专利名称：一种造血靶向的辅助腺病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体为一种具有造血靶向的辅助腺病毒的 构建、制备及其在辅助依赖性重组腺病毒制备中的应用。
背景技术：
腺病毒载体以其宿主范围广(能同时感染分裂期细胞和非分裂期细胞)、安全性 高(不整合入宿主基因组DNA)、感染效率高、理化性质稳定、易制备等优点被广泛用于基因 治疗的基础和临床研究。经过多年发展，逐渐形成了三代腺病毒载体系统(1)第一代重组腺病毒载体去除了 E1/E3基因表达框，可携带7. 5kb左右的目的基 因，在HEK293细胞中包装得到重组腺病毒。但其存在载体容量小、免疫原性强、目的基因表 达时间短等缺点，限制了其在基因治疗中的应用。(2)第二代腺病毒载体，对E3/E4基因部分或全部序列进行了突变，载体容量扩增 至14kb，且免疫原性明显降低，但成熟腺病毒颗粒的产量低、滴度低，因此，第二代腺病毒在 基因治疗中的应用较少。(3)第三代腺病毒载体，即辅助病毒依赖性腺病毒载体(Helper-D印endent Adenoviral Vectors, HD_Ad)，去除了所有的病毒编码基因，仅保留5’和3’末端反向重复 序列(ITR)和包装信号(Ψ)。HD-Ad除能有效消除病毒抗原特异性的宿主免疫反应外，还 具有外源基因能在静止期细胞中长期稳定表达、载体容量大幅度提升等优点。因此，HD-Ad 在基因治疗的应用中具有良好的前景。第三代腺病毒载体的制备包括三个主要过程构建携带目的基因载体的成分(第 三代腺病毒载体)，制备辅助病毒(反式提供病毒复制包装等功能)和在包装细胞系中包装 病毒。目前，绝大部分HD-Ad的包装和扩增由Cre/loxp重组系统调控即在辅助病毒包装 信号两侧插入Ioxp序列，并在表达Cre酶的包装细胞系中制备病毒。Cre重组酶能有效切 除包装信号，从而抑制辅助腺病毒的包装和扩增，提高目的病毒的产量和质量。HD-Ad载体的血清型由辅助腺病毒决定，故不同血清型辅助腺病毒，可实现血清型 转换。基于5型腺病毒载体的辅助腺病毒，其包装得到的HD-Ad具有5型腺病毒相似的感 染能力和靶向性，因此，对造血细胞的感染效率低，严重影响了其在造血细胞基因治疗中的 应用。腺病毒靶向性的改造，可通过对纤维蛋白、五邻体蛋白、六邻体蛋白和外壳蛋白的 改造和修饰来实现。5型腺病毒感染靶细胞的过程，首先通过识别细胞表面的柯萨奇_腺病 毒受体(Coxsackie Virus and Adenovirus Receptor, CAR)来完成的，而造血细胞表面缺 乏CAR受体。为提高重组腺病毒对造血细胞的感染能力，本实验室鲁茁壮博士等将5型腺 病毒载体的纤维顶球部分替换为B组Ilp型腺病毒(Adllp)的纤维顶球序列。进一步研究 表明，改构的重组腺病毒Ad5/F Ilp能够明显增强对造血细胞的感染能力。综上所述，以Ad5/Fllp为基础，构建并制备具有造血靶向并适用于Cre/loxp系统 的辅助腺病毒，对于造血靶向的辅助依赖性重组腺病毒制备体系的建立及其在造血细胞基因治疗中的应用，具有十分重要的理论和现实意义。
发明内容
本发明的目的在于构建并制备一种造血靶向的辅助腺病毒，并将其应用于HD-Ad 的包装和扩增，提高HD-Ad对造血细胞的感染能力，最终为HD-Ad在造血细胞基因治疗中的 应用提供技术平台。本发明以Ad5/Fllp骨架质粒为基础，首先，对穿梭质粒pshuttle的包装信号 进行改造，并在包装信号两端加上Ioxp序列；其次，将改造的穿梭质粒与骨架质粒pAd5/ Flip在BJ5183感受态细胞中同源重组，获得辅助腺病毒质粒pAd5/FlIp-HV ；再次，辅助腺 病毒质粒经PacI线性化后，转染HEK293细胞，包装得到辅助腺病毒Ad5/Fllp_HV ；然后， 于293Cre4细胞中包装携带GFP的HD-Ad载体pC4HSU_GFP，得到辅助依赖性重组腺病毒 HD-Ad5/FlΙρ-GFP,并进行鉴定；最后，将鉴定正确的HD_Ad5/FlIp-GFP感染多种造血细胞， 评价其对造血细胞的感染能力。具体为1、含有Ioxp位点包装信号DNA片段的合成参考Ad5和辅助病毒H14的包装信号序列，明确包装信号中含有的关键DNA序列 (高度保守序列)为A1-A7。为降低辅助腺病毒包装信号的包装效率，减少辅助腺病毒污染， 提高目的病毒产量和质量。