利用骨髓间充质干细胞和/或多能干细胞的血中动员的组织再生促进剂的制作方法

专利名称：利用骨髓间充质干细胞和/或多能干细胞的血中动员的组织再生促进剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及投予至与需要再生的组织不同的组织中的组织再生促进剂。
背景技术：
再生医疗是以损伤器官的功能性、器质性再生为目的的医疗，其利用在体外进行了培养和加工的细胞或组织。例如，皮肤培养片等是将在体外对从本人或他人采集的皮肤细胞进行培养并加工成片状的制品移植到损伤皮肤上。再生医疗中，为了确保治疗所使用的细胞，需要在体外对细胞进行培养增殖。通过培养操作，有可能会发生细胞的劣化(老化、肿瘤化、细菌和病毒等的污染)，因此为了維持安全性需要在保证GMP标准的设施内进行制造，从而可预想到治疗费用的高额化将成为课题。 另ー方面，己知生物体在器官损伤时具备损伤部位的修复再生机制，但损伤部位很大时,非功能性的疤痕组织会占据损伤部位。带有这种疤痕组织的损伤治愈在脑梗塞或脊髄损伤中成为神经再生的抑制因子、在心肌梗塞中成为心脏破裂的要因、在大面积烧伤或手术创伤中变为疤痕疙瘩等、在生命预后、美容方面成为明显损害QOL的原因。如果能够活化生物体所具有的损伤组织的修复再生机制，则可以期待在不发生疤痕治愈的情况下诱导利用功能性组织的损伤组织(器官)的再生。已知在骨髄内除了分化成白细胞或红细胞等的造血干细胞之外，还存在能够分化成骨、软骨、脂肪等的间充质干细胞，近年来还得知存在能够分化成上皮系或神经系细胞的多能干细胞。现有技术文献专利文献专利文献I :W02008/05389
发明内容
发明要解决的技术问题在现有的治疗方法中，对于治愈困难的大面积皮肤溃疡、难治性骨折、脑梗塞等难治性疾病，开发通过生理性修复再生机制的活化来诱导损伤组织的治愈的新型治疗方法成为课题。用于解决技术问题的方法在使用小鼠确认皮肤溃疡部位治愈过程中HMGB-I及S100A8的将骨髓源性细胞向皮肤溃疡部的动员效果时可知通过向相对于皮肤溃疡部远且不同位置的静脉血内投予HMGB-I或S100A8，骨髓源性细胞被动员到皮肤溃疡部位。接着，在确认HMGB-I及S100A8的静脉内投予所产生的皮肤溃疡治愈促进效果时显示通过将它们投予至距离溃疡部位远且不同位置的血管内，成功地促进了皮肤溃疡的治愈。进而，在确认皮肤溃疡的非疤痕性治愈促进效果时显示通过将HMGB-I进行静脉内投予，可以促进已被动员至血液中的骨髄源性细胞向溃疡部分的进ー步动员，从而可以促进皮肤溃疡的早期闭合和非疤痕性治愈。另外，在确认脑梗塞模型小鼠脑中的骨髄源性细胞的存在时显示对于制作脑梗塞后静脉投予了 HMGB-I的小鼠，在脑内确认到了表达神经细胞标记物的骨髄源性细胞。接着，在确认脑梗塞灶的缩小效果时显示与对照小鼠相比，HMGB-I静脉投予小鼠中，对于脑梗塞灶确认到了显著的改善效果。另外，在确认脑梗塞后的存活率改善时显示在HMGB-I静脉投予例中小鼠的存活率提高。进而，在使用小鼠确认在骨折治愈过程中骨折部以外部位的骨髄多能干细胞的相关性时可知损伤部位远处的骨髄源性细胞移动至骨折部分进行损伤组织的修复。进而，使用骨折模型小鼠评价HMGBl静脉投予所产生的骨髄间充质干细胞向损伤部位的动员活性时可知通过HMGBl的静脉内投予，已被动员至血中的骨髓间充质干细胞聚集至骨折部分。
本申请基于上述所知而提供以下的发明。(I) 一种药剂，其为含有以下(a) (q)中任一项所述的物质的组织再生促进剂，且其被投予至与需要再生的组织不同的组织；(a) HMGBl 蛋白质(b)分泌HMGBl蛋白质的细胞(c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体(d)HMGB2 蛋白质(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体(g)HMGB3 蛋白质(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体(j)S100A8 蛋白质(k)分泌S100A8蛋白质的细胞(I)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(m)S100A9 蛋白质(η)分泌S100A9蛋白质的细胞(ο)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体(P)细胞或组织的提取液(q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。( 2 )上述(I)所述的药剂，其被非经ロ投予。( 3 )上述(2 )所述的药剂，其为注射投予。( 4 )上述(I)所述的药剂，其被投予至血管内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内。(5)上述(I) (4)任一项所述的药剂，其中，细胞或组织的提取液是通过包含将细胞或组织浸溃在溶剂中的エ序的方法来制造。(6)上述(I) (4)任一项所述的药剂，其中，细胞或组织的提取液的肝素结合级分是通过包含以下エ序的方法来制造(a)将细胞或组织浸溃在溶剂中的エ序、
(b)使工序(a)中获得的提取液与固定化肝素接触的工序、和(c)从固定化肝素中洗脱肝素结合级分的工序。(7)上述(I) (6)任一项所述的药剂，其被用于神经组织、骨组织或皮肤组织的再生促进。(8)—种组织再生促进试剂盒，其包含含有以下(a) (q)中任一项所述的物质的组合物，该组合物被投予至与需要再生的组织不同的组织；
(a) HMGBl 蛋白质(b)分泌HMGBl蛋白质的细胞(c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体(d)HMGB2 蛋白质(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体(g)HMGB3 蛋白质(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体(j)S100A8 蛋白质(k)分泌S100A8蛋白质的细胞(I)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(m)S100A9 蛋白质(η)分泌S100A9蛋白质的细胞(ο)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体(P)细胞或组织的提取液(q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。( 9 )上述(8 )所述的试剂盒，其被非经口投予。(10)上述(9)所述的试剂盒，其为注射投予。( 11)上述(8 )所述的试剂盒，其被投予至血管内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内。(12)上述(8) (11)任一项所述的试剂盒，其被用于神经组织、骨组织或皮肤组织的再生促进。(13)—种促进组织再生的方法，其包含将有效量的含有以下(a) (q)中任一项所述的物质的组合物投予至与需要再生的组织不同的组织的工序；(a) HMGBl 蛋白质(b)分泌HMGBl蛋白质的细胞(c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体(d)HMGB2 蛋白质(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体(g)HMGB3 蛋白质(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
(j)S100A8 蛋白质(k)分泌S100A8蛋白质的细胞(I)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(m)S100A9 蛋白质(η)分泌S100A9蛋白质的细胞(ο)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体(P)细胞或组织的提取液(q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。 (14)上述(13)所述的方法，其中，为非经口投予。( 15)上述(14)所述的方法，其中，为注射投予。(16)上述(13)所述的方法，其中，向血管内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内进行投予。(17)上述(13) (16)任一项所述的方法，其促进神经组织、骨组织或皮肤组织的再生。(18)—种含有以下(a) (q)中任一项所述的物质的组合物在组织再生促进剂的制造中的用途，其中，该组织再生促进剂被投予至与需要再生的组织不同的组织；(a) HMGBl 蛋白质(b)分泌HMGBl蛋白质的细胞(c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体(d)HMGB2 蛋白质(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体(g)HMGB3 蛋白质(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体(j)S100A8 蛋白质(k)分泌S100A8蛋白质的细胞(I)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(m)S100A9 蛋白质(η)分泌S100A9蛋白质的细胞(ο)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体(P)细胞或组织的提取液(q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。(19)上述(18)所述的用途，其中，所述组织再生促进剂被非经口投予。(20)上述(19)所述的用途，其中，为注射投予。(21)上述(18)所述的用途，其中，所述组织再生促进剂被投予至血管内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内。(22)上述(18) (21)任一项所述的用途，其中，所述组织再生促进剂为神经组织、骨组织或皮肤组织的再生促进剂。
(23)—种组合物，其为用于在促进组织再生的方法中使用的、含有以下(a) (q)中任一项所述的物质的组合物，其被投予至与需要再生的组织不同的组织；(a) HMGBl 蛋白质(b)分泌HMGBl蛋白质的细胞(c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体(d)HMGB2 蛋白质(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞Cf)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体 (g)HMGB3 蛋白质(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体(j)S100A8 蛋白质(k)分泌S100A8蛋白质的细胞(I)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(m)S100A9 蛋白质(η)分泌S100A9蛋白质的细胞(ο)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体(P)细胞或组织的提取液(q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。(24 )上述(23 )所述的组合物，其被非经口投予。(25 )上述(24 )所述的组合物，其中，为注射投予。(26 )上述(23 )所述的组合物，其被投予至血管内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内。(27)上述(23) (26)任一项所述的组合物，其中，促进组织再生的方法是促进神经组织、骨组织或皮肤组织的再生的方法。发明效果作为损伤组织再生药品，已知HGF、EGF、VEGF、FGF等细胞增殖因子，但这些物质是被直接投予至损伤部位及其附近组织以期待促进细胞增殖来进行使用的。HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9具有动员骨髓多能干细胞的活性。骨髓多能干细胞除了能分化成间充质细胞之外，还可分化成上皮系或神经系的细胞。在大面积的组织损伤时，只要能够介由血流将骨髓多能干细胞动员至损伤部位，则可期待促进骨髓多能干细胞所带来的生理性损伤组织的修复再生。通过本发明，提供了下述方法通过利用静脉内投予等方法将作为骨髓多能干细胞动员因子的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9投予至远离损伤部位的远处部位，从而将骨髓多能干细胞动员至末梢血中，由此促进损伤组织修复。例如，在治疗如脑梗塞那样的体内深部器官的疾病时，很难将治疗药直接投予至损伤部位(脑)。而本发明中，由于使在通常诊疗中广泛实施的静脉投予的治疗成为可能，因而可以以任意的次数、浓度将治疗药安全且简便地投予，这是比现有的治疗方法更优异的效果。另外，作为最近开发出的使用了骨髄细胞的脑梗塞的治疗方法，已知从患者本人的骨髄采集细胞并再次投予到血液循环中的方法是有效的，但在采集骨髄细胞时由于需要将很粗的针刺入体内深部的骨髄进行抽吸，因而不可避免地伴有严重的侵袭。与此相对，在本发明中，通过将药剂进行静脉内投予，可以将骨髄细胞直接动员至血液循环中，因而即便多次向脑梗塞患者投予，也不会伴有严重的侵袭。骨髄来源的多能干细胞具有分化成间充质细胞、上皮系细胞、神经系细胞等多种细胞的潜在能力，认为在移动至损伤部位后根据周围的微环境进行分化并诱导组织修复。在再生医疗或细胞治疗中，是在生物体外将稀少的骨髓多能干细胞进行培养并使其增殖后用于治疗，但与以往的药品不同，由于具有在培养过程中可能发生的细胞的劣化(癌化或细菌、病毒等的污染)的危险，因而需 要充分的安全管理。本发明中，通过投予HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9而将骨髓多能干细胞动员至末梢循环血内，但由于不需要将细胞取出至体外以施加人工操作，因而是安全性高的治疗方法。


