专利名称：壳聚糖纳米粒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种壳聚糖纳米颗粒及其制备方法。
背景技术：
壳聚糖(Chitosan)是重要的一类天然生物降解高分子材料，是甲壳素的衍生 物，来源于甲壳类动物(如虾、蟹)、昆虫和其他无脊椎动物外壳中的甲壳质，也存在 于真菌酵母的细胞壁内，是自然界中惟一含游离氨基碱性基的阳离子可食性动物纤维。 它的分子结构与纤维素相似，是由氨基葡萄糖通过糖苷键连接而成的直链高分子，包含 氨基葡萄糖共聚物和N—乙酰氨基葡萄糖。壳聚糖已被证明具有许多优良特性无毒 性、助渗作用、生物粘附性、良好的组织相容性、生物降解性、易被制备成微颗粒和纳 米颗粒。另外，由于它还有抗癌、降血脂等保健作用品。自20世纪80年代以来，国内 外形成了甲壳素、壳聚搪等多糖类生物医用材料的开发研究热潮。随着壳聚糖在生物医药领域的广泛应用，越来越多的人热衷于微胶囊及纳米微 球的研究。大颗粒的壳聚糖微球主要用于药物的长效释放；小颗粒壳聚糖微球以及磁 微球可包覆抗癌药剂，用于特定区域的药物释放。壳聚糖以其优良的生物相容性和生物 降解性，已尝试用于鼻腔药物传递系统；制成包埋酶、蛋白质和细胞的微胶囊等。此 夕卜，壳聚糖还具有直接抑制肿瘤细胞的作用，有研究显示载铜离子壳聚糖纳米粒及壳聚 糖纳米粒均有剂量依赖性抑制肿瘤细胞增殖作用。浓度50Ug/ml壳聚糖纳米粒或者载铜 离子壳聚糖纳米粒与多种肿瘤细胞分别共培养24小时，肿瘤细胞增殖抑制率为67% 90% (Qi Lifeng, Xu Zirong, Jiang Xia, Li Yan,Wang Minqi. Cytotoxic activities of chitosan nanoparticles and copper-loaded nanoparticles. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2005 (15): (1397-1399)。研究者认为，壳聚糖纳米粒表面电荷度高是其产生细胞毒性的 主要原因。现在许多眼科疾病的发生发展与细胞凋亡过程相关，例如年龄相关性黄斑 变性、视网膜色素变性、糖尿病视网膜变性、青光眼、白内障等，但目前还没有报道壳 聚糖纳米粒应用于这些眼科疾病方面。目前有很多方法可以制备壳聚糖微球水油共混法(H. Onishi, J. Shimoda and Y. Machida, Chitosan-drag conjugate microsheres: preparation and drag release properties of microspheres composed of the conjugate of 2 ' - or 3 ' - (4-carboxy-butyryl) -5-fluorourid ine with chitosan. Drag Dev Ind Pharm,1996,22 (5) :457—463; M.Fwu-Long, K.Chih-Yang, S.Shin—Shing, L.Sung_Tao,C. Shon_Foun,The study of gelation kinetics and chain relaxation properties of glutaraldehyde-cross-linked chitosan gel and their effects on microspheres preparation and drag release. Biomaterials , 2000,41: 389-396)、乳滴联合技术(中国发明 专利壳聚糖药物载体及其制法和应用，公开号CN1903367A)、喷溅烘干法(P. He, S.S. Davis and L. Ilium , Chitosan microspheres prepared by spry drying. Int J Pharm 1999, 187: 53-65)。通常这些制备过程比较复杂，而且需要有机溶剂或表面活性剂。另外，这些 技术制备而得的微球粒径较大，限制了某些给药途径，比如静脉注射。本发明提出的离子交联滴入法操作简单，条件温和，不需要高温、有机溶剂、表面活性剂或其他实验技 术；而且容易得到满足生物医学应用要求的壳聚糖纳米粒。
发明内容
本发 明的目的之一在于提供了 一种亲水性带正电荷壳聚糖纳米颗粒。本发明的目的之二在于提供该纳米颗粒的制备方法。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种由壳聚糖和聚丙烯酸合成的壳聚糖纳米颗粒，其特征在于该纳米颗粒粒径大小 在150-200 nm,偏差为士20 nm的球形粒子，表面电位为40 60 mv。上述的壳聚糖的分子量为80 kDa，脱乙酰度>90.0%，粘度<100 cps。上述的聚丙烯酸的分子量为IOOkDa
上述纳米颗粒的粒径在150 200 nm的球形粒子。上述的纳米颗粒的表面电位为40 60 mv。一种制备上述的壳聚糖纳米颗粒的方法，其特征在于该方法依的具体步骤为
