专利名称：Tt1基因在制备治疗肿瘤的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于肿瘤药物制备领域，特别涉及一种植物源抗逆基因TTl的用途。
背景技术：
TTl基因是从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中分离得到的一种基因，现有技术仅公开了该基因具有提高植物抗逆性的用途(见专利申请号200810045667.8)。癌细胞是一种变异的细胞，是产生癌症的病源，癌细胞与正常细胞不同，有无限生长、转化和转移三大特点，因此难以消灭。现阶段，治疗癌症的方法主要有手术疗法、化学疗法、放射疗法。化学疗法简称“化疗”，即用化学药物治疗癌症，化疗药物能在癌细胞生长繁殖的不同环节抑制或杀死癌细胞，达到治疗目的。但现有的化学药物均有不同程度的毒副作用，它们在杀伤癌细胞的同时对正常人体细胞也有损害，尤其是杀伤人体中生长发育旺盛的血液、淋巴组织细胞等，而这些细胞与组织是人体重要的免疫防御系统，破坏了人体的免疫系统，癌症就可能迅速发展，造成严重后果。因此，进行化疗时往往出现不同程度的副作用，如恶心、呕吐、脱发等。许多资料证明，临床肿瘤化疗中化疗剂量强度与治疗效果明显相关，如果提高药物的剂量强度和按计划进行甚至缩短间隔时间，将显著提高治疗的有效率及治愈率，这已在乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤等的治疗中得到证实。但剂量强度过大，药物的毒副作用越大，越容易对正常人体细胞造成损害；而剂量强度不够不仅不能杀灭癌细胞，相反会造成癌细胞对抗癌药物摄取减少或对损伤细胞的修补能力增加等而产生抗药性。因此，如何权衡化疗药物剂量和治疗效果，已成为临床肿瘤化疗所关注的重点问题。随着分子生物学、分子遗传学、免疫学等相关学科的发展和渗透，基因治疗特别是肿瘤基因治疗技术迅速发展。所谓基因治疗是指在基因水平上治疗疾病的方法。其手段包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活、引入新基因等。我国是世界上较早开展基因治疗基础研究和临床试验的国家之一。经过多年的发展，在基因导入和基因治疗临床试验等方面都取得了很大进展。 尤其是肿瘤基因治疗临床试验方面，我国目前已有重组腺病毒(p53)抗癌注射液市场化，疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因治疗恶性脑胶质瘤、以树突状细胞为基础的肿瘤细胞治疗与基因治疗、IL-2基因工程胃癌细胞等等。然而，癌症的发病机制是极其复杂的，基因治疗技术中的许多环节和问题仍然困扰着科学家，现阶段的基因治疗仅是对传统的手术治疗、化疗和放疗的补充。因此，作为当前临床肿瘤研究的新热点，寻找更多有利于肿瘤基因治疗的基因具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于证明TTl基因及其所表达的多肽可抑制人或动物细胞的生长，同时增强人或动物细胞对化疗药物的敏感性，以便开发出一类配合化疗药物治疗肿瘤的新型药物。本发明所述TTl基因已在Genbank注册,注册号⑶204975,具有如下核苷酸序列:(I):SEQ ID N0.1所述核苷酸序列；
或(2):在SEQ ID N0.1限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID N0.1的序列编码功能相同的多肽。所述“在SEQ ID N0.1限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”形成的的TTl基因序列一般是指编码具有SEQ ID N0.1所编码的蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ IDN0.1同源性低至约89%的简并序列也能编码出SEQ ID N0.1所述的序列。另外，“在SEQID N0.1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID N0.1所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列；还包括与SEQ ID N0.1中的核苷酸序列的同源性至少80%，较佳地至少89%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列；还包括能编码具有与天然的SEQ ID N0.1相同功能的蛋白的SEQ ID N0.1中开放阅读框序列的变异形式，这些变异形式包括(但并不限于):若干个核苷酸的缺失、插入和/或取代(通常为I 90个，较佳地I 60个，更佳地I 20个，最佳地I 10个)，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)。所述“功能相同”是指抑制人或动物细胞生长， 同时增强人或动物细胞对化疗药物敏感性。本发明所述TTl基因编码的多肽具有如下氨基酸序列:(I):SEQ ID N0.2所述氨基酸序列；或(2):在SEQ ID N0.2限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列，且与SEQ ID N0.2所述氨基酸序列的多肽功能相同。