专利名称：负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种组织工程和医学用品领域，尤其涉及一种负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片及其制备方法和应用。
背景技术：
女性盆底器官脱垂是常见的妇科疾病，其产生的原因包括产伤，神经肌肉的损伤， 环境因素及遗传因素等。传统的外科治疗方案包括通过手术进行阴道前后壁修补或是子宫切除术。然而上述两种治疗方案只能修复脱垂的女性盆底器官，而无法提高组织本身的强度，无法达到盆底解剖结构重建，从而彻底治愈女性盆底器官脱垂等疾病的目的，手术后复发率高。为了克服传统的手术方案，人们采用向人体中植入新型材料，从而帮助提高组织本身的强度，达到盆底解剖结构重建目的。而理想的盆底重建材料要求具有良好的生物相容性、三维立体结构有利于细胞迁移再生、以及具有较好的机械强度和可塑性，在盆底组织再生过程中提供良好的支架作用，再生完成后能自行降解，降解率要与组织再生率相适应。近年来，以聚丙烯网片为代表的合成网片材料广泛应用于盆底重建手术中。如美国伊西康公司的中国专利CN101027012B就采用聚丙烯网片为材料制备一种最小侵入的医学植入物和插入装置，用于治疗压力性尿失禁等疾病。这些合成网片材料孔隙率较高，组织融合较佳，具有良好的生物力学性能，从而有效提高组织本身的强度。从而大大降低手术后的复发率。虽然采用合成网片材料可以有效治疗盆底器官脱落等疾病，但合成网片植入后， 却会引发诸如侵蚀暴露、感染、疼痛、性交不适等一系列与网片相关的并发症，而且，目前盆底重建网片发生侵蚀的原因尚不明确，可能的原因包括网片变性、挛缩、膨胀、网片的面积较大；术后作为盆底组织生长的构架，在运动不当或负重时，网片与周围组织产生相对运动，致使周围脆弱、未完全修复的组织断裂再修复，反复的慢性炎症导致置入的网片发生侵蚀等。为了避免上述可能引起网片相关并发症，人们开始对于网片进行修饰改进。其包括对网片进行胶原覆盖、脂肪酸涂层、聚偏二氟乙烯涂层，从而提高网片与植入后的人体周边组织的生物相容性。而在修饰中，效果最好的数壳聚糖修饰。壳聚糖是生物合成的天然多糖，是目前已知的天然多糖中唯一的碱性多糖。其结构与细胞外基质成分糖胺聚糖(GAGs)相似，由于壳聚糖含有较多的氨基，使其具有聚阳离子的特性，可与细胞表面带负电荷的基团相互作用，与细胞膜发生非特异性吸附，从而有利于其与细胞外黏附分子及IV型胶原蛋白等结合，有助于相关细胞的黏附和组织的生长。而且壳聚糖还可有效促进血管内皮细胞的生长，有利于细胞的增殖和组织的修复。在同济大学校报，第31卷第6期的医学版上了报道了壳聚糖涂覆的聚丙烯网片在妇科中的应用，植入涂覆壳聚糖的聚丙烯网片可有效增加网片与人体组织的生物相容性。然而，需要指出的是不同的涂布方式及制作工艺影响着聚丙烯网片涂布壳聚糖的抑菌效果，也意味着适用于不同的疾病治疗。对于涂覆壳聚糖的聚丙烯网片在治疗不同疾病中的应用的研究，是目前医学人体植入材料研究的重点。而目前，壳聚糖聚丙烯网片在治疗女性盆底器官脱垂的医用材料的应用尚未有合适方案。
发明内容
本发明提供了负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片及其制备方法和应用，其克服了现有的治疗女性盆底器官脱垂的医用材料的不足，在聚丙烯网片的表面涂覆一层壳聚糖挂膜的同时负载干细胞，这样在提高的材料机械强度和可塑性同时，增加了材料与植入后人体周边组织的生物相容性和组织相容性，从而抑制现有人体植入材料治疗女性盆底器官脱垂后出现的并发症。本发明第一个目的是提供一种可负载干细胞的采用壳聚糖挂膜聚丙烯网片的制备方法，通过以下技术方案实现其目的
