专利名称：表没食子酸儿茶素没食子酸酯的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及表没食子酸儿茶素没食子酸酯的用途，尤其涉及在制药领域中的用途。
背景技术：
茶叶是世界上最受欢迎的饮料之一，具有抗氧化、抗衰老、抗菌抗病毒、抗肿瘤、降低某些疾病发病率等多种功效，尤其是近年来的研究表明，饮茶在降血糖、降血脂、防治肿瘤和艾滋病等方面有确切的功效，使茶叶的保健功能引起了人们的广泛关注。但其具体的作用机制一直被认为很复杂而并不清晰，作用靶点一直不明确，限制了茶在保健、药物开发上的应用。茶叶的成分很复杂，茶叶中已分离鉴定的化合物有500余种，其中有机化合物有 450余种，无机物营养素也有几十种。茶叶的水提取物中，J L茶素占25 % 40 %，表没食子酸儿茶素没食子酸酯(*其缩写词为EGCG，为便于表述，以下采用缩写)占儿茶素的60%。 EGCG被认为是茶叶鲜叶和绿茶中的主要活性成份。国内外对茶叶功效的研究也集中对EGCG的研究上。经过多年研究，人们发现EGCG 对细胞、动物具有明显的生物效应，尤其是对肿瘤细胞和荷瘤小鼠具有明确的抗肿瘤效应。 人们也试图阐明EGCG引发生物学效应的分子机制，阐述了 EGCG引起的细胞内信号传递如 akt、MAPK, AMPK等变化和机体的动态变化，日本学者于2003年发现EGCG可以与细胞表面分子量为67千道儿顿的非整合素受体(67LR)特异性结合介导一些细胞生理生化反应。但 67LR自身与细胞内的生化联系尚未阐明，使它介导的EGCG的生理生化反应不能与机体的生物学反应直接联系，因而限制了 EGCG在药物开发上的应用。NOTCH是一类定位在细胞膜上的跨膜受体，广泛存在于所有已知动物细胞中。 NOTCH介导细胞与细胞间的局部信号传递及相应的信号级联反应。现在认为NOTCH是细胞间短距离相互作用的主要机制。NOTCH基因最早发现于果蝇，部分功能缺失导致翅缘缺刻。 NOTCH信号通路是进化中高度保守的信号转导通路，其调控细胞增殖、分化和凋亡的功能涉及几乎所有组织和器官。NOTCH对于神经系统的分化和形成具有重要作用。NOTCH在几乎所有人类和实验动物肿瘤组织和细胞中表达异常，多数情况下肿瘤组织的NOTCH异常活化， 人类的急性淋巴细胞白血病细胞更是NOTCH信号依赖性的，单纯抑制NOTCH信号就可以使该类白血病细胞凋亡，进而治愈该型白血病。NOTCH抑制剂已经用于该型白血病的临床治疗。脑胶质瘤对NOTCH信号的抑制也极为敏感。迄今为止，尚未发现天然的NOTCH抑制剂。但由于NOTCH信号对于机体的生长极为重要，人工开发的NOTCH信号传递抑制剂对于肠道等细胞更新较快的器官具有很强的毒性，限制了它们的临床应用。人类共有四种NOTCH蛋白，分别成为N0TCH1、N0TCH2、N0TCH3、 N0TCH4。人类NOTCH有5种专一配体，分别是JAG1、JAG2、D111、D113和D114。不同细胞上 NOTCH受体和配体的结合能够导致NOTCH的活化。同一细胞上配体和NOTCH的结合则抑制 NOTCH的活化。活化的NOTCH在细胞核内调节相关基因的转录，是决定细胞命运的重要因素。NOTCH特别在神经系统的发育过程中起着重要的作用。NOTCH可以改变细胞对外界信号发生反应的方式和后果。几乎所有肿瘤细胞的NOTCH表达都发生了变化，它们对NOTCH 的反应机制也可能有显著的改变。特别是一些淋巴瘤病人体内的瘤细胞，其NOTCH高度表达且活化，仅仅抑制NOTCH的活化就可以使细胞进入凋亡进程，使瘤细胞死亡。