图I为表示HMGBl的纯化过程的照片。将在HMGBl的N末端侧含有利用GST-标签6XHis-标签HRV3C获得的剪切序列的表达载体转染至HEK293。使培养上清结合于镍柱，用咪唑对结合级分进行洗脱。进而，将镍柱结合级分利用HRV3C从HMGBl中剪切GST-标签6XHis标签后，使其结合在肝素亲和柱上，利用氯化钠进行洗脱。使肝素结合级分结合在Q柱上，利用氯化钠进行洗脱。为了检测各个纯化过程的纯化度，对结合在柱上的级分进行SDS-PAGE后，进行考马斯染色。图2为表示溃疡闭合后的皮肤和皮肤的薄切片的GFP信号的照片。在GFP骨髄移植小鼠的背中制作皮肤溃疡，经静脉投予HMGBl或S100A8。经静脉投予了 HMGBl和S100A8的小鼠的皮肤上与对照相比，检测到更多量的为GFP阳性的骨髓源性细胞。图3为表示经时测定的皮肤溃疡面积的曲线。在小鼠的背中制作皮肤溃疡，经静脉投予HMGBl或S100A8。制作溃疡后第3天，与对照组相比，在HMGBl投予组中可见皮肤溃疡的缩小效果。在制作溃疡后第7天，与对照组相比，在S100A8投予组中可见皮肤溃疡的缩小效果(纵轴溃疡面积+皮肤溃疡制作时的面积X 100，横轴皮肤溃疡制作后的天数)。图4为表示皮肤溃疡闭合后对皮肤的薄切片进行了苏木精伊红染色(HE)、MaSSon三色染色(MT)后的结果的照片。在小鼠的背中制作皮肤溃疡，经静脉投予HMGB1。在对照小鼠中可见胶原纤维异常增加，而经静脉投予了 HMGBl的小鼠中抑制了胶原纤维的异常增加。图5为表示巢蛋白(神经干细胞标记物)和β III微管蛋白(神经元标记物)表达细胞的检测结果的照片。在GFP骨髄移植小鼠中制作脑梗塞，经静脉投予HMGBl来进行治疗。治疗结束后，制作脑的薄切片进行免疫组织化学。左侧照片的箭头所示的细胞为GFP阳性且巢蛋白阳性的细胞。右侧照片的箭头所示的细胞为GFP阳性且β III微管蛋白阳性的细胞。确认了骨髄来源的细胞表达神经标记物。图6为表示梗塞部位的检测结果的照片。制作脑梗塞疾病模型小鼠，经静脉投予HMGBl0治疗结束后，制作脑的薄切片，进行尼氏染色。在PBS投予例(对照)中皮质可见坏死的组织，在HMGBl治疗例中皮质未见坏死的组织。图7为表示脑梗塞制作后7天的存活率的曲线。制作脑梗塞疾病模型小鼠(缺血45分钟、缺血60分钟)后，进行经静脉投予HMGBl所实施的治疗。在缺血45分钟、缺血60分钟的任一情况下，都确认了通过利用HMGBl的治疗所带来的存活率的改善。图8为表示在通过皮肤结合的GFP骨髄移植小鼠和野生型小鼠中，GFP骨髄嵌合体小鼠的骨髄细胞移动至野生型小鼠的右足骨折部位并分化成成骨细胞的照片。通过皮肤将GFP骨髄移植小鼠和野生型小鼠结合、在野生型小鼠中制作骨折。在骨折部位的治愈后，在表达骨钙素的成骨细胞中存在GFP阳性细胞。教示了 在骨折的治愈过程中，距离损伤部位远的骨髓源性细胞移动至骨折部位并分化成成骨细胞，从而进行生理性损伤治愈。图9为表示在向GFP骨髄移植小鼠背部移植皮肤后所观察到的对移植皮肤片的GFP荧光聚集的照片。上面左侧的照片表示皮肤移植部的肉眼图像、上面中央的照片表示在移植皮肤与受体皮肤的边界部(用“丨”表示的部分)附近处受体皮肤的HE组织图像、上面右侧照片表示植皮皮肤的HE组织图像。另外，下面左侧照片表示对植皮皮肤的GFP荧光的聚集、下面中央的照片表示植皮部的放大图像、下面右侧照片表示对该放大部皮肤的GFP 荧光的聚集。图10为表示在GFP骨髄移植小鼠背部上的移植皮肤片中聚集的骨髄来源的表皮细胞、骨髄来源的真皮成纤维细胞的照片。左侧开始第I列是DAPI染色(核染色)，上面的照片表示植皮部皮肤的弱放大图像(100倍)；中间照片以其强放大图像(200倍)表示表皮/真皮边界部；下面以其强放大图像(200倍)表示毛囊部。左侧开始第2列表示第I列的各个区域的GFP荧光图像、左侧开始第3列表示其角蛋白5 (K5)的免疫染色图像、左侧开始第4列表示将各个荧光重叠后的图像(Merge)。观察到了多个GFP阳性表皮细胞和真皮成纤维细胞。图11为表示使用了 Boyden小室的皮肤提取液的骨髄来源间充质干细胞迁移能力活性测定结果的照片。上面左侧照片是使用蓝色色素对骨髓间充质干细胞进行了染色的图像，所述骨髓间充质干细胞从Boyden小室的上槽内通过硅膜上的微孔迁移至皮肤提取液侦仪下槽侧)并附着在硅膜下槽侧，从上开始表示刚开始培养后(Oh)、12小时后(12h)、24小时后(24h)的染色图像(各4个孔)。上面右侧照片表示Oh的强放大图像、下面左侧照片表示12h的强放大图像、下面右侧照片表示24h的强放大图像。图12为表示皮肤提取液纯化级分标准品组的使用了 Boyden小室的骨髄来源间充质干细胞迁移能力活性测定结果与各个纯化级分标准品的SDS-PAGE电泳结果的对应的照片。左侧开始第I泳道(M.W.)表示电泳了分子量标记物后的银染色图像、第2泳道(C.E.)表示电泳了纯化前皮肤提取液后的银染色图像、第3泳道(H. A.)表示电泳了肝素亲和柱结合级分(中间纯化级分)后的银染色图像、第4 13泳道(A. E.)表示电泳了以各种NaCl浓度洗脱出的阴离子交换柱结合级分(最终纯化级分)后的银染色图像。进而，将骨髄来源间充质干细胞迁移活性最强的最终纯化级分序号4的电泳凝胶银染色图像(泳道7)的各染色带切出，进行质谱分析和数据库解析，结果明确了 “一”所示的条带是HMGBl。图13为表示使用了 Boyden小室的HMGBl的骨髄来源间充质干细胞迁移能力活性测定结果的照片。上面两个表示迁移至皮肤提取液中的骨髄来源间充质干细胞的染色图像、中间两个表示迁移至HMGBl纯化标准品的骨髄来源间充质干细胞的染色图像、下面表示迁移至在中间使用的HMGBl纯化标准品中添加抗HMGBl多克隆抗体而进行了中和的溶液中的骨髄来源间充质干细胞的染色图像(迁移活性基本消失)。
图14为表示HMGBl的生物体内骨髄来源间充质干细胞动员活性的照片。HMGBl级分(最终纯化级分序号4)显示出了对照(最终纯化级分序号I)的约3倍的动员活性。图15为利用HMGBl级分(最终纯化级分序号4)在生物体内被动员了的细胞的强放大照片。图16为刚开始培养迁移到硅管内的细胞后的照片。左侧照片表示接种于培养基内的迁移细胞的明视野图像、右侧照片表示其暗视野的GFP荧光图像。图17为开始培养迁移到硅管内的细胞24小时后的照片。左侧照片表示附着在培养塑料培养皿上进行增殖的成纤维细胞样细胞和上皮细胞样细胞的明视野图像、右侧照片表示其暗视野的GFP荧光图像。图18为开始培养迁移到硅管内的细胞2周后的照片。左右侧照片为同一视野、左侧照片是明视野、右侧照片通过荧光滤波器(B和D是检测GFP的荧光、F是检测角蛋白5的 荧光)的照片。在塑料培养皿上圆形地形成集落的骨髄来源GFP阳性细胞团的左侧可见线状的毛发状形态〈用Λ (箭头)表示〉。F表示骨髓源性细胞呈现毛发状的形态变化并进一步表达角蛋白5 (用Λ (箭头)表示)。图19为使用Western blot法检测新生小鼠皮肤提取液中的HMGB家族的照片。图20为表示哺乳类细胞的HMGB家族的表达载体的MAP的图。大量地合成带有巨细胞病毒增强子和鸡β -肌动蛋白启动子、处于启动子下游的HMGB家族的cDNA(complementary DNA,互补 DNA)所编码的 mRNA。图21为表示在HEK293细胞中表达的纯化重组Flag标签-HMGB家族融合蛋白的Western blot结果的照片。图22为表示使用了 Boyden小室的重组HMGBl、HMGB2、HMGB3的骨髓间充质干细胞迁移活性的图。任一重组蛋白与对照组相比均显示了迁移活性。图23为显示在小鼠的皮肤溃疡治疗模型中HMGB家族的治疗结果的图。HMGB1、HMGB2、HMGB3与对照组相比均显示了显著地缩小溃疡面积的效果。图24为使用Boyden小室确认人HMGBl和人皮肤提取液的使人骨髓来源的间充质干细胞迁移的活性的照片。图25为利用肝素柱对小鼠心脏、小鼠脑及小鼠皮肤提取液中的骨髓间充质干细胞诱导活性物质进行纯化、并使用Boyden小室确认活性的照片。图26为使用Boyden小室法确认培养细胞株HEK293和HeLa提取液的人骨髓间充质干细胞迁移活性的照片。任一种培养细胞株均显示了人骨髓间充质干细胞迁移活性。图27A为将小鼠固定在脑定位固定装置、用手术刀在头部正中切开并使用钻进行头部穿孔的照片。B为使用注射器对脑施加负压以抽吸一部分脑组织的照片。C为注入5 μ I的溶解于纤维蛋白糊制剂的纤维蛋白原的皮肤提取液肝素柱纯化级分、接着注入5μ I的纤维蛋白糊制剂的凝血酶后的照片。D和E为脑损伤模型治疗2周后的照片。与对照的D相比，利用皮肤提取液肝素柱纯化级分的治疗组的E中可见GFP阳性细胞的聚集。F和G为脑损伤模型治疗6周后的照片。与对照的F相比，利用皮肤提取液肝素柱纯化级分的治疗组的G中可见GFP阳性细胞的聚集。图28为从小鼠尾静脉投予皮肤提取液(SE)并采集末梢血的图。图29为从小鼠尾静脉投予HMGBl并采集末梢血的图。
图30为用抗小鼠TOGFRa抗体、抗小鼠⑶44抗体对投予皮肤提取液(SE)12小时后的小鼠末梢血单核细胞级分进行荧光标记并利用流式细胞仪进行分级的图。上面3个为阴性对照的PBS投予组(n=3)、下面3个为皮肤提取液(SE)投予组(n=3)。纵轴表示⑶44的表达量、横轴表示I3DGFR a的表达量。蓝线围住的部分表示⑶44阳性且TOGFR a阳性细胞群，其在皮肤提取液投予组(SE)中与PBS组相比有所增加。图31为用抗小鼠TOGFRa抗体、抗小鼠⑶44抗体对HMGBl投予12小时后的小鼠末梢血单核细胞级分 进行荧光标记并利用流式细胞仪进行分级的图。左侧为阴性对照的PBS投予小鼠的图、右侧为HMGBl投予小鼠的图。纵轴表示CD44的表达量、横轴表示PDGFR a的表达量。蓝线围住的部分表示⑶44阳性且TOGFRa阳性细胞群，其在HMGBl投予小鼠中与PBS投予小鼠相比有所增加。图32A为表示显示了具有⑶44和TOGFRa的细胞的存在频率的流式细胞仪的结果的图。末梢血中的I3DGFR a阳性且⑶44阳性细胞和I3DGFR a阳性且⑶44阴性细胞的任一细胞群均通过HMGBl投予而增加。B为表示在PBS投予组和HMGBl投予组中对TOGFRa阳性且CD44阳性细胞的末梢血中出现频率进行比较的结果的图、C为表示在PBS投予组和HMGBl投予组中对TOGFRa阳性且⑶44阴性细胞的末梢血中出现频率进行比较的结果的图。对于任一细胞群均是在HMGBl投予组中发生了统计学上显著的增加。图33为表示在向GFP骨髄移植小鼠背部移植皮肤后观察到的对移植皮肤片的GFP荧光聚集的照片。左侧照片(A)用DAPI对细胞核进行了染色。中央的照片(B)用绿色荧光色表示聚集在植皮部的GFP阳性骨髓源性细胞。右侧照片(C)是将照片(A)和照片(B)重叠后的图。骨髓源性细胞将皮肤组织进行再构建。图34为表示使用了 Boyden小室的皮肤提取液的骨髄来源间充质干细胞迁移能力活性测定结果的照片。是用蓝色色素对骨髓间充质干细胞进行了染色的图像，所述骨髓间充质干细胞从Boyden小室的上槽内通过带有8 μ m微孔的聚碳酸酯膜的微孔迁移至含有皮肤提取液的下槽侧并附着在膜下槽侧。在下层中加入有从2日龄小鼠和6周龄小鼠采集的皮肤的提取液。图35为利用Western blot法确认皮肤提取液中的S100A8、S100A9蛋白的存在的照片。图36为表示将皮肤提取液中的肝素结合蛋白质从肝素亲和柱利用NaCl浓度梯度进行洗脱的结果的照片。各馏分的蛋白质利用SDS-PAGE进行分级并用银染色进行检测。图37为表示使用了 Boyden小室的皮肤提取液对骨髓来源的间充质干细胞的迁移能力活性的测定结果的照片。其是用蓝色色素对骨髓间充质干细胞进行染色而得到的图像，所述骨髓间充质干细胞从Boyden小室的上槽内通过膜上的微孔迁移到皮肤提取液的经肝素结合的各级分(下槽侧)中并附着于膜下槽侧。图38为使用Western blot法检测皮肤提取液的经肝素结合的各级分中S100A8、S100A9蛋白的存在的结果的照片。图39为S100A8、S100A9表达载体的图。图40为表示使用了 Boyden小室的皮肤提取液对骨髓来源的间充质干细胞的迁移能力活性的测定结果的照片。其是用蓝色色素对骨髓间充质干细胞进行染色而得到的图像，所述骨髓间充质干细胞从Boyden小室的上槽内通过膜上的微孔迁移到分别含有重组GST-S100A8、GST-S100A9、皮肤提取液的下层侧并附着于膜下槽侧。图41A为从小鼠的尾静脉投予GST-S100A8、GST-S100A9并对12小时后末梢血中的⑶45阴性细胞的级分进行⑶44、PDGFRa、PDGFR^的FACS的图。B是用棒状图进行表示，左图表示在CD45阴性细胞群中CD44阳性、PDGFRa阳性的细胞群的比例；右图表示在⑶45阴性细胞群中⑶44阳性、TO GFR β阳性的细胞群的比例。图42为表示使用抗⑶lib MACS珠对TOGF受体a -GFP敲入小鼠骨髄来源的附着细胞进行分选后的细胞的照片。⑶Ilb阳性的细胞几乎未见GFP的表达。⑶Ilb阴性的几乎所有细胞中均可见GFP的表达。⑶IIb阳性细胞表示TOGF受体a阴性、⑶Ilb阴性细胞表示PDGF受体a阳性。图43为表示HMGBl对作为CDllb阳性细胞的巨噬细胞几乎没有迁移活性而对作为CDllb阴性细胞的间充质干细胞具有迁移活性的照片。图44为表示在I3DGF受体a GFP小鼠上制作骨折后通过GFP荧光(绿色荧光)观察骨折部位处的骨髓间充质细胞的聚集的结果的照片。显示出与阴性对照投予小鼠相比，HMGBl静脉投予小鼠中骨髓间充质细胞更多地聚集在骨折部位。