一种负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片的制备方法，其中，步骤如下 步骤一，将洁净的聚丙烯网片浸泡于浓度为广5%的壳聚糖铸膜液中，直至在所述聚丙烯网片上涂覆一层壳聚糖膜，制得壳聚糖挂膜聚丙烯网片；
步骤二，在3(T40°C下，将制得的壳聚糖挂膜聚丙烯网片浸泡于悬液细胞密度为 1 X IO5^l X IO7个/毫升的干细胞悬液中3飞个小时，从而得到负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片。上述的方法，其中，在所述步骤二中，采用干细胞悬液滴加在所述壳聚糖挂膜聚丙烯网片上，直至干细胞悬液刚好没过所述壳聚糖挂膜聚丙烯网片，并在3(T40°C下，浸泡 3 5个小时。上述的方法，其中，在所述步骤二中，所述的干细胞为兔脂肪干细胞，并优选培养至第四代的兔脂肪干细胞。上述的方法，其中，在所述步骤一中，在所述步骤二中壳聚糖挂膜聚丙烯网片制备过程中，将洁净的聚丙烯网片浸泡于所述的铸膜液中圹7min后取出，晾干后，再次浸泡入所述铸膜液中Γ7π η，再次晾干；并重复所述聚丙烯网片浸泡于所述铸膜液，与晾干过程， 直至在所述聚丙烯网片上涂覆一层壳聚糖膜，制得壳聚糖挂膜聚丙烯网片。上述的方法，其中，还包括所述壳聚糖铸膜液的制备过程，其包括以下步骤将一定量的壳聚糖溶解在乙酸溶液中；之后向溶液中加入占总固体原料质量的4飞％戊二醛和占总固体原料质量的45飞0%正庚烷；并在45飞0°C，搅拌条件下交联反应0. 5 1. 5小时，静置后，制得壳聚糖质量含量为广5%的壳聚糖的铸膜液。本发明第二个目的是提供一种上述方法制备的负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片，其中，包括作为支架的聚丙烯网片，所述聚丙烯网片表面涂覆有一层壳聚糖挂膜；在壳聚糖挂膜的聚丙烯网片上负载有干细胞。所述干细胞优选为兔脂肪干细胞。上述的负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片，其中，在所述壳聚糖挂膜的聚丙烯网片上的所述兔脂肪干细胞的接种密度为1 XIO3 1 X IO5个/立方厘米。本发明第三个目的是提供一种上述的负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片的应用，所述负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片用于治疗女性盆底器官脱垂治疗的植入医用材料。
4
采用本发明一种壳聚糖挂膜聚丙烯网片的制备方法的优点在于
1.本发明负载兔脂肪干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片，一方面利用聚丙烯网片孔隙率高、周围组织很好地契入生长的特点，可以增强修补部位的抗拉伸性能，另一方面利用壳聚糖的良好生物相容性以及兔脂肪干细胞成体干细胞的作用，以期有效的降低植入部位聚丙烯网片侵蚀、暴露及组织粘连等并发症的发生，在女性盆底重建外科中，有利于提高盆底重建手术聚丙烯材料的组织相容性，减少盆底重建术后并发症，具有很高的医用价值。2.本发明负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片的制备方法简单易行，不涉及任何有毒有害试剂，对医用补片的后续使用无不利影响，而且原料壳聚糖，以及兔脂肪干细胞来源广泛，易于取得，大大减小了医用成本，实用性强。
