专利名称：油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物的制备方法
技术领域：
本发明属于中药制药领域，具体涉及油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物的制备方法。
背景技术：
国内外临床实践均证明花粉及其制剂是治疗前列腺疾病的理想药物。李永辉(李永辉.青菜花粉抗前列腺增生的药效物质基础研究.上海医药工业研究院硕士学位论文(D)，2009)针对文献报道有抗前列腺增生物活性的油菜蜂花粉、青菜花粉、玉米花粉、松花粉和向日葵花粉。研究结果显示:油菜蜂花粉具有很强的抗前列腺增生作用，确定了油菜蜂花粉抗前列腺增生的最佳有效成分为脂肪酸类和黄酮类。在药效筛选研究过程中，发现花粉二氧化碳超临界提取物具有良好的抗前列腺增生活性。并经GC-MS分析，显示脂肪酸类化合物是二氧化碳超临界提取物的主要化学成分，且以棕榈酸和亚麻酸及其衍生物含量最高。文献(朱刚，王建业，刘俊达，等.雌雄激素对前列腺基质细胞增殖的影响[J].中华泌尿外科杂志，2000，2U6):361-363.)报道亚麻酸具有抗5-还原酶和抗前列腺增生的活性，因此本研究对花粉中的活性成分亚麻酸和主要成分棕榈酸进行定量分析，为花粉药材和提取物的质量控制提供参考。中国发明专利申请:CN 101347490 A(杨义芳，李坤，李永辉:“一种油菜破壁花粉提取物及其提纯方法和应用”)公开了一种油菜破壁花粉的提纯方法及制备的提取物，该提纯方法包括将油菜破壁花粉采用超临界二氧化碳萃取的萃取物用大孔树脂富集，采用乙醇洗脱，收集洗脱液，且该方法提取的有效成分具有较佳的抗炎活性以及抗前列腺增生，抗前列腺纤维化等前列腺疾病的功效。中国发明专利申请:CN 101933947 A(杨义芳，杨必成，金丽丽:“一种在蜂花粉中提取脂肪类化合物的方法”)公开了一种采用超临界二氧化碳萃取法从蜂花粉中提取脂肪类化合物的方法，其显著提高了制得的提取物中的脂肪酸类化合物的含量。 按照专利CN 101933947 A公开，油菜蜂花粉水洗离心后的膏体需要干燥到含水量<质量百分比10%，才能进行超临界萃取，该申请中公开的真空干燥和喷雾干燥方法，经过试验发现小剂量的样品可以迅速干燥，但是试验量上升到千克级别后真空干燥样品呈流体状，试验时间延长3倍以上，干燥完后样品呈浅黄或黑色，色泽不均匀；喷雾干燥样品干燥不均，干燥完后花粉湿度大与百分之十，需反复操作，干燥时间大大延长。用真空干燥和喷雾干燥来干燥花粉水洗浸膏实验设计不周密使得实验误差加大，操作不具有可控性，不适于工业化生产。另一方面，油菜蜂花粉超临界提取物中主要成分为长链脂肪酸及其衍生物，但是也含有大量无效成分的化合物，不宜于直接开发作新药，按照专利CN 101347490 A公开的纯化长链脂肪酸及其衍生物的方法得到的化合物，经过药效学实验证明对前列腺疾病有很好的疗效，其中主要包括亚麻酰胺，亚麻酸甘油酯，亚麻酸乙酯，月桂酸，亚麻酸，10-甲氧基-1-十七烷烯_4，6- 二炔基-3，9- 二醇，鲽油酸，二十碳二酸，12-甲基-肉豆蘧酸甲酯，亚麻酸，油酸，漆树酸A，豆留醇阿魏酸酯等长链脂肪酸及其衍生物，但是因为长链脂肪酸及其衍生物的本身特性，油菜蜂花粉超临界提取物极其不容易挂柱上样，有效成分洗脱后因为极性更小的非有效成分还残留在柱子上，不容易洗脱下来，不能直接进行下一批生产，所以用大孔树脂富集有效成分不适合于工业化生产。
发明内容