具体实施例方式本发明提供一种药剂，其为含有以下(a广(q)中任一项所述的物质的组织再生促进剂，其被投予至与需要再生的组织不同的组织，(a) HMGBl 蛋白质(b)分泌HMGBl蛋白质的细胞(c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体(d)HMGB2 蛋白质(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体(g)HMGB3 蛋白质(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体(j)S100A8 蛋白质(k)分泌S100A8蛋白质的细胞(I)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(m)S100A9 蛋白质(η)分泌S100A9蛋白质的细胞(ο)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体(P)细胞或组织的提取液(q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。该组织再生促进剂的特征在于，通过被投予至与需要再生的组织不同的组织，介由末梢循环将骨髓细胞从骨髓动员(也可表述为诱导或局部诱导)至需要再生的组织。这里，“末梢循环”还被称作“血液循环”、“末梢血液循环”。本发明的组织再生促进剂优选抑制疤痕治愈并诱导非疤痕性治愈。疤痕治愈是指功能性组织被纤维性胶原置换的状态。而非疤痕性治愈是指损伤部位将由细胞成分形成的功能性组织再生的状态，在功能性、审美性方面而言比疤痕治愈更为优异。本发明的组织再生促进剂中含有这种非疤痕性组织再生促进剂。因此，本发明的药剂是一种组织再生促进剂，其特征在于，其被投予至与需要再生的组织不同的组织，将骨髓细胞从骨髄动员至末梢血中，介由末梢循环体系将骨髓源性细胞动员至需要再生的组织，从而促进组织的再生。还可表述为一种药剂，其是非疤痕性组织再生促进剂，其被投予至与需要再生的组织不同的组织；一种药剂，其是非疤痕性组织再生促进剂，其特征在于，其被投予至与需要再生的组织不同的组织，将骨髓细胞从骨髄动员至末梢血中，介由末梢循环体系将骨髓源性细胞动员至需要再生的组织，从而促进组织的再生。作为需要再生的组织，可例示出损伤了的组织、坏死了的组织、术后组织、功能降低了的组织、纤维化了的组织、老化了的组织、患病的组织等，例如可例示出生物体皮肤组织、体内活检(手术)组织(脑、肺、心脏、肝脏、胃、小肠、大肠、胰脏、肾脏、膀胱、脾脏、子宫、辜丸、血液等)。本发明中，向与需要再生的组织不同的组织的投予是指投予至除需要再生的部位以外的部位(与需要再生的部位不同的部位)。因此，“与需要再生的组织不同的组织”还可表述为与需要再生的组织不同的部位、与需要再生的部位不同的部位、远离需要再生的组织的部位、远离需要再生的部位的部位、位于距离需要再生的部位远的部位、位于距离需要再生的组织远的组织、远处部、远处组织。特别是，本发明的药剂可被有效用于对难以从体外直接投予药剂的组织(脑、心脏等)进行再生。被动员至需要再生的组织的骨髓源性细胞分化成各种细胞，从而有助于需要再生的组织的功能性再生和功能维持、功能强化。本发明中，作为需要再生的组织，可举出由缺血/灌注不足/低氧状态所引起的各种病态、外伤、烧伤、炎症、自身免疫、基因异常等导致了损伤的组织，但并非限定于这些原因。作为本发明中的组织，只要是骨髓源性细胞能够分化的组织，则无特别限定，例如可例示出皮肤组织、骨组织、软骨组织、肌肉组织、脂肪组织、心肌组织、神经系统组织、肺组织、消化道组织、肝/胆/胰腺组织、泌尿/生殖器等生物体内的所有组织。另外，通过使用上述组织再生促进剂，不仅在难治性皮肤溃疡、皮肤创伤、水疱症、脱毛症等皮肤疾病中可进行诱导功能性组织再生的治疗，而且在脑梗塞、心肌梗塞、骨折、肺梗塞、胃溃疡、肠炎等需要再生的组织中也可进行诱导功能性组织再生的治疗。作为被投予上述组织再生促进剂的动物种，并无特别限定，可举出哺乳类、鸟类、鱼类等。作为哺乳类，可举出人或非人动物，例如可例示出人、小鼠、大鼠、猴子、猪、狗、兔子、仓鼠、豚鼠、马、羊、鲸等，但并非限定于这些。另外，作为与需要再生的组织不同的组织，可例示出血液组织、肌肉组织、皮下组织、皮内组织、腹腔等。因此，本发明的药剂中包含用于促进上述组织的再生的药剂。
本发明的药剂中优选包含神经组织、骨组织、皮肤组织等的再生促进剂，但并非限定于这些。作为神经组织的再生促进剂，可举出中枢神经组织的再生促进剂，但并非限定于此。另外，神经组织的再生促进剂例如可在脑梗塞、脑出血、脑挫伤等的治疗中使用，但并非限定于这些。另外，骨组织的再生促进剂例如可在骨折的治疗中使用，但并非限定于此。另夕卜，皮肤组织的再生促进剂例如可在皮肤溃疡、手术伤口的缝合不全、烧伤、割伤、挫伤、皮肤糜烂、擦伤等的治疗中使用，但并非限定于这些。本说明书中，“骨髄细胞”、“骨髓源性细胞”是造血系干细胞及来源于其的白细胞、红细胞、血小板以外的细胞，是以目前被称作骨髓间充质干细胞或骨髄间质多能干细胞或骨髓多能干细胞的细胞为代表的干细胞。另外，“骨髄细胞”包含含有存在于骨髄中的组织祖细胞团的细胞。“骨髄细胞”、“骨髓源性细胞”可以通过骨髄采集(骨髄细胞采集)或末梢血采血进行分离。造血系干细胞是非附着性细胞，但“骨髄细胞”、“骨髓源性细胞”的一部分通过由骨髄采集(骨髄细胞采集)、末梢血采血所获得的血液中的单核细胞分级细胞培养，可以作为附着性细胞获得。另外，“骨髄细胞”、“骨髓源性细胞”含有间充质干细胞，优选具有分化成成骨细胞(诱导分化可通过可见钙的沉积来鉴别)、软骨细胞(可通过阿辛蓝染色阳性、番红-O染色阳性等来鉴别)、脂肪细胞(可通过苏丹III染色阳性来鉴别)的能力、更优选具有分化成成纤维细胞、平滑肌细胞、基质细胞、肌腱细胞等间充质细胞的能力、进一 步优选具有分化成神经细胞、上皮细胞(例如表皮角质形成细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族)、血管内皮细胞的能力。分化后的细胞并非限定于上述细胞，还包含分化为肝脏、肾脏、胰脏等实质器官细胞的能力。本说明书中，“骨髄细胞”是指存在于骨髄内的细胞，而“骨髓源性细胞”是指被动员至骨髄外的“骨髄细胞”。在本发明中，“骨髓间充质干细胞”、“骨髓间质多能细胞”或“骨髓多能干细胞”是指存在于骨髓内的细胞，其能够从骨髓直接采集或者从其他组织(血液、皮肤、脂肪或其他组织)间接地采集并作为附着于培养皿(塑料或者玻璃制)的细胞进行培养和增殖，其为带有具有分化为骨、软骨、脂肪等间充质组织(间充质干细胞)、或者分化为骨骼肌、心肌、进而分化为神经组织、上皮组织(多能干细胞)的能力这样的特征的细胞；其是可以通过骨髓细胞采集来获得的细胞。另外，从骨髄动员的“骨髓间充质干细胞”、“骨髄间质多能细胞”或“骨髓多能干细胞”是能够通过末梢血采血、以及通过从脂肪等间充质组织、皮肤等上皮组织、脑等神经组织采集来获得的细胞。另外，骨髓间充质干细胞、骨髄间质多能干细胞、骨髓多能干细胞、或由骨髓动员的这些细胞还具有下述特征通过在采集后直接投予至生物体的损伤部、或将一度附着于培养皿的细胞投予至生物体的损伤部，从而还具有分化为例如构成皮肤的角质形成细胞等上皮组织、构成脑的神经系统的组织的能力。另外，作为骨髓间充质干细胞、骨髄间质多能干细胞、骨髓多能干细胞或从骨髓动员的这些细胞，可例示出具有CDllb阴性的性质的细胞，但并非限定于此。骨髓间充质干细胞、骨髓间质多能干细胞、骨髓多能干细胞或从骨髓动员的这些细胞除了具有分化为成骨细胞(诱导分化可通过可见钙的沉积等来鉴别)、软骨细胞(可通过阿辛蓝染色阳性、番红-O染色阳性等来鉴别)、脂肪细胞(可通过苏丹III染色阳性等来鉴别)的能力外，优选还具有分化为例如成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、基质细胞、肌腱细胞等间充质细胞、神经细胞、色素细胞、表皮细胞、毛囊细胞(表达细胞角蛋白家族、毛发角蛋白家族等)、上皮细胞(例如表皮角质形成细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族等)、内皮细胞，进一步优选具有分化为肝脏、肾脏、胰脏等实质器官细胞的能力，但分化后的细胞并不限定于上述细胞。另外，作为人骨髓间充质干细胞、骨髄间质多能干细胞、骨髓多能干细胞或从骨髄动员的这些细胞，可例示出可通过骨髄采集(骨髄细胞采集)、末梢血采血、脂肪采集获得、直接或者将单核细胞级分分离后进行培养以作为附着性细胞获得的细胞，但并非限定于此。作为人骨髓间充质干细胞、骨髄间质多能干细胞、骨髓多能干细胞或从骨髄动员的这些细胞的标记物，可例示出Lin阴性、⑶45阴性、⑶44阳性、⑶90阳性、⑶29阳性的全部或一部分，但并非限定于这些。另外，作为小鼠骨髓间充质干细胞、骨髄间质多能干细胞、骨髓多能干细胞或从骨髄动员的这些细胞，可例示出例如可通过实施例所记载的方法获得的细胞，但并非限定于这些。作为小鼠骨髓间充质干细胞、骨髄间质多能干细胞、骨髓多能干细胞或从骨髄动员的这些细胞的标记物，可例示出⑶44阳性、PDGFRa阳性、PDGFRβ阳性、⑶45阴性、Lin阴性、Sca-I阳性、c-kit阴性、⑶90阳性、⑶29阳性的全部或一部分，但并非限定于这些。 组织祖细胞被定义为具有单方向性地分化为除血液系统以外的特定组织细胞的能力的未分化细胞，包括具有分化为上述的间充质组织、上皮组织、神经组织、实质器官、血管内皮的能力的未分化细胞。本发明的组织再生促进剂中，作为上述(a广(q)所记载的物质中的至少I种物质以外的物质，只要不抑制骨髓源性细胞的诱导或组织再生促进则无特别限定。例如，本发明的组织再生促进剂中除了上述(a广(q)所记载的物质中的至少I种物质之外，还可含有强化上述(a) (q)所记载的物质的功能性组织再生诱导功能的相关分子(群)、抑制上述(a) (q)所记载的物质的所期待效果以外的作用的分子(群)、抑制骨髓源性细胞的增殖和分化的因子、强化/维持这些因子或细胞的功能的其他因子。作为成为本发明的组织再生促进剂中的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质、上述提取液或上述肝素结合级分的来源的动物种，可以举出人或非人动物，例如可例示出人、小鼠、大鼠、猴子、猪、狗、兔子、仓鼠、豚鼠等，优选是与投予上述物质的动物种相同的动物种。作为本发明中的HMGBl蛋白质，可例示出包含序列号1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的HMGBl蛋白质还包括与包含序列号1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可列举出例如I)由在序列号1、3或5中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质、和2 )为由与包含序列号2、4或6中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质、且与包含序列号1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。作为本发明中的HMGB2蛋白质，可例示出包含序列号7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的HMGB2蛋白质还包括与包含序列号7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可举出例如I)由在序列号7、9或11中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质；和2)为由与包含序列号8、10或12中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质、且与包含序列号7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。作为本发明中的HMGB3蛋白质，可例示出包含序列号13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的HMGB3蛋白质还包括与包含序列号13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可举出例如I)由在序列号13或15中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质；和2)为由与包含序列号14或16中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质、且与包含序列号13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。作为本发明中的S100A8蛋白质，可例示出包含序列号17、19或21中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的S100A8蛋白质还包括与包含序列号17、19或21中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可举出例 如I)由在序列号17、19或21中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号17、19或21中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质；和2)为由与包含序列号18、20或22中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质、且与包含序列号18、20或22中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。作为本发明中的S100A9蛋白质，可例示出包含序列号23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的S100A9蛋白质还包括与包含序列号23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可举出例如I)由在序列号23、25或27中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质；和2)为由与包含序列号24、26或28中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质、且与包含序列号23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质。与包含序列号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质可以是包含序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质的同源物或者旁系同源物。关于与包含序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质，本领域技术人员可以通过公知的方法(实验医学别册·基因工学手册(実験医学別冊·遺伝子工学^ > K 7' V ^ )，PP246-251、羊土社、1991年发行)来分离。作为与包含序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质，可举出具有将骨髓源性细胞动员至需要再生的组织的活性的蛋白质或者具有迁移骨髓源性细胞的活性的蛋白质。作为由在序列号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质，包括天然存在的蛋白质。一般来说，如在干扰素基因等中所已知的那样，真核生物的基因具有多态性(PO I ymorph i sm )。由于该多态性所产生的碱基序列的变化，有时I个或多个氨基酸被置换、缺失、插入和/或添加。属于这样自然存在的蛋白质且具有在序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列、并且与由序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等同的蛋白质也包括在本发明的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质中。另外，只要是与由序列号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的
氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等同的蛋白质，则人工制作的突变蛋白质也包括在本发明中。作为对给定的碱基序列施加随机突变的方法，已知例如利用DNA的亚硝酸处理的碱基对置换(Hirose, S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，79:7258-7260，1982)。该方法中，通过对欲导入突变的片段进行亚硝酸处理，能够在特定的片段中随机地导入碱基对置换。或者，作为在任意位点导入目标突变的技术，有gapped duplex法等(Kramer W. and FritzHJ. , Methods in Enzymol.，154:350-367，1987)。将克隆要导入突变的基因而得到的环状 双链载体分成单链，使其与在目标部位具有突变的合成寡核苷酸杂交。使被限制性内切酶切断而形成线状的载体来源的互补单链DNA与上述环状单链载体退火，用DNA聚合酶填充该载体与上述合成核苷酸之间的间隙，进而通过连接形成完整的双链环状载体。所改变的氨基酸的数目典型地为50个氨基酸以内、优选为30个氨基酸以内、进一步优选为5个氨基酸以内(例如I个氨基酸)。在人为地置换氨基酸的情况下，如果置换为性质相似的氨基酸，则容易维持原蛋白质的活性。本发明的蛋白质包括下述蛋白质其为在上述氨基酸置换中加以保存性置换而得到的蛋白质，且是与包含序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质。在置换对于蛋白质活性来说重要的区域的氨基酸等情况下，保存性置换是重要的。这样的氨基酸的保存性置换对于本领域技术人员来说是熟知的。作为相当于保存性置换的氨基酸的组，可举出例如碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等。另外，通过非保存性置换也会使蛋白质的活性等进一步提高(例如包括恒定的活化型蛋白质(constitutively activated proteins)等)。此外，作为获得与包含序列号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质的方法，可举出利用杂交的方法。即，将如序列号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 或 28 所示的编码本发明的 HMGBUHMGB2,HMGB3.S100A8或S100A9蛋白质的DNA、或者其片段作为探针，分离出能够与其杂交的DNA。若在严格的条件下实施杂交，可选择同源性高的DNA作为碱基序列，其结果是被分离出的蛋白质中含有与HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质在功能上等同的蛋白质的可能性增加。同源性高的碱基序列是指能够显示例如70%以上、优选90%以上的相同性。
另外，严格的条件具体地可以示出例如在6XSSC、40%甲酰胺、25°C下进行杂交、且在I X SSC、55°C下进行洗涤的条件。严格性会受盐浓度、甲酰胺的浓度或温度等条件的影响，但只要是本领域技术人员，就能够设定这些条件以获得所需的严格性。通过利用杂交，能够将编码例如除包含序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23,25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质以外的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的同源物的DNA分离。与包含序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质通常与序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列具有高的同源性。高的同源性是指至少30%以上、优选50%以上、进一步优选80%以上(例如95%以上)的序列的相同性。关于碱基序列或氨基酸序列的相同性，可以利用使用了网络的同源性检索网站来进行[例如在日本DNA数据库(DDBJ)中，可以利用FASTA、BLAST、PSI-BLAST和SSE ARCH等同源性检索[例如日本DNA数据库(DDBJ)网站上的同源性检索(Search and Analysis)的网页http://www. ddbj. nig. ac. jp/E-mail/homology_j.html]。另夕卜，在 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 中，可以进行使用了 BLAST的检索(例如NCBI主页的网站的BLAST网页http: //www.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ ；Altschul, S. F. et al. , J. Mol. Biol. , 1990, 215 (3) :403-10 ；Al tschul, S. F. &Gish, ff. , Meth. Enzymol. , 1996, 266 : 460-480 ；Altschul, S. F. etal. , Nucleic Acids Res.，1997，25:3389-3402)]。例如对于Advanced BLAST 2. I中的氨基酸序列的相同性的计算，通过程序使用blastp、将Expect值设定为10、将Filter全部设定为0FF、Matrix使用BL0SUM62、并将Gapexistence cost、Per residue gap cost 和 Lambda ratio 分别设定为 11、1、0· 85(缺省值)来进行检索，可以获得相同性(identity,同一性)的值(％) (Karlin, S. and S. F. Altschul(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-68 ；Karlin, S. and S. F. Altschul (1993)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_7)。与包含序列号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质还可以是序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25
或27中记载的氨基酸序列的片段。本发明的蛋白质或在功能上与其等同的蛋白质可以是施加了糖链等生理性修饰、荧光或放射性物质等标记或者与其他蛋白质的融合等各种修饰而得到的蛋白质。特别是在后文所述的基因重组体中，糖链的修饰有可能根据使其表达的宿主的不同而产生差异。但是，即使糖链的修饰存在差异，只要是显示与本说明书中公开的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质相同性状的蛋白质，则均属于本发明的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质、或在功能上等同的蛋白质。HMGBl、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质不仅可以从生物体材料获得，而且可以通过将对其进行编码的基因整合入适当的表达体系而作为基因重组体来获得。为了通过基因工程技术获得腿681、麗682、麗683、510(^8或510(^9蛋白质，将上文所述的编码HMGBU HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA整合入适当的表达体系并使之表达即可。作为本发明中可应用的宿主/载体体系，例如可示出表达载体pGEX和大肠杆菌。由于pGEX可以使外源基因作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白质来表达(Gene，67 31-40, 1988)，因此通过热激将整合了编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的基因的PGEX导入BL21等大肠杆菌株中，在适当的培养时间后，添加异丙基硫代_β -D-半乳糖苷(IPTG)以诱导GST融合HMGBl、GST融合HMGB2、GST融合HMGB3、GST融合S100A8或GST融合S100A9蛋白质的表达。本发明的GST由于吸附于谷胱甘肽琼脂糖4B，因此表达产物能够容易地通过亲和柱层析法分离 和纯化。作为用于获得HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的重组体的宿主/载体体系，还可以采用下述的体系。首先，当利用细菌作为宿主时，市售有利用了组氨酸标签、HA标签、FLAG标签等的融合蛋白质的表达用载体。另外，本发明的基因重组体还包括附加有标签或其一部分肽的状态的基因重组体。关于酵母，已公知Pichia属酵母对于具备糖链的蛋白质的表达是有效的。从糖链的添加的角度出发，利用了以昆虫细胞为宿主的杆状病毒载体的表达体系也是有用的(Bio/Technology, 6 =47-55, 1988)。此外，还可利用哺乳动物的细胞进行利用了 CMV、RSV或SV40等启动子的载体的转染，这些宿主/载体体系均能够用作HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的表达体系。另外，还可以利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等病毒载体来导入基因。所得到的本发明的蛋白质可以从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离，并纯化成实质上纯且均一的蛋白质。蛋白质的分离、纯化使用在通常的蛋白质纯化中使用的分离、纯化方法即可，没有任何限定。例如，可以适当选择和组合色谱柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳法、透析、重结晶等以对蛋白质进行分离、纯化。作为色谱法，可举出例如亲和层析法、离子交换色谱法、疏水性色谱法、凝胶过滤法、反相色谱法、吸附层析法等(Marshak et al. , Strategies for Protein Purificationand Characterization A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring HarborLaboratory Press, 1996)。这些色谱法可以使用液相色谱法例如HPLC、FPLC等液相色谱法来进行。另外，本发明的蛋白质优选是实质上经纯化的蛋白质。这里，“实质上经纯化”是指本发明的蛋白质的纯化度(本发明的蛋白质在蛋白质成分总体中的比例)为50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、100%或者接近100%。接近100%的上限依赖于本领域技术人员的纯化技术和分析技术，例如为99. 999%,99. 99%,99. 9%、99%等。另外，只要是具有上述纯化度的蛋白质，则可以是通过任何纯化方法进行了纯化的蛋白质，都包括在实质上经纯化的蛋白质内。例如，可例示出通过适当选择或组合上述色谱柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、透析、重结晶等方法而实质上经纯化得到的蛋白质，但并不限定于这些。作为释放或分泌本发明的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的细胞，基本上生物体内所有组织来源的细胞均可以。作为容易采集和培养的细胞，可例示出成纤维细胞(例如正常皮肤成纤维细胞和来源于其的细胞株)，但并不限定于此。另外，分泌HMGBI,HMGB2,HMGB3,S100A8或S100A9蛋白质的细胞也可以通过将下述载体导入成纤维细胞(例如正常皮肤成纤维细胞和来源于其的细胞株)等哺乳类细胞、昆虫细胞或其他细胞中来制作，所述载体是通过将编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA、或者通过使编码分泌信号的 DNA (ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTGTGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC ;序列号:29)结合到编码 HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA上而得到的DNA插入公知的表达载体或基因治疗用载体而制作的。作为编码分泌信号的DNA，可例示出具有上述序列的DNA，但并不限定于此。另外，这些细胞所来源的动物种没有特别限制，优选使用要投予载体的对象动物种的细胞、对象自身的细胞、或者与要投予载体的对象具有血缘关系的动物来源的细胞。编码本发明的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA只要编码HMGBI,HMGB2,HMGB3,S100A8或S100A9蛋白质，则可以是cDNA、也可以是基因组DNA，另外，还可以是天然的DNA或是人工合成的DNA。编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA通常以插入到载体中的状态被投予。作为本发明中的载体，可例示出质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、仙台病毒载体、仙台病毒包膜载体、乳头状瘤病毒载体等，但并不限定于这些。该载体中还可以包括有效地诱导基因表达的启动子DNA序列、控制基因表达的 因子、用于维持DNA稳定性所需的分子。另夕卜，本发明中还可以利用属于HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的部分肽且具有动员骨髓来源细胞的活性的肽、分泌该部分肽的细胞或插入有编码该部分肽的DNA的载体。本发明中的细胞或组织的提取液可通过包含将细胞或组织浸溃到溶剂中的工序的方法来制造。作为浸溃到溶剂中的细胞或组织，并无特殊限定，可例示出组织来源的细胞、由组织来源的细胞建立的细胞株(例如可例示出HeLa、HEK293，但并非限定于这些)、经分离的细胞、未经分离的细胞(例如分离出的组织中存在的细胞)、导入有编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA的细胞等。作为上述组织，可以是任意组织，例如可例示出活体皮肤组织、体内活检(手术)组织(脑、肺、心脏、肝脏、胃、小肠、大肠、胰脏、肾脏、膀胱、脾脏、子宫、睾丸或血液等)，但并不限定于这些。作为上述溶剂，可例示出生理盐水、PBS (磷酸盐缓冲液)、TBS (Tris (三羟甲基氨基甲烷)缓冲盐)，但并非限定于这些。另外，作为将细胞或组织浸溃到溶剂中的时间，为用于诱导细胞坏死所需的足够的时间，即I小时 48小时(例如6小时 48小时),优选为12小时 24小时，但并不限定于该时间。因此，“将细胞浸溃到溶剂中的工序”也可以换言之为“将细胞在溶剂中浸溃用于诱导坏死所需的足够的时间的工序”或“使细胞坏死的工序”。另外，作为将细胞或组织浸溃到溶剂中的温度，可例示出4°C 25°C (例如4°C 8°C)、优选例示出4°C，但并非限定于此。另外，作为将细胞或组织浸溃到溶剂中的pH，可例示出PH为7 8、优选例示出pH为7. 5，但并非限定于此。另外，作为缓冲液的成分，可举出10mT50mM、优选l(T20mM浓度的磷酸缓冲液，但并非限定于此。另外，本发明中，在将细胞或组织浸溃到溶剂中后，还可以从含有细胞或组织的溶剂中除去该细胞或该组织。从溶剂中除去细胞或组织的方法可以是本领域技术人员公知的方法，并无特殊限定。例如可以通过在4°C 25°C(例如4°C)、且重力加速度为IOG 100000G(例如440G)下进行离心并分取出上清，从而从溶剂中除去细胞或组织，但并非限定于此。可以将该上清用作细胞或组织的提取液。
