专利名称：新抗cd98抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种新的抗⑶98抗体,进ー步涉及ー种利用新抗⑶98抗体的自身免疫疾病治疗剂。更具体地，本发明涉及ー种糖尿病(尤其是I型糖尿病)治疗剂以及类风湿性关节炎治疗剂。
背景技术：
⑶98是ー种大约120kDa的异ニ聚体糖蛋白，在细胞膜上广泛表达，被认为与氨基酸转运、与増加的细胞膜表达相关的细胞融合、以及整联蛋白介导的粘附有夫。作为⑶98的结构，由大约80kDa的II型跨膜蛋白CD98hc (重链4F2hc，SLC3A2)和6种大约40kDa的轻链(LAT1，LAT2, y+LATl, y+LAT2, xCT, asc)中的一种通过ニ硫键形成异ニ聚体，该异ニ聚体起氨基酸转运者的功能。CD98的重链(CD98hc)起将ニ聚体移动到细胞膜的功能，而轻链(Ic)被认为起转运蛋白的功能。CD98hc首先是作为T细胞活化蛋白被发现的，并且是ー种具有多种功能的糖蛋白。作为其功能，其在生长中的淋巴细胞及其他具有高増殖能力的细胞中高表达，并且在促进肿瘤形成的整联蛋白依赖性信号转导(integrin dependent signaling)中起关键作用。⑶98所參与的氨基酸转运系统由6种转运蛋白(大约40kDa的轻链)之ー构成——这6种转运蛋白反映了要作为底物的氨基酸分子的多祥性——并且根据转运底物选择性和Na+依赖性被归类于各种转运系统。例如，它与特定的转运蛋白(LAT1，LAT2, y+LAT1，y+LAT2, xCT, asc)形成ニ硫键，上述转运蛋白对应于中性氨基酸转运系统L、小型中性氨基酸转运系统asc、中性和碱性氨基酸转运系统y+L、胱氨酸、和碱性及中性氨基酸转运系统x-c。⑶98重链存在于上皮细胞的血管侧的细胞膜上，承担将上述转运蛋白运送到血管侧的细胞膜的功能。此外，已知CD98在多种癌细胞中高表达。其原因被认为是中性氨基酸的转运蛋白的过表达，这是由于癌细胞为了促进细胞増殖，需要积极地摄取对增殖而言必要的必需氨基酸。例如，L-型氨基酸转运蛋白I(LATl)作为在癌细胞中特异性高表达的氨基酸转运蛋白而被克隆(Kanai et al.，J. Biol. Chem. (1998)，273，23629-23632)。LATl 与 CD98 重链形成复合物，并以不依赖钠离子的方式转运具有长侧链的氨基酸，如亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸等。已知LAT在除了脑、胎盘、骨髄和睾丸之外的大多数正常组织中表达低或者不表达，但在人恶性肿瘤如结肠直肠癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、喉癌、食道癌、肺癌等的组织中其表达与⑶98 —起升闻(非专利文献I)。因此，⑶98重链和轻链(LATl)的表达降低以及氨基酸摄取的抑制被认为可能遏制肿瘤生长。已经有人报道了在癌症移植小鼠模型中通过降低轻链(LATl)的表达遏制了肿瘤生长(专利文献I)。因此，人们认为LATl活性的遏制可能是有希望的癌症治疗方法。此外，有报道称为了抑制CD98 (重链和轻链的复合物)的氨基酸输送，在癌症移植小鼠模型中使用抗CD98抗体获得了遏制癌细胞的效果(专利文献2、3)。由此，人们对使用抗CD98抗体作为抗癌剂进行了多种多样的尝试。但是目前与作为抗癌剂之外的用途相关的工作几乎还尚未开展。文献列表专利文献专利文献1:JP-A-2000-157286
专利文献 2: JP-A-2009-189376专利文献3:W02007/11449非专利文献非专利文献1: Yanagida et al. , Biochem. Biophys. Acta, (2001), 1514, 291-30
发明内容
发明要解决的问题本发明致カ于提供新的抗CD98抗体，以及使用该抗体的自身免疫疾病治疗药。具体而言，本发明g在提供使用抗CD98抗体的I型糖尿病或类风湿性关节炎治疗药。解决问题的手段由于⑶98敲除小鼠在胚胎早期就会死亡，人们认为⑶98在氨基酸转运中起重要作用。因此，本发明人为了促进糖尿病疾患中细胞对糖的摄入和消费，研究了对细胞摄入氨基酸的抑制。在这项研究中，本发明人清楚了具有氨基酸转运活性的⑶98(重链和轻链的复合物)起着正向控制T细胞活化的功能。为了进一步推进研究，还制备了具有结合CD98的重链有特异性结合能力的抗CD98抗体。本发明的抗CD98抗体具有这样的特征它不同于专利文献2的抗CD98抗体，对氨基酸转运完全没有影响，而显著地抑制破坏胰腺B细胞的T淋巴细胞的活化。此外，本发明的抗CD98抗体具有遏制由纤连蛋白介导的细胞粘附的特征。由于纤连蛋白是T细胞粘附于其他细胞发挥功能所必需的粘附因子，而本发明的抗CD98抗体抑制由纤连蛋白介导的细胞粘附，因此认为可以遏制T细胞对胰腺B细胞的粘附，结果可以遏制T细胞对胰腺B细胞的破坏。此外，为了发现本发明的抗CD98抗体的效果，进行了各种动物模型实验，发现该抗体不但抑制I型糖尿病的进展，还可以治疗I型糖尿病。換言之，对于迄今为止除了胰岛素补充疗法之外还没有合适的治疗方法的基于胰腺3细胞凋亡的I型糖尿病，该抗体显示是非常有效的。 此外，还清楚了本发明的抗⑶98抗体还可遏制类风湿性关节炎的进展。这些发现已经显示本发明的抗CD98抗体可以用作自身免疫疾病的治疗药。本发明人基于上述发现完成了本发明。由此，本发明提供下述。[I]抗⑶98抗体或其功能性片段，其包含这样的重链，所述重链包含SEQ IDNO: 19所示的序列作为CDRlJnSEQ ID NO: 20所示的序列作为CDR2、以及如SEQ ID NO: 21所示的序列作为⑶R3。[2]抗⑶98抗体或其功能性片段，其包含这样的轻链，所述轻链包含SEQ IDNO: 22所示的序列作为CDRlJnSEQ ID NO: 23所示的序列作为CDR2、以及如SEQ ID NO: 24所示的序列作为⑶R3。
[3]抗⑶98抗体或其功能性片段，其包含如SEQ ID NO: 19所示的序列作为重链的CDRl JBSEQ ID NO:20所示的序列作为重链的CDR2，和如SEQ ID N0:21所示的序列作为重链的CDR3，如SEQ ID NO:22所示的序列作为轻链的CDR1，如SEQ ID N0:23所示的序列作为轻链的⑶R2，和如SEQ ID NO:24所示的序列作为轻链的⑶R3。[4]上述[1]-[3]中任一项所述的抗⑶98抗体或其功能性片段，其包含SEQ IDNO:6和8两条序列，。[5]上述[I] _[4]中任一项所述的抗⑶98抗体或其功能性片段，其中所述抗⑶98抗体来源于NITE BP-1007。[6]上述[1]-[5]中任ー项所述的抗CD98抗体或其功能性片段，其中抗体重链恒定区的类别是IgG。[7]上述[I]_[6]中任ー项所述的抗CD98抗体或其功能性片段，其中上述功能性片段选自抗体的重链和轻链可变区(Vh和VJ、Fab、Fab ’、F (ab ’)2、Fv、Fd、scFv、sdFv，以及它们的组合。[8]抗⑶98抗体或其功能性片段，其包含这样的重链，所述重链包含SEQ IDNO: 13所示的序列作为CDR1, SEQ ID NO: 14所示的序列作为CDR2，以及SEQ ID NO: 15所示的序列作为⑶R3。[9]抗⑶98抗体或其功能性片段，其包含这样的轻链，所述轻链包含SEQ IDNO: 16所示的序列作为⑶Rl, SEQ ID NO : 17所示的序列作为CDR2，以及SEQ ID NO: 18所示的序列作为⑶R3。[10]上述[8]或[9]的抗CD98抗体或其功能性片段，其包含SEQ ID NO: 13所示的序列作为重链的⑶Rl，SEQ ID NO: 14所示的序列作为重链的⑶R2，和SEQ ID NO: 15所示的序列作为重链的CDR3，SEQ ID NO: 16所示的序列作为轻链的CDR1，SEQ ID NO: 17所示的序列作为轻链的⑶R2，和SEQ ID NO: 18所示的序列作为轻链的⑶R3。[11]前述[8]_[10]中任ー项所述的抗CD98抗体或其功能性片段，其包含SEQ IDNO: 2和4两个序列，分别作为重链可变区和轻链可变区。[12]前述[8]-[II]中任ー项所述的抗CD98抗体或其功能性片段，其中抗体重链恒定区的类别是IgG。[13]前述[8]-[12]中任ー项所述的抗CD98抗体或其功能性片段，其中上述功能性片段选自抗体的重链和轻链可变区(Vh和、Fab、Fab’、F(ab，)2、Fv、Fd、scFv、sdFv及其组合。[14]前述[8]-[13]中任ー项所述的抗CD98抗体或其功能性片段，其中所述抗CD98抗体来源于NITE BP-964.[15]表达前述[I] _[14]中任ー项所述的抗CD98抗体或其功能性片段的细胞。[16]包含前述[I]_[14]中任ー项所述的抗CD98抗体或其功能性片段作为活性成分的药物组合物。[17]自身免疫病治疗剂，包含前述[1]_[14]中任ー项所述的抗CD98抗体或其功能性片段作为活性成分。[18]前述[17]的治疗剂，其中所述自身免疫病是I型糖尿病、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、银屑病、克罗恩氏病、系统性红斑狼疮或巴塞多病。
[19]前述[17]或[18]的治疗剂，其中所述自身免疫病是I型糖尿病或类风湿性关节炎。[20]前述[17]-[19]中任一项所述的治疗剂，其中所述抗CD98抗体a)具有⑶98的重链中的结合位点，b)对⑶98的氨基酸摄取无影响，和c)对T淋巴细胞活化有遏制作用。[21] 一种产生前述[8]_[14]中任ー项所述的抗CD98抗体或其功能性片段的方法，包括将包含SEQ ID NO:1和3两个序列的表达载体导入宿主、培养所述宿主，以及从培养物获得所述抗体。[22] 一种产生前述[I]_[7]中任一项所述的抗⑶98抗体或其功能性片段的方法，包括将包含SEQ ID N0:5和7两个序列的表达载体导入宿主、培养所述宿主，以及从培养物获得所述抗体。[23]上述[21]或[22]所述的方法，其中所述宿主选自下组大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、植物和哺乳动物(不包括人)。[24] ー种用于预防或治疗自身免疫病的方法,包括对目标施用治疗有效量的前述-[14]中任ー项所述的抗CD98抗体或其功能性片段。[25]前述[I]_[14]中任ー项所述的抗CD98抗体或其功能性片段，用于自身免疫病的预防或治疗。发明的效果本发明提供新的抗CD98抗体和包含所述抗CD98抗体作为活性成分的自身免疫病治疗剂。本发明的抗CD98抗体对于没有有效治疗的I型糖尿病和类风湿性关节炎特别有效。此外，由于本发明的抗CD98抗体有效遏制T细胞活化但不影响CD98的氨基酸摄取，这种抗体对能量代谢的影响较小，导致的副作用较少。基于本发明的抗CD98抗体的功能的特征，当本发明的抗CD98抗体用于自身免疫病的治疗时，例如治疗糖尿病时，可以遏制胰腺B细胞的疲敝和耗竭，并且特别地，可以遏制I型糖尿病的进展，从而为预防和治疗I型糖尿病提供可能。当所述自身免疫病是例如类风湿性关节炎时，通过使用本发明的抗CD98抗体能遏制关节炎的发病和进展，从而为预防和治疗风湿性关节炎提供可能。综上所述，含有本发明的抗CD98抗体作为活性成分的自身免疫病治疗剂对于没有特别适切的治疗的自身免疫病(例如I型糖尿病和类风湿性关节炎)的治疗极为有用。附图简述
