专利名称：用作疫苗的修饰的革兰氏阴性细菌的制作方法
技术领域：
本发明总体涉及用作疫苗的修饰的革兰氏阴性细菌。
背景技术：
革兰氏阴性细菌是在革兰氏染色操作中不能保留结晶紫染料的细菌。革兰氏阴性细菌的许多种类是致病的，意味着它们在宿主生物体中能引起疾病。这种致病能力通常与革兰氏阴性细胞壁的某些成分、尤其是脂多糖(也被称为LPS或内毒素)层有关。LPS是革兰氏阴性细菌的外膜的主要成分，对细菌的结构完整性有很大的贡献，而且保护膜免受某种化学侵蚀。LPS也增加了细胞膜的负电荷，帮助稳定整个膜结构。LPS是内毒素，能诱导正常动物免疫系统的强烈响应。LPS还是外源性致热源(外源的发热诱导化 合物)。LPS包括三个部分多糖(0)侧链、核心多糖和脂质A。脂质A通常包含脂肪酸(例如羟基肉豆蘧酸)，嵌于外膜中，而LPS的剩余部分从表面伸出。脂质A是具有伸入膜中的多个脂肪酸尾部的二糖。当细菌细胞被免疫系统降解时，含脂质A的膜的碎片被释放进入循环系统，导致发热、腹泻和可能的致死性内毒素休克(也被称为败血性休克)。多糖侧链也被称为细菌的0-抗原。0侧链(0-抗原)是从核心多糖伸出的多糖链。0侧链的组成随不同的革兰氏阴性细菌菌株而不同。0侧链被宿主的抗体轻易地识别，然而，革兰氏阴性细菌可以轻易地修饰链的性质而逃避检测。核心寡糖包含稀有糖(例如KD0，酮-脱氧辛酮糖酸和庚糖)，但是关于其作用却知之甚少。具体而言，其毒力作用从未被直接研究过。已经设想了许多诱导针对脂多糖(LPS)的体液免疫的LPS突变体作为潜在疫苗。然而，纯LPS突变体或表达LPS突变体的细菌通常被认为毒性太强不能被用作疫苗，尤其考虑到它们强烈的副作用，因此，需要一种能表现减弱的毒力并诱导出足以保证宿主免疫的体液免疫的新的疫苗。
发明内容
发明人发现，通过修饰革兰氏阴性细菌LPS核心的特定结构，可能获得具有减弱的毒力但能诱导出足以保证宿主免疫的体液免疫的菌株。事实上，发明人发现，参与LPS核心合成的特定糖基转移酶对革兰氏阴性细菌的毒力具有关键作用。当至少一种这些糖基转移酶的被失活时，革兰氏阴性细菌合成的修饰的LPS诱导出宿主的强烈的免疫响应和其免疫效果。而且，发明人进一步表明，将革兰氏阴性细菌产生的LPS给药于宿主(其中至少一种所述糖基转移酶被失活)诱导出非特异性免疫响应，能被用作刺激免疫系统的佐剂。发明详沭本发明的一个目标涉及携带失活基因的革兰氏阴性细菌，所述基因编码参与所述革兰氏阴性细菌的LPS核心合成的糖基转移酶，其中所述糖基转移酶选自具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 21的氨基酸序列的糖基转移酶、或者具有与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :21至少50%、尤其至少60%、更尤其至少70%、最尤其至少80%同一性的氨基酸序列的其同源物，以及其中所述编码参与所述革兰氏阴性细菌的LPS核心合成的糖基转移酶的失活基因导致具有修饰核心的LPS的合成。发明人已经表明，具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的糖基转移酶是参与流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的LPS核心的特定分枝结构的合成的糖基转移酶。这种糖基转移酶被发明人称作BABLpcC。发明人尤其表明了，与至今报道的诱导LPS的核心和0-链的缺失的所有 LPS 核心的突变体(Gonzales 等人；PL0S one, July 2008, vol. 3, issue 7, e2760)不同，本发明的突变的革兰氏阴性细菌具有缺少核心部分但保持完整0-链的LPS。这些结果证明流产布鲁氏菌具有分枝的LPS核心，这到目前为止是未知的(见
图10，其给出了流产布鲁氏菌LPS核心的推测结构)。不想被理论束缚，发明人相信野生型细菌的LPS核心的这种分枝结构在逃避天然免疫的识别中很重要。因此，本发明的革兰氏阴性细菌突变体引起了更强烈的保护性免疫响应，因此构成了非常有希望的疫苗。除了流产布鲁氏菌的BABLpcC，发明人也表明同源的糖基转移酶存在于其它生物体中。因此，非常可信的是流产布鲁氏菌的LPS核心的特定结构也存在于其它生物体中。发明人进一步表明了这些同源蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO :1具有至少60%、尤其至少70%、更尤其至少80%的高百分比的同一性。参与LPS核心合成并与BABLpcC具有高百分比同一性的糖基转移酶的例子如下表
所示
权利要求
1.携带失活基因的革兰氏阴性细菌，所述基因编码参与所述革兰氏阴性细菌的LPS核 心合成的糖基转移酶，其中所述糖基转移酶选自具有SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :21的氨基酸序列的糖基 转移酶、或者具有与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 21至少50%、尤其至少60%、更尤其至少 70 %、最尤其80 %同一性的氨基酸序列的其同源物，以及其中所述编码参与所述革兰氏阴性细菌的LPS核心合成的糖基转移酶的失活基因导 致具有修饰核心的LPS的合成。
2.根据权利要求1所述的革兰氏阴性细菌，其中所述与SEQID NO :1具有至少50%、 尤其至少60%、更尤其至少70%、最尤其至少80%同一性的氨基酸序列是选自SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 22 的与SEQ ID NO 1具有至少60%、尤其至少70%、更尤其至少80%同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的革兰氏阴性细菌，其中所述与SEQID N0:21具有至少 50 %、尤其至少60 %、更尤其至少70 %、最尤其至少80 %同一性的氨基酸序列是选自SEQ ID NO :23、SEQ ID NO 24 和 SEQ ID NO :25 的与 SEQ ID NO 21 具有至少 50%、尤其至少 60 %同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的革兰氏阴性细菌，其中编码参与LPS的0-多糖合 成的蛋白的基因是失活的。