NOTCH以分子量为300KD的前体形式合成，NOTCH蛋白翻译结束后被运输到细胞内的高尔基体内进行处理，在高尔基体内NOTCH被一种称为furin的蛋白酶切割，形成胞外段(约180kd)和膜结合区域(即所谓的NTM，约80-120kd)，它们形成一种稳定结合的异源二聚体，经过一系列的修饰后运送到细胞膜上，成为成熟的NOTCH。成熟的NOTCH与其配体结合后传递调控细胞的信号。NOTCH信号途径的抑制剂——γ分泌酶抑制剂已经应用于临床治疗急性T细胞淋巴瘤(TALL)。Nature Medicine 2009年发表了人工合成的NOTCH抑制剂，对小鼠白血病模型上的白血病有良好的抑制效果。NOTCH的作用不仅仅在于肿瘤的治疗上，由于它参与生命的各个进程，它在生命过程的许多方面都有着重要的作用。NOTCH的抑制剂和/或调理剂在人类疾病中的治疗和预防中可以起到更多的作用。
发明内容
本发明是基于下述发现而完成的，即本发明通过深入地研究发现EGCG对人类细胞的很多生物学效应与67LR并没有直接的关系，本发明对此取得了重要的突破，发现可能存在着除67LR之外的EGCG作用靶点和作用机制。本发明首次揭示了 EGCG作用于细胞的明确的分子靶点，即动物细胞膜表面的 NOTCH受体，EGCG通过抑制NOTCH的信号调节细胞、机体的生命活动。本发明通过试验证实1. EGCG在短时间内使细胞表面的NOTCH蛋白迅速降解。在加入EGCG后，0 60 分钟内，EGCG与细胞膜表面的N0TCH1、2、3、4受体发生特异结合，导致细胞膜表面NOTCH的迅速减少。2. EGCG抑制了 NOTCH的成熟过程，使细胞膜表面的NOTCH受体持续处于相对不足状态。表现为肿瘤细胞内NOTCH前体的大量增加。N0TCH4. EGCG对NOTCH信号的抑制作用在EGCG去除后可以恢复。3. EGCG对NOTCH的抑制作用可以用来治疗肿瘤，尤其是急性淋巴瘤、脑胶质瘤，2 型糖尿病等疾病。在此基础上，本发明的目的在于提供所述的EGCG的新用途，即提供EGCG在制药及关联领域中的用途。同时，还提供EGCG以NOTCH为作用靶点的具体应用对象和应用领域。实际上，本发明涉及EGCG在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。涉及以EGCG为主体化合物的修饰化合物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用，其中，所述的修饰化合物具有同样或类似的与NOTCH发生作用的特征。涉及以EGCG为主体化合物的修饰化合物在制备治疗或预防与NOTCH异常相关联疾病的药物中的应用，所述疾病的特征为NOTCH表达异常或突变。同时，本发明还涉及以EGCG为主体化合物的修饰化合物在制备治疗或预防与 NOTCH异常相关联疾病的食品或保健品或日用品中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。A.本发明所述的EGCG是一种天然化合物，主要存在于茶叶及其提取物中，结构如图2所示，名称是表没食子儿茶素没食子酸酯((J-Epigallocatechin gallate)。本发明的研究表明，EGCG在细胞上的作用靶点是位于真核生物细胞膜表面的 NOTCH蛋白受体，这些受体包括人和哺乳动物细胞表面的NOTCHl、N0TCH2、N0TCH3、N0TCH4， 昆虫细胞表面的N蛋白，线虫细胞表面的Linl2和GLPl蛋白。B.深入的研究还表明，以所述化合物为主体化合物的修饰后化合物，它们具有同样或类似的与NOTCH发生作用的特征，用来治疗肿瘤等疾病或用来作为预防性制剂。修饰方法包括但不限于甲基化、磷酸化、硫酸化、乙酰化、聚合体、形成络合物或螯合物等等；增加或减少某一功能基团不改变其与NOTCH相互作用的性质。C.所述的化合物及其修饰后化合物，其治疗肿瘤范围包括但不限于淋巴瘤、肝脏肿瘤、脑胶质瘤、消化道肿瘤。