图1显示通过电泳对分离的识别分子的分子量进行评估的结果，其中所述识别分子可与本发明的抗CD98抗体反应。向用NP40溶解的小鼠脾细胞溶液中加入抗小鼠CD98抗体(mCD98Ab)，4°C静置2小吋。然后加入蛋白G琼脂糖，将混合物在4°C搅拌下培养。通过稀释去除游离的抗CD98抗体，添加样品缓冲液，并将混合物在98°C处理3分钟，并在聚丙烯酰胺凝胶上电泳。对电泳使用的凝胶进行银染色。结果，在大约75kDa(CD98重链的分子量)处发现了银染色的显色。
图2显示了本发明的mCD98Ab识别表达小鼠⑶98的CHO细胞并与之反应(右图)。使用组入了小鼠⑶98基因的pcDNA3.1或单独的pcDNA3.1通过电穿孔法转染CHO细胞。为了选择CD98基因转染到了 CHO细胞基因组中的细胞，使用G418进行了药物筛选，并分离的药物抗性细胞。对该细胞用大鼠免疫球蛋白G或mCD98Ab染色，并洗去游离的抗体，用PE标记的抗大鼠IgG染色。結果，mCD98Ab不与无⑶98基因导入的细胞反应，而与转染了⑶98基因的细胞反应。左图显示了与用PCDNA3.1単独转染的细胞的反应的结果，右图显示与导入并表达小鼠CD98基因后的细胞反应的結果。图3显示本发明的mCD98Ab显著降低OVA免疫所导致的小鼠血中的抗原特异性抗体效价。BALB/c小鼠用完全弗氏佐剂和卵清蛋白的悬液皮下免疫，10天后收集血清。将该小鼠被免疫接种的第一日作为0，在第2、4、6和8日对小鼠腹膜内施用对照抗体或抗⑶98抗体各200 u g。将卵清蛋白以50 u g/ml的浓度在96孔平板中固化，并与收集的血清反应。与卵清蛋白反应的卵清蛋白抗体用HRP标记的抗小鼠IgG抗体检测。该图显示在加入底物后测得的CD值。图4显示本发明的抗小鼠⑶98抗体(3-142抗体)消除小鼠脾细胞中的边缘区(marginal zone)B细胞。BALB/c小鼠静脉内一次施用作为对照的大鼠IgG(200 y g)或者mCD98Ab (200 ii g)。一日后，移出脾并用抗⑶19抗体、抗⑶23抗体和抗⑶21抗体染色。这些图显示了在⑶19阳性细胞中⑶23和⑶21的表达模式。在mCD98Ab施用组中，⑶21高⑶23 的边缘区B细胞与对照相比几乎消失。 图5显示本发明的m⑶98Ab对T淋巴细胞活化显示遏制作用。为了评估本发明的mCD98Ab的功能，使用了下述的T淋巴细胞活化系统进行研究。首先分离C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠的脾细胞，然后使用氯化铵溶液溶血。然后，将BALB/c小鼠的脾细胞在50 u g/ml丝裂霉素C溶液中培养45min，停止DNA合成。然后，将C57BL/6小鼠的脾细胞和BALB/c小鼠的脾细胞混合培养3天。在培养完成前6小时添加[3H]-胸苷，并且在完成培养之后通过液体闪烁计数器验证其摄取。图6显示本发明的mCD98Ab剧烈遏制I型糖尿病小鼠模型的发病，其中■代表抗⑶98抗体施用组， 代表对照组。图7显示比较施用了本发明的mCD98Ab的I型糖尿病-模型小鼠与对照的I型糖尿病-模型小鼠中胰腺组织样本的照片。在mCD98Ab施用组中胰腺中B细胞没有被破坏，而且细胞浸润较之对照组的胰腺显著被遏制。图8显示对I型糖尿病发病后的糖尿病模型小鼠施用抗小鼠CD98抗体显著改善了血糖水平。显示本发明的抗CD98抗体的施用使得I型糖尿病的治疗成为可能。图9显示本发明的抗人⑶98抗体和抗小鼠⑶98抗体展现抑制纤连蛋白介导的细胞粘附的作用。显示细胞粘附抑制作用依赖于抗体的浓度而提高。图10显示，在胶原蛋白诱导的关节炎模型小鼠中，在关节炎发病前施用抗小鼠CD98抗体可以遏制关节炎的发病和进展。图11显示在胶原蛋白诱导的关节炎发病的小鼠中，抗小鼠CD98抗体施用组与非施用组(大鼠IgG施用组)之间关节炎进展的差异。显示本发明的抗CD98抗体抑制在已经发病的关节炎中也显著地抑制了关节炎的进展。图12显示了从胶原蛋白诱导的关节炎发病的小鼠(大鼠IgG施用组或抗小鼠CD98抗体施用组)分离脾细胞、并用胶原蛋白II处理后的[3H]-胸苷的摄取率的增减。以未经胶原蛋白II处理昀脾细胞的[3H]-胸苷的摄取率为1，显示以其为基准的増加率。图13显示了抗小鼠⑶98抗体和抗人⑶98抗体对细胞的3H-亮氨酸摄取的影响的评价，其中a)显示施用NIH3T3细胞作为细胞评价抗小鼠CD98抗体的亮氨酸摄取抑制作用的結果，b)显示施用293T细胞作为细胞评价抗人CD98抗体的亮氨酸摄取抑制作用的结果。这两种抗CD98抗体都没有抑制细胞的亮氨酸摄取。图14显示了本发明的抗小鼠⑶98抗体(3-142抗体)和常规的抗⑶98抗体(专利文献3的4种抗体K3，1-40-1，3-69-6，C2IgGl)相关的可变区核酸序列的系统树。图15是显示将本发明的抗⑶98抗体与常规的抗⑶98抗体的可变区的氨基酸序列(重链)进行比较的结果的示意图。重链中CDRlI的位置是以现有抗体的可变区(大鼠(杂交瘤 YTH906)免疫球蛋白可变区(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/M87783.1))作为參考而确定的。此外，參考了专利文献3中描述的常规抗CD98抗体C2IgGl重链的序列。图16是显示将本发明的抗CD98抗体与常规的抗CD98抗体的可变区的氨基酸序列(轻链)进行比较的结果的示意图。轻链中CDRf 3的位置是以现有抗体的可变区(褐家鼠(杂交瘤53R-4)免疫球蛋白重排kappa链mRNA可变(V)区,部分ds (http://www. ncb1.nlm. nih. gov/nuccore/L07407.1)作为參考而确定的。此外，參考了专利文献3中描述的常规抗⑶98抗体C2IgGl轻链的序列。
实施方案的描述本发明中术语“抗体”以最广义使用，包括任何抗体，如单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体变体、低分子化抗体(smaller antibody)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等，只要它展现期望的生物学活性(如下述的抗⑶98抗体的活性)。本发明的“抗⑶98抗体”是这样的抗体，其具有⑶98重链与⑶98轻链(具有氨基酸转运活性)的ニ硫键合形式的CD98特异性结合能力。本发明的抗CD98抗体具有SEQID N0s:2和4这两条序列作为重链可变区和轻链可变区。在另ー个实施方案中，本发明的抗⑶98抗体具有SEQ ID N0s:6和8这两条序列作为重链可变区和轻链可变区。在本发明的另ー个优选的实施方案中，本发明的抗⑶98抗体具有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列作为重链可变区⑶Rl，SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列作为重链可变区⑶R2 JPSEQ ID NO: 15所示氨基酸的序列作为重链可变区⑶R3。在另ー个实施方案中，本发明的抗⑶98抗体具有SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列作为轻链可变区⑶R1，SEQ IDNO: 17所示的氨基酸序列作为轻链可变区CDR2 JPSEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列作为轻链可变区⑶R3。例如，本发明的抗⑶98抗体具有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列作为重链⑶Rl，SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列作为重链⑶R2，和SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列作为重链CDR3 JPSEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列作为轻链CDR1，SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列作为轻链⑶R2，和SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列作为轻链⑶R3。在本发明的另ー个优选的实施方案中，本发明的抗⑶98抗体具有SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列作为重链可变区⑶Rl，SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列作为重链可变区⑶R2JPSEQ ID NO:21所示的氨基酸序列作为重链可变区⑶R3。在又一个实施方案中，本发明的抗⑶98抗体具有SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列作为轻链可变区⑶Rl，SEQ IDNO: 23所示的氨基酸序列作为轻链可变区CDR2 JPSEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列作为轻链可变区⑶R3。 例如，本发明的抗⑶98抗体具有SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列作为重链CDR1，SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列作为重链CDR2 JPSEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列作为重链CDR3，和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列作为轻链CDR1，SEQ ID N0:23所示的氨基酸序列作为轻链⑶R2，和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列作为轻链⑶R3。