专利名称：一种注射用益气复脉制剂的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药制剂的新用途，特别涉及一种注射用益气复脉制剂对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP3A4活性的诱导作用。
背景技术：
注射用益气复脉(冻干)是由红参、麦冬、五味子制成的用于静脉滴注的中药复方制剂，具有益气复脉，养阴生津的疗效。主要用于冠心病劳累性心绞痛气阴两虚证，症见胸痹心痛，心悸气短、倦怠懒言、头晕目眩、面色少华、舌淡、少苔或剥苔，脉细弱或结代；冠心病所致慢性左心功能不全II、III级气阴两虚证，症见心悸、气短甚则气急喘促，胸闷隐痛，时作时止，倦怠乏力，面色苍白，动则汗出，舌淡、少苔或剥苔，脉细弱或结代。注射用益气复脉(冻干)性状本品为浅黄色的疏松块状物；有引湿性。取I瓶 内容物,加水2 3ml溶解后，为棕红色澄明液体。用法用量静脉滴注。每日I次，每次8瓶，用250ml 500ml 5%葡萄糖注射液或生理盐水稀释后静脉滴注。每分钟约40滴。疗程2周。在临床应用中，注射用益气复脉(冻干)有较多的合用情况，有潜在的药物相互作用风险。CYP450酶是催化药物I相代谢的主要酶类，90%以上的代谢性相互作用都是由CYP450酶活性改变引起的。国内外对于中草药在此方面的研究已取得一定的进展，但注射用益气复脉(冻干)尚未有过相关的研究报道。本研究选择大鼠为实验对象，以代谢产物来测定大鼠肝微粒体中的CYP1A2、CYP3A4活性，将受试药物组与空白对照组相比较，从而反映出受试药物对于CYP1A2、CYP3A4活性的影响。
发明内容
本发明意外的发现，注射用益气复脉制剂对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP3A4活性具有诱导作用，因此本发明提供一种注射用益气复脉制剂的医药新用途，特别是提供一种注射用益气复脉制剂在制备一种对肝微粒体CYP1A2、CYP3A4活性具有诱导作用的药物中的应用。其中益气复脉制剂是由红参、麦冬、五味子制成的。其中益气复脉制剂是注射剂。优选的其中益气复脉制剂是冻干注射剂。所述益气复脉制剂具有益气复脉，养阴生津的疗效。其中益气复脉制剂对肝微粒体中的CYP1A2、CYP3A4的诱导作用具有剂量相关性。在和其他药物一同使用时，益气复脉制剂应注意调整剂量。益气复脉制剂可以和对肝微粒体CYP1A2、CYP3A4活性具有抑制作用的其他药物一同使用。本发明的应用是经过以下试验研究获得的，有关实验如下I.材料I. I仪器与设备AgilentllOO型液相色谱仪，包括G1310A单元泵、G1314A紫外可变波长检测器、G1322A在线脱气系统、G1313A自动进样系统、AT-130柱温箱(美国Agilent公司)；FSH_2型组织匀浆机(江苏金坛荣华仪器有限公司)；Z323K型高速冷冻离心机(德国HERMLE公司)；LG10-2.4A型台式高速离心机(北京京立离心机有限公司)；Sroi010型真空浓缩仪(美国Thermo Savant公司);微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司);DR5000紫外分光光度计(Hash公司)；WB/0B-45型恒温水浴(德国Memmert公司)。I. 2药品与试剂注射用益气复脉(冻干)由天津天士力之骄药业有限公司提供，批号20091007 ；生理盐水购于山东齐都药业有限公司；咪达唑仑、I-羟基咪达唑仑、非那西丁、对乙酰氨基酹购于Sigma公司；Folin&Ciocalteus酹试剂购于上海蓝季科技发展有限公司；苯巴比妥购于天津市化学试剂批发有限公司；EDTA、DDT购于联星生物技术有限公司；NADPH购于Roche公司；Tris、牛血清白蛋白购于生工生物工程有限公司；原儿茶酸、地西泮购于中国药品生物制品检定所；乙腈、甲醇均为色谱纯，购于Merck公司；其余试剂购于天津化学试剂厂。
