专利名称：基于紫杉醇的小分子水凝胶-纳米球传输体系及其制备方法
技术领域：
本发明的技术方案涉及一种紫杉醇的衍生物和合成方法以及用酶催化这种手段 催化其形成纳米球，具体说是新型的靶向性多肽修饰的紫杉醇衍生物纳米球的制备。
背景技术：
紫杉醇是20世纪90年代应用于临床的新一代广谱抗癌药。由于其的水溶性差， 目前临床上使用的紫杉醇制剂多以聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和无水乙醇(1 1) 混合液作为助溶剂。给药前用生理盐水或者5%葡萄糖稀释到终浓度为0. 4-1. ^imolL—1， 这些助溶剂可导致多种不良反应，比较明确的包括过敏反应和神经毒性。另外，聚氧乙烯 蓖麻油在血循环中形成的小微粒能将紫杉醇分子包裹，阻碍了药物的作用。为了解决紫杉 醇水溶性差和现在临床制剂的毒副作用，许多科学家一直在探索具有毒副作用小，靶向性 强且具有缓释作用的药物载体。现在研究的紫杉醇载体主要有脂质体，两亲性共聚物，大 分子多聚物和用蛋白质连接，水溶性的前提药物等，但是许多载体存在包封率低，无选择性 (靶向)，合成困难等缺点，限制了这些载体的进一步应用。现在普遍认为纳米粒子作为药 物载体具有潜在的应用前景，纳米颗粒作为药物传输体系可以延长药物作用时间；增强药 效，减轻毒副作用；控制药物释放、提高难溶药物的溶解性；而且可以通过对纳米颗粒的修 饰，比如连上靶向性的基团如叶酸，转铁蛋白等提高载体或者纳米药物粒子的靶向性，从而 避免药物在非特异性的组织释放(Nature Nanotechnology, 2 (1) :20 21，(2007) ；Nano Letter, 2008 :4221 4228 ；InternationalJournal of Pharmaceutics,373(1-2) :116 123(2009))。小分子自组装形成的纳米粒子在近几年得到广泛的关注，尤其是小分子多肽 类的自组装，因为其具有生物相容性好，对身体无毒，容易合成等优点。小分子水凝胶作为 一种新型的材料，由于其良好的生物相容性，较好的三维形貌，已经在生物医学和生物材料 方面得到国内外科学家广泛的研究。迄今为止，还没有出现用小分子多肽连接疏水药物通 过酶催化自组装形成纳米球靶向肿瘤细胞，并且疗效可能与紫杉醇相当的报道。
发明内容
为了解决疏水药物紫杉醇的水溶性以及靶向性问题，本发明涉及一种可以通过酶 催化(专利号2009102四186)方法自组装的紫杉醇药物的前体分子及其制备方法，即通过 磷酸化的多肽一端连接疏水性的抗癌药物紫杉醇，另一端连接靶向性的基团叶酸分子。本 发明的目的之一是设计合成能够自组装并且溶解性能良好的前体分子(结构式如下)，该 分子具有很好的溶解性。首先通过在紫杉醇的2'羟基位点引入丁二酸，再把用FMOC-固相 合成方法合成好的短肽FM0C-Gp^(连接到裸露的羧基上，然后脱掉FMOC基团，把事先做的
叶酸活化酯连接到甘氨酸的氨基上。最终化合物的结构式如下所示
其中G代表甘氨酸，Y(P)代表被磷酸化的酪氨酸，K代表赖氨酸，蓝色代表叶酸分 子，红色代表紫杉醇分子本发明的有益效果是首先本发明合成简单，而且用到的原料为人体每天所需要 的氨基酸和叶酸分子，紫杉醇在该分子中的含量约为49.4%，远远大于其它药物载体中的 紫杉醇含量；并且前体分子在细胞培养基(DMEM)或PBS缓冲液(pH = 7. 4)中有很好的溶解 度(大于10mg/mL)；前体分子在碱性磷酸酶的作用下能够形成小分子水凝胶，并且三维形 貌是50nm左右均勻的纳米球。由于其具有靶向性的基团(叶酸分子)，而且形成的是50nm 左右的纳米粒子，因此很容易到达肿瘤部位并且可能在血液循环中通过“增强的渗透和滞 留效应(EPR) ”在肿瘤部位聚集，因在紫杉醇2'羟基位点引入了酯键，在体内酯酶的作用 下可以被降解释放出紫杉醇，从而达到治疗肿瘤的目的。