本发明的抗⑶98抗体特征性地a)至少在⑶98的重链中有结合位点，b)对⑶98的氨基酸摄取不显示影响，和c)遏制T淋巴细胞(T细胞)的活化。优选地，除了上述a)-c)的特征之外，其还特征性地d)遏制由纤连蛋白介导的细胞粘附。由于本发明的抗⑶98抗体遏制T淋巴细胞的活化，作为结果其遏制OVA免疫模型中OVA抗体的产生。由此，本发明的抗CD98抗体的一个更优选的实施方案除了上述的特征a)-d)之外，还提供这样的特征e)在OVA免疫模型中遏制OVA抗体的产生。本发明的抗CD98抗体的一个特别优选的实施方案具有下述特征a)_e)；a)其在⑶98的重链中具有结合位点，b)其不影响⑶98的氨基酸摄取，c)其对T淋巴细胞活化具有遏制作用，d)其遏制纤连蛋白介导的细胞粘附，和e)其遏制OVA免疫模型中OVA抗体的产生。优选作为本发明的抗CD98抗体者包括小鼠型(抗小鼠CD98抗体)和人型(抗人⑶98抗体)抗⑶98抗体。本发明的抗⑶98抗体可以根据专利文献2等的已知方法来产生。例如，抗人⑶98抗体(小鼠单克隆抗体)是通过用人CD98表达细胞系(包括天然表达的细胞和转化细胞)免疫非人哺乳动物如小鼠等来产生的(Haynes B. F et al.，J.1mmunol.，(1981)，126,1409-1414, Masuko T. et al. , Cancer Res. , (1986), 46, 1478-1484,和 Freidman AW. etal. , Cell.1mmunol. , (1994), 154, 253-263)。本发明的抗小鼠⑶98抗体可以从通过已知方法，如上文所述的方法等获得的抗小鼠⑶98抗体产生细胞(NITE BP-964)来获得。类似地，本发明的抗人⑶98抗体可以从例如抗人⑶98抗体产生细胞(NITE BP-1007)来获得。根据本发明的抗CD98抗体的功能性片段是指抗CD98抗体的这样的片段，其特异性地结合该抗CD98抗体特异性结合的抗原，并且更具体地，包括重链和轻链可变区(Vh和VL)、F(ab，)2、Fab’、Fab、Fv、Fd、ニ硫化物连接的 FV(sdFv)、单链 FV(scFV)及其聚合物，等等(D. J. King.，Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies. , 1998T.J.1nternational Ltd)。这些抗体片段可通过常规方法获得,例如，利用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶消化抗体分子，或通过已知的遗传工程技木。或者构建编码此类抗体片段的基因，导入表达载体，并在合适的宿主细胞中表达(參见例如Co，M. S. et al.，J.1mmunol. (1994) 152,2968-2976;Better, M. and Horwitz,A.H. , Methods Enzymol.(1989) 178,476-496;Pluckthun, A. and Skerra, A. , Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515;Lamoyi, E. , Methods Enzymol. (1986) 121，652-663;Rousseaux, J. et al., MethodsEnzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W.，Trends Biotechnol.(1991)9，132-137)。
本发明的抗体的功能性片段优选具有比全长抗体更小的分子量。例如，其可以形成多聚体例如ニ聚体、三聚体、四聚体等，有时具有比全长抗体更大的分子量。本发明的抗⑶98抗体还涵盖这样的单克隆抗体，其由具有构成抗体的重链和/或轻链的各自的氨基酸中缺失、替代或添加一个或数个氨基酸的氨基酸序列的重链和/或轻链组成。本发明的抗CD98抗体的氨基酸序列中的这样的氨基酸的部分改变(缺失、替代、插入、添加)可以通过这样的方式来导入将编码该氨基酸序列的核苷酸序列加以部分的改变。该核苷酸序列的部分的改变可以使用已知的定点诱变通过常规方法导入(ProcNatl Acsd Sci USA.，1984 Vol. 81 5662-5666;Sambrook et al.，Molecular Cloning ALaboratory Manual(1989)Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。根据本发明的抗CD98抗体包括具有任何免疫球蛋白类型和亚类的抗体。在本发明的一个优选的实施方案中，所述抗体是具有小鼠免疫球蛋白类型及亚类、且具有人免疫球蛋白类型及亚类的抗体，优选免疫球蛋白G(IgG)。本发明的抗⑶98抗体可以通过例如下述方法来产生。⑶98或其一部分、或者与适用于增强抗原的抗原性的物质(例如钥孔戚血蓝蛋白和牛血清白蛋白等)结合的物质、或在细胞表面上表达大量CD98的细胞，视需要与免疫刺激剂(弗氏佐剂等)一起用来免疫非人哺乳动物，如大鼠、小鼠、家兔、山羊、马等，或通过使用组入了⑶98的表达载体来免疫非人哺乳动物。本发明的⑶98抗体可以通过这样的方式得到从获自经免疫的动物的抗体产生细胞、以及无自身抗体产生能力的骨髓瘤细胞制备杂交瘤，克隆该杂交瘤，并选择产生显示对用于免疫的抗原的特异性亲和カ的单克隆抗体的克隆。下面进ー步具体地说明本发明的抗体的产生方法。但是，产生方法不限于此，例如,也可以使用脾细胞和骨髓瘤之外的抗体产生细胞。作为抗原，可以使 用⑶98或其部分，以及天然地表达⑶98的细胞，还可以使用通过将编码⑶98的DNA组入动物细胞用表达载体，并将该表达载体导入动物细胞而获得的转化株本身。作为动物细胞表达载体，例如，可以使用pEGF-Nl (Becton Dickinson BioscienceClontech制造)等载体。用于导入目的基因的载体可以用过下述方法来制备用适当的限制酶切割插入部位，并连接用相同限制酶切割的编码CD98的DNA。将制备好的表达载体导入作为宿主的例如し929细胞(American Type Culture Collection No. CCL-1)等细胞，可以制备高表达⑶98的细胞。向宿主导入基因的方法是公知的，包括例如任意的方法(例如使用钙离子的方法、电穿孔法、原生质体法、醋酸锂法、磷酸钙法、脂质体转染法等)。如此制备的转化细胞可以用作制备CD98抗体用的免疫原。此外，表达载体自身也可以用作免疫原。CD98可以基于公知的核苷酸序列或者氨基酸序列，合适地利用基因重组技木，以及化学合成法、细胞培养法等技术领域中已知的方法来加以制造。还可以用这样获得的CD98蛋白质作为抗原来产生抗CD98抗体。CD98的部分序列可以按照后述的技术领域中已知的方法，通过基因重组或者化学合成方法来制备，或者也可以通过用蛋白分解酶等合适地切割⑶98来加以制备。如上所述获得的抗原可以如下所述用来进行免疫。具体地，将制得的抗原与合适的用来增强抗原性的物质(例如钥孔戚血蓝蛋白、牛血清白蛋白等)和视需要的免疫刺激剂(弗氏完全或不完全佐剂等)混合，用来免疫非人哺乳动物如小鼠、大鼠、山羊和马。要免疫的动物以3-10日的间隔接受多次免疫。例如，当使用细胞作为抗原时，单次免疫所用的细胞是任意的。一般而言，用103-108，例如IO6个细胞进行免疫。当使用蛋白质或肽作为抗原时,一般用1-1OOii g进行免疫。从经过多次免疫的动物收集免疫活性细胞，并将产生目标抗体的细胞克隆以产生本发明的单克隆抗体。免疫活性细胞(immunocompetent cell)是指在经免疫的动物中具有产生抗体的能力的细胞。分泌单克隆抗体的杂交瘤可以通过或者根据K^hler与Milstein (Nature.，1975Vol. 256:495-497)的方法来制备。换言之，从经过如上所述的免疫的动物获得的、包含于脾、淋巴结、骨髄、扁桃体等，优选包含于淋巴结或脾的抗体产生细胞，与优选来源于哺乳动物如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、家兔或人等的、不能产生任何自身抗体的骨髄瘤细胞进行细胞融合。细胞融合可以通过将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞在聚合物如聚こニ醇(例如1500-6000的分子量)的高浓度溶液中在通常大约30-40°C混合大约l-10min。可以这样筛选产生单克隆抗体的杂交瘤克隆 将杂交瘤在例如微量滴定板上培养，并使用免疫学方法，如酶免疫測定(例如ELISA)、放射免疫測定、或荧光抗体法，測量有杂交瘤生长的孔的培养上清液对免疫抗原的反应性。单克隆抗体可以通过体外培养所述杂交瘤，然后从培养上清液分离单克隆抗体来产生。单克隆抗体也可以通过在体内在小鼠、大鼠、豚鼠、家兔等的腹水等中培养杂交瘤，然后从该腹水分离单克隆抗体来产生。此外，还可以通过基因重组技术来制备重组抗体从抗体产生细胞如杂交瘤克隆出编码单克隆抗体的基因，并将该基因组入合适的载体中，将该载体导入宿主(例如来自哺乳动物细胞系的细胞，如中华仓鼠卵巣(CHO)细胞等、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞及其他(P. J. Delves. ANTIBODYPRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997, WILEY, P. Shepherd and C. Dean. , MonoclonalAntibodies. , 2000,OXFORD UNIVERSITY PRESS,J.ff.Go ding, MonoclonalAntibodies !principles and practice. , 1993, ACADEMIC PRESS)。此外，通过生产转基因动物的方法制备靶抗体的基因导入了内源基因的转基因牛、山羊、绵羊或猪，可以从该转基因动物的乳中获得大量的源自该抗体基因的单克隆抗体。当在体外培养杂交瘤时，根据培养的细胞种类的特性、研究的目的、以及培养方法等各种条件来増殖、維持和保存杂交瘤，可以使用用于在培养上清液中产生单克隆抗体的已知的营养培养基或者从已知的基本培养基诱导制备的任何营养培养基实施培养。产生的单克隆抗体可以通过本领域已知的方法，例如通过合适地组合使用蛋白A柱的色谱、例子交换色谱、疏水色谱、硫酸铵盐析、凝胶过滤、亲和色谱等，来加以纯化。此外，本发明的抗⑶98抗体还可以基于可变区的碱基序列信息来通过基因工程产生。例如，将包含SEQ ID N0:1和3两条序列，或者SEQ ID NO: 5和7两条序列的表达载体导入宿主，培养宿主，并可以从培养物获得抗体。SEQ ID NO:1和3可以导入同一表达载体，或者可以导入不同的表达载体。类似地，SEQ ID N0:5和7可以导入同一表达载体,或者可以导入不同的表达载体。作为表达载体和宿主，使用如上述同样者。使用构建为表达所述抗⑶98抗体的表达载体，可以制备表达本发明的抗⑶98抗体或其功能性片段的抗体。具体地说，将编码目标抗体的DNA组入表达载体。此时，该DNA以这样的方式组入表达载体，使得表达在表达调节区域如增强子和启动子的控制下发生。然后，转化了表达载体的宿主细胞表达抗体。在此情况下，可以组合使用合适的宿主和表达载体。载体的例子包括M13-型载体，pUC-型载体，pBR322, pBluescript, pCR-Script 等等。当期望亚克隆cDNA或切割吋，除了上述载体之外可以使用例如，pGEM-T, pDIRECT, pT7