本发明通过实验证明，将TTl基因的重组表达载体转染到人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞H印G2、人肺癌细胞A549、人前列腺癌细胞PC3，所述各种癌细胞的生长受到抑制，与对照相比，生长速度有明显降低，同时，对化疗药物顺钼的敏感性增强，在较低的化疗药物浓度下(lug/ml)就可达到癌细胞生长受抑制的效果。实验结果表明，TTl基因及其编码的多肽可在制备治疗肿瘤的药物中应用。所述TTl基因的重组表达载体，是将TTl基因可操作地连于载体的表达调控序列获得。上述载体可选用本领域已知的各种载体，如病毒载体(逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)、非病毒载体(质粒、阳离子脂质体和阳离子聚合物)、细菌载体(大肠杆菌Escherichia coli,沙门氏菌Salmonella,耶尔森氏菌Yersinia,志贺菌 Shigella，李氏杆菌 Listeria等)，通常选用 pcDNA3、pLNCX、pCMV、pEGFP、pSG5、pSV2中的一种。所述的“可操作地连于”表示如下情况:即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA ;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明具有以下有益效果:1、为TTl基因及其编码的多肽开掘了新的医疗用途，开发了新的应用领域。
2、为宫颈癌、肝癌、肺癌、前列腺癌等癌症患者提供了一种新的治疗药物，此种药物配合化疗药物治疗肿瘤(癌症)可明显降低毒副作用。
图1是转染子HeLa-TTl及其对照的RT-PCR鉴定图谱，转染子HeLa-TTl细胞具有TTl和β -actin条带,而HeLa细胞对照和空载体对照仅有β -actin条带。图2是转染子HeLa-TTl及其对照的Western Blotting鉴定谱图，转染子HeLa-TTl细胞具有TTl和β -actin条带，而HeLa细胞对照和空载体对照仅有β -actin条带。图3是转染子HeLa-TTl及其对照细胞在37°C下的生长情况示意图。图4是转染子HeLa-TTl及其对照细胞在37°C下的生长曲线，其中，A图为无顺钼条件下的生长曲线；B图为I μ g/ml顺钼条件下的生长曲线。图5是转染子H印G2-TT1及其对照的RT-PCR鉴定谱图，转染子H印G2-TT1细胞具有TTl和β -actin条带,而HepG2细胞对照和空载体对照仅有β -actin条带。图6是转染子HepG2_TTl及其对照的Western Blotting鉴定谱图，转染子HepG2-TTl细胞具有TTl和β -actin条带，而H印G2细胞对照和空载体对照仅有β -actin条带。图7是转染子HepG2-TTl及其对照细胞在37°C下培养不同时间的生长情况示意图。图8是转染子！fepG2_TTl及其对照细胞在37°C下的生长曲线，其中，A图为无顺钼条件下的生长曲线，B图为I μ g/ml顺钼条件下的生长曲线。图9是转染子A549-TT1及其对照细胞在37°C下的生长曲线，其中，A图为无顺钼条件下的生长曲线；B图为I μ g/ml顺钼条件下的生长曲线。图10是转染子PC3-TT1及其对照细胞在37°C下的生长曲线，其中，A图为无顺钼条件下的生长曲线；B图为I μ g/ml顺钼条件下的生长曲线。
具体实施例方式下面通过实施例并结合附图，进一步说明而不限定本发明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如 Sambrook, Russel l 的分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中，人宫颈癌细胞HeLa，人肝癌细胞H印G2，人肺癌细胞A549，人前列腺癌细胞PC3均购自美国模式培养物集存库(ATCC)。大肠杆菌(E.coli)DH5a菌株为Qiagen公司产品；载体pET_28a (+)和pcDNA
3.1(+)均为Invitrogen公司产品。T4 DNA连接酶、限制性内切酶均为美国Fermentas (MBI)公司产品；焦碳酸二乙酯(DEPC)、Taq DNA聚合酶、Pfu高保真DNA聚合酶、dNTPs、PCR及凝胶DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、Bcip/NBT试剂盒均为北京天根科技公司产品；无血清培养基、DMEM培养液、RPMI 1640培养液、胎牛血清、细胞培养用磷酸缓冲液、细胞培养用胰蛋白液均为HyClone公司产品；RNA提取试剂RNAiso Plus为大连宝生物公司(Takara)产品；脂质体Lipofectamine 2000为美国Invitrogen产品；顺钼、MTT、抗生素G418为美国Sigma产品；DNA第一链合成试剂盒ReverTra Ace为日本东洋纺公司(Toyobo)产品；小鼠抗Myc标签抗体、小鼠抗β -actin抗体、碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG为北京中杉金桥公司产品；PVDF膜为美国Millipore公司产品。