专利名称：一种诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法
技术领域：
本发明属生物医学领域，涉及诱导干细胞分化为内皮细胞的方法，具体涉及诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法，尤其涉及芍药苷诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法及用途。
背景技术：
据报道，细胞移植治疗从细胞水平入手，促进缺血部位新生血管形成，改善血液供应，是目前治疗缺血性血管疾病的新策略。随着研究者对各种干细胞生物学特性认识的不断深入以及分离纯化手段的不断改进，使采用干细胞等治疗性血管生成方法在缺血部位重新建立有效的侧支循环逐渐成为可能；因此，研究者对通过干细胞移植增加血管生成治疗严重的下肢缺血产生了浓厚的兴趣。
目前，将干细胞用于治疗缺血性疾病已经成为了基础和临床研究的热点之一；有关临床前期的研究已经显示出干细胞移植治疗令人鼓舞的成果，但是仍存在许多问题亟需解决，如细胞来源、免疫反应及伦理学争议等。有研究发现，临床治疗下肢缺血时，取得满意的患肢再灌注，需要移植异源性干细胞2xl04/g体重；通过体外培养扩增，IOOml健康成人志愿者的外周静脉血通常约可产生5. OxlO6个内皮干细胞，按上述研究结果预算，用于治疗一条严重缺血的肢体，至少需要12升外周静脉血才能获得足够数量的内皮干细胞，这无疑是极难实现的，因此，对上述疾患的治疗，干细胞的来源问题亟需解决。有研究表明，脐带间充质干细胞是除骨髓、外周血之外又一极具有潜力的干细胞来源，在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的应用前景广阔。脐带作为干细胞移植的另一种干细胞来源，与骨髓和外周血造血干细胞相比有如下显著优点(I)富含可在体内长期植入的干、祖细胞；在作体外集落形成试验时，细胞产生的集落形成单位比成人骨髓来源的HSC的更大；(2)干细胞的端粒酶的长度较成年细胞更长；(3)移植后移植物抗宿主病发生率低；(4)在体外的长期培养中仍可以扩增。目前，随着干细胞技术的迅速发展，由多能干细胞向内皮细胞诱导分化已经有了较为完善的技术，但仍存在分化效率低等缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种涉及诱导干细胞分化为内皮细胞的方法，具体涉及诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法，尤其涉及芍药苷诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法。本发明的进一步目的是提供所述的方法在制备内皮细胞制剂中的用途。本发明中，所述的脐带间充质干细胞来源于离体的胎儿脐带，获得的脐带充质干细胞经分离、扩增和诱导分化过程制得脐带间充质干细胞来源内皮细胞。本发明的诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法中，将脐带间充质干细胞分别在含有P -巯基乙醇和维甲酸5%DMEM的培养基中诱导后，转入含有芍药苷的内皮细胞条件培养基，获得所需的内皮细胞。该方法利用芍药苷诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞，能有效解决内皮细胞移植治疗中因细胞分化效率低、细胞分化周期长等缺陷造成的难题。具体而言，本发明的诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)无菌条件下获得离体脐带，经含有双抗的PBS清洗，切碎，再经胶原酶和胰酶分别消化，收集单细胞悬液，裂解红细胞，然后接种培养；
(2)在含有20%胎牛血清、l-50ng/mlbFGF的间充质干细胞培养基中培养，隔天换液，3-4天传代后得到胎脐带充质干细胞；
(3)上述制得的脐带间充质干细胞在含有P-巯基乙醇1-100 u mol/L培养基中诱导24小时后，在1-100 ii mol/L 5%DMEM的培养基中诱导24小时；
(4)将上述诱导后的脐带间充质干细胞，转入含有芍药苷的内皮细胞条件培养基，每隔两天半量换液，诱导10-14天，获得脐带间充质干细胞来源内皮细胞；
所述的内皮细胞条件培养基中，含有芍药苷I-IOOii mol/L、ECGFlOOii mol/L、VEGF50-100ng/ml、bFGF 10-100ng/ml 5%DMEM 的培养基。本发明的一个实施例中，所述的含有芍药苷的内皮细胞条件培养基为芍药苷
0.25mg/L-50mg/L、ECGFl-100ng/ml、VEGF 50_100ng/ml、bFGF 10-100ng/ml 5%DMEM 的培养基。本发明中，所述的苟药苷为苟药及川赤苟根中提取的单体化合物,是白苟及赤苟的主要有效成分，其分子式C23H28011，分子量480. 45，具有式(I )的结构
权利要求
1.一种诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法，其特征在于，将脐带间充质干细胞分别在含有P -巯基乙醇和维甲酸5%DMEM的培养基中诱导后，转入含有芍药苷的内皮细胞条件培养基，获得所需的内皮细胞，包括以下步骤 (1)无菌条件下获得离体脐带，经含有双抗的PBS清洗，切碎，再经胶原酶和胰酶分别消化，收集单细胞悬液，裂解红细胞，然后接种培养； (2)在含有20%胎牛血清、l-50ng/mlbFGF的间充质干细胞培养基中培养，隔天换液，3-4天传代后得到胎脐带充质干细胞； (3)上述制得的脐带间充质干细胞在含有P-巯基乙醇1-100 u mol/L培养基中诱导24小时后，在1-100 ii mol/L 5%DMEM的培养基中诱导24小时； (4)将上述诱导后的脐带间充质干细胞，转入含有芍药苷的内皮细胞条件培养基，每隔两天半量换液，诱导10-14天，获得脐带间充质干细胞来源内皮细胞。
2.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的内皮细胞条件培养基中，含有芍药苷I-IOOii mol/L、ECGFlOOii mol/L、VEGF 50_100ng/ml、bFGF 10-100ng/ml 5%DMEM。
3.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的芍药苷分子式为C23H28011，分子量% 480. 45，具有式(I )的结构:
4.芍药苷在制备内皮细胞条件培养基中的用途。
5.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的内皮细胞条件培养基中，含有芍药苷I-IOOii mol/L、ECGFlOOii mol/L、VEGF 50_100ng/ml、bFGF 10-100ng/ml 5%DMEM。
6.权利要求I的方法所制得的内皮细胞在制备内皮细胞制剂中的用途。
7.按权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的内皮细胞制剂在制备治疗缺血性血管疾病的药物或其它原因引起的血管损伤的组织修复药物中的用途。
8.按权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的缺血性血管疾病选自缺血性心血管疾病、缺血性脑血管疾病或缺血性下肢血管疾病。
全文摘要
本发明属生物医学领域，涉及芍药苷诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法及用途。本发明中，所述的芍药苷具有式(Ⅰ)的结构；所述方法的诱导分化步骤为将脐带间充质干细胞分别在含有β-巯基乙醇1-100μmol/L和维甲酸1-100μmol/L5%DMEM的培养基中诱导24小时，然后转入含有芍药苷的内皮细胞条件培养基，每隔两天半量换液，诱导10-14天，获得脐带间充质干细胞来源内皮细胞。本发明中，所述的芍药苷的用途和方法可促进脐带间充质干细胞分化，并提高分获效率，可用于缺血性血管疾病的细胞移植治疗；所获得的内皮细胞可进一步制备成细胞制剂，用于缺血性血管疾病的治疗、及血管组织工程的种子细胞应用。
文档编号A61K35/44GK102776150SQ20111012391
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月13日 优先权日2011年5月13日
发明者吴万龄, 姜博仁, 谢晓云, 陆颖理 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院