专利名称：人参二醇皂苷在制备与糖皮质激素受体结合药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域。
背景技术：
地塞米松(Dexamethasone，Dexa)等糖皮质激素作用与副作用在药理学教科书上 的记载(1)药理学作用是Dexa具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反 应等药理作用，故广泛应用于各科治疗多种疾病，如自身免疫性疾病，过敏，炎症，哮 喘及皮肤科、眼科疾病等。近年来，地塞米松临床用药量逐年增加，至今我国已成为世 界上最大的地塞米松市场。(2)副作用的描述摘要如下①长程或大量使用Dexa会发生 医源性库欣氏综合征面容和体态、低血钾综合征，出血倾向；②创口愈合不良、骨质疏 松以致发生股骨头缺血性坏死，消化道应激性出血等；③并发感染或陈旧性结核病灶复 发也是肾上腺皮质激素的不良反应。地塞米松(Dexa)作为紫杉醇抗肿瘤作用的辅助药已写入药物说明书在紫杉醇 注射液“用法用量”栏目中写到《为了预防发生过敏反应，在紫杉醇治疗前12小时口 服地塞米松10mg，治疗前6小时再口服地塞米松10mg，治疗前30 60分钟给予苯海拉 明肌注20mg》。Dexa作为紫杉醇和顺钼等的治疗辅助药已经广泛用于临床的肿瘤治疗 中，在预防患病机体对化疗药物的过敏和毒性反应起到了重要的作用。从而使肿瘤的化 学治疗能够顺利进行。但是，糖皮质激素所致的急性应激性出血可引起危症患者死亡并 成为隐形杀手。探索一种有糖皮质激素样作用，而无其副作用的药物具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种人参二醇皂苷在制备与糖皮质激素受体结合药物中的应用。目 的是揭示人参二醇皂苷PDS有Dexa样作用的分子机制，为人参二醇皂苷开发成替代地塞 米松等糖皮质激素的药物提供理论依据。人参二醇皂苷在制备与糖皮质激素受体结合药物中的应用。人参二醇皂苷(Panaxadiol Saponins, PDS)有地塞米松样作用但无激素样副作用
的实验研究(1)发现PDS有与Dexa样的抗失血性休克作用，而无引起胃肠道应激性出 血的副作用为揭示祖国医学有关“人参汤有起死回生功效”的物质基础与机理，而做 了系列的研究，以Dexa为阳性对照药进行了 PDS的抗失血休克作用的实验研究。结果 发现，PDS有与Dexa类似的抗失血性休克作用，而无激素样副作用。在实验中意外地 发现Dexa组犬在放血至平均动脉压下降至40mmHg后有2条犬(2/15)的平均血压迅速 降至0，回输全部血液后血压仍然急剧下降而死亡，尸检发现胃肠道充满鲜血，诊断为胃 肠道应激性溃疡性出血。临床上，在各种休克等危症的抢救中，大量应用Dexa时也会有 类似的意外发生，但无法与危症引起的死亡鉴别，很难引起临床专家们的重视。所以， 称之为“隐形杀手”。为了进一步肯定这种有意义的发现，我们又相继完成了 PDS抗内 毒素性休克、抗失血/内毒素双打击的研究，其结果都证明人参二醇皂苷在抗各种休克的研究中，都显示有优于地塞米松类的作用。在用PDS与顺钼联合抗前列腺癌移植瘤研究中，发现PDS有Dexa样抗过敏和 减毒作用，但PDS组存活时间、脾脏指数和皮毛的光亮程度等均优于Dexa组。特别是 Dexa和顺钼联合用药组小鼠在疗程第13天以前全部死亡。因此，人参二醇皂苷在制备 与糖皮质激素受体结合药物中的应用、阐明PDS有Dexa同样作用的分子机制，对于开发 PDS替代Dexa的新药有重要意义。
图1是荧光素酶报告基因检测图。图中1.GRE-Iuciferase 与 Glucocorticoid Receptor 结合产生的荧光强度。2.加入Dexa后荧光强度增加36倍。3.加入PDS 25 μ g/ml荧光强度无影响。4.加入PDS 50 μ g/ml荧光强度增加5倍。5.加入PDS100 μ g/ml荧光强度增加12倍。
具体实施例方式实验例不同剂量PDS对糖皮质激素受体转录活性的影响。应用糖皮质激素受体反应元件启动的报告基因(GRE-Luciferase)与糖皮质激素 受体(Glucocorticoid Receptor)共转染293细胞中。观察在加入地塞米松后对糖皮质激素 受体转录活性的影响；再用PDS取代地塞米松，观察不同剂量PDS是否对糖皮质激素受 体转录活性有影响，是否呈剂量依赖性进行综合评价。材料与方法1.293细胞系，购自美国ATCC。置含5 % (V/V)小牛血清及抗生素的RPMI 1640 (GIBCO BRL公司)培养液中，于37°C、5% CO2培养箱中培养。2.药物人参茎叶二醇组皂苷(PDS)由吉林大学天然药物研究室提供，是专利 (ZL 98100070.3)产品，使用时用生理盐水或5%葡萄糖溶解；顺钼和地塞米松都是临床