坐坐寸寸o当载体用于表达抗体的目的时，表达载体是特别有用的。当宿主是大肠杆菌如JM109，DH5 a，HB101，XLl-Blue等等吋，表达载体必须具有能够在大肠杆菌中高效表达的启动子，例如，IacZ 启动子(Ward et al. , Nature (1989) 341, 544-546; FASEBJ. (1992)6, 2422-2427,本说明书中通过提述并入其全部内容)，araB启动子(Better etal., Science (1988) 240, 1041-1043，本说明书中通过提述并入其全部内容)，T7启动子等等。此类载体的例子包括 pGEX_5X_l (Pharmacia 制造)、“QIAexpress system” (QIAGEN 制造)、pEGFP、pET (在此情况下，宿主优选是表达17 RNA聚合酶的BL21)等等，除了上述的载体之外。此外，载体可含有用于多肽 分泌的信号序列。作为用于多肽分泌的信号序列，当产生在大肠杆菌的周质中时，可以使用pelB信号序列(Lei, S. P. et al J. Bacteriol.(1987) 169, 4397,本说明书中通过提述并入其全部内容)。载体可以通过例如氯化钙法或电穿孔法导入宿主细胞。此外，可以使用源自哺乳动物的表达载体(例如，pcDNA3 (Invitrogen制造)、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990,18(17), p5322、本说明书中通过提述并入其全部内容)、pEF、pCDM8)、源自昆虫细胞的表达载体(例如，“ Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBC0 BRL制造)、pBacPAK8)、源自植物的表达载体(例如，pMHl，pMH2)、源自动物病毒的表达载体(例如，pHSV，pMV，pAdexLcw)、源自逆转录病毒的表达载体(例如，pZIPneo)、源自酵母的表达载体(例如，“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen制造)、pNVll、SP_Q01),源自枯草芽孢杆菌的表达载体(例如，pPL608、pKTH50)等等。对于在动物细胞如CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等等中的表达，载体必须包含细胞内表达所需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan et al. , Nature (1979) 277, 108,本说明书中通过提述并入其全部内容)，MMTV-LTR启动子、EFla启动子(Mizushima etal. ,Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322,本说明书中通过提述并入其全部内容)、CAG启动子(Gene. (1991) 108, 193，本说明书中通过提述并入其全部内容)、CMV启动子等等，更优选地包含用于选择经转化的细胞的基因(例如，可以用药物(新霉素、G418等等)区分的药物抗性基因)。具有这样的特性的载体的例子包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、p0PRSV、p0P13等等。当期望基因的稳定表达以及胞内基因拷贝数的扩增时，可以列举包括向核酸合成途径缺陷的CHO细胞中导入具有对其补全的DHFR基因的载体(例如，pCHOI等等)，并通过甲氨蝶呤(MTX)将其扩增的方法。当期望瞬时基因表达时，可以列举包括用具有SV40复制起点(pcD等等)的载体转化在染色体上具有表达SV40T抗原的基因的COS细胞的方法。作为复制起点，可以使用源自多瘤病毒(polioma virus)、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等等的复制起点。为了在宿主细胞系统中扩增基因拷贝数，表达载体可以含有氨基糖苷酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、四氢叶酸还原酶(dhfr)基因等等作为选择标记。本发明还涉及结合与本申请公开的抗体(上述的抗CD98抗体)结合的表位相同的表位的抗体，及其作为自身免疫病治疗剂的用途。所述表位可以通过生物信息学方法如序列数据分析和立体结构分析来预测。此外，抗体是否结合相同表位可以通过确认两种抗体对表位有无竞争关系来加以判断。本发明中使用的抗 体可为例如结合于各种分子，如非肽聚合物例如聚こニ醇(PEG)等等、放射性物质、毒素等，的缀合抗体。此类缀合抗体可以通过化学地修饰所得的抗体来获得。化学修饰方法在本领域中已经是确立的。本发明的抗体也涵盖这样的缀合in 体(D. J. King. , Applications and Engineering of Monoclonal antibodies. , 1998T. J.1nternational Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer. , 1998 MarcelDekker Inc;Chari et al. , Cancer Res. , 1992 Vol 152:127;Liu et al. , Proc Natl AcadSci USA. , 1996 Vol93:8681，all本说明书中通过提述并入其全部内容)。本发明中的“自身免疫病”是由于免疫系统对内源抗原产生自身抗体而发生的基因，例如，I型糖尿病、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、银屑病、克罗恩氏病、系统性红斑狼疮、巴塞多病等等。现有的研究已经查明，这些自身免疫病是由T细胞的异常过度活化造成的。具体地说，公知CD4阳性或CD8阳性T淋巴细胞(T细胞)被过度活化而促进自身抗体生成或诱导组织破坏，对病状的进展有显著的影响。由于本发明的抗⑶98抗体遏制T淋巴细胞(T细胞)的活化，上面描述的自身免疫病可以使用本发明的抗CD98抗体来治疗。例如，如图6-图8所示，本发明的抗CD98抗体对I型糖尿病的治疗有效，且如图10-图12所示，其对类风湿性关节炎的治疗有效。因此，本发明的抗CD98抗体可以用于自身免疫病的治疗，例如，I型糖尿病、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、银屑病、克罗恩氏病、系统性红斑狼疮、巴塞多病等等。如上文提到的，本发明的抗CD98抗体的优选应用是I型糖尿病、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、银屑病、克罗恩氏病、系统性红斑狼疮、和巴塞多病的治疗，特别优选的应用是I型糖尿病或类风湿性关节炎的治疗。在本发明中，“类风湿性关节炎”是ー种关节和骨、肌肉、韧带、肌腱等等中具有疼痛的自身免疫病，是发病频率最高、进展极度慢性、难以治疗的ー种自身免疫病。已知类风湿性关节炎的病状进展是由于CD4阳性T细胞被过度活化而产生多种多样的细胞因子，此外还由于⑶8阳性T细胞破坏关节组织。因此，对T细胞(T淋巴细胞)活化具有遏制作用的本发明的抗CD98抗体对于类风湿性关节炎的治疗而言是优选的。在本发明中，“ I型糖尿病”是指胰脏P细胞主要由于自身免疫被破坏，导致胰岛素产生耗竭和胰岛素短缺的疾病。当糖尿病加重时，胰岛素抵抗亢进，胰脏P细胞疲敝，开始发生凋亡，于是2型糖尿病向I型糖尿病推进。CD4阳性和CD8阳性T细胞都对I型糖尿病的发病有贡献，最終由于CD8阳性T细胞破坏胰脏P细胞而导致胰岛素缺乏。因此，本发明的对T细胞(T淋巴细胞)活化的遏制作用的抗CD98抗体对于I型糖尿病的预防和治疗而目是优选的。
含有本发明的抗CD98抗体的自身免疫病治疗剂优选作为药物组合物提供。这样的药物组合物含有治疗有效量的所述抗体，并且配制为多种用于胃肠外施用的形式。这里，治疗有效量是指对于给定的症状或治疗计划提供治疗效果的量。本发明的药物组合物除了所述抗体之外还可包含可药用的担载体。可药用的担载体的例子包括灭菌水和盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂、缓冲剂、防腐剤、表面活性剤、螯合齐U、粘合剂等等。可以含有这些担载体中的ー种或多种。在本发明中，作为表面活性剤，可以列举非离子型的表面活性剤，例如具有HLB6-18者，例如，作为典型的例子，可列举失水山梨醇脂肪酸酯如失水山梨醇单戊酸酷、失水山梨醇单月桂酸酷、失水山梨醇单棕榈酸酯等等；甘油脂肪酸酯如甘油単戊酸酯甘油単肉豆蘧酸酷，甘油単硬脂酸酯等等；多聚甘油脂肪酸酷如，十聚甘油単硬脂酸酷，十聚甘油ニ硬脂酸酷，十聚甘油单亚麻酸酯等等；聚氧こ烯失水山梨醇脂肪酸酯如聚氧こ烯失水山梨醇单月桂酸酷，聚氧こ烯失水山梨醇单油酸酷，聚氧こ烯失水山梨醇单硬脂酸酷，聚氧こ烯失水山梨醇单棕榈酸酷，聚氧こ烯失水山梨醇三油酸酷，聚氧こ烯三硬脂酸失水山梨醇酯等等；聚氧こ烯失水山梨醇脂肪酸酯如聚氧こ烯失水山梨醇四硬脂酸酷，聚氧こ烯失水山梨醇四油酸酯等等；聚氧こ烯甘油脂肪酸酯如聚氧こ烯甘油単硬脂酸酯等等；聚乙ニ醇脂肪酸酯如聚こニ醇ニ硬脂酸酯等等；聚氧こ烯烷基醚如聚氧こ烯月桂基醚等等；聚氧こ烯聚氧丙烯烷基醚如聚氧こ烯聚氧丙ニ醇、聚氧こ烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧こ烯聚氧丙烯十六烷基醚等等；聚氧こ烯烷基苯基醚如聚氧こ烯壬基苯基醚等等；聚氧こ烯氢化蓖麻油，如聚氧こ烯蓖麻油、聚氧こ烯氢化蓖麻油(聚氧こ烯氢蓖麻油)等等，聚氧こ烯蜂蜡衍生物，如聚氧こ烯失水山梨醇蜂蜡等等；聚氧こ烯羊毛脂衍生物如聚氧こ烯羊毛脂等等；聚氧こ烯脂肪酸酰胺如聚氧こ烯硬脂酸酰胺等等，诸如此类。