图1为未经处理的聚丙烯网片扫描电镜(X500倍)图片； 图2为2. 5%壳聚糖挂膜聚丙烯网片扫描电镜(X 300)图片；
图3为rADSCs与壳聚糖挂膜聚丙烯网片复合培养，细胞在壳聚糖膜上粘附生长情况的倒置显微镜(X40)图片。
具体实施例方式本发明提供了一种负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片其包括作为支架的聚丙烯网片，所述聚丙烯网片表面涂覆有一层壳聚糖挂膜；且在壳聚糖挂膜的聚丙烯网片上负载有干细胞。其中，所述干细胞优选为兔脂肪干细胞，进一步优选为第四代兔脂肪干细胞， 且干细胞在聚丙烯网片上的接种密度为1 X IO3 1 X IO5个/立方厘米。本发明公开了上述负载兔脂肪干细胞的聚丙烯网片的制备方法，其过程包括，
步骤一，将洁净的聚丙烯网片浸泡于浓度为广5%的壳聚糖铸膜液中，直至在所述聚丙烯网片上涂覆一层壳聚糖膜，制得壳聚糖挂膜聚丙烯网片；
步骤二，将密度为1 X IO5^l X IO7个/毫升的干细胞悬液滴加在壳聚糖挂膜聚丙烯网片上，直至干细胞悬液刚好没过所述壳聚糖挂膜聚丙烯网片，并在3(T40°C下，使壳聚糖挂膜聚丙烯网片浸没与干细胞悬液中3飞个小时从而得到负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片。经体外实验表明rADSCs与壳聚糖修饰聚丙烯网片共培养24h后，如图3所示，在显微镜下观察，见细胞在壳聚糖铸膜液修饰的聚丙烯网片材料上生长。扫描电镜下可见细胞在壳聚糖挂膜支架上生长良好，呈三角形或是长梭形，分泌细胞基质。其中，前序步骤包括，
(1).壳聚糖挂膜聚丙烯网片的制备，其具体过程包括
a.清洁聚丙烯网，将普通的聚丙烯网片置于无水乙醇中浸泡，并采用去离子水冲洗多次后，置60°C的烘箱中烘干，从而得到洁净的聚丙烯网片。b.壳聚糖铸膜液制备，称取一定质量的壳聚糖，并溶解在广3%乙酸溶液中；之后向溶液中加入戊二醛和正庚烷；并在45飞0°C条件下交联反应0. 5^1. 5小时，静置一段时间后，制得壳聚糖质量含量为广5%的壳聚糖的铸膜液；
c.壳聚糖挂膜聚丙烯网片制备，将清洁的聚丙烯网片浸泡于壳聚糖铸膜液中Γ7π η后取出，晾干后，再次浸泡入所述铸膜液中Γ7π η，再次晾干；重复上述聚丙烯网片浸泡于所述铸膜液，与晾干过程，直至在所述聚丙烯网片上涂覆一层壳聚糖膜，从而制得壳聚糖挂膜聚丙烯网片。制得的壳聚糖挂膜聚丙烯网片先用5 10%的NaOH清洗后，再用去离子水反反复清洗。这样便得到了洁净的壳聚糖挂膜聚丙烯网片。经过上述步骤制得壳聚糖挂膜聚丙烯网片，如图2显微镜照片观察显示，经壳聚糖修饰的网孔呈半透明薄膜状，且膜上有许多孔径大小不一的间隙。未经处理的图1所示的普通聚丙烯网片，表面光洁，与之相比图2中的壳聚糖挂膜聚丙烯网片可见许多细小的空隙和裂缝，这说明壳聚糖膜很好的涂覆在聚丙烯网上，而壳聚糖可有效促进血管内皮细胞的生长，有利于细胞的增殖和组织的修复，而且具有良好的机械性能和可塑性。(2).兔脂肪干细胞(rADSCs)分离、培养及传代
a.按30mg/kg的麻醉剂量沿耳缘静脉注入3%异戊巴比妥钠麻醉。取兔腹股沟部皮下脂肪组织2. (Γ3. Og,并在无菌条件下将脂肪组织放入含IOmL体积分数为5%胎牛血清的低糖DMEM培养液的50mL离心管中；