本发明采用不完全包装信号序列A1-A4即A1 :GTAAATTTG、A2 GTAAG ATTTG、A3 :AGTGAAATCTG、A4 :ATAATTTTG。IoxP位点是Cre重组酶的特异性重组位点，其由34bp组成，即ATAACTTCGTATAGCA TACATTATACGAAGTTAT,两端有13bp的反向重复(带下划线部分)，中间的8bp决定重组的方 向。将Ioxp位点置于包装信号两端，可在表达Cre酶的包装细胞系中有效切除包装信号。2、穿梭质粒pShuttle包装信号的改造将上述合成的带有Ioxp序列的DNA片段替换pShuttle载体上的包装信号，得到 重组质粒pShuttle-SynESbSh-SynEs)。改构的穿梭质粒携带不完全包装信号，可有效降低 包装效率；而在Cre重组酶作用下，Ioxp序列同源重组可切除包装信号。因此，由pSh-SynEs 制备的辅助病毒，其在293Cre4细胞中的包装效率能够得到有效控制，进而降低辅助病毒 的含量，保证HD-Ad的产量和质量。3、造血靶向辅助病毒的构建、制备及鉴定本实验室改构的造血靶向重组腺病毒Ad5/FllP能高效靶向造血细胞，利用其骨 架质粒pAd5/Fllp与上述改造的穿梭质粒pSh-SynES在BJ5183中同源重组，得到重组辅 助腺病毒质粒pAd5/Fllp-HV。经pacl线性化后，HEK293细胞包装获得辅助腺病毒Ad5/ Fllp-HV，并在基因组水平对其进行鉴定。鉴定正确的辅助病毒具有Ad5/Fllp的颗粒特性， 能有效靶向造血细胞。4、造血靶向HD-Ad及对照病毒的制备和鉴定为评价HD-Ad对造血细胞的感染效 率，分别以辅助腺病毒Ad5/Fl Ip-HV和 H14 (microbix公司商业化病毒)包装携带GFP的HD-Ad质粒pC4HSU_GFP (microbix公司商 业化载体)，分别于293Cre4细胞中制备得到辅助依赖性重组腺病毒HD_Ad5/FlIp-GFP和 HD-Ad/H14-GFP。将制备得到的病毒分别感染H印G2细胞，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的 表达。正确的HD-Ad可见绿色荧光蛋白的表达。
5、HD-Ad5/Fl Ip-GFP 和 HD-Ad/H14_GFP 的扩增和纯化HD-Ad5/F lIp-GFP与辅助腺病毒Ad5/Fllp_HV分别感染293Cre4细胞，大量扩 增目的病毒，经氯化铯密度梯度离心得到纯化的HD-Ad5/FlIp-GFP。HD_Ad5/FlIp-GFP禾口 Ad5/FlIp-HV的基因组大小分别为32Kb和29Kb左右，因此，氯化铯梯度离心可见HD_Ad5/ Fllp-GFP位于辅助病毒的下方。同时，HD-Ad/H14-GFP与辅助腺病毒H14扩增、纯化得到纯化的HD-Ad/H14_GFP。 HD-Ad/H14-GFP和H14的基因组大小分别为32Kb和36Kb左右，因此，可见HD-Ad/H14_GFP 位于辅助病毒上方。最后，检测HD-Ad5/FlIp-GFP 和 HD-Ad/H14_GFP 的纯度和滴度。6、HD_Ad5/ Fllp-GFP和HD-Ad/H14-GFP的造血细胞感染效率评价HD-Ad5/FlIp-GFP 和 HD-Ad/H14_GFP 以不同 MOI 感染白血病细胞系 K562、U937、 Juarket和HL-60后，于不同时间点，分别采用流式细胞术和荧光显微镜观察的其感染效 率，从而评价辅助腺病毒Ad5/Fllp-HV对HD-Ad造血靶向性的影响。本发明的创新点在于以造血靶向腺病毒为基础，建立造血靶向HD-Ad的制备体 系。对重组腺病毒包装信号的改造，可使其在Cre/loxp系统中，在不完全包装信号和Ioxp 位点同源重组的作用下，有效减少辅助腺病毒残留，提高HD-Ad产量；同时，将改造的穿梭 质粒与pAd5/Fllp同源重组，可得到造血靶向辅助腺病毒Ad5/Fllp-HV。该辅助腺病毒包装 得到的HD-Ad，具有与辅助病毒相似的颗粒特征，能有效靶向造血细胞。