医院药房提供。3.荧光素酶报告基因检测方法3.1将293细胞接种于12孔培养板，细胞密度约为1 X IO5/孔，培养24小 时待细胞生长到90%融合时进行质粒转染。用于转染的质粒总量为300ng/孔，包括 IOOng GRE-Luciferase/孔和200ng/孔糖皮质激素受体表达质粒。所用的转染试剂为 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 公司)，转染 24 48 小时，分别加入Dexamethasone 或PDS
处理细胞。3.2Dexa组加Dexamethasone的浓度为100 μ mol/L,药物处理后12小时后，收 集细胞，并按照 STRATAGENE 公司的 Luciferase Assay Kit Instruction manual 的要求进行 Luciferase活性分析。3.3PDS 组分别加入 Ιμ 、2μ1, 4μ 1(25 μ g/ml, 50 μ g/ml, 100 μ g/ml)。药物 处理12小时后，收集细胞，并按照STRATAGENE公司的Luciferase Assay Kit Instruction manual的要求进行Luciferase活性分析。
结果结果如图1所示，在糖皮质激素受体反应元件启动的报告基因(GRE-Luciferase) 与糖皮质激素受体(GlucocorticoidReceptor)共转染293细胞，荧光强度很低。在加入地 塞米松(DexamethasonelOO μ mol/L)时，糖皮质激素受体的转录活性增加36.5倍。在用 不同剂量PDS取代地塞米松时对糖皮质激素受体转录活性的影响如下①加入25 μ g/ml PDS时，对糖皮质激素受体的转录活性没有影响；②加入PDS为50 μ g/ml时糖皮质激 素的转录活性增加5.5倍；③当加入PDS为100 μ g/ml时糖皮质激素的转录活性增加12 倍。可见，人参二醇皂苷与糖皮质激素受体结合，具有与地塞米松类似的生物学效应， 并且表现为有明显的剂量依赖关系。实验例PDS> Dexa与顺钼联合用药对小鼠移植瘤生长与淋巴细胞功能的影响临床上在用顺钼、紫三醇等抗肿瘤治疗之前，常规地口服地塞米松用以预防机 体的过敏反应。然而，地塞米松等糖皮质激素的副作用，特别是对免疫系统的抑制作用 会明显减弱机体的抗击肿瘤作用。PDS有与地塞米松等糖皮质激素的受体结合的作用， 但无地塞米松样副作用，本实验对比观察了 PDS和Dexa分别作为顺钼的辅助药在抗小鼠 前列腺癌移植瘤中的作用与副作用。1材料与方法1.1实验动物雄性C57小鼠60只，体重18_20克，购于中国科学院北京实验 动物中心，由吉林大学实验动物中心SPF级动物饲养室繁殖与饲养。1.2鼠源性前列腺癌细胞株RM-I细胞移植前准备培养在含10%小牛血清的 IMDM培养液中，置37°C，5% CO2湿化的培养箱中，待RM-I细胞长至95%培养瓶时用 PBS冲洗培养瓶2次，加入0.125%胰酶消化，将消化好的细胞吸入离心管内，950rpm/ min离心5min，弃上清，加入不含小牛血清的IMDM培养液，吸管吹打混勻(细胞计 数)，再离心，弃上清，将RM-I细胞密度调至IXlO7Anl备用。1.3小鼠移植瘤模型的复制与实验动物分组1.3.1小鼠皮下移植瘤模型的复制取RM-I细胞IX 107ml，接种于小鼠背部近 前肢侧皮下，每个接种点注射RM-I细胞0.1ml (IX IO6/点)。观察移植肿瘤成功率，每 隔2天测肿瘤的各径线，记录动物的一般状态。在肿瘤细胞体积长至约2.5X3.0时，进 行动物分组。1.3.2动物分组与给药在接种RM-I细胞第7天的C57小鼠成瘤率高达100%， 肿瘤体积长至11.7(2.5X32X0.52)mm3时随机分成6组，每组10只。①模型组只给生 理盐水lOOul，②顺钼组给以用生理盐水稀释的顺钼(1.5mg/kg)，③Dexa组只给以 Dexa 2.0mg/kg，④顺钼+Dexa 组(1.5mg/kg+2.0mg/kg)，⑤ PDS 组(12.5mg/kg)⑥顺 钼+PDS组(1.5mg/kg+12.5mg/kg)，以上各组，隔天腹腔注射给药1次，疗程为14d。末 次给药后24h，麻醉下经眼球采血处死动物，称量心、肝、脾、肺、肾及瘤重量，并计算 系数。1.3.3肿瘤体积与抑瘤率的计算①肿瘤体积的测量与计算用游标卡尺测量皮 下移植瘤长短径，按通用公式[V(mm3) =LX W2X0.52]计算肿瘤体积V。