其可以用于其他与NOTCH异常相关联疾病的治疗。这些疾病的特征为NOTCH表达异常或突变。D.以所述的化合物为主体成份或重要成份的原料药物及其制剂。其特征在于含有EGCG或其修饰后化合物对NOTCH的作用及其可能效果。制剂范围包括但不限于片剂、注射剂、静脉注射剂、喷雾剂、洗剂、吸入剂、颗粒剂、分散剂、丸剂、膏剂、贴剂。E.含有所述化合物成分的食品及饮用品。其特征在于EGCG或其修饰后化合物对 NOTCH的作用及其可能效果。食品及饮用品的范围包括但不限于常规食品、饮用品、保健食品、保健饮用品、具有保健功能的食品、具有保健功能的饮用品。F.含有所述化合物成分的化妆品、沐浴用品等日常家用化学产品。其特征在于 EGCG或其修饰后化合物对NOTCH的作用及其可能效果。日用家化产品的范围包括但不限于肥皂、洗衣粉、面膜、洗发用品、各种化妆品、沐浴露等。G.含有所述化合物成分的家用杀虫剂、农药、化学肥料。其特征在于EGCG或其修饰后化合物对NOTCH的作用及其可能效果。农药、杀虫剂的范围包括但不限于家用喷雾剂、 洗剂，农田用乳剂、油剂、水剂、混悬剂、粉剂、拌种剂、各种农用化肥等。H.本发明提供了所述的EGCG的制备方法，该方法采用下述步骤用普洱生茶或普通绿茶制备茶汤，经过乙酸乙酯萃取、柱层析分离得到高纯度的 EGCG0与现有技术相比，本发明具有以下显著的进步本发明首次公开了 EGCG作为肿瘤治疗药物的作用靶点及其适应症。该药物是从经过数千年食用证实是安全的茶叶中提取的。该药物具有明确的化学结构，该药物及其制剂在细胞上的作用靶点是人和动物的NOTCH蛋白。该药物及其制剂的作用机理是抑制 NOTCH信号的异常活化。该药物适应于NOTCH信号异常的肿瘤的治疗。鉴于几乎所有肿瘤细胞出现NOTCH信号异常，且该药物及其制剂具有较高的安全剂量，使得该药物及其制剂具有广泛且明确的市场应用前景。
图1是EGCG能够降低细胞膜上成熟N0TCH(以N0TCH2为例)的量。增加未成熟NOTCH前体的量。0是未加入EGCG时细胞内N0TCH2的状况，1_6是加入EGCG不同时间后细胞内N0TCH2的状况。图2是EGCG的化学结构式。图3是EGCG能降低人外周血细胞膜上成熟NOTCH(以N0TCH2为例)的量。0是未加入EGCG时细胞内的状况。1、2、3是加入EGCG后不同时间时细胞内的状况。图4是NOTCH靶基因的相对表达量的状态图。使用EGCG处理后，NOTCH靶基因的表达量相对于未处理组有明显的降低。图5是EGCG对人外周血细胞膜上NOTCH(以N0TCH2为例)的效应在去除EGCG后可以逆转。1、是未加入EGCG时细胞内N0TCH2的状况；2是加入EGCG后细胞内N0TCH2的状况；3是将EGCG移除30分钟后细胞内N0TCH2的状况。图6是EGCG能够有效地促进人急性淋巴瘤细胞系Jurkat细胞死亡的效果图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细的说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限制本发明的保护范围。实施例1——EGCG对Jurkat细胞膜表面NOTCH受体的作用Jurkat是能够传代培养的人急性淋巴瘤(白血病的一种)细胞系。使用含10%胎牛血清(Hyclone)、1%青链霉素的RPMI 1640培养基(GIBCO)培养Jurkat细胞。将EGCG 用无血清RPMI 1640培养基溶解，浓度为20mg/ml。将传代的Jurkat细胞用无血清培养基处理M小时后，分别加入EGCG至不同的终浓度，对照加入等体积的无血清培养基，每个浓度使用2千万(2*107)个细胞进行实验。处理30分钟。