此外，作为表面活性剤，还可以列举阴离子型表面活性剤，例如，作为典型的例子，可以列举具有C10-C18烧基基团的烧基硫酸盐，如壬基硫酸纳、月桂基硫酸纳、油酸硫酸纳等等；其中氧化こ烯的平均添加摩尔数为2-4、且烷基基团具有10-18个碳原子的聚氧こ烯烧基酿硫酸酷，如聚氧こ稀月桂基硫酸纳等等；烧基基团具有8_18个碳原子的烧基横基玻珀酸酯盐，如月桂基磺基琥珀酸钠等等，天然表面活性剂如卵磷脂、甘油磷脂、鞘磷脂如神经鞘磷脂等等；有12-18个碳原子的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酷等等。在本发明中，作为缓冲剂，可以列举有机酸如磷酸、柠檬酸、こ酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸钾、葡糖酸、辛酸、脱氧胆酸、水杨酸、三こ醇胺、富马酸等等；碳酸盐缓冲齐U、TriS缓冲剂、组氨酸缓冲剂、咪唑缓冲剂等等。本发明的药物组合物除了抗体之外还可包含其他低分子量多肽、蛋白质如血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白等等、氨基酸、糖或碳水化合物如多糖、单糖等等，和糖醇。在本发明中，作为氨基酸，可以列举碱性氨基酸如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸等等，和这些氨基酸的无机酸盐(优选盐酸盐或磷酸盐的形式，即磷酸-氨基酸)。当使用游离氨基酸时，通过添加合适的生理学上可接受的缓冲物质，例如无机酸，特别是盐酸、磷酸、硫酸、こ酸、甲酸或它们的盐，来调整优选的PH值。在此情况下，使用磷酸盐是特别有利的，因为可以获得特别稳定的冻干产品。当制得的产品实质上不含有机酸，例如苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸等等 ，或者没有对应的阴离子(苹果酸离子、酒石酸离子、柠檬酸离子、琥珀酸离子、富马酸离子等等)吋，是特别有利的。优选的氨基酸是精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸。此外，还可以使用酸性氨基酸，例如，谷氨酸和天冬氨酸，以及它的盐(优选钠盐)，或中性氨基酸，例如，异亮氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸或丙氨酸，或芳香族氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或衍生物(N-こ酰基色氨酸)。在本发明中，作为多糖、单糖等糖或碳水化合物，可以列举右旋糖酐、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、棉籽糖等等。在本发明中，作为糖醇，可以列举甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇等等。当本发明的药物组合物被制备为注射用水溶液吋，它可以与含有例如葡萄糖和其他辅助剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠)的盐水或者等渗溶液混合。水溶液可以与合适的增溶剂(例如醇(こ醇等)、多元醇(丙ニ醇、PEG等)、非离子型表面活性剂(聚失水山梨醇80、HC0-50)等等)组合使用。期望时，可以包含稀释剂、增溶剤、pH调节剂、无痛化剂、含硫还原剂、抗氧化剂等等。在本发明中，作为含硫还原剂，可以列举N-こ酰半胱氨酸、N-こ酰高半胱氨酸、硫辛酸，硫ニ甘醇，硫こ醇胺，硫代甘油、硫代山梨糖醇、硫代こ醇酸及其盐、硫代硫酸钠、谷月光甘妝、以及具有疏基 者如Ci_7硫代链烧酸等等。在本发明中，作为抗氧化剂，此外，可以列举赤藻糖酸，ニ丁基羟基甲苯，丁基羟基茴香醚，a -生育酚，こ酸生育酚，L-抗坏血酸及其盐，L-抗坏血酸棕榈酸酯，L-抗坏血酸硬脂酸酷，亚硫酸氢钠，亚硫酸钠，没食子酸三戊酷、没食子酸丙酯或螯合剂如こニ胺四こ酸ニ钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏亚硫酸氢钠等。必要时，所述组合物可以密封在微胶囊中(羟甲基纤维素、明胶、聚甲基丙烯酸甲酯等等的微胶囊)，或者还可以制备为胶体药物递送系统(脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊等等)(见“Remington’ sPharmaceutical Science 16th edition “，Oslo Ed. , 1980 等等)。此夕卜，将药物加工为持续释放药物的方法也是已知的，并可以适用于本发明(Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.1981， 15:167-277;Langer,Chem.Tech.1982， 12:98-105;USPatent No.3，773，919;EP-A_58，481;Sidman et al. , Biopolymers1983，22:547-556;EP-B-133，988)。作为制剂的形态，可以根据治疗目的和治疗计划选择诸如冻干制剂(可以通过添加上述的缓冲水溶液重建后使用)、持续释放制剂、肠溶性制剂、注射剂、点滴剂等等)。施用途径可以合适地确定，例如可以列举ロ服施用、以及胃肠外施用如静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内注射等等。或者，使本发明的抗CD98抗体直接接触患者的患处也是可能的。至于剂量，基于使用动物的试验和临床试验来合适地确定，一般而言，应当考虑患者的状态或严重程度、年龄、体重、性别等等。通常，对成人可ロ服施用大约0. Olmg-1OOOmg每天，一次给药或分成数份。对于胃肠外施用，可以通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射每次施用 0. Ol-1OOOmg0本发明还涵盖预防或治疗上述疾病的方法，该方法施用本发明的抗体或药物组合物。此外，本发明还涵盖本发明的抗体用来制备上述疾病的预防或治疗剂的用途。在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的抗CD98抗体作为含有所述抗体在水或其他药理学上可接受的溶液中的无菌溶液或悬液的安瓿来使用。此外，可以在安瓿中充填无菌粉末制剂(优选冻干的本发明的抗体)，并且当使用时可以用药理学上可接受的溶液稀释。此外，本发明的抗⑶98抗体还可以制备为与其他可用于联用的药物的混合物。具体地，作为其他药物，可以列举本发明的抗CD98抗体之外的抗体、自身免疫病治疗剂、糖尿病治疗剂等等。此类与本发明的抗CD98抗体联用的药物又称并用药物。本发明的抗CD98抗体之外的抗体的例子包括专利文献和2中提供的抗体。自身免疫病治疗剂的例子包括类风湿性关节炎治疗剂等等。糖尿病治疗剂的例子包括胰岛素制剂、a -葡萄糖苷酶抑制剂、双胍、胰岛素分泌促进剂、二肽酰肽酶-1V(DPP-1V)抑制剂、GLP-U GLP-1类似物、蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制齐U、￠3激动剂等等。两种或更多种上述的并用药物可以按照合适的比例组合使用。
实施例 下面参照实施例更详细地解释本发明，这些实施例不应解释为限定性的。(实施例1)抗小鼠⑶98抗体的制备从BALB/c小鼠分离骨髓细胞，并将所述骨髓细胞在GM-CSF的存在下培养8天。然后，用所述细胞腹腔内免疫8周龄Wistar大鼠(lx IO7个细胞)。首次免疫两周后,重复免疫。接下来，2周之后，再次免疫小鼠，3天后自大鼠摘出脾脏。使用脾细胞和SP2细胞(骨髓瘤细胞)，根据常规方法进行细胞融合，并在HAT培养基中进行选择。然后，利用流式细胞仪选择对树突细胞有反应性的抗体。对于选定的抗体，利用有限稀释法收集单个克隆。由于有限稀释法在0. 5个细胞/孔的条件下进行了 3次，故认为克隆是单个克隆。通过上述方法可以分离到不少于40种抗体。将所得的抗体加入到T细胞培养系统(通过混合BALB/c小鼠的T细胞与C57BL/6小鼠的脾细胞而获得的混合的淋巴细胞反应)中，选择遏制T细胞生长的抗体。选择了 10种这样的抗体。为了鉴定出由这些抗体之一(mCD98Ab)识别的分子，用NP40溶解BALB/c小鼠的脾细胞，并将抗体加入到溶解的蛋白质分子混合物中。利用蛋白G分离抗体 蛋白复合物，并用SDS凝胶分开。通过银染色显现被分开的蛋白。如图1中所示，将一条特异性反应的75kD条带切出，用质谱(LC-MAS)鉴定。结果，发现被识别的分子是⑶98重链。该抗体用Western印迹不反应,发现它是识别高级结构的抗体。将产生该抗体的抗小鼠CD98抗体产生细胞于2010年7月8日在独立行政法人制品评价技术基础机构(2-5-8 Kazusakamatri, Kisarazu-shi, Chiba, Japan)进行国内保藏，于 2011 年 2 月 7 日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，被给予保藏号NITEBP-964(原保藏日2010年7月8日)。由NITE BP-964产生的抗体又称为3-142抗体。(实施例2)本发明的抗小鼠⑶98抗体(mCD98Ab)的反应性为了确认本发明的mCD98Ab的反应性，通过导入小鼠⑶98基因(mCD98，GenBank/EMBL/DDBJ登录号U25708)产生了表达CD98的CHO细胞(293T/CD98)。即，将导入了小鼠⑶98基因的pcDNA3.1或单独的pcDNA3.1通过电穿孔法转染到CHO细胞中。为了选择⑶98基因掺入CHO细胞基因组的细胞，通过使用G418进行了药物筛选，分离了药物抗性细胞。细胞使用大鼠免疫球蛋白G (对照抗体)或mCD98Ab染色，洗涤以去除游离抗体，并用PE-标记的抗大鼠IgG染色。结果如图2所示。本发明的mCD98Ab与无⑶98基因导入的细胞无反应，而与导入了⑶98基因的细胞反应。左图显示了用pcDNA3.1单独转染的细胞，右图显示导入了小鼠CD98基因的细胞。上面的结果掲示，本发明的mCD98Ab特异性地识别CHO细胞中表达的小鼠⑶98。(实施例3)本发明的抗小鼠⑶98抗体(mCD98Ab)的抗炎症作用为了评估本发明的mCD98Ab的功能，制备了 OVA免疫模型。S卩，通过皮下注射OVA (卵白蛋白)蛋白和完全弗氏佐剂混合的复合物来免疫致敏BALB/c小鼠。