附图 1 :Fmoc-L-Tyr (PO(OEt)2) -OH (化合物 5)的合成步骤，其中 Fmoc-OSu 是芴 甲氧羰酰琥珀酰亚胺，DIEA为N，N- 二异丙基乙胺，DCM为二氯甲烷，TFA为三氟乙酸，I2为 碘，triethyl phosphate为亚磷酸三乙酯，pyridine为吡啶附图2 =FA-GpYK-Taxol的合成步骤附图3 小分子水凝胶形成的外观图片与用原子力显微镜观察的三维形貌
具体实施例方式实施例1 (I)Fmoc-L-Tyr (P0(OEt)2)-OH(化合物5)的合成，合成步骤见说明书附图1第一步=Fmoc-L-Tyr-OtBu(化合物 3)的合成称取5_ο1(1. 185g)L-酪氨酸叔丁酯溶解在30mL的丙酮溶液中，加入5分子 的N，N-二异丙基乙胺，在搅拌的过程中逐渐滴加5mm0l(1.65g)芴甲氧羰酰琥珀酰亚 胺的丙酮溶液，室温反应过夜，用旋转蒸发仪除去溶剂，然后用硅胶色谱柱分离，得到 2. 2g，产率为 95. 8 %。1H NMR(300MHz, DMS0_d6) δ 8. 03-8. 05(d，2H)，7· 81-7. 85(t，2H)， 7. 56-7. 59 (t, 2H)，7. 46-7. 48 (m, 2H)，7. 19-7. 21 (d, 2H)，6. 81-6. 83 (d, 2H)，4. 30-4. 40 (m, 3H)，4. 2-4. 24 (m, 1H)，3. 30-3. 36 (m, 2H)，1. 50 (s,9H) · MS :calc. M+ = 459. 2，obsvd. (M+l)+ =459. 8.第二步Fmoc-L-Tyr(P0 (OEt) 2_0H将8mmol亚磷酸三乙酯溶解在40mL的二氯甲烷中，加入3. 3mmol的碘，冰浴反 应30min，使其恢复至室温，然后逐渐滴加第一步所得到的化合物3和10. Ommol吡啶的二 氯甲烷溶液，冰浴反应4h，然后用IOOmL乙醚和200mL乙酸乙酯萃取，有机相用IOOmL 5%
4硫酸氢钠洗三遍，再用饱和食盐水洗一遍，然后有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，用旋转蒸 发仪旋干，用硅胶色谱柱分离，产率为85. 5%。1H NMR(300MHz, DMS0-d6) δ 8. 03-8. 05 (d, 2H)，7. 82-7. 84 (d, 2H)，7. 57-7. 59 (t, 2H)，7. 42-7. 48 (m, 4H)，7. 25-7. 28 (d, 2H)， 4. 10-4. 40 (m, 8H)，3. 11-3. 13 (m, 1H)，3. 03-3. 07 (m, 1H)，1. 49 (s,9H)，1. 37-1. 41 (t,6H) · 31P NMR( δ -6. 366ppm). MS :calc. M+ = 595. 2，obsvd. (M+l)+ = 596. 01.第三步Fmoc-L-Tyr(P0 (OEt) 2_0H (化合物 6)的合成将得到的化合物4加入到5mL 二氯甲烷和IOmL三氟乙酸的混合溶液中，置 于冰浴中反应，用层析板检测反应的进程，反应完毕后，旋转蒸干，甲苯共旋两次，得到 Fmoc-L-Tyr (P0 (OEt) 2_0H，产率为 98. 3 %。IH 匪R (300MHz，DMS0_d6) δ 8. 23-8. 25 (d, 2H)， 8. 01-8. 05 (t, 2H)，7. 76-7. 79 (t, 2H)，7. 59-7. 62 (m, 4H)，7. 47-7. 52 (d, 2H)，4. 30-4. 60 (m, 8H) ,3. 45-3. 48 (m, 1H) ,3. 21-3. 27 (m, 1H)，1. 58-1. 61 (t, 6H). 31PNMR( δ -6. 348ppm). MS calc. M+ = 539. 2，obsvd. (M+H)+ = 540. 1.(2) Fmoc-GpYK-OH (化合物 7)的合成第一步用Fmoc固相合成的方法合成Fmoc-Gly-Try (P0(OEt)2)-Lys-OH，所使用 的氨基酸均为氨基端被Fmoc保护的氨基酸，具体合成步骤如下①称量Immol树脂，加入固相合成器中，加入适量DCM浸没树脂，在氮气的鼓吹作 用下膨胀5min ；除去溶剂，加入Immol第一个氨基酸(本实验中为Fmoc保护的赖氨酸)的 DCM溶液，加入2mmol DIEA，反应浊；②洗涤用DCM洗涤，洗5次，每次Imin ；③封闭用体积比DCM 甲醇DIEA为17 2 1的溶液反应lOmin，将树脂上