然后1200转/分离心5分钟收集细胞，使用全细胞裂解液裂解细胞，收集细胞全蛋白，测定蛋白浓度。使用10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离细胞裂解液， 每个处理的裂解液上样量60ug蛋白质。100伏恒压电泳90分钟。将电泳分离完毕的蛋白通过外加电场转移到硝酸纤维素膜上。150毫安恒流转移150分钟。在室温用5%牛血清白蛋白封闭蛋白转移完毕的硝酸纤维素膜60分钟后，分别使用兔抗人N0TCH1-4抗体(Cell Signal Technology)、小鼠抗人泛素抗体与封闭结束的硝酸纤维素膜反应120分钟，然后用磷酸盐缓冲的生理盐水洗涤硝酸纤维素膜5次，每次5分钟。洗涤结束后，用马过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(HRP Conjugated goat anti-rabbit IgG)与硝酸纤维素膜反应60分钟。反应结束后用磷酸盐缓冲的生理盐水洗涤硝酸纤维素膜5次，每次5分钟。洗涤结束后，参照说明书用ECL化学发光试剂盒处理(GE Healthcare)。在暗室用X光底片曝光。结果如图所示。EGCG处理后30分钟内，细胞膜上NOTCH蛋白的量与没有进行任何处理的对照样品相比显著减少，同时NOTCH前体的量大量增加。结果见图1。实施例2取新鲜分离的浓缩人外周血淋巴细胞(PBMC) —个单位。用无血清MI1640培养基稀释4倍后，用人淋巴细胞分离液分离血浆、白细胞和红细胞。具体做法是在一次性使用的50毫升无菌无热原离心管中加入20毫升人淋巴细胞分离液，小心地在人淋巴细胞分离液的液面上加入稀释后的浓缩人外周血淋巴细胞25毫升，避免两液体的界面发生扰动以形成清晰的界面。在室温用低速离心机以2200转每分钟离心25分钟(约850g)。不使用离心机的刹车功能使之自然缓慢减速至停止。用无菌无热原的一次性吸管将上层淡黄色血浆吸出，做好标记，用做白细胞培养时使用的自体血浆。将两层液面间有一定浑浊的白细胞中间层吸出放到一新的50毫升离心管中，加入20毫升RPMI 1640无血清培养基，与白细胞混勻后1500转每分钟离心5分钟，弃上清。管底部的沉淀是分离的人外周血淋巴细胞，重复用20毫升无血清RPMI1640洗涤细胞沉淀一次。然后加入含5%自体血浆和青链霉素的RPMI 1640培养基，用自动细胞计数器计数细胞浓度。每个处理样品使用1千万个人外周血白细胞。用含EGCG(EGCG使用浓度为 0. l-100ug/ml)和5%自体血清的RPMI 1640培养基培养细胞30分钟后，离心收集细胞。用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞，蛋白定量后用于免疫印迹检测。 具体方法参照实施例1。结果见图3。结果显示EGCG使人外周血细胞细胞膜表面的成熟NOTCH的量大幅度降低。实施例3用含EGCG(EGCG使用浓度为0. Ι-lOOug/ml)和5%自体血清的RPMI1640培养基培养细胞5-120分钟后，离心收集细胞。使用RNA提取试剂盒Oligernnc.)提取总RNA，用逆转录试剂盒(TAKARA Inc.)转录成为互补DNA (cDNA)。使用序列表中所列的引物序列进行 Real-time PCR检测NOTCH靶基因的表达情况。表现为notch靶基因的表达抑制。结果见图4。结果显示EGCG能够使NOTCH的靶基因表达量降低，提示NOTCH信号受到了抑制。实施例4用含EGCG(EGCG使用浓度为0. Ι-lOOug/ml)和0-10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养Jurkat细胞30分钟后，将细胞以1200转/分种离心5分钟收集细胞，弃去含EGCG 培养液，用磷酸盐缓冲的生理盐水重悬细胞后再次将细胞以1200转/分种离心5分钟以洗去残留的EGCG。