b.之后用链霉素溶液及PBS反复间隔冲洗兔脂肪组织。并将脂肪组织置于直径IOOmm 培养皿中，充分粉碎。将粉碎后的脂肪组织置于50mL离心管中，加入0. 1%1型胶原酶溶液 20mL，在37°C恒温摇床消化60min后，2000 r/min离心10 min,除去上清液并获得高密度的细胞沉淀物；在细胞沉淀物中加入培养液(LG-DMEM，10%FBS，100mg/mL链霉素，100 U/mL青霉素)使细胞重悬，此即为脂肪干细胞。c.按IO6个/毫升的细胞密度接种于培养皿内，加入培养液至8mL。将接种好细胞的培养皿置于37°C、体积分数为5%C02中，并在100%饱和湿度的条件下，培养4 后首次换液(此时，倒置相差显微镜下观察见大量细胞贴壁和漂浮的血细胞)。用PBS反复轻轻冲洗去除漂浮的细胞，并加入DMEM和体积分数为10%胎牛血清培养液。隔天换液，细胞融合至80%传代。并且，传代前用少量PBS洗涤1次，加入0. 25%胰蛋白酶和0. 02%EDTA 2mL,此时观察可见大部分细胞胞质回缩、形态变圆，立即加入3mL含血清的DMEM培养液终止消化， 收集细胞悬液、计数，以2X IO4个/立方厘米的细胞密度接种于新的培养皿内。当细胞长至70% 80%融合时，再次传代。本发明优选用培养传代至第4代的rADSCs细胞负载于壳聚糖挂膜聚丙烯网片。下面我们通过具体实施例进一步详细阐明本发明，但本发明的保护范围并不局限于下述各个实施例。实施例1
称取1. 25g壳聚糖溶解在体积分数为的乙酸溶液中，再加入总固体重量5%的戊二醛和总固体重量50%的正庚烷，在磁力搅拌转速为230r/min、温度为45°C的条件下交联反应lh，静止脱泡一晚，得到壳聚糖质量分数分别为2. 5%的铸膜液。将聚丙烯网片 (Gynmesh ，美国强生医疗器械有限公司生产)置于无水乙醇中浸泡Mh，以去除网片表面的杂质。取出网片，用去离子水多次冲洗后置60°C的烘箱中烘干。铸膜液倒入培养皿中，将网片置于其中浸泡5min，取出挂起自然晾干，数小时后重复浸泡、晾干的过程，直至网片上均勻涂覆了壳聚糖膜。此时得到壳聚糖膜中含有醋酸，用质量分数为10%的NaOH稀溶液处理 30min，处理后的网片用去离子水多次冲洗直至洗液为中性为止。
rADSCs与壳聚糖修饰聚丙烯网片共培养取未挂膜的聚丙烯网片和壳聚糖挂膜聚丙烯网片各3张，制作成IOmmX IOmm大小。先用75%酒精浸泡消毒45min，再用PBS清洗 3飞次，换培养液浸泡，置37°C培养箱孵育M小时，确定有无细菌生长。收集预先准备好的第4代兔脂肪干细胞，调整悬液细胞密度为1 X IO5个/mL。用分子枪吸取100 μ L细胞悬液均勻滴加于每片聚丙烯网片材料上，置37°C培养箱中4小时后加培养液，以刚没过材料为且。经检测，本实施例制备的聚丙烯网片兔脂肪干细胞的接种密度为1. 2X103个/立方厘米。体外实验表明rADSCs与壳聚糖修饰聚丙烯网片共培养24h后，在显微镜下观察， 见细胞在壳聚糖铸膜液修饰的聚丙烯网片材料上生长。扫描电镜下可见细胞在壳聚糖挂膜支架上生长良好，呈三角形或是长梭形，分泌细胞基质。而兔ADSCs与未挂膜的聚丙烯网片共培养24h后，表面未见细胞生长。实施例2
称取1. 25g壳聚糖溶解在体积分数为的乙酸溶液中，再加入总固体重量5%的戊二醛和总固体重量50%的正庚烷，在磁力搅拌转速为230r/min、温度为45°C的条件下交联反应lh，静止脱泡一晚，得到壳聚糖质量分数分别为2. 5%的铸膜液。将聚丙烯网片 (Gynmesh ，美国强生医疗器械有限公司生产)置于无水乙醇中浸泡Mh，以去除网片表面的杂质。取出网片，用去离子水多次冲洗后置60°C的烘箱中烘干。