a.将壳聚糖溶于浓度为1的冰醋酸溶液中，配制成浓度为0.1 0.6 mg/ml壳聚 糖溶液；
b.将浓度为0.01% 0.06w/v %的聚丙烯酸溶液逐滴加入到步骤a所得壳聚糖溶液 中，搅拌下形成乳白色混悬液，其中壳聚糖和聚丙烯酸质量比为3:1 10:1;
C.在步骤b所得的乳白色混悬液过滤，所得固体静置陈化24小时，即得到壳聚糖纳 米颗粒。上述的搅拌速度为180 200 rpm。
本发明的优点在于 (1)本发明的制备方法简单，可操作性强，能进一步满足生产和应用的需求。(2)本发明制备的壳聚糖纳米颗粒具有良好的物理化学稳定性。(3)本发明中制备的壳聚糖纳米颗粒粒径小，带正电荷，这增强了其在有生物 阳离子存在时的稳定性，也因可以与带负电的生物膜性结构有很好的交互反应，使其用 于抗肿瘤治疗方面。本发明制备的壳聚糖纳米粒可在年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿 病视网膜变性、青光眼、白内障等眼科疾病等方面有很好的应用。且制备工艺简单，生 产成本低，所得的壳聚糖纳米粒稳定性好，能进一步满足生产和应用的需求。
图1壳聚糖纳米粒扫描电镜图。图2壳聚糖纳米粒粒径分布图。横坐标为粒径大小，纵坐标为粒度数百分比。图3壳聚糖纳米粒拉曼图谱。横坐标为拉曼位移，以波数表示，纵坐标为拉曼 光强。图4实施例1不同配比的壳聚糖和聚丙烯酸制备的壳聚糖纳米粒粒径比较。图5实施例2不同酸碱度的缓冲液孵化壳聚糖纳米粒粒径比较。图6实施例3放置不同时间的壳聚糖纳米粒粒径比较。1. 1天；2. 10天；3. 20天；3. 30 天；3. 60 天。 图7实施例3放置不同时间的壳聚糖纳米粒表面电位比较。1. 1天；2. 10天； 3. 20 天；3. 30 天；3. 60 天。图8壳聚糖纳米粒杀伤人晶状体上皮细胞的MTT检测图。1.空白细胞；2. 150 nm的壳聚糖纳米粒；3. 180 nm的壳聚糖纳米粒。图9壳聚糖纳米粒成形范围。其中X,澄清液体；V ,乳液悬液；丨沉淀。
具体实施例方式以下实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具 体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1使用不同配比的壳聚糖/聚丙烯酸制备壳聚糖纳米粒 1.壳聚糖溶液/聚丙烯酸溶液的制备
a.将壳聚糖配制成浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/ml的醋酸溶液;
b.聚丙烯酸(PAA)配制成浓度分别为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、 0.06%的水溶液。c.壳聚糖纳米粒的制备按照体积比为1:5的比例分别将上述聚丙烯酸溶液逐滴 加入壳聚糖溶液中。具体说，就是将Iml PAA (分子量为IOOkDa)水溶液逐滴加入5 ml 壳聚糖溶液中(分子量为SOkDa的壳聚糖溶解在(w/v)的醋酸溶液)，同时磁性搅 拌，形成乳白色混悬液。所得乳白色混悬液用滤纸过滤，过滤好的混悬液静置24小时。结果如图9所示，壳聚糖纳米粒成形范围为壳聚糖和聚丙烯酸质量比为3:1 10:1,只有在这个范围才能得到稳定的壳聚糖纳米粒。如图4所示，PAA浓度一定时， 随着壳聚糖醋酸溶液浓度增加，制备的壳聚糖纳米粒粒径增加；壳聚糖浓度一定时，随 着PAA浓度增加，壳聚糖纳米粒粒径减小。实施例2使用不同酸碱度的缓冲液孵化壳聚糖纳米粒
a.按照为1:5的体积比分别将1 ml 0.02% PAA (分子量为100 kDa)水溶液逐滴加入 5 ml 0.2 mg/ml的壳聚糖溶液中(分子量为80 kDa的壳聚糖溶解在(w/v)的醋酸溶 液)，同时磁性搅拌，形成乳白色混悬液。所得乳白色混悬液用滤纸过滤，过滤好的混 悬液静置24小时。b.配制不同酸碱度的缓冲液，使其pH=l, 2, 3, 4, 5, 6, 7,9。c.将上述制得的壳聚糖纳米粒子，分别在pH=l, 2, 3, 4, 5, 6, 7,9的缓冲液中孵化 24小时。如图5结果显示，壳聚糖纳米粒子在3.0-7.0的pH值范围的溶液中都很稳定， 而其壳聚糖纳米粒子的粒径随pH值增加而增加。但在pH 2以下的溶液中几分钟就溶解 了，而在pH值大于9的溶液中则容易有沉淀析出。实施例3放置不同时间的壳聚糖纳米粒
a.将壳聚糖配制成浓度0.2 mg/ml的醋酸溶液，聚丙烯酸(PAA)配制成浓度分别为 0.02%的水溶液。b.将1 ml 0.02% PAA (分子量为100 kDa)水溶液逐滴加入5 ml 0.2 mg/ml的壳
聚糖溶液中(分子量为80 kDa的壳聚糖溶解在(w/v)的醋酸溶液)。
C.同时磁性搅拌，形成乳白色混悬液。d.将其分别放置1天，10天，20天，30天，60天。如图6，7结果显示，在60天之内壳聚糖纳米粒的粒径和表面电位变化趋势几乎 完全一致，一定程度上可以说明，该方法制备的壳聚糖纳米粒体系较为稳定，适用于生 物体系之中。实施例4壳聚糖纳米粒对人晶状体上皮细胞(Hurmn Lens Epithelial Cell, HLECs )的杀伤作用