鉴于上述现有技术中的缺陷，本发明提供一种新颖的油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物的制备方法，该方法不仅能使油菜蜂花粉水洗离心后浸膏干燥后易于存放、尽可能减少花粉易于引起过敏的过敏原，使有效药物的适用范围扩大，而且能将药物有效成分尽可能多的提取出来。本发明所述油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物的制备方法的可控性强，能耗低，污染小，成本低，利于工业化生产。本发明以油菜蜂花粉水洗离心后得到的浸膏为研究对象，提供一种油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物的制备方法，包括以下步骤:a)提供油菜蜂花粉水洗离心后的浸膏；b)用微波真空干燥上述浸膏；c)进行超临界萃取，得到超临界萃取物；d)用C1-C5的醇类或其水溶液提取上述超临界萃取物，得到油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物。根据本发明，a)步骤中提供油菜蜂花粉水洗离心后的浸膏是现有技术，可按照专利申请CN 101933947A公开的方法制备，具体步骤如下:称取粉碎后的油菜蜂花粉2000克置于桶内搅拌，加入蒸懼水12L,室温搅拌4小时后,置于离心机中以5000r/min离心20分 钟，倾去上清液，之后将离心浸膏干燥至含水量小于4%。本发明中，将油菜蜂花粉水洗离心后的膏体干燥到含水量<质量百分比10%，再进行超临界萃取，将萃取物进行进一步提纯得到有效成分。为了达到药品生产的标准，在整个生产过程中，需要对原料中的虫卵，菌类等微生物进行除虫杀菌。因为油菜蜂花粉水洗离心后的膏体需要干燥，可以考虑在这一步进行除虫杀菌。本发明使用选定微波真空干燥。在本发明上下文中，微波是指波长为Imm lm，频率为300 300000MHz的电磁波，其方向和大小随时间作周期性变化。我国常用的频率有915MHz和2450MHz。微波技术可与其它干燥技术，如热风干燥、真空干燥、冷冻干燥、远红外线干燥等技术相结合，形成了微波-热风干燥技术，微波-真空干燥技术，微波-冷冻干燥技术，微波-远红外干燥技术。微波-真空干燥技术是把微波干燥和真空干燥技术相结合，真空干燥由于有一定的真空度，水分扩散速率加快，物料是在较低的温度下进行脱水干燥的，较好地保持了物料的营养成分。微波可为真空干燥提供热源，克服了真空状态下常规热传导速率慢的缺点。微波-真空干燥技术适合热敏性物料的干燥处理，是干燥油菜蜂花粉水洗残渣的理想选择。另外，在生产工艺中引进微波真空干燥这一现代化生产工艺后，利用微波使蛋白质和生理活性物质发生变异和破坏，可以最大限度的减少过敏原。用微波真空干燥油菜粉花粉水洗残渣经实践证明不仅可以有效快速的使样品干燥，而且可以杀死样品中残留的虫卵有害微生物使样品得到净化，同时减少样品中的过敏原。根据本发明一个优选的实施方式，b)步骤中所述微波真空干燥的条件为:每次干燥水洗离心后浸膏投料为Ι-lOkg，优选8-10kg，干燥时间为1-4小时，干燥温度为40°C _70°C，真空度为-0.05MPa—0.1MPa,干燥微波功率为1800MHZ-2450MHZ，排水量50% -60%。根据本发明，c)步骤中的超临界萃取也是现有技术，该步骤可根据专利申请CN101933947 A公开的方法制备，具体方法是:将b)步骤所得的微波真空干燥后的油菜蜂花粉粉碎并过60目筛后投入到IOL的萃取斧中，对萃取釜、分离釜1、分离釜II分别加热，并启动制冷剂制冷，控制萃取温度分别为50°C，萃取压力为35MPa，二氧化碳流量20L/h，分离I温度45°C，压力8MPa ;分离II温度35°C，压力4_6MPa，萃取时间为90min，在分离釜中得到超临界提取物。根据本发明一个优选的实施方式，d)步骤具体包括以下步骤:将c)步骤所得的超临界萃取物溶于C1-C5的醇类或其水溶液，加热至20-100°C，搅拌0.5-10h，冷却到15-30°C，优选20-25°C进行抽滤，取滤液，将滤液在30-100°C下浓缩得到黄色油状流体，即油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物。根据本发明一个优选的实施方式，d)步骤中，C1-C5的醇类的体积浓度为1% -100%，优选 55% -80%，更优选 70% -80%，最优选 80%。根据本发明一个优选的实施方式，d)步骤中，C1-C5的醇类的体积与超临界萃取物的质量比为 15ml/g-250ml/g,优选 20ml/g-100ml/g,最优选 50ml/g。