附图1包装信号DNA片段SynES的合成1为SynES的PCR扩增产物；2为 DL2000Marker ；附图2重组质粒pSh-SynES的鉴定1为DL2000 Marker ； 2为阴性对照；3为 pMD-SynES的PCR扩增产物；4为pSh_SynES的PCR扩增产物；附图3辅助腺病毒Ad5/FlIp-HV制备示意图1表示pSh-SynEs经PmeI酶切 后电转BJ5183感受态细胞，与pAd5/FllP同源重组，得到pAd5/FllP_HV ；2表示pAd5/ FllP-HV的PacI线性化；3表示线性化pAd5/FlIP-HV转染HEK293细胞，包装产生辅助 腺病毒Ad5/FllP-HV;附图4辅助腺病毒载体pAd5/Fllp-HV酶切鉴定1为λ-HindIII Marker ；2 为 pAd5/FlIp-HV 的 EcoRV 酶切产物；3 为质粒 pAd5/Fllp 的 EcoRV 酶切产物；4 为 DL2000Marker ；附图5辅助腺病毒Ad5/FlIp-HV的鉴定a，PCR鉴定1为Ad5/FlIp-HV感染的 HEK293细胞基因组DNA的PCR扩增产物；2为正常HEK293细胞基因组DNA的PCR扩增产 物；3为DL2000Marker ；b，纯化的辅助腺病毒电镜负染图；附图6HD-Ad5/Fl IP-GFP感染U937细胞24h后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达 a为白光照片；b为相应的荧光照片；附图720M0I 的 HD_Ad5/Fl IP-GFP 和对照病毒 HD-Ad/H14_GFP 感染后 48h，流式细 胞术检测绿色荧光蛋白表达结果分组1为未感染病毒的对照；2为感染HD-Ad5/FlIP-GFP 的细胞；3为感染HD-Ad/H14-GFP的细胞；
具体实施例方式实施例1含有包装信号DNA序列SynES的合成及克隆其方法是合成包装序列，并在序列两端加入loxp位点。合成引物后，重叠PCR扩 增获取全长DNA序列SynES，最后将其克隆到pMD-18T载体上，并进行测序鉴定。具体为(1)全长DNA序列SynES的合成以Ad5和H14的包装信号序列为基础，确定用于辅助病毒构建的不完全包装信号 序列，在序列两端加入loxp序列，即为新的包装信号DNA序列SynES。设计引物，分别记为 P1 P8，见序列表序列1 8，采用重叠PCR扩增获取全长DNA序列。将上述引物按等摩尔混合后，先PCR扩增15个循环。然后，以上述扩增产物为模 板，以P1和P8为引物，进行第二轮扩增，可得到总长度为241bp的DNA序列SynES (如附图 la所示)。该序列包含两端的loxp位点及包装信号关键序列A1 A4，如序列表序列9所不。(2) pMD-SynES 载体的构建对合成的SynEs序列采用DNA聚合酶加A尾后克隆到T载体pMD_18T上，Amp+筛 选获得阳性克隆pMD-SynES，分别经PCR、酶切及测序鉴定正确。实施例2重组穿梭质粒pSh-SynEs的构建其方法是以酶切、连接等方法将pMD-SynES上的SynEs序列转移至pShuttle载体 上，替换原有的包装信号，得到重组穿梭质粒psh-SynEs。具体为限制性内切酶BsrGI (Bspl407I)和Bglll双酶切pMD-SynES载体，回收相应的包 装信号序列SynEs ；同时，双酶切pShuttle载体(保藏号P3_6_1)，去除包装信号序列Es， 回收大片段，记为pShuttle- A Es。然后，将SynEs与pShuttle- A Es进行连接、转化，Kana+ 筛选得到阳性克隆pSh-SynEs。得到的阳性克隆经扩增，提取质粒，并以其为模板，以P1和P6为引物，PCR扩增可 见176bp左右的条带(如附图2所示)。最终，经测序鉴定正确。实施例3辅助腺病毒Ad5/Fllp_HV的制备其方法是以Adeasy系统为基础，Pmel酶切穿梭质粒psh-SynEs后，电转 BJ5183-Ad5/Fllp感受态细胞，与Ad5/Fllp骨架质粒同源重组获得辅助腺病毒质粒pAd5/ F1 lp-HV，经酶切及PCR鉴定正确。pAd5/Fl lp-HV经PacI线性化后转染HEK293细胞制备病 毒。基因组水平鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定。(如附图3所示)(1)重组辅助腺病毒质粒pAd5/Fllp-HV的产生骨架质粒Ad5/Fllp (保藏号P3-6_5)转化BJ5183感受态，Amp+筛选得到阳性克 隆，鉴定正确后，按分子克隆“电击转化感受态细胞制备”方法，制备BJ5183-Ad5/Fllp感受 态细胞。穿梭质粒pSh-SynES进行Pmel线性化并去磷酸化，以“200 Q，2. 5KV，25 u F”的条 件电击转化BJ5183-Ad5/Fllp感受态细胞，Kana+筛选得到辅助腺病毒质粒pAd5/Fllp_HV。 以P1和P6作为引物，PCR鉴定正确；同时，PacI.EcoRV分别进行酶切鉴定正确(如附图4 所示)。(2)辅助腺病毒Ad5/Fl lp-HV的制备鉴定正确的辅助腺病毒质粒pAd/Fl lp-HV经PacI酶切和酚氯仿抽提纯化后，脂质 体介导方式转染包装细胞HEK293 (保藏号C12-7-14)。普通显微镜观察细胞形态改变，8天