I. 3实验动物WISTAR大鼠，SPF级，雌雄各半，体重(220±30) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK (京)2006-0009。2.方法2. I动物分组与给药30只Wistar大鼠随机分成空白对照组、诱导组、益气复脉低、中、高浓度组，每组6只大鼠，雌、雄各半。空白对照组ig给予生理盐水，诱导组ig给予苯巴比妥75mg · kg-1,益气复脉低、中、高剂量组分别iv给予注射用益气复脉(冻干)181mg · kg_1>542mg · kg'1625mg · kg'连续给药7天。2. 2大鼠肝微粒体的制备实验前，所有试剂和用具置4°C预冷，各组实验大鼠禁食18h，脱颈椎处死，取出肝脏，洗净，称重，采用钙盐沉淀法制备肝微粒体[7]，保存于_80°C备用。 2. 3Lowry法测定肝微粒体蛋白浓度2. 3. I标准曲线的制备依照文献方法[8]，用O. 5mol · Γ1的NaOH溶液溶解牛血清白蛋白，依次稀释成20、40、60、80、100μ g · ml/1的浓度。以O. 5mol · Γ1的NaOH溶液为空白对照，在750nm处测定吸收度，蛋白浓度C对吸收度A进行线性回归，即得标准曲线，y = O. 002x+0. 006，r =
O.9998。2. 3. 2蛋白浓度测定肝微粒体样品分别稀释50、100、200倍，取I. OmL与上述标准曲线同样处理，以Tris-HCl缓冲液作为空白对照测得吸收度值，代入标准曲线计算各肝微粒体样品蛋白浓度。2. 4肝微粒体的孵化评价CYP1A2的活性时，选择非那西丁作为其特异性底物[9]。参照文献方法[1°]，建立孵化体系。孵化体系中含大鼠肝微粒体蛋白I. OmgNADPH 10. Ommol · L—1、MgCl2IO. Ommol · L \ KCl 10. Ommol · L \非那西丁 10. O μ g · L S 以 O. Imol · L 1Tris-HCl缓冲液(pH 7. 4)定容至500 μ L。60min取反应液100 μ L，立即加入100 μ L冰冷甲醇终止反应。CYP3A4选择咪达唑仑作为其特异性底物[9]，并用上述方法建立孵育体系(10. O μ g · L-1的咪达唑仑替换10. O μ g · L-1的非那西丁 )。2. 5样品预处理孵化反应终止后，加入100 μ L的内标溶液(非那西丁反应液加入2 μ g · ι Γ1的原儿茶酸溶液，咪达唑仑反应液加入I μ g · πιΓ1的地西泮溶液)，1A2样品和3A4样品分别加入3mL乙酸乙酯、3mL乙醚-二氯甲烧(60 : 40, v/v),润旋3min,振荡IOmin,离心IOmin (4500r · mirT1),分离上清液吹干，100 μ L流动相复溶,取20 μ L进样,记录色谱图。2. 6色谱条件 2. 6. I对乙酰氨基酚色谱条件色谱柱Z0RBAXSB-C18 150X4. 6mm, 3. 5 μ m ；流动相甲醇-水-甲酸(24 76 O. 2);流速0· SmLiirT1 ;检测波长254nm;柱温30°C。2. 6. 21’ -羟基咪达唑仑色谱条件色谱柱ZORBAXEclipse XDB-C18 250 X 4. 6mm, 5 μ m ;流动相乙臆-IOmmol · L-1醋酸铵水溶液(38 62);流速1. OmL · mirT1 ;检测波长220nm ;柱温30°C。2. 7统计学分析根据测得的反应液中代谢产物的浓度，计算CYP1A2、CYP3A4的平均反应速率，即CYP1A2、CYP3A4的活性。用SPSS10. O软件进行统计学分析，P < O. 05表明有统计学意义。2. 8专属性取空白孵化反应液(同“2. 4肝微粒体的孵化”，同体积O. Imol -T1Tris-HCl缓冲液(pH7. 4)代替10. 0μ g · L—1非那西丁 ) 100 μ L，除不加内标溶液并补加100 μ L甲醇,其余按“2.5样品预处理”项下方法操作，获得空白反应液的色谱图，见图I(A);将一定浓度的对乙酰氨基酚和内标溶液加入空白反应液，同法操作，获得相应色谱图，见图I(B);孵化后样品溶液，按“2. 5样品预处理”项下方法操作，得相应的色谱图，见图I (C)。10. Oyg* Γ1咪达唑仑代替上述的10. O μ g · Γ1非那西丁，I’ -羟基咪达唑仑代替上述各项对乙酰氨基酚，得相应色谱图，见图2。2. 9标准曲线及其线性关系精密配制O. 1、0·2、0·5、2·0、5·0、10·0、20· Oyg .mr1的对乙酰氨基酚溶液，和
Γ-羟基咪达唑仑溶液。取空白孵化反应液(80°C加热lOmin，使之灭活UOOyL，依次加入上述系列标准溶液ΙΟΟμ L，其余操作同“2. 5样品的预处理”。以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归计算[11]，求得对乙酰氨基酚的标准曲线为y = 0. 3476x+0. 0050, r = 0. 9994。线性范围为0. 1-20. O μ g ·πι Λ最低定量限为0. 1μ g .mL' I，-羟基咪达唑仑的标准曲线为y = 0. 4056χ-0. 0141, r =