一、细胞的培养本发明所用人晶状体上皮细胞来源于第二军医大学附属 长征医 院，所用培养液为含体积分数为10%的胎牛血清和的青霉素一链霉素的DMEM培养 液。所用细胞在37 °C，在体积分数为5% CO2的饱和湿度培养箱中培养，实验选用对数 生长期细胞。1. MTT检测细胞死亡率
a.收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞密度为5 X IO3— IX IO4/孔，每 孔加入100 ul。b.5% CO2, 37°C孵育，至细胞单层铺满孔底，加入壳聚糖纳米粒混悬液，每孔 IOOul。c.5%C02, 37°C孵育24小时，倒置显微镜下观察。d.吸去96孔板中的培养液，每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5% MTT)，继续培养4h。e.每孔加入IOOul 二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物
充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。f.根据以下公式计算细胞抑制率抑制率=(对照一给药)/(对照一本 底)X100%。如图8所示壳聚糖纳米粒混悬液孵育过的细胞死亡率明显大于对照组，此结果 表明壳聚糖纳米药物可以杀伤人晶状体上皮细胞，有望用于年龄相关性黄斑变性、视网 膜色素变性、糖尿病视网膜变性、青光眼、白内障等眼科疾病等方面的治疗。本发明中，壳聚糖纳米粒的形貌通过场发射扫描电镜观察，粒度和电势用动态 激光光散射法检测。结果参见图1、图2和图3。由场发射扫描电子显微镜测定表明由 离子交换法制备的壳聚糖纳米粒呈现良好的形貌，而且分散均勻(图1)；由激光粒度仪 分别检测壳聚糖纳米粒的粒径以及表面电位，其平均粒径和表面电位分别为180 nm， +58.1 mv (图2)；由激光拉曼光谱仪检测壳聚糖纳米粒的拉曼图谱(图3)，其结果显 示纳米粒中含有壳聚糖和聚丙烯酸成分。本发明还提供了壳聚糖纳米粒的应用，即将该壳聚糖纳米粒用于人晶状体上皮 细胞的凋亡。将上述壳聚糖纳米粒加入到对数生长期的人晶状体上皮细胞(Human Lens Epithelial Cell, HLECs)(人晶状体上皮细胞来源于第二军医大学附属长征医院)，继续 培养24小时，用MTT检测其对人晶状体上皮细胞的杀伤率，发现其对人晶状体上皮细胞 的杀伤率大于90%。
权利要求
1.一种由壳聚糖和聚丙烯酸合成的壳聚糖纳米颗粒，其特征在于该纳米颗粒粒径大 小在150-200 nm,偏差为士20 nm的球形粒子，表面电位为40 60 mv。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖纳米颗粒，其特征在于所述的壳聚糖的分子量为80 kDa，脱乙酰度 >90.0%，粘度 <100cps。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖纳米颗粒，其特征在于所述的聚丙烯酸的分子量为 100k Da根据权利要求1所述的壳聚糖纳米颗粒，其特征在于所述的纳米颗粒的粒径在150 200 nm的球形粒子。
4.根据权利要求1或4所述的壳聚糖纳米颗粒，其特征在于所述的纳米颗粒的表面电 位为40 60 mv。
5.一种制备根据权利要求1所述的壳聚糖纳米颗粒的方法，其特征在于该方法的具体 步骤为a.将壳聚糖溶于浓度为1的冰醋酸溶液中，配制成浓度为0.1 0.6 mg/ml壳聚 糖溶液；b.将浓度为0.01% 0.06w/v %的聚丙烯酸溶液逐滴加入到步骤a所得壳聚糖溶液 中，搅拌下形成乳白色混悬液，其中壳聚糖和聚丙烯酸质量比为3:1 10:1;C.在步骤b所得的乳白色混悬液过滤，所得固体静置陈化24小时，即得到壳聚糖纳 米颗粒。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的搅拌速度为180 200rpm。
全文摘要
本发明涉及一种壳聚糖纳米颗粒及其制备方法。该纳米颗粒是由壳聚糖和聚丙烯酸合成的壳聚糖纳米颗粒，其特征在于该纳米颗粒粒径大小在150-200nm，偏差为±20nm的球形粒子，表面电位为40～60mv。本发明制备的壳聚糖纳米粒可在年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病视网膜变性、青光眼、白内障等眼科疾病等方面有很好的应用。且制备工艺简单，生产成本低，所得的壳聚糖纳米粒稳定性好，能进一步满足生产和应用的需求。
文档编号A61K9/14GK102010527SQ201010586419
公开日2011年4月13日 申请日期2010年12月14日 优先权日2010年12月14日
发明者何丹农, 王美艳, 金彩虹, 魏锐利, 黄潇 申请人:上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司, 上海长征医院