未反应的活性基团封闭；④洗涤用DCM洗涤，洗5次，每次Imin ；洗涤用DMF洗涤，洗5次，每次Imin ；脱 Fmoc保护基团加入20%哌啶溶液，反应30min ；⑤洗涤用DMF洗涤，洗5次，每次Imin ；加入2mmol第二个氨基酸(本实验中为 实施例1中合成的化合物5)的DMF溶液，加入46mmol DIEA, 2mmol缩合剂HBTU，反应池；重复操作步骤④，⑤，将氨基酸依次连接在树脂上；⑥切割加入TFA的二氯甲烷溶液，每次反应lmin，收集液体，旋转蒸干，用反 相高效液相分离，得到化合物6。第二步将得到的化合物6溶于干燥的IOmL 二氯甲烷中，加入25分子的三甲 基溴硅烷，室温搅拌Mh，然后旋转蒸干得到固体，再加入双蒸水室温反应池，用冷冻干燥 机冻干，用高效液相分离得到化合物7. 1H NMR(300MHz, DMS0_d6) δ 7. 875 (d，J = 7. 235， 2H)，7. 640-7. 715 (m, 2H)，7. 375-7. 428 (t,2H)，7. 290-7. 340 (m, 2H)，6. 935-7. 075 (m, 2H)，4. 205-4. 285 (m, 3H)，3. 630 (m, 2H)，3. 065-3. 155 (m, 5H)，2. 635-2. 725 (m, 1H)， 1. 145-1. 198(m，6H). 31P NMR( δ -4. 969ppm) · MS :calc. M+ = 668. 2, obsvd. (M+I)+ = 669. 5.(3) FA-GpYK-Taxol (化合物 1 的合成)第一步:Taxol-succ(化合物 8)的合成(参照文献 J. Med. Chem.，1989，32 (4)，pp 788-792)第二步Fmoc-GpI-Taxol (化合物9)的合成将150mg化合物8溶解在5mL 二甲基甲酰胺溶剂中，加入130ul DIEA，室温反应过夜，用高效液相提纯化合物，得到Rnoc-GpYK-jTaxol,产率为 61. 7%。第三步FA-NHS活化酯的合成称取Ig (2. 26mmol)叶酸，溶解在20mL DMF溶液 中，边搅拌边加入0. 257g N-羟基琥珀酰亚胺，然后加入0.31g N，N-二环己基碳化二亚胺， 室温避光反应16h，过滤除去副产物，滤液中加入含30%丙酮的乙醚溶液，边加边搅拌，然 后把析出的固体用30%的丙酮乙醚溶液洗两遍，冻干，得到化合物FA-NHS活化酯。第四步FA-GpI-TaX0l (化合物1)的合成把反应得到的化合物9，加入含10% 哌啶的DMF溶液，室温搅拌池，用高效液相提纯得到化合物NH2-GYpK-Tax0L称取80mg化 合物NH2-GYpK-Taxol溶解在5mL的DMF溶液中，加入93. 6mg Folate-NHS活化酯，同时加 入40ul的DIEA，室温搅拌过夜，用高效液相分离化合物1，得到43. 7mg，产率为42. 02%. 1H NMR(300MHz, DMS0-d6) δ 7. 980 (d, J = 7. 198，2H)，7. 855-7. 715 (m，J = 7. 223, 2H), 7. 640-7. 745 (m, 6H)，7. 435-7. 565 (m, 6H)，7. 195-7. 258 (m, 3H)，7. 030-7. 075 (m, 2H)， 7. 625-6. 650 (m, 1H)，6. 290 (s, 1H)，5. 792-5. 840 (t, 1H)，5. 505-5. 535 (m, 1H)，5. 