作为本发明中的细胞或组织的提取液，例如可举出皮肤提取液或末梢血单核细胞提取液(末梢血提取液)，但并非限定于这些。末梢血提取液的制备方法为在使用注射器等采血后，用冰箱、液氮或干冰等将细胞冷冻，然后在0°c以上的温度下使其再融解。此外，为了除去细胞的不溶成分，例如可以通过在4°C 25°C (例如4°C)、且重力加速度为IOG 100000G (例如440G)下进行离心并分取出上清，从而从溶剂中除去细胞的不溶成分，但并非限定于此。可以将该上清液用作细胞或组织的提取液。为了除去细胞的不溶成分，可以代替离心操作，使其通过具有O. 45 μ m的微孔的硝化纤维素滤器等来将不溶成分除去。另外，可以通过将采集的末梢血在4°C的状态下放置3小时 48小时来诱发细胞坏死，以使从末梢血中的细胞释放细胞内成分。可以通过在这之后在重力加速度为10G100000G (例如440G)下进行离心并分取出上清，从而从溶剂中将细胞的不溶成分除去，但并非限定于此。可以将该上清用作细胞或组织的提取液。为了除去细胞的不溶成分，可以代替离心操作，使其通过具有0.45 μ m的微孔的硝化纤维素滤器等来将不溶成分除去。 另外，由末梢血单核细胞制备细胞提取液的方法为在使用注射器等采集末梢血全血后，利用PBS将总量稀释至4mL，在离心管中插入Ficoll-Paque Plus (GE)液3mL后，在其上叠置稀释血液。在400G (18°C)下离心40分钟，将含有单核细胞的中间层回收至新的离心管，添加45mL的PBS，在800 G (18°C)下离心5分钟，将上清除去。进而再次添加45mL的PBS，在800 G (18°C)下离心5分钟，将上清除去。在沉淀的细胞中添加200 μ L的PBS进行悬浮。细胞悬浮液在_80°C的冰箱内冷冻30分钟，从冰箱中拿出在冰上融解。重复该冷冻融解操作3次。进而，在800 G (4°C)下离心15分钟，将上清回收。可以代替对细胞进行冷冻，通过在4°C的冰箱中放置3小时 48小时来诱发细胞坏死、使细胞内成分分泌。另外，还可一边在冰上进行冷却一边进行超声波处理，从而将细胞破坏，使细胞内成分释放到细胞外。任一情况下都进行如下操作在将细胞内成分释放到细胞外后，在重力加速度为440G 1000000G、优选100000G 20000G下进行离心操作，将其上清回收而制成细胞提取液。另外，还可代替离心操作，通过使其通过具有0. 45 μ m微孔的硝化纤维素滤器或醋酸纤维素滤器等，从而将不溶成分除去，制成细胞提取液。本发明中的细胞或组织的提取液的肝素结合级分可以通过包含以下工序的方法来制造。(a)将细胞或组织浸溃到溶剂中的工序、(b)使工序(a)中得到的提取液与固定化肝素接触的工序、和(C)从固定化肝素中洗脱肝素结合级分(也可表述为肝素纯化级分、肝素柱纯化级分)的工序固定化肝素是使肝素共价键合到不溶性载体上而得到的。作为上述不溶性载体，可举出 Sepharose 珠粒(Sepharose 4B、Sepharose 6B 等GEHealthcare),但并非限定于此。本发明中还可以使用市售的固定化肝素(Hitrap肝素HP柱GE Healthcare)。作为细胞或组织的提取液与固定化肝素的接触条件，可例示出pH为7 8左右(优选pH为7. 5)、盐浓度为(T200mM、优选为10(T200mM左右，但并非限定于这些。提取液与固定化肝素接触的时间没有特殊限定，但从使肝素结合级分充分地吸附于固定化肝素的观点出发，优选保持5分钟以上。另外，作为温度，可举出4 8°C、优选举出4°C，但并非限定于这些。此外，作为吸附于固定化肝素的肝素结合级分的洗脱条件，可例示出pH为71左右、盐浓度为20(Tl000mM (优选为IOOOmM左右)，但并非限定于这些。本发明的组织再生促进剂的投予方法可举出非经口投予，作为这样的投予方法，具体地可举出注射投予等，但并非限定于该方法。另外，作为本发明的组织再生促进剂的投予方法，只要是组织再生促进剂不会滞留在投予部位、而是进入血液循环的投予方法，则无特别限定。作为本发明的组织再生促进剂的投予方法，例如可例示出血管内投予(动脉内投予、静脉内投予等)、血液内投予、肌肉内投予、皮下投予、皮内投予、腹腔内投予，但并非限定于这些。另外，还可根据患者的年龄、症状选择适当的投予方法。投予HMGBI、HMGB2、HMGB3、S100A8、或S100A9蛋白质时，例如在每次投予中，每Ikg体重可以在O. OOOOOOlmg IOOOmg的范围内选择投予量。或者,例如每位患者可以在O. OOOOflOOOOOmg/body的范围内选择投予量。在投予分泌HMGBl、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的细胞或插入有编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、或S100A9蛋白质的DNA的基因治疗用载体时，也可按照在需 要再生的组织中HMGBl、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的量达到上述范围内的方式进行投予。但是，本发明的组织再生促进剂并非限定于这些投予量。本发明的组织再生促进剂可根据常规方法制成制剂(例如Remington’sPharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U. S. A),还可同时含有医药学上可允许的载体或添加物。可举出例如表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等，但并非限定于这些，还可以适当使用其他常用的载体。具体而言，可举出轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯乙缩醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。本发明还提供一种试剂盒，其为含有包含以下(a广(q)中任一项所述的物质的组合物的组织再生促进试剂盒，该组合物被投予至与需要再生的组织不同的组织。(a) HMGBl 蛋白质(b)分泌HMGBl蛋白质的细胞(c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体(d)HMGB2 蛋白质(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体(g)HMGB3 蛋白质(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体(j)S100A8 蛋白质(k)分泌S100A8蛋白质的细胞(I)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(m)S100A9 蛋白质(η)分泌S100A9蛋白质的细胞
(ο)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体(P)细胞或组织的提取液(q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。该组织再生促进用试剂盒的特征在于，通过被投予至与需要再生的组织不同的组织，介由末梢循环将骨髄细胞从骨髄动员至需要再生的组织中。另外，本发明的试剂盒中包括用于对上述需要再生的组织进行治疗的试剂盒。优选本发明的试剂盒中包括被非经口投予的试剂盒、更优选包括被注射投予的试剂盒。另外，本发明的试剂盒中优选包括被投予至血管内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内的试剂盒。另外，优选本发明的试剂盒中包括用于神经组织、骨组织或皮肤组织的再生促进的试剂盒。
作为组织再生促进用试剂盒，可例示出含有(I)溶解于纤维蛋白原的上述物质和
(2)凝血酶的组织再生促进用试剂盒；或者含有(I)上述物质、(2)纤维蛋白原和(3)凝血酶的组织再生促进用试剂盒。本发明中，可以使用市售的纤维蛋白原和凝血酶。例如可举出纤维蛋白原 HT-Wf (Benesis-Mitsubishi Pharma)、Beriplast (ZLB Behring)、Tissel(Baxter)、Bolheal (化血研)、TachoComb (ZLB Behring),但并非限定于这些。另外，上述细胞或组织的提取液、细胞或组织的提取液的肝素结合级分、HMGBUHMGB2、HMGB3、S100A8 或 S100A9 蛋白质、分泌 HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8 或 S100A9 蛋白质的细胞、插入有编码HMGBI、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA的载体、HMGBI、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的部分肽、分泌该部分肽的细胞、插入有编码该部分肽的DNA的载体的用途还可以表现为以下(I) (3 )。(I) 一种促进组织再生的方法，其包含将有效量的含有以下(a) (q)中任一项所述的物质的组合物投予至与需要再生的组织不同的组织的工序；(a) HMGBl 蛋白质(b)分泌HMGBl蛋白质的细胞(c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体(d)HMGB2 蛋白质(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体(g)HMGB3 蛋白质(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞(i )插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体(j)S100A8 蛋白质(k)分泌S100A8蛋白质的细胞(I)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(m)S100A9 蛋白质(η)分泌S100A9蛋白质的细胞(ο)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体(P)细胞或组织的提取液(q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
(2)含有以下(a) (q)中任一项所述的物质的组合物在组织再生促进剂的制造中的用途，该组织再生促进剂被投予至与需要再生的组织不同的组织；(a) HMGBl 蛋白质(b)分泌HMGBl蛋白质的细胞(c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体(d)HMGB2 蛋白质(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞Cf)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体(g)HMGB3 蛋白质(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体(j)S100A8 蛋白质(k)分泌S100A8蛋白质的细胞(I)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(m)S100A9 蛋白质(η)分泌S100A9蛋白质的细胞(ο)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体(P)细胞或组织的提取液 (q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。(3)—种组合物，其为用于在促进组织再生的方法中使用的、含有以下(a广(q)中任一项所述的物质的组合物，其被投予至与需要再生的组织不同的组织；(a) HMGBl 蛋白质(b)分泌HMGBl蛋白质的细胞(c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体(d)HMGB2 蛋白质(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞(f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体(g)HMGB3 蛋白质(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞(i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体(j)S100A8 蛋白质(k)分泌S100A8蛋白质的细胞(I)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体(m)S100A9 蛋白质(η)分泌S100A9蛋白质的细胞(ο)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体(P)细胞或组织的提取液(q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。