以小鼠免疫致敏的首日作为第0天，在第2、4、6和8天对小鼠腹膜内施用对照抗体或抗CD98抗体(各200 u g)。在第10天，从小鼠分离血清，并通过ELISA方法测量其中的OVA-特异性IgM和IgG。S卩，以50 ii g/ml的浓度将卵白蛋白固相化到96孔板上，并与收集的血清反应。用HRP标记的抗小鼠IgG检测抗卵白蛋白抗体。结果如图3所示。在图3中，在施用了本发明的抗小鼠CD98抗体的组中观察到OVA抗体产生的显著減少。由于用已知的抗CD98抗体没有观察到过显著減少血液抗原特异性抗体效价的作用，因此认为该作用是本发明的抗CD98抗体的特征。(实施例4)本发明的抗小鼠⑶98抗体(mCD98Ab)对边缘区的B细胞的效果为了评价本发明的mCD98Ab的功能，确认了对边缘区的B细胞的效果。首先，将对照抗体或抗CD98抗体(各200i!g)腹膜内施用给BALB/c小鼠。施用后两天，分离小鼠脾细胞，用小鼠抗CD23抗体和小鼠抗CD21抗体染色，并用流式细胞仪检查。结果如图4所示。在抗小鼠⑶98抗体施用组中观察到⑶21胃^23ィ￡级分的消失。该级分是称为边缘区B细胞的细胞群体。用已知的抗CD98抗体尚未观察到此作用(边缘区B细胞的消失)。 (实施例5)本发明的抗小鼠⑶98抗体(mCD98Ab)对T淋巴细胞活化的遏制效果为了评价本发明的mCD98Ab的功能，利用下述T细胞细胞刺激系统进行了研究。首先，分离了 C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠的脾细胞，并使用氯化铵溶液溶血。然后，将BALB/c小鼠的脾细胞在50 ii g/ml丝裂霉素C溶液中培养45 min，并进行停止DNA合成的操作。然后，将C57BL/6小鼠的脾细胞和BALB/c小鼠的脾细胞混合培养3天。在培养终了前6小时时添加[3H]-胸苷，并且在培养完成之后，利用液体闪烁计数器验证其摄取。在添加[3H]-胸苷的同时分别添加20 u g/ml的对照IgG或mCD98Ab。结果示于图5中。本发明的mCD98Ab显示遏制T淋巴细胞刺激活性。(实施例6)本发明的抗小鼠CD98抗体对I型糖尿病模型小鼠的治疗效果为了评估本发明的mCD98Ab的功能，制备了下述I型糖尿病-模型小鼠，施用本发明的抗小鼠CD98抗体，并确认了其效果。所述I型糖尿病模型是对NOD小鼠(雌性，10周龄)腹膜内施用环磷酰胺(CPM)两次(间隔2周)而导致糖尿病发病的系统。当空腹血糖连续两次不低于250mg/dl时,诊断小鼠为患有糖尿病。NOD小鼠是久为人知的I型糖尿病模型小鼠，而且已知其可自然发生糖尿病。但是，施用CPM可以早期诱发糖尿病。因此，这次使用了这种模型。(I)抗小鼠⑶98抗体的I型糖尿病发病预防效果首先，在第一次CPM施用的同日施用抗小鼠⑶98抗体(200 iig/小鼠)，且每3日一次腹膜内施用6次。作为对照，使用大鼠IgG抗体(200 u g/小鼠)代替抗小鼠CD98抗体，并以相同的方式每3日一次腹膜内施用6次。结果如图6所示，其中■显示抗小鼠CD98抗体施用组， 显示对照组。如图6所示，抗小鼠⑶98抗体的施用显著遏制的糖尿病的发病。此外，对于抗小鼠⑶98抗体施用组和对照组中的每只小鼠摘出脾脏，用福尔马林固定，并制备石蜡切片。切出薄层切片后，用对切片染色。其显微镜照片如图7所示。对照组的胰脏显示P细胞的坏死脱落，如图7的左图所示。然而，抗小鼠⑶98抗体施用组未显示P细胞的大变化，如图7的右图所示。(2)抗小鼠⑶98抗体在I型糖尿病发病后的治疗效果对NOD小鼠从15周龄起观察尿糖和血糖,将显示尿糖阳性和平时血糖(casualblood glucose)超过200mg/dl的小鼠评估为已经糖尿病发病。对糖尿病发病的小鼠，在发病之时和6天后腹膜内施用抗小鼠⑶98抗体(200 iig)。每隔一天测量血糖，检查糖尿病发病是否被遏制。如图8所示，通过两次施用抗体，血糖水平有显著降低的倾向。由此可知，本发明的抗CD98抗体即使对已经发病一次的I型糖尿病也具有有效的治疗效果。(实施例7)抗人⑶98抗体的产生
如下产生本发明的抗人⑶98抗体。首先，通过电穿孔法将人⑶98基因(hCD98, GenBank/EMBL/DDBJ accession no. AB018010)导入 CHO 细胞。由于组入了人 CD98基因的质粒具有新霉素抗性基因，选择具有新霉素抗性的CHO细胞。结果，建立了组成性表达人⑶98 (CH0-h⑶98)的CHO细胞。将上述的CH0_h⑶98施用给Wistar大鼠以进行免疫致敏(三次，间隔2周)。将经免疫的大鼠的脾细胞与SP2细胞根据常规方法融合以制备杂交瘤。使用该杂交瘤和流式细胞仪，选择了与CH0-hCD98反应但不与CHO细胞反应的抗体。结果，建立了总共9种认为是识别人CD98的抗体。这些抗人⑶98抗体中的一种显示出与实施例1中的抗小鼠⑶98抗体相似的细胞粘附抑制活性，如实施例8所示。产生该抗体的抗人⑶98抗体产生细胞于2010年11月30日在独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(2-5-8 Kazusakamatri, Kisarazu-shi, Chiba, Japan)进行了国内保藏(NITE P-1007)，于2011年2月7日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并给予保藏号NITE BP-1007(原保藏日2010年11月30日)。由NITE BP-1007产生的抗体又称为h⑶98-314抗体。(实施例8)本发明的抗人CD98抗体和抗小鼠CD98抗体的细胞粘附抑制效果的测
试根据实施例7的方法，将小鼠⑶98基因或人⑶98基因导入CHO细胞，并通过药物筛选建立了组成性表达和小鼠CD98或人CD98的CHO细胞系。将建立的细胞与不同浓度的实施例1的抗小鼠CD98抗体或实施例7的抗人CD98抗体在4°C反应30分钟，并洗涤细胞。将上述细胞播种在其中固相化有纤连蛋白的24孔板中，并在播种后4小时计数铺展细胞(spreading cells)。将无抗体处理组中的铺展细胞的数目作为100%,并评价了用抗体处理时的铺展抑制率。结果示于图9。如图9中所示，抗小鼠CD98抗体和本发明的抗人CD98抗体都抑制了 CHO细胞的铺展。也就是说，两种抗体都显示了同等的抑制T细胞粘附的能力。
(实施例9)本发明的抗小鼠CD98抗体对类风湿性关节炎模型小鼠的治疗效果根据已知文献制成了诱导型关节炎模型小鼠(Kijima M. et al.，J Immunol. 2009Mar 15; 182 (6) :3566-72)。首先，将通过混合并乳化牛胶原蛋白II和完全佐剂而获得的乳液对DBA/1J小鼠(7周龄，雄性，10只小鼠)施用两次以进行免疫致敏，诱导关节炎。結果，制备了以关节肿胀、发红为主要症状的关节炎发病的模型小鼠。(I)抗小鼠⑶98抗体的关节炎发病预防效果将两组DBA/1J小鼠(7周龄，雄性，10只小鼠)分成抗体施用组和非抗体施用组，并且在施用通过混合并乳化牛胶原蛋白II和完全佐剂而获得的乳液之前2天，对施用组施用抗小鼠⑶98抗体(200 iig/小鼠)，并对非施用组施用大鼠IgG(100iig/小鼠)。在第一次施用牛胶原蛋白II之后第2、4和6天,如上述一样对施用组施用抗小鼠⑶98抗体(200 u g/小鼠)，对非施用组施用大鼠IgG(100ii g/小鼠)。此外,在第26天,第二次施用牛胶原蛋白II，观察评价关节炎的发病。结果如图10所示。图10提供了临床得分的均值土标准偏差。横轴显示自第二次胶原蛋白免疫起的天数。如结果显示，抗小鼠CD98抗体施用组与非施用组相比显示了胶原蛋白诱导的关节炎发病的显著遏制，并显示所述抗小鼠CD98抗体具有关节炎预防效果。(2)抗小鼠⑶98抗体的关节炎发病后的治疗效果和前项同样地，将2组DBA/1J小鼠(7周龄，雄性，10只小鼠)分成抗体施用组和非施用组，同样地施用牛胶原蛋白II， 第26天再次施用牛胶原蛋白II，等待关节炎发病。在第二次施用牛胶原蛋白II之后第3、5、7、9和11天，对施用组施用抗小鼠⑶98抗体(400 yg/小鼠)，对非施用组施用大鼠IgG(100ii g/小鼠)。结果如图11所示。在图11中，横轴显示关节炎发病后的天数。此外，临床得分以均值土标准偏差显示。如结果中所示，与非施用组相比，抗小鼠CD98抗体施用组即使对发病一次的关节炎也显示了良好的遏制效果。因此，显示所述抗小鼠CD98抗体对关节炎的治疗是有效的。(实施例10)本发明的抗小鼠CD98抗体对类风湿性关节炎模型小鼠的脾细胞中的T细胞活化的遏制效果在实施例9(2)中进行了关节炎模型处理实验之后，第二次施用牛胶原蛋白II，之后第20天，分离施用组和非施用组中每只小鼠的脾脏。对分离的小鼠脾细胞以50y g/ml的浓度添加牛胶原蛋白II，将混合物培养72小吋。在培养终了前8小时，加入[3H]-胸苷(I微居(UCi))，并在培养终了后利用液体闪烁计数器计数脾细胞的[3H]-胸苷摄取。结果如图12所示。图12显示以不添加胶原蛋白(CU)的组为I时，添加胶原蛋白时的増加率。从这些结果发现，施用本发明的抗小鼠CD98抗体显著遏制T细胞的活化。(实施例11)抗小鼠CD98抗体和抗人CD98抗体对细胞的氨基酸摄取的抑制效果(I)抗小鼠⑶98抗体的抑制效果NIH3T3细胞用终浓度为30 u g/ml的实施例1制备的抗小鼠CD98抗体于37°C处理30分钟。处理之后，洗涤细胞，添加[3H]-亮氨酸(ly Ci)，并将混合物于37°C温育10分钟。洗涤细胞之后，加入裂解缓冲液(IOOiU)以裂解细胞。收集裂解物的上清液，并计算上清液中每单位蛋白的放射剂量。结果如图13a)所示。从图上清楚可见，与通过添加IgG作为对照获得的测试结果相比，抗小鼠CD98抗体显示完全不抑制NIH3T3细胞的氨基酸摄取。(2)抗人⑶98抗体的抑制效果使用实施例7中制备的293T细胞和抗人CD98抗体，进行了如上述(I)中同样的操作。结果如图13 b)所示。从图上清楚可见，与通过添加IgG作为对照获得的测试结果相比，抗人CD98抗体显示完全不抑制293T细胞的氨基酸摄取。(实施例12)编码抗小鼠CD98抗体或抗人CD98抗体的基因的分析(I)抗小鼠⑶98抗体的分析将实施例1中获得的产生3-142抗体的杂交瘤在含有10% FBS的RPMI1640培养基中培养，并利用RNAiso Plus(Takara)从大约IOx IO7个细胞中提取总RNA。提取方法遵照试剂所附的文档。将该总RNA溶解在无核酸酶水(Ambion)中，并利用无RNA酶的DNA酶I(Takara)按照所附的文档进行DNA降解处理。为了从该总RNA获取cDNA，利用寡聚dT引物和PrimeScript RT-PCR试剂盒(Takara)进行逆转录实验。