6可见噬斑形成，并逐渐扩大，直至Ild出现完全病变。收集细胞和上清，反复冻溶3次后收 集上清，获得辅助腺病毒Ad5/FlIp-HV的病毒原液，病毒基因组DNA序列见序列表序列10 所示。(3)辅助腺病毒Ad5/Fllp_HV的鉴定、扩增、纯化及滴度测定病毒上清感染HEK293细胞，48 72h出现细胞病变。收集细胞，提取病毒基因组 DNA，并经PCR鉴定正确(如附图5a所示)。将鉴定正确的Ad5/Fllp_HV大量扩增后，收 集病变细胞，反复冻融三次，取上清。氯化铯密度梯度法纯化后，-80°C保存于10%甘油的 Hank's液中备用。纯化的病毒经电镜负染后，观察其具有典型的腺病毒形态结果(如附图 5b所示)。紫外分光光度计法(波长260nm)和有限稀释法(Median TissueCulture Infective Dose，TCID50)分别测定辅助腺病毒 Ad5/FlIp-HV 的颗粒滴度(Viral Particle Units per Milliliter，vp/ml)，纯度(0D260nm/280nm)和 感染滴度(Infection Units per Milliliter, IU/ml)。结果如表1所示，其感染滴度、纯度均符合进一步实验要求。表1辅助腺病毒Ad5/Fl Ip-HV的纯度和滴度测定结果
权利要求
1.一种造血靶向的重组辅助腺病毒，其特征在于以Stratagene公司的Adeasy载体系 统为基础，用B组Ilp型腺病毒(Adllp)的纤维顶球序列替换5型腺病毒纤维顶球的部分 序列；用5型腺病毒的不完全包装信号序列Al A4替换原有包装序列，并在其两端加入 Ioxp序歹丨J ο
2.根据权利要求1所述的重组辅助腺病毒，其特征在于其具有F5/llp杂合的纤维顶球。
3.根据权利要求2所述的重组辅助腺病毒，其特征在于其具有造血靶向性。
4.根据权利要求1所述的重组辅助腺病毒，其特征在于不完全包装信号具有序列表中 序列9所述的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的重组辅助腺病毒，其特征在于其含有的Ioxp序列可在 293Cre4细胞中有效切除包装信号，减少辅助病毒产量。
6.根据权利要求1所述的重组辅助腺病毒，其特征在于其能够在293Cre4细胞中包装 辅助依赖性重组腺病毒。
7.根据权利要求6所述的辅助依赖性重组腺病毒，其特征在于其具有造血靶向性。
8.权利要求1-6任一项所述的重组辅助腺病毒在辅助依赖性重组腺病毒制备中的应用。
9.权利要求7所述的辅助依赖性重组腺病毒在造血靶向基因治疗及药物开发中应用。
全文摘要
一种造血靶向的辅助腺病毒及其应用，涉及生物技术和基因治疗领域，包括造血靶向辅助腺病毒的构建、制备，辅助依赖性重组腺病毒(Helper-Dependent Adenoviral Vectors，HD-Ad)的制备、扩增、纯化及其造血靶向功能验证。该辅助腺病毒携带的包装信号为不完全包装信号，且在包装信号两端含有loxp序列，能在Cre酶作用下同源重组，切除包装信号，进而减少辅助腺病毒产生，提高目的病毒的产量和质量；该辅助腺病毒的骨架质粒为pAd5/F11p，其改构的纤维顶球，能使辅助腺病毒具有造血靶向特性。利用该辅助病毒制备的HD-Ad，具有辅助腺病毒的颗粒特性，能够有效靶向造血细胞，从而为HD-Ad在造血细胞基因治疗中的应用提供实验基础和理论依据。
文档编号A61K48/00GK102002483SQ20101022940
公开日2011年4月6日 申请日期2010年7月19日 优先权日2010年7月19日
发明者吴祖泽, 李泽良, 杨月峰, 王 华, 王立生, 鲁茁壮 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所