需要说明的是，本说明书中被引用的全部现有技术文献都作为参照编入本说明书中。实施例IHMGB-I的钝化和S100A8的钝化使用Trizol (invitrogen)从新生小鼠皮肤提取RNA,然后使用SuperScript IIIcDNA合成试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。以该cDNA为模板，使用PCR (聚合酶链反应)法对HMGBl的cDNA进行扩增，为了纯化，将其插入在哺乳类细胞中表达蛋白质的质粒载体PCAGGS中，以使得表达在氨基酸序列的N末端添加了 GST标签和6XHis标签的序列的蛋白质。使用聚乙烯亚胺(PEI)将pCAGGS-GST-His-HMGBl转染到人胎儿肾细胞来源的HEK293培养细胞株，48小时后回收细胞和培养上清。将细胞和培养上清在4°C下以4400g离心5分钟，分离上清和细胞并分别回收。使回收的上清进一步通过具有直径为O. 8 μ m 孔的醋酸纤维素滤器，然后使其通过具有O. 45 μ m的孔的硝化纤维素滤器，由此制备除去了不溶级分的样品。将该样品加入用含50mM NaCl的50mM Tris HCl (pH8. O) (50mL)平衡后的5mL HisTrap FF (GE)中，将吸附成分进一步用含有IOmM咪唑的50mMNaCl 50mMTris HCl (pH8. O)洗涤，以除去非特异性吸附成分。将特异性吸附成分用含有IOOmM咪唑的50mM NaCl 50mM Tris HCl (pH8. O)从柱中洗脱。将吸附级分分别每管500 μ L地分级到经硅涂覆的塑料管中，合并含有蛋白质的馏分后，使用脱盐柱HHO (GE)除去咪唑，使用50mM TrisHCl (pH. 7. 5)、150mM NaCl 进行洗脱。向洗脱的样品中添加 HRV3C (Novagen)，在4°C下使其反应8小时。切断后使样品结合于用50mM Tris HCl (pH. 7. 5)、150mM NaCl平衡后的 HiTrap 肝素 ImL 柱(GE)上，用 50mMTris HCl (pH. 7. 5)、150mM NaCl 对柱内部进行洗涤，然后用50mM Tris HCl (pH. 7. 5) UOOOmM NaCl对结合蛋白质进行洗脱。使用50mM TrisHCl (pH. 8. 8) 20mM NaCl将洗脱的样品稀释50倍，使其吸附于用同一缓冲液平衡后的ImLHiTrap Q FF(GE)0 使用 50mM Tris HCl (pH. 8. 8) 500mM NaCl，使 NaCl 的浓度缓慢上升，由此洗脱出吸附蛋白质。将结合在镍柱、肝素柱、Q柱上的蛋白质进行SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色，确认了蛋白质的存在。其结果如图I所示,纯化得到高纯度的HMGB-1。以下的实施例中使用利用本纯化方法获得的HMGB-1。使用Trizol (invitrogen)从新生小鼠皮肤提取RNA,然后使用SuperScript IIIcDNA合成试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。以该cDNA为模板，使用PCR (聚合酶链反应)法对S100A8的cDNA进行扩增，将其插入在哺乳类细胞中表达蛋白质的质粒载体pCAGGS中(图39),以使得表达在氣基酸序列的N末端添加了 GST标签的序列(序列号31 (氣基酸序列)、序列号32 (DNA序列))的蛋白质。使用脂转染试剂(Invitrogen)将pCAGGS-GST_S100A8转染到人胎儿肾细胞来源的HEK293培养细胞株，48小时后回收细胞和培养上清。将细胞和培养上清在4°C下以4400g离心5分钟，分离上清(上清A)和细胞并分别回收。细胞通过添加含0. l%Tween20的PBS并在冰冷下超声波30秒钟而将细胞膜破坏。进而在4°C下以4400g离心5分钟，将上清回收(上清B)。将上清A与上清B混合，添加至预先用30mL的PBS将缓冲液置换的HiTrap GSTFF柱(GE healthcare，5mL)中。添加后，用PBS IOOmL对柱进行洗涤，用含有还原型谷胱甘肽的20mM磷酸缓冲液(pH. 8)将吸附的蛋白质洗脱。为了除去谷胱甘肽，使用凝胶过滤柱PD-IO (GE公司制)将缓冲液置换成PBS。实施例2皮肤溃疡部位治愈过程中通过HMGB-I和S100A8的静脉内投予所带来的骨髓源性细胞向皮肤溃疡部的动员效果对C57BL/6雄性小鼠(6周龄)照射致死量放射线(IOGy)，之后立即从尾静脉移植GFP (绿色荧光蛋白)转基因小鼠(Okabe M. et al, FEBS Lett. 407，313-319，1997)来源的骨髄细胞(5X IO6个/0. Iml生理性磷酸缓冲溶液，pH为7. 4)。8周后，在背部制作直径为6mm的圆形皮肤溃瘍。为了防止小鼠的皮肤收缩,使用双面胶和医疗用粘接剂Aron alphaA (三共)将娃制的外径为10mm、内径为6mm、厚为Imm的圆盘粘接在溃瘍部上。为了防止溃疡部分的干燥和细菌感染，用直径为10_、厚为Imm的硅制圆盘将溃疡部覆盖。为了保护溃瘍部，用Tegaderm (3M)覆盖。从皮肤溃疡制作当天开始，以24小时的间隔从尾静脉投予HMGB-I (40 μ g)或 S100A8 (250ng)5次。在制作溃疡开始的2周后，使用异氟醚对小鼠吸入麻醉后，使用荧光实体显微镜观察在背部制作的皮肤溃疡制作部分的GFP荧光的聚集程度。进而，将皮肤溃疡制作部分的皮肤以圆形切除，用含4%多聚甲醛的PBS (磷酸缓冲液，nacalai)固定，包埋在OCT复合物中后，使用带冷却装置的切片机(Leica)制作8μπι的薄切片。将切片粘贴在载玻片上后，使用PBS对复合物进行洗涤，用DAPI将细胞核染色。进而，使用PBS将多余的DAPI洗涤，用含有防荧光消退剂的封固材料进行封固。使用荧光显微镜对各个样品检测GFP的荧光。将结果示于图2。与对照进行比较确认了 在HMGB-1/S100A8投予小鼠中，骨髓源性细胞(GFP阳性细胞)大量集中在皮肤溃疡闭合后的真皮、特别是上层处。骨髓多能干细胞可分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，但认为在皮肤组织中可分化成表皮细胞、毛囊系细胞、真皮成纤维细胞等。虽然已经明确了 HMGB-I和S100A8具有动员骨髓多能干细胞的活性、和在将HMGB-I和S100A8直接投予至皮肤溃疡部位的小鼠中可见皮肤溃疡缩小的效果，但通过本次结果首次表明了 通过将HMGB-I或S100A8投予至距离皮肤溃疡部远且不同位置的的静脉血内，会将骨髓源性细胞动员至皮肤溃疡部位。实施例3利用HMGB-I和S100A8的静脉内投予来促讲皮肤溃疡治愈的效果在C57BL/6雄性小鼠(8周龄)的背部上制作直径为6_的圆形皮肤溃疡。为了防止小鼠的皮肤发生收缩，使用双面胶和医疗用粘接剂Aron alpha A (三共)将硅制的外径为10mm、内径为6mm、厚为Imm的圆盘粘接在溃疡部上。为了防止溃疡部分的干燥和细菌感染，用直径为10mm、厚为Imm的硅制圆盘将溃疡部覆盖。为了保护溃疡部，用Tegaderm (3M)覆
至JHL ο从皮肤溃疡制作当天开始，以24小时的间隔从尾静脉投予HMGB-I (40 μ g)或S100A8 (250ng)共计5次。测量溃疡作成后第3天、第5天、第10天的溃疡部分的面积。将结果示于图3。对于HMGB-1，与阴性对照(PPS投予)相比，从溃疡作成后第3天开始可见溃疡面积的缩小。另外，对于S100A8，与阴性对照(PPS投予)相比，从溃疡作成后第7天开始可见溃疡面积的缩小。目前，通过将HMGB-I和S100A8直接投予至皮肤溃疡部，获得了皮肤溃疡的治愈促进效果，但通过本研究首次成功地通过投予至距离溃疡部位远且不同位置的血管内而促进了皮肤溃疡的治愈。通过本发明，由于可以在不直接投予至溃疡部分的情况下进行皮肤溃疡的治愈，因而可以开发出在大面积皮肤溃疡、伴有皮肤缺损或感染灶或坏死灶的溃疡等难以直接投予溃疡部分的状态中也可使用的药品。实施例4利用HMGB-I静脉内投予来促进皮肤溃疡的非疤痕性治愈的效果在C57BL/6雄性小鼠(8周龄)的背部上制作直径为6_的圆形皮肤溃疡。为了防止小鼠的皮肤发生收缩，使用双面胶和医疗用粘接剂Aronalpha A (三共)将硅制的外径为10mm、内径为6mm、厚为Imm的圆盘粘接在溃疡部上。为了防止溃疡部分的干燥和细菌感染，用直径为10mm、厚为Imm的硅制圆盘将溃疡部覆盖。为了保护溃疡部，用Tegaderm (3M)覆
至JHL ο 从皮肤溃疡制作当天开始，以24小时的间隔从尾静脉投予HMGB-I (40 Ug)共计5次。采集溃疡制作4周后的溃疡部分，用10%甲醛缓冲液固定。将样品进行石蜡包埋后，使用切片机制作薄切片。去石蜡后，进行HE (苏木精伊红)染色和MT (Masson三色)染色。将结果示于图4。投予了 HMGB-I的小鼠皮肤与对照小鼠(PBS投予)相比，在真皮上层明显可见Masson三色染色阳性部分。在皮肤溃疡的治愈过程中，已知当皮肤组织的再构成未充分进行时，通过疤痕治愈来进行溃疡的闭合。疤痕治愈是利用由成纤维细胞等分泌的胶原纤维等非细胞成分所进行的溃疡部分的闭合，由于与正常组织不同、没有功能性组织构建，因而在治愈后仍伴有组织的硬化、结疤等，从功能方面、美容方面出发，抑制疤痕是重要的课题。由本次的结果可知通过静脉内投予HMGB-1，可以将骨髓源性细胞动员至溃疡部分，促进皮肤溃疡的早期闭合和非疤痕性治愈。实施例5静脉内投予了 HMGB-I的脑梗塞模型动物脑中的骨髓源性细胞的确认在GFP骨髄移植小鼠中制作脑梗塞(大脑中动脉线栓模型)。具体地说，使用异氟醚对通过上述实施例的方法制作的GFP骨髄移植小鼠进行吸入麻醉后，将头部皮肤切开，将激光多普勒血流仪探头直接粘接在头盖骨上确认脑血流。进而，将胸骨至下颚的正中皮肤切开，将右颈总动脉剥离，使用4号丝线慢慢结扎。在右颈外动脉的远处部用6号丝线结扎。一边对颈总动脉的线施加张力，一边在右颈外动脉近位部处开孔，插入前端加热成形了700μπι的6号单丝尼龙线(栓塞线)。向内颈动脉推进栓塞线，在插入至距离栓塞线前端约8mm的部位处将颈总动脉线松开。利用激光多普勒血流仪确认了在阻断血流前后、血流仪的数值变为1/10。阻断血流30分钟后将栓塞线拔去，使血流恢复。12小时后，将纯化HMGB-I(100 μ g)用500 μ L的PBS稀释，从所制作的疾病模型小鼠的尾静脉投予。之后每隔24小时同样地投予HMGB-1，进行4次。对照小鼠投予PBS。从治疗最终日开始的2周后，在异氟醚的吸入麻醉下，使用2%多聚甲醛进行灌流固定。将脑从头盖骨中取出，在10%蔗糖液中浸透12小时、20%蔗糖液中浸透24小时，从脑组织进行脱水。脱水后投入至OTC复合物内，在干冰上使其冻结，制作团块。团块使用冷冻切片用的切片机制作厚度为8 μ m的切片，并在硅烷涂覆的载玻片上伸展。伸展后使其充分地干燥，使用PBS洗涤复合物。使含2%脱脂乳的PBS浸透至样品中后，用含2%脱脂乳的PBS将抗小鼠巢蛋白抗体和β III微管蛋白抗体稀释至500倍，在4°C浸透样品8小时。使用PBS每5分钟地充分洗涤5次后，在室温下使用含2%脱脂乳的PBS稀释至500倍的PE标记抗大鼠IgG抗体浸透至样品。同样，使用PBS充分地洗涤后，在室温下使DAPI溶液浸透10分钟，用PBS充分地洗涤。用含防荧光消退剂的封固剂进行封固后，使用共聚焦激光显微镜观察GFP、DAPI,PE的荧光。将结果示于图5。在HMGB-I投予小鼠的脑中，可见大量骨髓源性细胞(GFP阳性细胞)，部分可见骨髓源性细胞且巢蛋白阳性细胞(右图黄色的细胞)或骨髓源性细胞且β III微管蛋白阳性细胞(左图黄色的细胞)。在PBS投予组中，虽然可见骨髓源性细胞，但未见同时表达巢蛋白或β III-微管蛋白的细胞(照片未示)。已知骨髓源性细胞在体外(培养体系)分化成神经细胞。另外，已知在体内(生物体 内)骨髓源性细胞在脑内很少表达神经标记物，还不清楚是否保有作为脑神经的功能。而虽然通过对脑梗塞的病症投予骨髓间充质干细胞等非炎症系骨髄细胞确认了具有治疗效果，但治愈机制还不清楚。由本结果可知在脑梗塞制作后静脉投予了 HMGB-I的小鼠中，在脑内可见表达神经细胞标记物的骨髓源性细胞。可以预想到这些GFP阳性细胞是来自于骨髓间充质干细胞等非炎症系细胞。实施例6通过HMGB-I投予所带来的脑梗寒灶的缩小效果使用异氟醚对8周龄C57/B16雌性小鼠进行吸入麻醉后，将头部皮肤切开，将激光多普勒血流仪探头直接粘接在头盖骨上确认脑血流。进而，将胸骨至下颚的正中皮肤切开，将右颈总动脉剥离，使用4号丝线慢慢结扎。在右颈外动脉的远处部用6号丝线结扎。一边对颈总动脉的线施加张力，一边在右颈外动脉近位部处开孔，插入前端加热成形了 700 μ m的6号单丝尼龙线(栓塞线)。向内颈动脉推进栓塞线，在插入至距离栓塞线前端约8mm的部位处将颈总动脉线松开。利用激光多普勒血流仪确认了在阻断血流前后、血流仪的数值变为1/10。阻断血流30分钟后将栓塞线拔去，使血流恢复。12小时后，将纯化HMGB-1( 10 μ g)用500 μ L的PBS稀释，从所制作的疾病模型小鼠的尾静脉投予。之后每隔24小时同样地投予HMGB-I，进行4次。对照小鼠投予PBS。从治疗最终日开始的5天后，在异氟醚的吸入麻醉下，使用2%多聚甲醛进行灌流固定。将脑从头盖骨中取出，脱水后投入至OTC复合物内，在干冰上使其冻结，制作团块。团块使用冷冻切片用的切片机制作厚度为8 μ m的切片，并在硅烷涂覆的载玻片上伸展。伸展后使其充分地干燥，使用PBS洗涤复合物。使用含4%多聚甲醛的PBS固定10分钟后，利用磷酸缓冲液洗涤5分钟、用蒸馏水浸透10分钟。进而使用O. 5%甲酚紫溶液染色13分钟。用蒸馏水洗涤I分钟后，分别浸透至50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇中10秒钟后，浸透至二甲苯中2分钟，重复2次。进而使用Entellan液进行封固。将结果示于图6。与PBS投予小鼠相比，HMGB-I投予小鼠中在脑梗塞灶处确认到了显著的改善效果。