根据本发明一个优选的实施方式，所述C1-C5的醇类为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其混合物。但是乙醇与其他几种溶剂相比低毒，防腐，污染小，价廉等特性更适于本工艺应用于工业化大生产，因此根据本发明一个优选的实施方式，所述C1-C5的醇类为乙醇。本发明方法得到的油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物通过采用碘化铋钾试剂，
0.1%的溴酚兰的70%乙醇溶液和油斑-25%的磷钥酸乙醇溶液预实验结果显示含有生物碱及有机酸，经GC-MS验证为长链脂肪酸及其衍生物。进一步，根据上述方法得到的油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物中的有效成分通过LC-MS定性检测为:10-甲氧基-1-十七烷烯_4，6-二炔基_3，9-二醇，鲦油酸，二十碳二酸，12甲基-肉豆蘧酸甲酯，亚麻酸，油酸，漆树酸A和豆留醇阿魏酸酯。本发明方法使得提取物中含有的治疗前列腺疾病的有效成分的含量增高，从现有技术工艺的百分之二十多提高到百分之四十五以上；而且生产效率高易于产业化生产，污染小，明显优于旧工艺及已有专利申请中公开的方法。
图1是油菜蜂花粉的照片；图2是实施例1中经微波真空干燥后的油菜蜂花粉照片；图3是油菜蜂花粉按照实施例1纯化方法得到的高效液相谱图；图4是油菜蜂花粉按照CN 101347490 A公开的纯化方法得到的高效液相谱图；图5a到5e分别是实施例1获得的油菜蜂花粉超临界提取物按照不同纯化条件获得的高效液相谱图；图6是实施例5-2 、实施例5-4和实施例2所得最终提取物的UV205nm色谱图，其中第一图为空白结果，第二图为实施例2所得最终提取物的结果，第三图为实施例5-2所得最终提取物的结果，第四图为实施例5-4所得最终提取物的结果；图7是实施例2所得最终提取物样品正模式的ECCs ；图8是实施例2所得最终提取物样品负模式的ECCs ；图9是实施例5-2所得最终提取物样品正模式的ECCs ；图10是实施例5-2所得最终提取物样品负模式的ECCs ；图11是实施例5-4所得最终提取物样品正模式的ECCs ；图12是实施例5-4所得最终提取物样品负模式的ECCs。
具体实施例方式为了更好地理解本发明，通过以下实施例来说明:实施例1:提供油菜蜂花粉水洗离心后的浸膏称取粉碎后的油菜蜂花粉2000克置于桶内搅拌，加入蒸馏水12L，室温搅拌4小时后，置于离心机中以5000r/min离心20分钟，倾去上清液，之后将离心浸膏干燥至含水量小于4%。油菜蜂花粉水洗离心后的浸膏用微波干燥:称取粉碎后的油菜蜂花粉(购自安徽宣城百康蜂业)7kg置于搅拌桶内，加蒸馏水28L，室温搅拌4小时后，置于离心机中以5000r/min离心20分钟，倾去上清液，制得浸膏9kg，将浸膏9kg放置微波干燥器中(贵州贵阳新奇微波工业有限责任公司销售的WBZ-10智能化静态微波真空干燥机)，干燥温度60°C，真空度-0.082MPa, 200min后干燥完成，微波功率2400MHz，耗电量6.25千瓦，排水56.89 %，干燥样品重3.88kg，干燥前后样品颜色基本无改变，参见附图1。微波真空干燥后的油菜蜂花粉的超临界萃取:将上述经微波真空干燥后的油菜蜂花粉3.88kg粉碎并过60目筛后投入到IOL的萃取釜中，对萃取釜、分离釜1、分离釜II分别加热，并启动制冷剂制冷，控制萃取温度分别为50°C，萃取压力为35MPa，二氧化碳流量20L/h，分离I温度45°C，压力8MPa ;分离II温度35°C，压力4-6MPa，萃取时间为90min，在分离釜中得到超临界提取物0.776kg，萃取釜中剩余3.104kg超临界残渣，超临界提取物收率为20%。超临界萃取物的纯化:取2g超临界提取物，加入80%的乙醇溶液100ml，提取温度为40°C，提取时间为lh，密闭条件下，边加热边搅拌，实验结束均冷却到22°C进行抽滤。