5.根据权利要求4所述的革兰氏阴性细菌，其中所述参与LPS的0-多糖合成的蛋白 选自具有氨基酸序列 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO 1U SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 26、SEQ ID N0:27 和 SEQ ID NO :28 的蛋白或具有与选自 SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO 27 和 SEQ ID NO 28 的氨基酸序列至少 50%、尤其至少 60 %、更尤其至少70 %同一性的氨基酸序列的其同源物。
6.根据权利要求4所述的革兰氏阴性细菌，其中所述参与LPS的0-多糖合成的蛋白是 具有氨基酸序列SEQ ID NO 13的perosamine合成酶或具有与氨基酸序列SEQ ID NO 13 至少90%同一性的氨基酸序列的其同源物。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的革兰氏阴性细菌，所述细菌选自于-布鲁氏菌属的细菌，其中所述糖基转移酶选自具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :21的 氨基酸序列的糖基转移酶、或者具有与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :21至少60%、尤其至少 70%、更尤其至少80%同一性的氨基酸序列的其同源物，-人苍白杆菌细菌，其中所述糖基转移酶选自具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列或与SEQ ID NO :1具有至少85%同一性的氨基酸序列、或具有SEQ ID NO :23的氨基酸序列或与SEQ ID NO 21具有至少62%同一性的氨基酸序列的糖基转移酶，-烟碱降解细菌，其中所述糖基转移酶选自具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列或与SEQ ID NO :1具有至少85%同一性的氨基酸序列、或具有SEQ ID NO :24的氨基酸序列或与SEQ ID NO 21具有至少62%同一性的氨基酸序列的糖基转移酶，-汉氏巴尔通体细菌，其中所述糖基转移酶选自具有SEQ ID NO :22的氨基酸序列或与 SEQ ID NO :1具有至少69%同一性的氨基酸序列的糖基转移酶，-昆氏巴尔通体细菌，其中所述糖基转移酶选自具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列或与 SEQ ID NO :1具有至少65%同一性的氨基酸序列的糖基转移酶，-巴尔通体细菌，其中所述糖基转移酶选自具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列或与SEQ ID NO 1具有至少64%同一性的氨基酸序列的糖基转移酶，-杆状巴尔通体细菌，其中所述糖基转移酶选自具有SEQ ID NO :4的氨基酸序列或与 SEQ ID NO :1具有至少61%同一性的氨基酸序列的糖基转移酶，-根癌农杆菌细菌，其中所述糖基转移酶选自具有SEQ ID NO :7的氨基酸序列或与SEQ ID NO 1具有至少63%同一性的氨基酸序列的糖基转移酶，-放射农杆菌细菌，其中所述糖基转移酶选自具有SEQ ID NO :25的氨基酸序列或与 SEQ ID N021具有至少57%同一性的氨基酸序列的糖基转移酶。
8.根据权利要求7所述的革兰氏阴性细菌，其中所述布鲁氏菌属的细菌选自马尔他 布鲁氏杆囷、流广布鲁氏囷、猪布鲁氏杆囷、绵羊布鲁氏杆囷、轄足类布鲁氏杆囷、Brucella ceti、田鼠布鲁氏杆菌和犬布鲁氏杆菌。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的革兰氏阴性细菌，其用在治疗人或动物体的方法中。
10.根据权利要求8中所述的革兰氏阴性细菌，其用在治疗人或动物体的布鲁氏菌病 的方法中。
11.包含权利要求1-8中任一项的革兰氏阴性细菌的疫苗。
12.从根据权利要求1-8中任一项所述的革兰氏阴性细菌获得的分离的脂多糖。
13.根据权利要求12中所述的分离的脂多糖，其用在刺激人或动物体的免疫系统的方 法中。
14.包含根据权利要求12所述的脂多糖的佐剂。
15.包含抗原和佐剂的疫苗，其中所述佐剂包含权利要求12的脂多糖。
16.包含连接至载体分子的根据权利要求12所述的脂多糖的偶联物。
全文摘要
本发明涉及携带失活基因的革兰氏阴性细菌，所述基因编码参与所述革兰氏阴性细菌的LPS核心合成的糖基转移酶，其中所述失活基因导致具有修饰核心的LPS的合成。这些菌株具有减弱的毒力，但诱导足以保证宿主免疫的体液免疫。
文档编号A61K35/74GK102665739SQ201080052734
公开日2012年9月12日 申请日期2010年9月21日 优先权日2009年9月21日
发明者I·莫里昂, J-P·戈维尔, M·伊里亚特, R·康德-阿尔瓦瑞兹, V·阿塞戈维尔 申请人:国家医疗保健研究所, 国家科学研究中心, 纳瓦拉公司科学与技术研究所, 艾克斯-马赛大学