其余化学实际均为市售分析纯。下述实施例中，当“SEQ ID NO:1”单独出现时，本领域技术人员可理解其为“SEQID NO:1所示核苷酸序列”的简称。实施例1:TT1基因抑制人宫颈癌细胞HeLa生长并增加其对顺钼的敏感性1、ΤΤ1动物细胞重组表达载体的构建1.1原核重组表达载体pET_28a (+) -TTl的构建根据SEQ ID NO:1所示核苷酸序列设计引物，上游引物(SEQID N0.3):5’ -CGCGGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’，下游引物(SEQID N0.4):5，-CCGGAGCTCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。然后经PCR从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列PCR程序如下:1.95°C4min (预变性)2.950C30s (变性)
3.530C30s (复性)4.720C50s (延伸)5.2-4步骤循环30次6.72 0C5min(终延伸)7.4V保存。对PCR产物纯化(纯化操作见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamHl与Sacl酶切，胶回收，与原核表达载体pET-28a(+)连接(连接位点=BamHl与Sacl)，获得含有SEQID NO:1序列的原核重组表达载体pET-28a (+) -TTl。1.2真核重组表达载体pcDNA3.1 (+) -Myc-TTl的构建 pcDNA.1 (+) -Myc 为在 pcDNA 3.1 (+)的 NheI 和 HindiII 位点之间插入了来自c-Myc的抗原决定族后构建的质粒,来自c-Myc的抗原决定族的序列见SEQ ID NO:5。根据SEQ ID N0.1所述核苷酸序列设计扩增TTl基因的引物:上游引物(SEQID N0.6):5’ -CCCAAGCTTATGTCGGATGATTTGAGTTTA-3’，下游引物(SEQID N0.7):5’ -CGGAATTCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGA-3’。以原核重组表达载体pET_28a (+) -TTl为模板，用Pfu高保真DNA聚合酶，以上述引物PCR扩增TTl基因，反应体系如下:
权利要求
1.TTl基因在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述TTl基因具有如下核苷酸序列: (I):SEQ ID N0.1所述核苷酸序列； 或(2):在SEQ ID N0.1限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID N0.1的序列编码功能相同的多肽。
2.TTl基因编码的多肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述TTl基因编码的多肽具有如下氨基酸序列: (I):SEQ ID N0.2所述氨基酸序列； 或(2):在SEQ ID N0.2限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列，且与SEQ ID N0.2所述氨基酸序列的多肽功能相同。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于将TTl基因可操作地连于载体的表达调控序列，形成TTl基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述载体为pcDNA3、pLNCX、pCMV、pEGFP、pSG5、pSV2 中的一种。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述肿瘤为宫颈癌、肝癌、肺癌、前列腺癌中的一种。
全文摘要
本发明通过实验证明，将TT1基因的重组表达载体转染到人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549、人前列腺癌细胞PC3，所述各种癌细胞的生长受到抑制，与对照相比，生长速度有明显降低，同时，对化疗药物顺铂的敏感性增强，在较低的化疗药物浓度下(1μg/ml)就可达到癌细胞生长受抑制的效果。实验结果表明，TT1基因及其编码的多肽可在制备治疗肿瘤的药物中应用。所述TT1基因具有如下核苷酸序列(1)SEQ ID NO.1所述核苷酸序列；或(2)在SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同的多肽。
文档编号A61K38/16GK103110958SQ201110363999
公开日2013年5月22日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者杨毅, 王健美, 万谦, 刘志斌 申请人:四川大学