O.9995。线性范围为0. 2-20. Oyg · mL—1，最低定量限为0. 2 μ g · mL'2. 10精密度与准确度按“2. 9”项下方法分别配制对乙酰氨基酚和I’ -羟基咪达唑仑空白孵化反应液低、中、高三个浓度(浓度分别均为0. 2.2.0.16.(^8*!!^1)的质量控制样品(QC)，各6样本，连续测定3天，与标准曲线同时进行。根据当日标准曲线计算QC样品的浓度，根据QC样品结果计算精密度与准确度，结果见表1、2。2. 11提取回收率按“2. 9”项的方法制备低、中、高三个浓度的质量控制样品(QC)，每浓度进行3样本分析。另取空白孵化反应液ΙΟΟμ L，按“2. 5样品预处理”项操作，于上层有机相中加入相应浓度的对乙酰氨基酚或Γ-羟基咪达唑仑标准溶液100 μ L，获得相应峰面积值(三次测定的平均值)。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。2. 1224h稳定性考察按“2. 9”项下的方法制备低、中、高三个浓度的质量控制样品(QC)，样品预处理后，室温(约20°C)下放置24h测定，以考察处理后的对乙酰氨基酚样品在室温下的稳定性。每一浓度进行3样本分析。
3.结果3. I专属性对乙酰氨基酚和内标的保留时间分别为3. 9min和4. 5min，试验结果表明，孵化反应液中的杂质与对乙酰氨基酚和内标分离良好，不干扰测定。I’ -羟基咪达唑仑和内标的保留时间分别为9. 8min和24. 7min,杂质不干扰I’ -轻基咪达唑仑和内标的测定。3. 2精密度与准确度表I对乙酰氨基酚精密度与准确度实验结果(η = 18)
加入浓度测得浓度相对偏差日内精密度日间精密度 /pg.mL-l/pg.mL-l/%/%/%0.20.20士0.010.232.63.4
2.02.02士0.041.441.05.7
16.016.25 士0.271.571.13.8表2 I’ -羟基咪达唑仑精密度与准确度实验结果(η = 18)
加入浓度测得浓度相对偏差日内精密度日间精密度 /pg.mL-l/pg.mL-l/%/%/%0.20.20士 0.01-0.13.84.5
2.02.01 士0.090.653.49.6
16.015.96 士0.44 -0.242.64.03. 3提取回收率对乙酰氨基酚在低、中、高三个浓度的提取回收率分别为93. 1 + 2.2%,93. 2±4. 9%和93. 7±3. 4%。I’ -羟基咪达唑仑在低、中、高三个浓度的提取回收率分别为82· 0±0· 4%,91. 5±0· 1%和 88. 9±1· 3%。3. 424h 稳定性稳定性样品中的对乙酰氨基酚和I’ -羟基咪达唑仑测定值与添加值的相对偏差(RE)绝对值均小于4. 8%，说明分析测试过程中的样品较为稳定。3. 5CYP1A2、CYP3A4 酶活性的评价经SPSS 17. O软件分析，益气复脉低、中、高剂量组与空白对照组相比，CYP1A2和CYP3A4的活性均有显著性差异(P < O. 05)，而益气复脉高、中、低剂量组之间相比，CYP1A2和CYP3A4的活性均无显著性差异(P > O. 05)。CYP1A2、CYP3A4活性数据见表3。表3CYP1A2、CYP3A4 活性数据
CYPIA2活性CYP3A4活性
组别
/ng-(mg protein)'1-min'1/ng-(mg protein)'1-min'1
空白对照组1.304±0.2059.100±2.235
诱导组8.555±1.193**47.413±4.320**益气复脉组(低)2.927±0.576*38.649±5.043**
益气复脉组(中)3.675±0.444*36.282±3.254**
益气复脉组(高)3.024±0.552*33.764±5.128**注与空白对照组相比，*P < O. 05，林P < O. 01从所得的结果可以初步推断，注射用益气复脉(冻干)对于大鼠肝微粒体中的CYP1A2、CYP3A4具有诱导作用，其强弱与本研究中给予的三个受试药物剂量未呈现出明显的相关性。
图I对乙酰氨基酚高效液相色谱图A.空白反应液；B.空白反应液加入对乙酰氨基酚和内标；C.孵化样品；I.对乙酰氨基酚；II.内标(原儿茶酸)图21’ -羟基咪达唑仑高效液相色谱图A.空白反应液；B.空白反应液加入I’ -羟基咪达唑仑和内标；C.孵化样品；
I.I’ -羟基咪达唑仑；ΙΙ·内标(地西泮)