滤液在60°C浓缩成浸膏称重，并记录，本实施例得到的有效成分与投药量比为收率达40%。实施例2油菜蜂花粉水洗离心后的浸膏的获得步骤同实施例1。油菜蜂花粉水洗离心后的浸膏用微波干燥:称取粉碎后的油菜蜂花粉(购自安徽宣城百康蜂业)7kg置于搅拌桶内，加蒸馏水28L，室温搅拌4小时后，置于离心机中以5000r/min离心20分钟，倾去上清液，制得浸膏9kg，将浸膏8.654kg放置微波 干燥器中(贵州贵阳新奇微波工业有限责任公司销售的WBZ-1O智能化静态微波真空干燥机)，干燥温度45°C，真空度-0.072MPa,干燥中途在物料起块时，将物料中途捣碎，190min后干燥完成，微波功率2400MHz，耗电量5.8千瓦，排水量57.89%,干燥样品重3.635kg,干燥前后样品颜色基本无改变。微波真空干燥后的油菜蜂花粉的超临界萃取步骤同实施例1。超临界萃取物的纯化:取2g超临界提取物，加入无水甲醇100ml，提取温度为40°C，提取时间为lh，密闭条件下，边加热边搅拌，实验结束均冷却到22°C进行抽滤。滤液在60°C浓缩成浸膏称重，并记录，本实施例得到的有效成分与投药量比为收率达45%。尽管甲醇的提取效果要比乙醇好，但是在药物生产中使用甲醇，会因为甲醇的毒副作用使生产工艺变得复杂，生产成本增加，所以更优选使用乙醇。实施例3油菜蜂花粉水洗离心后的浸膏的获得步骤同实施例1。油菜蜂花粉水洗离心后的浸膏用微波干燥:称取粉碎后的油菜蜂花粉(购自安徽宣城百康蜂业)12kg置于搅拌桶内，加蒸馏水48L，室温搅拌4小时后，置于离心机中以5000r/min离心20分钟，倾去上清液，制得浸膏12kg，将浸膏10.0kg放置微波干燥器中(贵州贵阳新奇微波工业有限责任公司销售的WBZ-10智能化静态微波真空干燥机)，干燥温度55°C，真空度-0.089MPa,干燥中途在物料起块时，将物料中途捣碎，2IOmin后干燥完成，微波功率2450MHz，耗电量6.8千瓦，排水量57.14%,干燥样品重4.286kg,干燥前后样品颜色基本无改变。微波真空干燥后 的油菜蜂花粉的超临界萃取步骤同实施例1。超临界萃取物的纯化: 取2.5g超临界提取物，加入60%的乙醇溶液IOOml，提取温度为60°C，提取时间为lh，密闭条件下，边加热边搅拌，实验结束均冷却到22°C进行抽滤。滤液在60°C浓缩成浸膏称重，并记录，本实施例得到的有效成分与投药量比为收率达24.31%。实施例4油菜蜂花粉水洗离心后的浸膏的获得步骤同实施例1。油菜蜂花粉水洗离心后的浸膏用微波干燥:称取粉碎后的油菜蜂花粉(购自安徽宣城百康蜂业)7kg置于搅拌桶内，加蒸馏水28L，室温搅拌4小时后，置于离心机中以5000r/min离心20分钟，倾去上清液，制得浸膏9kg，将浸膏3.0kg放置微波干燥器中(贵州贵阳新奇微波工业有限责任公司销售的WBZ-10智能化静态微波真空干燥机)，干燥温度40°C，真空度-0.065MPa,干燥中途在物料起块时，将物料中途捣碎，IOOmin后干燥完成，微波功率2450MHz，耗电量1.8千瓦，排水量55.36%,干燥样品重1.339kg,干燥前后样品颜色基本无改变。微波真空干燥后的油菜蜂花粉的超临界萃取步骤同实施例1。超临界萃取物的纯化:取2.5g超临界提取物，加入70%的乙醇溶液200ml，提取温度为60°C，提取时间为
1.5h，密闭条件下，边加热边搅拌，实验结束均冷却到22°C进行抽滤。滤液在60°C浓缩成浸膏称重，并记录，本实施例得到的有效成分与投药量比为收率达24.49%。从该实验看出提取时间越长得到的有效成分的收率不一定越高。
实施例5:不同纯化条件获得的有效成分收率对比取不同质量的实施例1获得的超临界提取物按照表I所列的纯化条件进行实验。将5-1到5-4得到的提取物浸膏溶于甲醇，与25ml容量瓶定容，过膜，进高效液相进行检测。5-5得到的提取物浸膏溶于甲醇，与IOOml容量瓶定容，过膜，进高效液相进行检测。仪器；安捷伦1260HPLC色谱柱；YMCJ’ sphere 0DS-H80 (4.6mmX 250mm, 4 μ m)；流动相；乙腈-水梯度洗脱(Omin:90: 10, IOmin:100: O, 20min:100: O)流动相流速；lml/min柱温箱温度；35°C检测波长；205nm_230nm进样量；20μ I。表1:
权利要求
1.菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物的制备方法，包括以下步骤: a)提供油菜蜂花粉水洗离心后的浸膏； b)用微波真空干燥上述浸膏； c)进行超临界萃取，得到超临界萃取物； d)用C1-C5的醇类或其水溶液提取上述超临界萃取物，得到油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，b)步骤中所述微波真空干燥的条件为:其中浸膏投料为Ι-lOkg，干燥时间为1-4小时，干燥温度为40°C-70°C，真空度为-0.05MPa—0.1MPa，干燥微波功率为 1800MHz_2450MHz，排水量 50% -60%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，d)步骤中，将超临界萃取物溶于C1-C5的醇类或其水溶液，加热至20-100°C，搅拌0.5-10h，冷却到15_30°C进行抽滤，取滤液，将滤液在30-100°C下浓缩得到黄色油状流体，即油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述抽滤温度为20-25°C。
5.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，d)步骤中，C1-C5的醇类的浓度为I % -100%，优选55% -80%,更优选70% -80%,最优选80%。
6.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，d)步骤中，C1-C5的醇类的体积与超临界萃取物的质量比为15ml/g-250ml/g, 20ml/g-100ml/g,最优选50ml/g。
7.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述C1-C5的醇类为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其混合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述C1-C5的醇类为乙醇。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物选自10-甲氧基-1-十七烷烯-4，6-二炔基-3，9-二醇、鲦油酸、二十碳二酸、12甲基-肉豆蘧酸甲酯、亚麻酸、油酸、漆树酸A或豆留醇阿魏酸酯。
全文摘要
本发明公开了一种油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物的制备方法，包括以下步骤a)提供油菜蜂花粉水洗离心后的浸膏；b)用微波真空干燥上述浸膏；c)进行超临界萃取，得到超临界萃取物；d)用C1-C5的醇类或其水溶液提取上述超临界萃取物，得到油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物。本发明所述油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物的制备方法的可控性强，能耗低，污染小，成本低，利于工业化生产。
文档编号A61K31/575GK103083328SQ201110346448
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者杨义芳, 韦洁, 杨必成 申请人:上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院