本实验中，通过在脑梗塞制作后将HMGB-I投予至血管内，可见脑梗塞灶的缩小效果。目前已知通过在脑梗塞后静脉投予本人的骨髄细胞而具有脑梗塞的改善效果，但由于HMGB-I具有动员骨髄来源的多能干细胞的活性，因而可期待具有与静脉投予骨髄细胞时同样的效果。另外，由于将HMGB-I直接投予至脑梗塞部位会有可能诱发脑组织的损伤或引发炎症等，因而本实验这种血管内投予、皮下投予等不同位置性投予是能够治疗脑梗塞的优异的投予方法。实施例7通过HMGB-I投予所带来的脑梗寒后的存活率改善使用异氟醚对8周龄C57/B16雄性小鼠进行吸入麻醉后，将头部皮肤切开，将激光多普勒血流仪探头直接粘接在头盖骨上确认脑血流。 进而，将胸骨至下颚的正中皮肤切开，将右颈总动脉剥离，使用4号丝线慢慢结扎。在右颈外动脉的远处部用6号丝线结扎。一边对颈总动脉的线施加张力，一边在右颈外动脉近位部处开孔，插入前端加热成形了 700 μ m的6号单丝尼龙线(栓塞线)。向内颈动脉推进栓塞线，在插入至距离栓塞线前端约8mm的部位处将颈总动脉线松开。利用激光多普勒血流仪确认了在阻断血流前后、血流仪的数值变为1/10。对各个小鼠分别进行一定时间(45分钟或60分钟)的血流阻断后，将栓塞线拔去，使血流恢复。12小时后，将纯化HMGB-1 (IOyg)用500μ L的PBS稀释，从所制作的疾病模型小鼠的尾静脉投予。之后每隔24小时同样地投予HMGB-1，进行4次。对照小鼠投予PBS0观察梗塞制作后7天内的存活率。将结果示于图7。梗塞时间为30分钟的小鼠全部存活到7天后(分别Ν=3)(未图示)。梗塞时间为45分钟的小鼠中，PBS投予例中7天后的存活率为40%、而HMGB-I投予例中全部小鼠存活。梗塞时间为60分钟的小鼠中，PBS投予例中7天后的存活率为50%、而HMGB-I投予例中全部小鼠存活。在45分钟和60分钟的梗塞时间的任一模型中，对照组(PBS投予组)中存活到7天后的都是约为半数。通过在脑梗塞制作12小时后开始投予HMGB-1，可见至梗塞制作7天后的存活率改善。脑梗塞是根据梗塞的部位、范围、时间而左右生命预后的疾病。另外，由于脑梗塞经常会伴有麻痹、意识消失等，因而有时很迟才会去医疗机构。目前可确认效果的t-PA制剂等药品由于需要在发病后3小时I小时以内进行投予，因而在所有脑梗塞症例中可适用该制剂的比例极少。脑梗塞发病后经过长时间时也可进行投予且有效的治疗药目前还很少。本发明利用静脉内投予这种极为简便且低侵袭的方法、即便在脑梗塞发病后经过长时间(12小时后)开始投予也可改善生命预后，因此能够开发出对于多数脑梗塞的例子可进行投予的新型脑梗塞治疗药。实施例8骨折治愈过程中骨折部以外部位的骨髓多能干细胞的参与对C57BL/6雄性小鼠(6周龄)照射致死量放射线(IOGy)，之后立即从尾静脉移植GFP (绿色荧光蛋白)转基因小鼠来源的骨髄细胞(5X IO6个/0. Iml生理性磷酸缓冲溶液(pH7. 4) ) (GFP骨髄嵌合体小鼠)。8周后，制作用皮肤将GFP骨髄嵌合体小鼠(图8左边小鼠)和野生型小鼠(图8右边小鼠)结合的联体共生。进而，在野生型小鼠(图8右边小鼠)的右下肢制作骨折，制作骨折治愈后的组织切片。对切片用含4%脱脂乳的PBS封闭后，使利用含4%脱脂乳的PBS稀释过的抗小鼠骨钙素抗体发生反应，用PBS进行洗涤后，在室温下使利用含4%脱脂乳的PBS稀释过的PE标记抗大鼠IgG抗体反应I小时。用PBS洗涤后，使用DAPI对细胞核进行染色，进而用PBS洗涤。封固后利用共聚焦激光显微镜观察荧光。将其结果示于图8。骨钙素(OC)为红色荧光部分，作为骨髓源性细胞的GFP阳性细胞为绿色荧光部分。重叠图像(Merge)的黄色的细胞是骨钙素阳性的骨髓源性细胞。SP，由图8显示了 左侧的GFP骨髄嵌合体小鼠的骨髄细胞移动至野生型小鼠的右足的骨折部位并分化成成骨细胞。
—直以来，认为在骨折的治愈过程中损伤部位附近的成骨细胞集中到损伤部位促进治愈。但是，由本结果可知损伤部位远处的骨髓源性细胞移动至骨折部分进行损伤组织的修复。由于左边小鼠与右边小鼠通过皮下和皮内的血管相连，因此只要能够将大量的骨髓间充质干细胞等骨髓多能干细胞从全身骨髄动员至血中，则可预料到能够促进骨折部分的治愈。实施例9目的骨折模型小鼠中通过HMGBl静脉投予所带来的骨髓间充质干细胞向损伤部位的动员活性的评价。方法针对上述目的，利用以下的方法进行研究。I)在实验中，使用在I3DGF受体α的启动子下游基因组敲入有GFP蛋白的小鼠(PDGFRa-GFP 小鼠)(参考文献HamiIton et al. ,Mol Cell Biol. 2003Jun ；23
(11):4013-25)。该小鼠由于在I3DGF受体α表达的细胞中表达GFP蛋白，因而使用荧光显微镜进行观察时可以检测到绿色的荧光。2)采集TOGFRa-GFP小鼠的骨髄细胞，接种于细胞培养用皿中，用含10%FBS的a-MEM进行培养。每3-4天更换培养基，约14天后将附着的细胞回收。使用抗CDllb MACS珠将回收的细胞分为CDllb阳性细胞和CDllb阴性细胞。利用荧光显微镜进行观察时确认7 =CDllb阳性细胞为GFP阴性(图42的Al、A2)、CDllb阴性细胞为GFP阳性(图42的BI、B2)。为了研究HMGBl是否使这些细胞迁移，进行Boyden小室法。在Boyden小室的上层分别放入⑶Ilb阳性细胞或⑶Ilb阴性细胞，在下层放入按照浓度达到0、50、100μ g/mL的方式将HMGBl稀释至含10%FBS的DMEM中的液体。小室在37°C、5%C02的孵育箱内静置。4小时后将小室的膜回收，通过对向下层迁移的细胞进行染色来进行检测(图43)。3)使用异氟醚对12周龄雄性I3DGFR a -GFP小鼠实施全身麻醉，制作左下腿胫骨的骨折模型。将10μ g的HMGBl稀释于500 μ L的PBS中，在骨折刚制作后、24小时后、48小时后的共计3次从尾静脉实施投予。阴性对照从尾静脉投予500 μ L的PBS (Ν=6)。4)在骨折制作72小时后取出左下腿胫骨，使用含4%多聚甲醛的PBS静置24小时将组织固定。用PBS洗涤后，使用荧光实体显微镜检测GFP的荧光(图44)。结果⑶Ilb阳性的细胞教示了为GFP阴性且不表达TOGF受体α (图42的A1、A2)。⑶Ilb阴性的细胞教示了为GFP阳性且表达I3DGF受体a (图42的BI、B2)。⑶Ilb阳性(H)GF受体a阴性)细胞通过HMGBl不会迁移，而⑶Ilb阴性(PDGF受体a阳性)细胞通过HMGBl发生了迁移(图43)。与作为阴性对照小鼠的PBS投予(图44的Dl)组进行比较时，HMGBl投予(图44的D2)组的6只中有4只在骨折部位周围的骨内观察到了 GFP阳性(PDGF受体α阳性)细胞。讨论本实验中，为了以活着的状态观察骨髓间充质干细胞，使用了作为骨髓间充质干细胞的标记物之一的I3DGF受体α阳性细胞表达GFP的小鼠(H)GFR a -GFP小鼠)。已知骨髄细胞中含有造血系细胞(红细胞、白细胞、巨噬细胞等)、间充质细胞，这些细胞中黏附在细胞培养皿上的细胞为巨噬细胞(⑶Ilb阳性)和骨髓间充质干细胞(⑶Ilb阴性)。另外，由于TOGF受体α是骨髓间充质干细胞的标记物之一，因而认为通过本实验获得的⑶Ilb阴性且GFP阳性(PDGF受体α阳性)是骨髓间充质干细胞。由Boyden小室法的结果可知，HMGBl不会使巨噬细胞(⑶Ilb阳性细胞)迁移、而使骨髓间充质干细胞(PDGF受体α阳性、CDllb阴性)迁移。另外，在使用了 TOGFRa -GFP小鼠的骨折模型小鼠中可见与阴性对照组相比，HMGBl投予组中GFP阳性细胞(PDGF受体α阳性细胞)聚集在骨折部分的周围。这些GFP阳性细胞认为是被HMGBl动员的骨髓间充质干细胞。已知骨髓间充质干细胞是分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等的多能干细胞。而通常来说，骨折的治愈机制是通过成骨细胞从骨折部位或附近迁移来进行治愈，但如实施例8的联体共生的实验结果所示，认为骨折部位以外的骨的骨髓间充质干细胞也有助于骨折部分的再生。由本实验的结果可知，通过HMGBl的静脉内投予，动员至血中内的骨髓间充质干细胞集中到骨折部分，由此认为HMGBl可作为骨折的治疗药使用。由于作为⑶Ilb阳性细胞(PDGF受体α阴性)的巨噬细胞是炎症系的细胞，因而不会迁移巨噬细胞与防止过度的炎症有关。过度的炎症会导致组织损伤的扩大或延长治愈期间，因而在组织再生中成为不利因素。该结果表明=HMGBl具有特异性地迁移对组织再生有效的间充质干细胞的活性。现有的骨折治疗主要是非侵袭性复位或手术、石膏固定等，用于积极促进骨折部位治愈的药剂基本不存在。本方法由于通过药剂的静脉投予来进行，因而还可应用于难治性骨折、手术困难的骨折等，可提供目前没有的划时代的治疗方法。(参考例I)目的评价生物体移植皮肤组织的功能性再生时骨髓源性细胞的贡献方法针对上述目的，利用以下方法进行研究。I)利用针对GFP骨髄移植小鼠的生物体皮肤移植体系，研究移植皮肤片的功能性再生时骨髓源性细胞的贡献程度。具体地说，对C57/BL6雄性小鼠(61周龄)照射致死量放射线(lOGy)，之后立即从尾静脉移植GFP (绿色荧光蛋白)转基因小鼠来源的骨髓细胞(5X IO6个/0. Iml生理性磷酸缓冲溶液(ρΗ7· 4))。2)等待移植骨髄细胞的移入(6周)，从而在获得的GFP骨髄移植小鼠的背部皮肤上移植了新生小鼠皮肤(雌性)。3)等待移植皮肤片的移入和充分的皮肤组织再生(4周)，利用荧光实体显微镜观察移植皮肤片区域上的GFP荧光的聚集程度。
4)在吸入麻醉下通过生检采集移植皮肤片，使用带冷却装置的切片机制作皮肤冷冻切片(6 μ m)，进行4%多聚甲醛固定(30分钟)，用DAPI将组织内的细胞核染色，使用表皮细胞特异性角蛋白5的抗体实施免疫染色后，将组织封固，利用共聚焦激光显微镜研究GFP阳性骨髓源性细胞的存在。另外，一部分的标本利用HE染色研究其组织构建。结果在向GFP骨髄移植小鼠的生物体皮肤移植体系中，在再生后的皮肤区域观察到了同样强的GFP荧光的聚集(图9)。另外，在使用了移植皮肤片的HE标本的组织学观察中，确认了含有大量毛囊的皮肤组织的功能性再生(图9)。在利用共聚焦激光显微镜的观察中，表达角蛋白5的表皮角 质形成细胞、真皮成纤维细胞、以及平滑肌细胞或脂肪细胞的多数显示GFP荧光，显示了这些细胞是骨髄来源的(图10)。即，首次弄清楚了在移植皮肤的功能性再生时所需的上皮系和间充质细胞的多数是由骨髄来源的干细胞提供的。讨论这些研究结果首次明确地表明了在目前临床现场中日常进行的皮肤移植的皮肤再生时，骨髓源性细胞作出很大贡献，这是极有意义的发现。有报告指出，在骨髄内存在造血系干细胞和间充质干细胞这2种干细胞系统。本次研究中显示了大量动员至移植皮肤内的骨髄来源的上皮系细胞和间充质细胞是由骨髄来源的造血系干细胞提供的，这是很难预想到的，强烈地教示了骨髄来源的间充质干细胞对移植组织的功能性再生作出贡献的可能性。即，可以预想到在刚植皮后，由处于灌注不足、坏死方向的移植皮肤组织释放骨髄来源的间充质干细胞动员因子，将间充质干细胞从骨髄介由末梢血液循环动员至移植皮肤片内，从而诱导功能性皮肤组织再生。(参考例2)目的皮肤组织提取液内存在的骨髓间充质干细胞诱导因子的鉴定方法为了鉴定被预想到是从处于灌注不足状态的切除皮肤释放的骨髓间充质干细胞动员因子，通过以下的方法进行研究。I)为了获得小鼠骨髓来源的间充质干细胞，从C57BL/6小鼠的大腿骨或下腿骨采集骨髓细胞，将含有10%胎牛血清的D-MEM (Nacalai公司制)作为细胞培养培养基而加入细胞培养皿中，在37°C、二氧化碳气体浓度为5%的条件下进行培养。当细胞增殖到其所占的面积相对于培养皿底面积为70 100%时，用O. 25%胰蛋白酶ImM EDTA (Nacalai公司制)将细胞从培养皿上剥离，再在相同的条件下进行传代培养。传代操作至少重复5次以上。然后，将这些附着细胞分离培养，用流式细胞仪对细胞表面抗原进行分析，确认为Lin阴性、⑶45阴性、⑶44阳性、Sca-I阳性、c_kit阴性。确认了这些细胞能够分化为骨细胞、脂肪细胞且具有骨髓间充质干细胞的性质。2)将从400只新生小鼠获得的游离皮肤片浸溃到生理性磷酸缓冲液(PH7. 4)(PBS) 400ml内，在4°C下进行24小时的孵育后，为了除去组织，在4°C的条件下以440G离心10分钟，回收上清，从而制作了皮肤提取液。3)为了确认所获得的皮肤提取液中存在骨髓间充质干细胞诱导活性，本发明人等使用Boyden小室对已形成细胞株的C57BL6小鼠骨髓来源的间充质干细胞的迁移活性进行了研究。具体而言，在Boyden小室的下槽(容量为25 μ I)中插入皮肤提取液(25μ I),放置具有8 μ m微孔的聚碳酸酯膜，然后与该碳酸酯膜相接地放置Boyden小室上槽(容量为50 μ 1)，向其中加入骨髓来源的间充质干细胞悬浮液(5Χ IO4个/50ml培养液DMEM/10%胎牛血清)，在0)2孵育箱内、在37°C下培养Γ24小时。培养后，将小室的上槽拿开，取出硅薄膜，利用染色定量地研究通过所述微孔迁移到小室下槽的骨髓来源的间充质干细胞的数量。4)进行肝素亲和柱层析法和阴离子交换柱(Q柱)色谱法以对皮肤提取液内的具有骨髓来源的间充质干细胞动员活性的因子进行纯化。用4°C的9倍容积的20mM磷酸缓冲液(pH7. 5)将皮肤提取液稀释到10倍(稀释液A)。预先使20mM磷酸缓冲液(pH7. 5) (30ml)流到HiTrap肝素HP柱(柱容量5ml，GE Healthcare)中使柱平衡。然后，使稀释液A与柱结合。然后，用20mM磷酸缓冲液(pH7. 5)、100mM NaCl (30ml)对柱进行洗涤。为了将吸附的蛋白洗脱，向柱内流入20mM磷酸缓冲液(pH7. 5) UOOOmM NaCl，将洗脱液分级至管内。对吸附级分分别收集通过2)所说明的利用Boyden小室的迁移活性评价法具有迁移能力的级分。将其用9倍容量的50mM Tris HCl (pH8. O)进行稀释(稀释液B)。预先使50mM TrisHCl (pH8. O) (30ml)流到 HiTrap mono Q 柱(柱容量1ml,GE Healthcare)中使柱平衡。然后，使稀释液B与柱结合。为了将吸附的蛋白质洗脱，向柱内流入Tris HCl (pH8. O) UOOOmMNaCl，将洗脱液分级至管内。以上的纯化过程都可在4 16°C下进行，优选在4 8°C下进行，更优选在4°C下进行。通过2)所说明的利用Boyden小室的迁移活性评价方法对该洗脱液进行评价。5)将通过利用Boyden小室的迁移活性评价和利用柱/色谱法的组合获得的具有骨髄来源间充质干细胞动员活性的由皮肤提取液纯化的标准品利用SDS-PAGE电泳法根据 分子量进行凝胶内分级，通过银染色检测电泳蛋白的条带。6)在通过5)的SDS-PAGE电泳和银染色而作为单一条带进行了凝胶内分级的皮肤提取液来源的蛋白组中，将由骨髄来源的间充质干细胞动员活性最强的色谱法纯化标准品获得的蛋白条带全部切出，利用质谱分析和数据库解析进行该蛋白的鉴定。7)由所鉴定的蛋白组中选择具有骨髄来源的间充质干细胞动员活性的候选蛋白，用中和抗体对含有该候选蛋白的纯化标准品进行处理(在该蛋白的多克隆抗体稀释100倍的条件下在冰上对纯化标准品溶液100 μ I孵育30分钟)后,通过使用Boyden小室的迁移能分析来研究骨髄来源间充质干细胞动员活性的抑制程度。8)将所得的骨髄来源间充质干细胞纯化标准品混合到基质胶(matrigel)中，使得达到约10%体积，插入至直径为约长的硅管内，将其移植到GFP骨髄移植小鼠背部皮下。