然后用不含EGCG的RPMI1640培养基在37度培养细胞30分钟。以1200 转/分钟离心收集细胞。同时做各种对照。用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞，蛋白定量后用于免疫印迹检测。具体方法参照实施例1。结果见图5。结果显示EGCG使Jurkat细胞表面的成熟NOTCH大幅度减少。移除EGCG30分钟后，细胞膜表面的成熟NOTCH的量得到了恢复。实施例5将JURKAT细胞按照实施例1的方法培养，加入一定量的EGCG，EGCG的浓度为 0-200微克/毫升。EGCG处理一定时间后测定细胞的存活情况。使用的方法为MTT法。结果如图6所示，EGCG促进了 Jurkat细胞的死亡。实施例6将普洱生茶或绿茶以重量比为1 10的75°C 85°C的蒸馏水浸泡，加热煮沸30 分钟，除去茶渣。茶汤用柠檬酸调节PH = 4. 0，加入重量三倍于茶汤的乙酸乙酯将混合液振荡摇勻静置10 25分钟，待溶液明显分层此时会看到上层的溶液为棕色即为第一次萃取的酯层，下层为棕黑色即为第一次萃取的水层然后再次萃取，得到萃取的酯层用孔径0. 45微米的滤膜过滤酯层滤液作为层析原料。实施例7用实施例6得到的乙酸乙酯萃取酯层为原料进行EGCG的色谱纯化。使用色谱柱0DS填料，直径30-40微米，色谱柱规格为2. 8)(50Cm，检测器为紫外检测器，检测波长= 278nm;流动相V(乙醇)V(水)=15 85，流速20ml/min进样体积15ml。在线检测制备柱的色谱流出曲线根据出峰的情况收集EGCG。收集41-70min的洗脱物作为产品馏份收集在一起。经冷冻干燥后得白色粉末，即为所需的高纯度EGCG。
权利要求
1.EGCG在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
2.以EGCG为主体化合物的修饰化合物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用，其中， 所述的修饰化合物具有同样或类似的与NOTCH发生作用的特征。
3.以EGCG为主体化合物的修饰化合物在制备治疗或预防与NOTCH异常相关联疾病的药物中的应用，所述疾病的特征为NOTCH表达异常或突变。
4.以EGCG为主体化合物的修饰化合物在制备治疗或预防与NOTCH异常相关联疾病的食品或保健品或日用品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种肿瘤治疗药物的作用靶点及其适应症。该药物是从经过数千年食用证实是安全的茶叶中提取的。该药物具有明确的化学结构，就是表没食子酸儿茶素没食子酸酯，英文名称为(-)-Epigallocatechin gallate，简写为EGCG。本发明的研究表明，所述药物及其制剂在细胞上的作用靶点是人或动物的NOTCH蛋白。该药物及其制剂的作用机理是抑制NOTCH信号的异常活化。该药物适应于NOTCH信号异常的肿瘤的治疗。鉴于几乎所有肿瘤细胞均出现NOTCH信号异常，且该药物及其制剂具有较高的安全剂量，使得该药物及其制剂具有广泛且明确的市场应用前景。
文档编号A61K31/353GK102370634SQ20111035543
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者严亮, 于海双, 向泽敏, 宋爽, 师思, 方崇业, 李冬青, 李春磊, 杜晓翠, 王宣军, 王涵, 王腾飞, 盛军, 郝淑美, 陆洋, 黄业伟 申请人:云南农业大学