利用cDNA作为模板和PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Takara),扩增了抗体的可变区。所用的引物为用于Y 链的5’ -CGG AAT TCA GGT (GC) (AC)A(AG) CTG CAG(GC)AGT-3’ (SEQ ID NO:9)和 5’ -GCG GAT CCG GAC AGG GCT CCA GAG TTC CA-3’ (SEQ IDNO: 10);用于 K 链的:5，-GCG AAT TCG ACA (CT) (CT) (AGC) (AT)G(AC)TGA C(ACT)C AGTCTC-3，(SEQ ID NO: 11)和 5，-CGC GAA GCT TTC AGT AAC ACT GT(CT)CAG GAC A_3’ (SEQID NO:12)(Patrik Wernhoff et. al. , Int.1mmunol.，13(7)pp909_919, 2001)。用于Y链 的PCR包括在98°C加热20分钟后，将下面三步进行40个循环98°C10秒、57°C 5秒、和72°C 2分钟。用于k链的PCR包括在98°C加热20分钟后，将下面三步进行40个循环98°C 10秒、55°C 5秒、和72°C 2分钟。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳，在Y链的PCR中确认了大约700bp的单条带，在K链的PCR中确认了大约550bp的单条带。将这些条带切出并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。将经纯化的产物利用Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)进行直接测序,使用3100-Avant基因分析仪(AppliedBiosystems)分析序列。3-142抗体的包含重链可变区和轻链可变区的DNA序列,和包含重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为如下SEQ ID NO所示的序列。<3-142抗体的重链可变区核酸序列>ATGGACACCAGGCTCAGCTTGGTTTTCCTTGTCCTTTTCATAAAAG GTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTG CAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACT TTCAGTGACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAAGAAGGGT CTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTTATGAGGGTAGTAGTATTTACTATGG AGACTCCGTGAAGGGCCGAGTCACTATCTCCAGAGATAATGCAAAAAG CACCCTATACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCAC TTATTACTGTGCAAGACGGGGATACTATGGATATAAGCCCTTCGATTACT GGGGCCAAGGAGTCATGGTCACAGTCTCCTCAGCCCAAACAACAGCC CCATCTGTCTATCCACTGGCTCCTGGATGTGGTGATACAACCAGCTCCA CGGTGACTCTGGGATGCCTGGTCAAGG(SEQ ID NO:1)<3-142抗体的重链可变区氨基酸序列>MDTRLSLVFLVLFIKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFT FSDYYMAffVRQAPKKGLEffVASISYEGSSIYYGDSVKGRVTISRDNAKS TLYLQMNSLRSEDTATYYCARRGYYGYKPFDYWGQGVMVTVSSAQTTAPSVYPLAPGCGDTTSSTVTLGCLVK(SEQ ID NO :2)<3-142抗体的轻链可变区核酸序列>GTCACCATCGAATGTCGAGCAAGTGAAGACATTTACAATGGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATA ATATAGATAACTTGCATACTGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGG ATCTGGTACACAGTATTCTCTCAAGATAAACAGCCTACAATCGGAGGAT GTCGCAAGTTATTTCTGTCAGCAGTATTACACTTATGCGTACACGTTTG GAGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACT GTATCCATCTTCCCACCATCCATGGAACAGTTAACATCTGGAGGTGCCA CAGTCGTGTGCTTCGTGAACAACTTCTATCCCAGAGACATCAGTGTCA AGTGGAAA(SEQ ID NO:3)<3-142抗体的轻链可变区氨基酸序列>VTIECRASEDIYNGLAWYQQKPGKSPQLLIYNIDNLHTGVPSRFSGSG SGTQYSLKINSLQSEDVASYFCQQYYTYAYTFGAGTKLELKRADAAPTVS IFPPSMEQLTSGGATVVCFVNNFYPRDISVKWK(SEQ ID NO:4)(2)抗人⑶98抗体的分析按照与上述(I)中对小鼠CD98抗体分析相同的方式，考察了实施例7中获得的h⑶98-314抗体的包含重链可变区和轻链可变区的DNA序列，以及包含重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。所述序列由下列SEQ ID NO显示。<hCD98_314抗体的重链可变区核酸序列>CACAGACTACTCACCATGGACATCAGGCTCAGCTTGGCTTTCCTTG TCCTTTTCATAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT G GGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGACGGTCCATGAAACTCTCCTGTGCAG CCTCAGGATTCACTTTCAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGC TCCAACGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTGCTGGTGGTGT TAACAATTACTATCGAGACTCCATGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGA GATAATGCAAAAAGCACCCTATACCTGCAAATGGACGGTCTGAGGTCT GAGGACACGGCCACTTATTACTGTGCACGACTTGTGAATAATTTAGGTA CAAACGTGTTTCCTGACTGGGGCCAAGGCACTCTGGTCACTGTCTCTT TAGCCCAAACAACAGCCCCATCTGTCTATCCACTGGCTCCTGGATGTGG TGATACAACCAGCTCCACGGTGACTCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTA TTTCCCTGAG(SEQ ID NO:5)<h⑶98-314抗体的重链可变区氨基酸序列>HRLLTMDIRLSLAFLVLFIKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSMKLSCA ASGFTFSNYYMAffVRQAPTKGLEffVASISAGGVNNYYRDSMKGRFTISR DNAKSTLYLQMDGLRSEDTATYYCARLVNNLGTNVFPDWGQGTLVTVSL AQTTAPSVYPLAPGCGDTTSSTVTLGCLVKGYFPE(SEQ ID NO:6)<h⑶98-314抗体的轻链可变区核酸序列>GCTGTGTCAGCGGGAGAGGCGGTCACTATAAACTGCAAGTCCAGT CAGAGTCTTTTATCCAGTGGAAACCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTAC CAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCT ACTAGGCAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGA CAGACTTCACTCTGACCATCAGCGGTGTGCAGGCAGAAGATCTGGCAG TTTATTACTGTCAGCAGTATAAGGAAATTCCGCTCACGTTCGGTTCTGGGA CCAAACTGGAGATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCT TCCCACCATCCATGGAACAGTTAACATCTGGAGGTGCCACAGTCGTGT GCTTCGTGAACAACTTCTATCCCAGAGACATCAGT GTCAAGTGGAAGATTGATGGCAG(SEQ ID NO:7)<h⑶98-314抗体的轻链可变区氨基酸序列>AVSAGEAVTINCKSSQSLLSSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWAS TRQSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISGVQAEDLAVYYCQQYKEIPLTFGSGTK LEIKRADAAPTVSIFPPSMEQLTSGGATVVCFVNNFYPRDISVKffKIDG (SEQ ID NO :8)(3)抗⑶98抗体的系统树的作成比较了本发明的抗⑶98抗体与ー种常规抗⑶98抗体的可变区中的DNA序列，并作成了系统树。作为常规抗CD98抗体的可变区中的DNA序列，使用了专利文献3中报道的K3、3-69-6、C2IgGl和1-40-1的可变区中的DNA序列。启动CLUSTALff 版本1. 