2周后取出插入管，利用荧光测定装置定量地分析由迁移至管内的骨髓源性细胞发出的GFP荧光。进而，从管内将迁移细胞取出，接种在DMEM/10%胎牛血清培养基中，在CO2孵育箱中进行培养，从而研究骨髄来源间充质干细胞的生物体内动员活性。继续培养2周后的细胞用2%多聚甲醛在25°C的条件下固定10分钟后，每5分钟使用PBS洗涤多聚甲醛，进行4次，用2%脱脂乳液进行处理，在4°C的条件下使利用含O. 5%tween 20的2%脱脂乳稀释至1000倍的抗小鼠角蛋白5抗体反应16小时。每5分钟使用PBS洗涤抗体，进行4次，在250C的条件下使利用2%脱脂乳稀释至1000倍的Alexa546标记抗兔子IgG抗体反应I小时。结果将从切除的新生小鼠皮肤提取至PBS中的溶液作为起始材料，利用上述方法进行具有骨髄来源间充质干细胞动员活性的蛋白质的鉴定和功能解析。通过利用Boyden小室的迁移活性解析显示，皮肤提取液中具有极强的骨髄来源间充质干细胞诱导活性(图11)。以该活性为指标，使用肝素亲和柱和阴离子交换柱(Q柱)进行目标因子的纯化，使用SDS-PAGE电泳对所得各级分进行解析，结果显示在含有通过银染色作为单一条带进行了凝胶内分级的多个蛋白的纯化标准品内具有很强的骨髄来源间充质干细胞动员活性(图12泳道7)。将所得的银染色条带切出，进行质谱分析、数据库解析，结果可知用箭头表示的分子量约为25,000的蛋白是HMGBl(图12)。为了明确该纯化级分(泳道7)中所含的HMGBl具有目标的骨髄来源间充质干细胞动员活性，进行利用抗HMGBl多克隆抗体的迁移抑制实验。结果可知抗HMGBl多克隆抗体强烈地抑制了该纯化标准品中的骨髄来源间充质干细胞迁移活性(图13)，存在于皮肤提取液内的骨髄来源干细胞动员因子是HMGBl。进而，为了确认HMGBl在生物体内具有骨髄来源间充质干细胞动员活性，将放有该纯化标准品的硅管插入到GFP骨髄移植小鼠背部皮下，研究2周后动员至管内的细胞的性质。结果是与对照组(图12中SDS-PAGE泳道4中使用的纯化标准品)相比，HMGBl纯化标准品将大量(对照组的约3倍)GFP阳性的骨髓源性细胞动员至管内(图14)。图15表示利用荧光实体显微镜拍摄的强放大图像。进而，将动员至管内的GFP阳性细胞取出，在DMEM/10%胎牛血清培养基内进行培养，结果确认了 刚开始培养后是圆形的悬浮细胞状态(图16)，但24小时后GFP阳性骨髓源性细胞附着在培养皿上，作为纺锤丝的成纤维细胞样 形态、进而近似圆形的上皮细胞样形态的细胞进行增殖(图17)。进而确认了 将这些细胞继续培养2周时，在GFP阳性骨髓源性细胞中可见呈毛囊形态的细胞(图18A :明视野、弱放大，图18B =GFP荧光、弱放大，图18C :明视野、强放大，图18D =GFP荧光、强放大)。另外，对作为上皮角质形成细胞的标记物的角蛋白5进行免疫组织化学时，在GFP阳性骨髓源性细 胞中确认了角蛋白5阳性细胞(图18E :明视野，图18F :角蛋白5阳性细胞的荧光)。讨论这次，本发明的发明人在世界上首次发现了 游离皮肤片会产生HMGBl ;所产生的HMGBl具有将骨髓来源的间充质干细胞大量动员至皮肤片内的活性；动员至皮肤片内的骨髓来源间充质干细胞在皮肤组织中分化成成纤维细胞、脂肪细胞、平滑筋细胞等间充质细胞，进而分化成形成表皮细胞毛囊的细胞，由此诱导移植皮肤组织的功能性再生。可以容易地预想到利用该HMGBl的骨髄来源间充质干细胞动员和作为其结果的功能性组织再生不仅对于移植皮肤再生作为功能性组织再生诱导机制发挥功能，而且在伴有灌注不足、坏死的多数器官和组织损伤时也作为功能性组织再生诱导机制发挥功能。相信通过利用HMGBl制剂开发药品，若能在损伤组织再生时将骨髄来源间充质干细胞动员至局部位置，则可进行没有纤维性疤痕治愈所导致的功能障碍、必要的功能性器官相伴的功能性组织再生诱导医疗。(参考例3)目的皮肤提取液中HMGBl家族的鉴定和骨髓间充质干细胞诱导活性的研究方法使用Western blot法确认了新生小鼠皮肤提取液中是否含有HMGB蛋白家族。使用SDS-PAGE法将作为样品的[参考例2]中获得的皮肤提取液10 μ I进行电泳，使用印迹装置(ATTO)将凝胶中分离出的蛋白转移到PVDF膜上。用含有3%脱脂乳的O. l%Tween20的PBS (S-T-PBS)在室温下孵育I小时，然后使其分别与用S-T-PBS稀释至1000倍的兔抗小鼠HMGBl抗体、兔抗小鼠HMGB2抗体、兔抗小鼠HMGB3抗体在4°C下反应16小时。反应后，将该PVDF膜用S-T-PBS洗涤5分钟、5次，然后将该PVDF膜使用用S-T-PBS稀释2000倍的过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(GE Healthcare)在25°C下孵育I小时。然后用S-T-PBS 洗涤 5 分钟、5 次，然后使 ECL Western Blotting 检测系统(GE Healthcare)与该PVDF膜反应，在使ECL胶片感光后进行显影，检测HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白的存在。使用Trizol (invitrogen)从新生小鼠皮肤提取RNA,然后使用SuperScriptIII cDNA合成试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。以该cDNA为模板，使用PCR (聚合酶链反应)法对HMGB1、HMGB2、和HMGB3的cDNA进行扩增，将其插入在哺乳类细胞中表达蛋白的质粒载体pCAGGS中，以使得表达在氣基酸序列的N末端添加了 Flag标签的序列(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys ;序列号30)的蛋白。将这些质粒载体基因导入至HEK293(人胎儿肾细胞来源的培养细胞株)，培养48小时使蛋白表达。将分别表达HMGB1、HMGB2和HMGB3蛋白的细胞和培养上清在4°C下孵育16小时，然后以4400g离心5分钟，回收上清。将该上清每50mL与100 μ L的抗Flag抗体Gel (Sigma)混合，在4°C下孵育16小时。离心回收Gel，然后用PBS洗涤5次。然后使用3X Flag肽(终浓度100 μ g/ml)进行洗脱。用使用了用S-T-PBS稀释1000倍的小鼠抗Flag抗体和用S-T-PBS稀释2000倍的过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体(GE Healthcare)的Western blot法确认了重组蛋白的表达。与[参考例2]同样地使用Boyden小室评价这些纯化重组蛋白的小鼠骨髓间充质干细胞迁移活性。另外，为了观察HMGB家族在体内的药效，将8周龄C57BL/6小鼠的背部皮肤切出直径为8 μ m的圆形，从而制作皮肤溃疡模型，然后将纯化的HMGB1、HMGB2、HMGB3各(IOOng)与lg/100mL PBS浓度的透明质酸溶液分别等量混合，然后将100 μ L投予至溃疡面。为了 使溃瘍面不干燥，用粘着性透明创伤覆盖/保护材料Tegaderm (3Μ Healthcare)覆盖,测量经时的创伤面积，从而测定治愈效果。此外，为了调查人皮肤提取液和人纯化HMGBl是否具有将人骨髓间充质干细胞迁移的活性，与[参考例2]同样地使用Boyden小室进行评价。将面积为Icm2的人皮肤浸溃到Iml的PBS中，在4°C的条件下孵育16小时，然后在4°C的条件下以440G离心10分钟。仅回收上清，将其用作人皮肤提取液。另外，加入Boyden小室的上部的细胞使用人骨髓间充质干细胞(Cambrex公司)(该细胞使用流式细胞仪进行细胞表面抗原分析的结果为CD105阳性、CD166阳性、CD29阳性、CD44阳性、CD34阴性、CD45阴性。此外，通过分化诱导试验，向脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞的分化为阳性)。另外，在小室下部以IOOng/孔加入人HMGBl(R&D公司)和用PBS稀释10倍的人皮肤提取液，使用PBS作为对照。结果Western blot的结果是，除了 HMGBl的条带以外，还检测到了 HMGB2和HMGB3的条带。因此确认了，新生小鼠皮肤提取液中在除HMGBl之外还含有作为家族蛋白的HMGB2和HMGB3(图19)。制作了分别在蛋白的N末端添加了 Flag标签的HMGB1、HMGB2、HMGB3的表达载体(图20)。将表达载体基因导入至HEK293细胞，在使用Flag标签将表达的蛋白纯化后，使用Western blot法对蛋白进行了确认(图21)。对使用了这些纯化蛋白的小鼠骨髓间充质干细胞的迁移活性进行测定，结果确认了任一蛋白质均具有活性(图22)。每隔7天测量在小鼠背部制作的溃疡面积，结果确认了 与非治疗组相比，HMGBU2和3的治疗组具有显著的溃疡面积缩小的效果(图23)。可知与小鼠的情况相同，人HMGBl和人皮肤提取液也具有将人骨髓间充质干细胞迁移的活性(图24)。讨论作为与HMGBl同源性高的蛋白，已知有HMGB2和HMGB3。期待这些蛋白也具有与HMGBl同样的性质。这里，确认了从游离皮肤片提取液中产生了作为HMGBl家族的HMGB2和HMGB3。此外，制作HMGBI、HMGB2、HMGB3的重组蛋白，确认了在体外的骨髓间充质干细胞迁移活性，并确认了在体内的皮肤溃疡治疗效果。可知新生小鼠游离皮肤片中的HMGB家族(HMGB1、HMGB2、HMGB3)和重组HMGB家族具有骨髓间充质干细胞诱导活性和将骨髓来源的能够分化为上皮系的干细胞诱导到局部的活性，并且，这些被诱导的骨髓来源的细胞群在损伤组织中能够分化为表皮角质形成细胞、毛囊和成纤维细胞等各种各样的细胞，从而具有促进损伤组织治愈的效果。另外，骨髓间充质干细胞由于是多能干细胞，因此相信对于其他组织损伤状态、例如脑损伤、心肌梗塞、骨折等组织损伤的治疗，通过全身投予或局部投予HMGB家族，可以期待同样的治疗效果。另外可知人与小鼠的各自构成HMGBl的氨基酸序列具有98% (213/215)的同源性，各自构成HMGB2的氨基酸序列具有96% (202/210)的同源性，各自构成HMGB3的氨基酸序列具有97%( 195/200)的同源性。因此可认为人的HMGB具有与小鼠的HMGB同样的活性，由本参考例的结果可知人的皮肤提取液、HMGBl与小鼠的皮肤提取液、HMGBl同样地具有诱导骨髓间充质干细胞的活性。(参考例4)目的确立骨髓间充质干细胞诱导因子组织提取液的制作方法方法将一只6周龄C57BL6份的脑、心脏、肠、肾脏、肝脏和一只新生小鼠份的皮肤浸溃到生理性磷酸缓冲液(pH7. 4) (PBS) Iml内，在4°C下孵育24小时后，为了除去组织， 在4°C的条件下以440G离心10分钟，回收上清，从而制成组织提取液。为了确认所得到的提取液中存在骨髓间充质干细胞诱导活性，使用Boyden小室与[参考例2]同样地研究了对骨髓来源间充质干细胞的迁移活性。另外，使用HMGBl ELISA试剂盒(Shino-Test)测量相同样品中所含的HMGBl的浓度。然后，使脑、心脏和皮肤的组织提取液与[参考例2]同样地结合于肝素亲和柱，使用Boyden小室确认了结合级分的蛋白的骨髓间充质干细胞诱导活性。结果小鼠脑提取液中含有与新生小鼠皮肤提取液等同的HMGB1。此外，小鼠脑中与皮肤同样地可见骨髓间充质干细胞诱导活性。小鼠肠提取液和小鼠心脏提取液中几乎不含有HMGB1，但也可见有骨髓间充质干细胞的诱导活性。另外，小鼠脑、小鼠心脏的肝素柱结合级分与小鼠皮肤的肝素柱结合级分同样地具有诱导骨髓间充质干细胞的活性(图25)。表I示出了测定小鼠各组织提取液的HMGBl浓度与骨髓间充质干细胞的诱导活性的结果。表I
权利要求
1.一种药剂，其为含有以下(a) (q)中任一项所述的物质的组织再生促进剂，其被投予至与需要再生的组织不同的组织 (a)HMGBl蛋白质 (b)分泌HMGBl蛋白质的细胞 (c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体 (d)HMGB2蛋白质 Ce)分泌HMGB2蛋白质的细胞 Cf)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体 (g)HMGB3蛋白质 (h)分泌HMGB3蛋白质的细胞 (i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体 (j)S100A8蛋白质 (k)分泌S100A8蛋白质的细胞 (I)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体 (m) S100A9蛋白质 (n)分泌S100A9蛋白质的细胞 (O)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体 (P)细胞或组织的提取液 (q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
2.根据权利要求I所述的药剂，其被非经口投予。
3.根据权利要求2所述的药剂，其为注射投予。
4.根据权利要求I所述的药剂，其被投予至血管内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内。
5.根据权利要求广4任一项所述的药剂，其中，细胞或组织的提取液通过包含将细胞或组织浸溃在溶剂中的工序的方法来制造。
6.根据权利要求广4任一项所述的药剂，其中，细胞或组织的提取液的肝素结合级分通过包含以下工序的方法来制造 Ca)将细胞或组织浸溃在溶剂中的工序、 (b)使工序(a)中获得的提取液与固定化肝素接触的工序、和 (C)从固定化肝素中洗脱肝素结合级分的工序。
7.根据权利要求I飞任一项所述的药剂，其被用于神经组织、骨组织或皮肤组织的再生促进。
全文摘要
通过本发明可知，当静脉内投予HMGB-1及S100A8时，骨髓源性细胞被动员至皮肤溃疡部位促进皮肤溃疡的治愈。另外，在脑梗塞模型小鼠脑中，在脑梗塞制作后静脉投予了HMGB-1的小鼠中，在脑内可见表达神经细胞标记物的骨髓源性细胞。对于脑梗塞灶的缩小效果，与对照相比，在HMGB-1静脉投予小鼠中确认到了显著的改善效果。对于脑梗塞后的存活率，HMGB-1静脉投予例中存活率提高。使用小鼠确认骨折治愈过程中骨髓多能干细胞的参与，结果显示，损伤部位远处的骨髓源性细胞移动至骨折部分进行损伤组织的修复。
文档编号A61K38/00GK102711777SQ20108005971
公开日2012年10月3日 申请日期2010年10月28日 优先权日2009年10月28日
发明者佐贺公太郎, 山崎尊彦, 玉井克人, 知野刚直, 远藤真弓, 金田安史 申请人:吉诺米克斯股份有限公司, 国立大学法人大阪大学