铸膜液倒入培养皿中，将网片置于其中浸泡5min，取出挂起自然晾干，数小时后重复浸泡、晾干的过程，直至网片上均勻涂覆了壳聚糖膜。此时得到壳聚糖膜中含有醋酸，用质量分数为10%的NaOH稀溶液处理 30min，处理后的网片用去离子水多次冲洗直至洗液为中性为止。rADSCs与壳聚糖修饰聚丙烯网片共培养取未挂膜的聚丙烯网片和壳聚糖挂膜聚丙烯网片各3张，制作成IOmmX IOmm大小。先用75%酒精浸泡消毒45min，再用PBS清洗 3飞次，换培养液浸泡，置37°C培养箱孵育M小时，确定有无细菌生长。收集预先准备好的第4代兔脂肪干细胞，调整悬液细胞密度为1 X IO6个/mL。用分子枪吸取100 μ L细胞悬液均勻滴加于每片聚丙烯网片材料上，置37°C培养箱中4小时后加培养液，以刚没过材料为且。经检测，本实施例制备的聚丙烯网片兔脂肪干细胞的接种密度为1. IX IO4个/立方厘米。体外实验表明rADSCs与壳聚糖修饰聚丙烯网片共培养24h后，在显微镜下观察， 见细胞在壳聚糖铸膜液修饰的聚丙烯网片材料上生长。扫描电镜下可见细胞在壳聚糖挂膜支架上生长良好，呈三角形或是长梭形，分泌细胞基质。而兔ADSCs与未挂膜的聚丙烯网片共培养24h后，表面未见细胞生长。实施例3
称取1. 25g壳聚糖溶解在体积分数为H的乙酸溶液中，再加入总固体重量5%的戊二醛和总固体重量50%的正庚烷，在磁力搅拌转速为230r/min、温度为45°C的条件下交联反应lh，静止脱泡一晚，得到壳聚糖质量分数分别为2. 5%的铸膜液。将聚丙烯网片 (Gynmesh ，美国强生医疗器械有限公司生产)置于无水乙醇中浸泡Mh，以去除网片表面的杂质。取出网片，用去离子水多次冲洗后置60°C的烘箱中烘干。铸膜液倒入培养皿中，将网片置于其中浸泡5min，取出挂起自然晾干，数小时后重复浸泡、晾干的过程，直至网片上均勻涂覆了壳聚糖膜。此时得到壳聚糖膜中含有醋酸，用质量分数为10%的NaOH稀溶液处理 30min，处理后的网片用去离子水多次冲洗直至洗液为中性为止。rADSCs与壳聚糖修饰聚丙烯网片共培养取未挂膜的聚丙烯网片和壳聚糖挂膜聚丙烯网片各3张，制作成IOmmX IOmm大小。先用75%酒精浸泡消毒45min，再用PBS清洗 3飞次，换培养液浸泡，置37°C培养箱孵育M小时，确定有无细菌生长。收集预先准备好的第4代兔脂肪干细胞，调整悬液细胞密度为1 X IO7个/mL。用分子枪吸取100 μ L细胞悬液均勻滴加于每片聚丙烯网片材料上，置37°C培养箱中4小时后加培养液，以刚没过材料为且。经检测，本实施例制备的聚丙烯网片兔脂肪干细胞的接种密度为1 X IO5个/立方厘米。综上所述，本发明壳聚糖挂膜聚丙烯网片的制备方法制得的壳聚糖挂膜聚丙烯网片一方面利用聚丙烯补片孔隙率高、周围组织很好地契入生长的特点，可以增强修补部位的抗拉伸性能；另一方面利用壳聚糖的良好生物相容性，可以有效的降低植入部位聚丙烯网片侵蚀、暴露及组织粘连等并发症的发生。其特别适用于临床女性盆底重建外科，提高盆底重建手术聚丙烯材料的组织相容性，减少盆底重建术后并发症。而且本发明的制备方法过程简单易行，不涉及任何有毒有害试剂，对医用补片的后续使用无不利影响。而制得的壳聚糖挂膜聚丙烯网片，特别适用于临床女性盆底重建外科，提高盆底重建手术聚丙烯材料的组织相容性，减少盆底重建术后并发症。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
权利要求
1.一种负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片，其特征在于，包括作为支架的聚丙烯网片，所述聚丙烯网片表面涂覆有一层壳聚糖挂膜；且在壳聚糖挂膜的聚丙烯网片上负载有干细胞。
