述细胞悬液100 μ L。在 37°C，含5% CO2的培养箱中孵育直到细胞完全贴壁。以不含小牛血清的DMEM培养液稀释 MGF41样品，加入96孔板中，样品浓度分别为0，5，10，50，500，10000ng/mL，每个浓度重复5 个孔，每孔加50 μ LMGF样品，以同浓度的BSA做对照。37°C，5% CO2条件下培养12h。每孔 加人10 μ LCCK-8溶液，370C ,5% CO2条件下继续孵育2h。用酶标仪测定波长450nm处的吸光度值。检测结果如图2，表明MGF41具有促细胞增殖的活性，可用于制备促细胞增殖的药 物。
权利要求
一种力生长因子多肽，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID NO1。
2.编码权利要求1的力生长因子多肽的核苷酸序列为SEQID NO :2。
3.一种载体，它含有权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种工程菌，其特征在于含有权利要求3所述的载体。
5.权利要求4所述工程菌为原核表达系统。
6.权利要求1所述的力生长因子多肽的制备方法，其特征在于，步骤如下A)构建pRSETc-MGF41表达载体；B)按照标准法转化大肠杆菌BL21，构建大肠杆菌工程菌株pRSETc-MGF41/BL21，将工程 菌接种在含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C，150r/min振荡培养至OD6tltl为0. 5-0. 7，加入 IPTG使终浓度为0. 5mmol/L，诱导表达5小时；C)收集菌体，破碎细胞，离心，将上清经阳离子交换层析获得目的蛋白，冷冻干燥。
7.权利要求1所述的力生长因子多肽在制备促细胞增殖药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种力生长因子多肽及其制备方法，以及该多肽的用途。本发明中的力生长因子多肽是力生长因子C端41个氨基酸的多肽，此多肽是力生长因子的活性区域。将这种多肽的核苷酸序列克隆到表达载体pRSETc中获得重组表达质粒pRSETc-MGF41，用该质粒转染大肠杆菌后得到表达力生长因子多肽的工程菌株，然后经过培养，纯化得到力生长因子多肽，该多肽具有促细胞增殖的功能，可用于制备促细胞增殖的药物。
文档编号A61P21/00GK101891812SQ20101022443
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者刘晓辉, 宋莉, 李卓玉, 祝文思, 董俊丽 申请人:山西大学