411 (d, J = 7. 259,1H), 5. 327-5. 350 (m, 1H), 4. 913 (d, J = 10. 382，1H)，4. 497-4. 665 (m，3H)， 4. 005-4. 299 (m, 4H)，2. 595—3. 005 (m, 9H)，2. 100—2. 598 (m, 13H)，1. 635—1. 770 (m, 5H)， 1. 495-1. 630 (m，3H)，0. 990-1. 490 (m，13H). 31P NMR ( δ -6. 110ppm).MS :calc. M+ = 1804.6， obsvd. (M+l)+ = 1805. 6.(4)小分子水凝胶的形成与通过原子力显微镜观察其三维形貌(见说明书附图3)称取2. Omg得到的化合物1，加入ImL的PBS (pH = 7. 4)缓冲液，用碳酸钠小心调 节PH至7. 4，然后加入碱性磷酸酶溶液(酶的最终浓度为90U/mL)，静置5min后，倒置小瓶 可以看到类似果冻状的胶体。用移液枪吸取大约15ul左右的胶体滴加到表面干净的硅片上，旋涂使胶体在硅 片上分布均勻，用原子力显微镜观察形貌。其形貌为分散均勻的50nm左右的纳米球。
权利要求
1.基于紫杉醇的小分子水凝胶-纳米球传输体系其特征在于该分子有如下结构，通 过小分子短肽Gp^(把紫杉醇衍生物(在紫杉醇2'位引入1，4_ 丁二酸)和叶酸连接起来， 不仅解决了紫杉醇溶解度差的问题而且具有靶向作用。
2.Gpl(或者类似结构的短肽)连接紫杉醇衍生物和叶酸分子。
3.根据权利要求书1所述基于紫杉醇的小分子水凝胶-纳米球传输体系，其特征在于 合成步骤与条件如下(1)化合物Fmoc-L-Tyr(PO(OEt)2)-OH(结构式见附图)的制备参照我们以前专利(专利号2009102四186)中的方法合成化合物 Fmoc-L-Tyr (P0 (OEt) 2) -OH ；(2)用FMOC固相合成的方法制备化合物Fmoc-Gly-Try(P0(OEt)2)-Lys-OH(结构式见 说明书附图2)首先通过把第一个氨基酸Fmoc-Lys (Boc) -OH连接在固相载体2_氯三苯甲基氯树脂 上，用二氯甲烷作为溶剂，反应两个小时，然后把保护基团Fmoc用哌啶脱掉，用同样的方法 加剩余的氨基酸，最后用含1 %三氟乙酸的二氯甲烷溶液把制备的短肽从树脂上切除，用高 效液相进行分离；(3)叶酸-甘氨酸-磷酸化的酪氨酸-赖氨酸-丁二酸酐衍生化的紫杉醇的制备首先把上步得到的化合物Fmoc-Gly-Try (P0 (OEt) 2) -Lys-OH溶解在二甲基甲酰胺中， 然后加入等摩尔的紫杉醇衍生物，再加入四分子的N，N-二异丙基乙胺，室温避光搅拌过 夜，然后用高效液相分离；把得到的化合物用5-20%的哌啶脱掉保护基团Fmoc，高效液相 分离，最后把得到的产物与叶酸活化酯在8ml的溶液中反应，同时加入四分子的N，N-二异 丙基乙胺，室温搅拌过夜，高效液相分离。
全文摘要
本发明涉及基于紫杉醇的小分子水凝胶-纳米球传输体系及其制备方法。本发明涉及一种把叶酸和紫杉醇通过一种短肽连接起来形成紫杉醇前体药物的制备方法。而且所得到的化合物通过酶催化的方法可以得到尺寸为50nm左右的纳米球和小分子水凝胶。具体是首先通过固相合成的方法合成小分子多肽，通过多肽赖氨酸的侧链氨基与紫杉醇2′羟基位衍生化的化合物反应，然后连接叶酸分子得到成胶成球前体分子。该前体分子不仅具有靶向的作用、而且有很好的溶解性，且能经过酶催化自组装成50nm左右的纳米球。因此本发明所建立的紫杉醇新型传输体系不仅解决了紫杉醇溶解度差，对细胞没有特异性的问题，而且有望解决其毒副作用和生物利用度低的问题。
文档编号A61K47/42GK102120756SQ20101057655
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月7日 优先权日2010年12月7日
发明者孔德领, 杨志谋, 杨翠红, 王怀民, 王玲 申请人:南开大学