2.根据权利要求1所述的负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片，其特征在于，所述干细胞为兔脂肪干细胞。
3.根据权利要求1所述的负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片，其特征在于，在所述壳聚糖挂膜的聚丙烯网片上的所述兔脂肪干细胞的接种密度为IX IO3 IX IO5个/立方厘米。
4.一种权利要求1所述的负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片的制备方法，其特征在于，步骤如下步骤一，将洁净的聚丙烯网片浸泡于浓度为广5%的壳聚糖铸膜液中，直至在所述聚丙烯网片上涂覆一层壳聚糖膜，制得壳聚糖挂膜聚丙烯网片；步骤二，在3(T40°C下，将制得的壳聚糖挂膜聚丙烯网片浸泡于悬液细胞密度为 1 X IO5^l X IO7个/毫升的干细胞悬液中3飞个小时，从而得到负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤二中，采用干细胞悬液滴加在所述壳聚糖挂膜聚丙烯网片上，直至干细胞悬液刚好没过所述壳聚糖挂膜聚丙烯网片，并在3(T40°C下，浸泡3飞个小时。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述的干细胞为兔脂肪干细胞。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤一中，壳聚糖挂膜聚丙烯网片制备过程中，将洁净的聚丙烯网片浸泡于所述的铸膜液中Γ7π η后取出，晾干后，再次浸泡入所述铸膜液中Γ7π η，再次晾干；并重复所述聚丙烯网片浸泡于所述铸膜液，与晾干过程，直至在所述聚丙烯网片上涂覆一层壳聚糖膜，制得壳聚糖挂膜聚丙烯网片。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括所述壳聚糖铸膜液的制备过程，其包括以下步骤将一定量的壳聚糖溶解在乙酸溶液中；之后向溶液中加入占总固体原料质量的4 6%戊二醛和占总固体原料质量的45飞0%正庚烷；并在45飞0°C，搅拌条件下交联反应0. 5^1. 5小时，静置后，制得壳聚糖质量含量为广5%的壳聚糖的铸膜液。
9.一种权利要求1所述的负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片的应用，其特征在于， 所述负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片用于治疗女性盆底器官脱垂治疗的植入医用材料。
全文摘要
本发明提供了负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片及其制备方法和应用，其克服了现有的治疗女性盆底器官脱垂的医用材料的不足，在聚丙烯网片的表面涂覆一层壳聚糖挂膜的同时负载干细胞，这样在提高的材料机械强度和可塑性同时，增加了材料与植入后人体周边组织的生物相容性和组织相容性，从而抑制现有人体植入材料治疗女性盆底器官脱垂后出现的并发症。
文档编号A61L31/10GK102302807SQ20111027097
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者吴氢凯, 孙俊芬, 张 荣, 滕银成, 程慧 申请人:上海市第六人民医院