83 (http: //clustalw. ddb j. nig. ac. jp/top-j. html),分别输入上述(I)中获得的3-142抗体的重链和轻链可变区核酸序列、以及K3、l-40-l、3-69-6和C2IgGl的重链和轻链可变区核酸序列，以给出分析結果。然后，启动MEGA4. 0.2 (http://www. megasoftware. net/mega4/mega. html),打开 CLUSTALW 中获得的数据，形成系统树。结果如图14所示。(4)抗⑶98抗体的互补性区域的确定基于上述(1)-(3)中获得的序列信息，确定了本发明的抗CD98抗体的互补性区域(CDR)1- 3。具体地说，它们是通过与所述常规抗CD98抗体的重链可变区氨基酸序列或轻链可变区氨基酸序列比较来确定的。重链CDR 1-3的位置以常规抗体的可变区(大鼠(杂交瘤YTH906)免疫球蛋白可变区(http://www.ncb1.nlm.nih. gov/nuccore/M87783.1))的序列(SEQ ID NO: 25)为參考来确定。此外，还通过使用专利文献3中描述的常规抗⑶98抗体C2IgGl重链(专利文献3中的SEQ ID NO:43 ;本说明书中的SEQ ID NO: 26)，并利用ABG: J几体 3D 结构目求(http://www.1bt. unam. mx/vir/structure/structures, ntml) >^于 Ig 序列的 BLAST (http://www. ncb1. nlm. nih. gov/igblast)等等来加以确定(图 15)。
轻链⑶R 1-3的位置以常规抗体的可变区(褐家鼠(杂交瘤53R-4)免疫球蛋白重排的 K _ 链 mRNA 可变(V)区，部分 ds (http://www. ncb1. nlm. nih. gov/nuccore/L07407.1)) (SEQ ID N0:27)为參考来加以确定。此外，还通过使用专利文献3中描述的常规抗⑶98抗体C2IgGl的轻链(专利文献3中的SEQ ID NO:83 ;本说明书中的SEQ IDNO: 28)，按与重链相同的方式来确定(图16)。3-142抗体的重链可变区和轻链可变区中的⑶Rl-⑶R3的氨基酸序列，以及h⑶98-314抗体的重链可变区和轻链可变区中的⑶Rl-⑶R3的氨基酸序列分别为下述SEQID NO所示的序列。<3-142抗体的重链可变区CDR1>DYYMA(SEQ ID NO:13)<3-142抗体的重链可变区CDR2>SISYEGSSIYYGDSVKG(SEQ ID NO:14)<3-142抗体的重链可变区CDR3>RGYYGYKPFDY(SEQ ID NO:15)<3-142抗体的轻链可变区CDR1>RASEDIYNGLA(SEQ ID NO:16)<3-142抗体的轻链可变区CDR2>NIDNLHT(SEQ ID NO:17)<3-142抗体的轻链可变区CDR3>
QQYYTYAYT(SEQ ID NO:18)<hCD98_314抗体的重链可变区CDR1>NYYMA(SEQ ID NO:19)<hCD98_314抗体的重链可变区CDR2>SISAGGVNNYYRDSMKG (SEQ ID NO :20)<hCD98_314抗体的重链可变区CDR3>LNNLGTNVFPD(SEQ ID NO:21)<hCD98_314抗体的轻链可变区CDR1>KSSQSLLSSGNQKNYLA(SEQ ID NO :22)<hCD98_314抗体的轻链可变区CDR2>WASTRQS(SEQ ID NO :23)
<hCD98_314抗体的轻链可变区CDR3>QQYKEIPLT(SEQ ID NO:24)序列表自由正文SEQ ID N0:9:引物 U 链)SEQ ID NO: 10:引物 U 链)SEQ ID NO: 11:引物(k 链)SEQ ID NO: 12:引物 U 链)工业实用性例如，在糖尿病(尤其是I型糖尿病)的治疗的场合，本发明的抗CD98抗体以及使用该抗体的自身免疫病治疗剂能够遏制脾脏3细胞的坏死或耗竭，从而为新的糖尿病抗体疗法提供了可能。此外，在例如类风湿性关节炎等等的治疗的场合，其能够遏制关节炎的发病和进展，为类风湿性关节炎(rheumatism)的新抗体疗法提供了可能。这样，对于目前为止尚无适切治疗方法的自身免疫病，含有本发明的抗CD98抗体的自身免疫病治疗剂作为不影响能量代谢、导致较少的副作用的治疗药是非常有用的。本申请基于在日本提交的特愿2010-72966、特愿2010-200599、以及特愿2010-273455，将它们的内容全部并入本文。本文通过提述并入本申请中引用的任何专利文献和非专利文献中公开的全部内容，如果这些内容已经在本文中公开一样。
权利要求
1.抗⑶98抗体或其功能性片段，其包含这样的重链，所述重链包含SEQID NO: 19所示的序列作为CDR1、SEQ ID NO:20所示的序列作为CDR2、以及SEQ ID NO:21所示的序列作为 CDR3。
2.抗⑶98抗体或其功能性片段，其包含这样的轻链，所述轻链包含SEQID NO: 22所示的序列作为CDR1、SEQ ID NO:23所示的序列作为CDR2、以及SEQ ID NO:24所示的序列作为 CDR3。
3.抗⑶98抗体或其功能性片段，其包含SEQID NO: 19所示的序列作为重链的⑶R1、SEQ ID N0:20所示的序列作为重链的⑶R2、以及SEQ ID NO:21所示的序列作为重链的CDR3，SEQ ID NO:22所示的序列作为轻链的CDR1、SEQ ID NO:23所示的序列作为轻链的CDR2、以及SEQ ID NO: 24所示的序列作为轻链的CDR3。
4.根据权利要求1-3中任一项的抗CD98抗体或其功能性片段，其包含分别作为重链可变区和轻链可变区的两个序列SEQ ID NO:6和8。
5.根据权利要求1-4中任一项的抗CD98抗体或其功能性片段，其中所述抗CD98抗体来源于 NITE BP-1007。
6.根据权利要求1-5中任一项的抗CD98抗体或其功能性片段，其中抗体重链恒定区的类别是IgG0
7.根据权利要求1-6中任一项的抗CD98抗体或其功能性片段，其中上述功能性片段选自抗体的重链和轻链可变区(Vh和Vl)、Fab、Fab’、F(ab，)2、Fv、Fd、scFv、sdFv及它们的组八口 o
8.抗⑶98抗体或其功能性片段，其包含这样的重链，所述重链包含SEQID NO: 13所示的序列作为⑶Rl、SEQ ID NO: 14所示的序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO: 15所示的序列作为 CDR3。
9.抗⑶98抗体或其功能性片段，其包含这样的轻链，所述轻链包含SEQID NO: 16所示的序列作为CDR1、SEQ ID NO: 17所示的序列作为CDR2，以及SEQ ID NO: 18所示的序列作为 CDR3。
10.权利要求8或9的抗⑶98抗体或其功能性片段，其包含SEQID NO: 13所示的序列作为重链的⑶Rl、SEQ ID NO: 14所示的序列作为重链的⑶R2、以及SEQ ID NO: 15所示的序列作为重链的CDR3，SEQ ID NO: 16所示的序列作为轻链的CDR1、SEQ ID NO: 17所示的序列作为轻链的⑶R2、以及SEQ ID NO: 18所示的序列作为轻链的⑶R3。
11.根据权利要求8-10中任一项的抗CD98抗体或其功能性片段，其包含分别作为重链可变区和轻链可变区的两个序列SEQ ID NO:2和4。
12.根据权利要求8-11中任一项的抗CD98抗体或其功能性片段，其中抗体重链恒定区的类别是IgG。
13.根据权利要求8-12中任一项的抗CD98抗体或其功能性片段，其中所述功能性片段选自抗体的重链和轻链可变区％和VL)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、scFv、sdFv以及它们的组合。
14.根据权利要求8-13中任一项的抗CD98抗体或其功能性片段，其中所述抗CD98抗体来源于NITE BP-964。
15.一种细胞，其表达权利要求1-14中任一项的抗⑶98抗体或其功能性片段。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项的抗CD98抗体或其功能性片段作为活性成分。
17.一种自身免疫病治疗剂，其包含权利要求1-14中任一项的抗CD98抗体或其功能性片段作为活性成分。
18.权利要求17的治疗剂，其中所述自身免疫病为I型糖尿病、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、银屑病、克罗恩氏病、系统性红斑狼疮或巴塞多病。
19.权利要求17或18的治疗剂，其中所述自身免疫病是I型糖尿病或类风湿性关节炎。
20.权利要求17-19中任一项的治疗剂，其中所述抗⑶98抗体 a)在CD98的重链中具有结合位点， b)对CD98的氨基酸摄取没有影响，并且 c)对T淋巴细胞活化具有遏制作用。
21.—种产生权利要求8-14中任一项所述的抗CD98抗体或其功能性片段的方法，包括将包含两个序列SEQ ID ΝΟ:1和3的表达载体导入宿主、培养所述宿主、以及从培养物获得所述抗体。
22.—种产生权利要求1-7中任一项所述的抗CD98抗体或其功能性片段的方法，包括将包含两个序列SEQ ID NO: 5和7的表达载体导入宿主、培养所述宿主、以及从培养物获得所述抗体。
23.权利要求21或22所述的方法，其中所述宿主选自下组大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、植物和哺乳动物(不包括人)。
24.一种预防或治疗自身免疫病的方法，包括对目标施用治疗有效量的权利要求1-14中任一项所述的抗CD98抗体或其功能性片段。
25.权利要求1-14中任一项所述的抗CD98抗体或其功能性片段，用于自身免疫病的预防或治疗。
全文摘要
公开了一种自身免疫病，尤其是1型糖尿病和类风湿性关节炎的新治疗剂。可以制备新的抗CD98抗体，并且利用这种抗体可以提供依赖新作用机理的新自身免疫病(1型糖尿病和类风湿性关节炎)治疗剂。这种新的抗CD98抗体不抑制CD98的氨基酸转运。此外，不同于常规的抗CD98抗体，这种新抗CD98抗体具有对T淋巴细胞活化的抑制活性、对纤连蛋白介导的细胞粘附的抑制活性，以及对OVA致敏模型中OVA抗体产生的抑制活性等活性。
文档编号A61P3/10GK103038255SQ20118002602
公开日2013年4月10日 申请日期2011年3月25日 优先权日2010年3月26日
发明者安友康二 申请人:国立大学法人德岛大学