具体实施例方式以下通过实施例，进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例I先对五味子用60-80%乙醇回流提取2-3次，每次60_120min，回收乙醇至物醇味，浸膏在搅拌下加入乙醇，使含醇量达60-80 %，滤过，减压浓缩得提取液A ;再用乙醇提取后的五味子药渣与人参，麦冬加水合煎，合并水提取液浓缩后，再经醇沉，滤过，回收乙醇后用10-15倍量去离子水溶解后，用大孔吸附树脂处理，先以去离子水洗至无糖，再以乙醇洗至无皂甙止，回收醇洗脱液，浓缩得提取液B ;将上述人参，麦冬和五味子水提醇沉后的沉淀加蒸馏水溶解，滤过，干燥，得水提多糖粗品，将多糖粗品加蒸馏水溶解，过中空纤维柱超滤，得提取液。实施例2人参用乙醇提取三次，合并提取液，减压浓缩，加水至与药材比I : 1，分离除去上层油，过滤，浓缩，真空干燥，得人参提取物；麦冬与五味子分别加水煎煮，合并提取液，减压浓缩，加乙醇，放置，滤过，滤液减压浓缩，再加乙醇，放置，过滤，调节pH值，放置，过滤，再调PH值，减压回收，真空干燥，分别得麦冬、五味子提取物。按照常规方法制成冻干制剂。实施例3益气复脉制剂的制备方法，红参用乙醇提取，回收乙醇，加水沉淀，过滤，浓缩，真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，得红参提取物；麦冬、五味子用水提取，提取液浓缩后，醇沉，回收乙醇，将药液浓缩，再用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥法干燥，得麦冬、五味子提取物。按照常规方法制成冻干制剂。
实施例4将红参药材切片，用5 10倍量60% 90 %的乙醇回流I 5次，每次O. 5 3小时，合并回流液，滤过，滤液减压回收乙醇至相对密度为I. 10 I. 15，所得稠膏加水，搅匀，2 SOC静置6 20小时，滤过，滤液用活性炭处理，滤过，得滤液A供配液用；取麦各药材，加5 10借量的水提取I 4次，每次20 90min，滤过，滤液浓缩至相对密度为I. 05 I. 10，加入95%乙醇进行两次醇沉，第一次使含醇量达80%，第二次使含醇量达85%，滤过，滤液减压回收乙醇至相对密度为I. 10 I. 15，加水，搅匀，置6 20小时，滤过，得滤液BI，将两次醇沉的沉淀合并，加入注射用水溶解，静置6 20小时，滤过，得滤液B2，将滤液BI和B2合并，加入重量体积比为O. 1-3%的活性炭处理，滤过，得滤液B供配液用；五味子药材加4 8倍量的水提取I 4次，每次20 90min，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为I. 10 I. 15，所得稠膏加入95%乙醇进行两次醇沉，第一次使含醇量达80%，第二次使含醇量达85%，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至相对密度为I. 10 I. 15，加水，搅匀，静置，滤过，滤液用活性炭处理后，滤过，得滤液C供配液用；将滤液A、B、C混匀，按照常规方法制成制剂。
权利要求
1.益气复脉制剂在制备一种对肝微粒体CYP1A2、CYP3A4活性具有诱导作用的药物中的应用。
2.权利要求I的应用，其特征在于，其中益气复脉制剂是由红参、麦冬、五味子制成的。
3.权利要求I的应用，其特征在于，其中益气复脉制剂是注射剂。
4.权利要求I的应用，其特征在于，其中益气复脉制剂是冻干注射剂。
5.权利要求I的应用，其特征在于，其中益气复脉制剂具有益气复脉，养阴生津的疗效。
6.权利要求I的应用，其特征在于，其中益气复脉制剂对肝微粒体中的CYP1A2、CYP3A4的诱导作用具有剂量相关性。
7.权利要求I的应用，其特征在于，在和其他药物一同使用时，益气复脉制剂应注意调整剂量。
8.权利要求I的应用，其特征在于，益气复脉制剂可以和对肝微粒体CYP1A2、CYP3A4活性具有抑制作用的其他药物一同使用。
全文摘要
本发明提供一种注射用益气复脉制剂的医药新用途，特别是提供一种注射用益气复脉制剂在制备一种对肝微粒体CYP1A2、CYP3A4活性具有诱导作用的药物中的应用。
文档编号A61K36/8968GK102772643SQ201110118000
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月9日 优先权日2011年5月9日
发明者万梅绪, 于初楚, 叶正良, 周大铮, 胡冰, 褚杨 申请人:天津天士力之骄药业有限公司