②计算抑瘤 率，抑瘤率[1-(实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)]X100%。③脏器系数，脏器系数％=脏器重量/体重X 100%。1.4MTT法检测ConA诱导的脾细胞增殖反应性1.4.1脾细胞制备与细胞的前处理①灭菌条件下取各组小鼠脾脏，置于预先加 入5mlHank' S液的平皿-略倾斜放置)用镊子将脾捣碎，并用纱布过滤细胞悬液除掉 组织块，滤液移至离心管中，洗涤1次(lOOOr/min)，5分钟。②用含10%小牛血清的 IMDM重新悬浮细胞，并取100 μ 1细胞悬液加入900 μ 1的细胞计数液中，显微镜下进行 细胞计数。③用含10%小牛血清的IMDM将各组脾细胞细胞浓度调至5Χ 106/ml，加入 96孔培养板，100 μ 1细胞悬液/孔。④ConA储备液的配制用1 XPBS配制成ConA含 量为200 μ 1/ml的储备液；⑤取载有100 μ 1细胞悬液/孔的96孔培养板，每孔加入ConA IOOyl/孔，每组3复孔，另设3复孔只加培养液作为阴性对照组。⑥经ConA处理的96 孔板置于37°C，5% C02培养箱内培养40-48h。1.4.2MTT比色法检测并计算淋巴细胞转化率①从培养箱中取出培养板，每孔 加入MTTlO μ 1，继续培养4h ；②1000r/min离心5分钟，小心吸弃上清，再加入二甲基 亚枫100 μ 1/well,于微量震荡器上缓慢作用lOmin。③在酶标仪上于570nm处测光吸收 值(A)。④淋巴细胞转化率计算如下所示
ConA刺激后W-对照空 U值
淋巴细胞转化率(％)=------------------------------------------
对照？U值1.5统计学分析计量资料X士SD表示，采用SPSS Windows for 11软件，单因素 方差分析，并进行样本均数的组间比较。2 结果2.1药物对荷瘤小鼠生存率与一般状况的影响2.1.1生存率各用药组在给药第14天，均未见死亡，生存率为100%。2.1.2顺钼+PDS组一般状态明显优于顺钼+Dexa组用药期间顺钼组，顺钼 +Dexa组，活动量明显减少，摄食量显著下降，饮水减少，消瘦及皮毛无光等表现。但 是，顺钼+PDS组的活动量，饮食及饮水量，皮毛的光亮程度均优于好于顺钼组及顺钼 +Dexa 组。2.2小鼠体重变化百分数与肿瘤指数的组间比较2.2.1单独应用Dexa和PDS对体重无明显影响①在隔天应用Dexa和PDS的情
况下，实验结束时的体重都呈正增长，见表1。②单纯应用Dexa和PDS组的肿瘤重量与 模型组比较没有显著差异，证明无论Dexa，还是PDS单独应用对移植瘤都无治疗作用， 见表2。2.2.2PDS作为顺钼的辅助药优于地塞米松①对于体重变化百分数的影响(表 1) PDS顺钼组，实验前后动物平均体重变化百分数显示减轻27%。而单用顺钼组和 Dexa顺钼组，实验前后动物平均体重变化百分数显示分别减轻36%和39%。比较PDS顺 钼组和Dexa顺钼组可以清楚的看出，PDS可增加顺钼组的体重，改善机体的机能状态， 而Dexa则无这种作用。②对肿瘤体积与重量的影响(表2所示)如表2所见，PDS顺 钼联用组肿瘤体积明显小于顺钼组和Dexa顺钼组。
表IPDS和Dexa与顺钼联合用药对移植瘤小鼠体重的影响
权利要求
1.人参二醇皂苷在制备与糖皮质激素受体结合药物中的应用。
2.人参二醇皂苷与顺钼联合应用在抗肿瘤中的应用。
3.如权利要求2所述的人参二醇皂苷与顺钼联合应用在抗肿瘤中的应用，其特征在 于人参二醇皂苷与顺钼的质量比是25 3。
全文摘要
本发明涉及人参二醇皂苷在制备与糖皮质激素受体结合药物中的应用，属于医药领域。人参二醇皂苷在制备与糖皮质激素受体结合药物中的应用；人参二醇皂苷与顺铂联合应用在抗肿瘤中的应用；在用PDS与顺铂联合抗前列腺癌移植瘤研究中，发现PDS有Dexa样抗过敏和减毒作用，但PDS组存活时间、脾脏指数和皮毛的光亮程度等均优于Dexa组。特别是Dexa和顺铂联合用药组小鼠在疗程第13天以前全部死亡。因此，阐明PDS有Dexa同样作用的分子机制，对于开发PDS替代Dexa的新药有重要意义。
文档编号A61P35/00GK102008493SQ201010520369
公开日2011年4月13日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者刘艳波, 孟艳, 张灵, 李扬, 李璐, 梁作文, 程金科, 赵丹, 赵丽娟, 赵雪俭 申请人:吉林大学