副痘病毒载体的制作方法

专利名称：副痘病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含来源于犬瘟热病毒(CDV)的异源DNA的重组副痘病毒以及它们在免疫原性组合物和疫苗中的用途。本发明还涉及用于接种以抗CDV、治疗或预防由CDV引起的疾病的方法。本发明还涉及重组副痘病毒用于诊断的用途。
背景技术：
痘病毒科(Poxviridae)的病毒为椭圆形、相当大的双链DNA病毒。副痘病毒属(Parapoxvirus，PPV)包括在此类病毒中。它们测量为长度约220_300nm，宽度140_170nm。它们具有独特的使它们与其它痘病毒相区别的螺旋形外壳。PPV被分成3个不同物种。然而，仍然未清楚这些病毒是副痘病毒属内的独立物种，还是它们就是相同的物种。第一物种，绵羊副痘病毒(Parapoxvirus ovis, ORF病毒，0RFV)，被认为是该属的原型。其也称为传染性痘疮病毒、接触性脓疮皮炎病毒或orf病毒。第二物种，牛副痘病毒(Parapoxvirus bovis) I,也称为牛脓疱口炎病毒或牛丘疫口炎病毒。第三物种，牛副痘病毒2，也称为乳房痘病毒(udderpoxvirus)、副痘苗病毒、假牛痘病毒或挤乳者结节病毒。副痘病毒物种常见于反刍动物中。已在赤鹿、驯鹿、红松鼠和斑海豹中发现PPV。PPV感染可引起动物和人的局部疾病。PPV物种的动物传染病的宿主为绵羊、山羊和牛。它们通过与被感染的动物直接接触，与局部表皮损伤(所述损伤愈合而不留下疤痕)反应来引起人的感染。防疫措施例如疫苗可用于控制疾病。先前已描述了用于表达外来遗传信息的、基于禽痘病毒、洗熊痘病毒、羊痘病毒、猪痘病毒或痘苗病毒的载体(参见US5，942，235和US7，094，412)。副痘病毒代表可用于载体疫苗的不同候选物。然而，由于痘病毒的各个属之间的形态学、结构和遗传差异，用于此类痘病毒的方法不能用于副痘病毒。此类差异的一个实例是，ORFV失去胸苷激酶(TK)基因，所述基因用于不同正痘病毒的重组体的选择。此外，一些痘病毒还具有凝集红细胞的能力，这通过表面蛋白质血细胞凝集素来介导，然而副痘病毒不具有该能力。PPV可具有免疫调节作用，因为它们刺激脊椎动物的一般性(非特异性)免疫反应。它们已成功地用于兽医学，用于增加动物的一般抗性。可将它们与同源和/或异源抗原组合，以提供具有持续数月至数年的病原体特异性作用以及快速的非病原体特异性作用的疫苗。绵羊副痘病毒先前已被用作载体，如美国专利6，365，393; Rziha等人，2000, J.Biotechnol.，83，137-145 ;W02004/054614 和 Fischer 等人，2003，J.Virol.77，9312-9323 中所描述的。当用作载体时，其提供显著的有利方面，包括非常窄的宿主范围，不存在全身性感染，短期载体特异性免疫(允 许重复免疫)，早期接种(可在母体抗体存在的情况下开始免疫的诱导)，和有益的免疫调节性质。本发明涉及，将副痘病毒用作来源于犬瘟热病毒的异源DNA的载体。绵羊副痘病毒株D1701是能够以与野生型病毒的滴度相当的滴度在细胞培养物中增殖的高度减毒的株系。其在支持感染性载体病毒复制的宿主(例如，绵羊和山羊)和不支持感染性载体病毒复制的宿主(例如，狗、猪、马、小鼠和大鼠)中具有突出的免疫刺激性质。来源于病毒株D1701的、作为化学灭活的绵羊副痘病毒的制剂的Zylexis (先前称为Baypamime )用于感染性疾病的预防性、metaphylaxis和治疗性治疗以及用于预防动物的应激诱导的疾病(stress-1nduced disease)。犬瘟热是在世界范围内存在的狗和其它食肉动物的高度感染性、急性或亚急性、发热性病毒性疾病。一些狗显示原发性呼吸道体征、其它肠体征，并且至少30%的动物产生神经学症状。所有实验上感染的狗在中枢神经系统中具有组织病理学损伤。死亡率在30%至80%之间。在少数案例中，已恢复的狗继续在脑细胞中携带病毒，在脑细胞中病毒缓慢地复制并且最终产生老犬脑炎。经历犬瘟热而存活的狗对再感染具有终身免疫。推荐进行免疫以控制狗的犬瘟热；推荐每年进行再接种。犬瘟热由犬瘟热病毒(CDV，麻疹病毒属(Morbi llivirus)和副粘液病毒科(Paramyxoviridae)的成员)引起。CDV与引起麻疹和牛疫的病毒密切相关。犬瘟热病毒体具有包被，且包含15，616个核苷酸的负链RNA基因组。已对适应细胞培养的Onderstepoort (OP-Q)V)株的整个基因组进行了测序(Sidhu等人，1993,Virologyl93, 50-65)。病毒基因组编码6个蛋白质:核衣壳(N)蛋白、磷蛋白(P)、基质(M)蛋白、融合(F)蛋白、血凝素⑶蛋白和巨大(L)蛋白。基因按下述顺序(3’-5’):N、P、Μ、F、H和L排列在基因组RNA中。每一种蛋白质都从转录自负链RNA模板的独特mRNA翻译而来。H和F蛋白都为糖蛋白，且位于病毒包膜中。F蛋白前体(FO)经历翻译后切割，从而产生 Fl 亚单位蛋白(Cherpillod 等人,2004, Arch.Virol.149, 1971-1983)。发明概述本发明总地来说涉及重组副痘病毒，特别地绵羊副痘病毒(PPVO)用于介导快速的先天免疫应答以及抗犬瘟热病毒的长效的外来基因特异性免疫的用途。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括来源于犬瘟热病毒的异源DNA。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701-V。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-Η。在另一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括SEQ ID N0:2或与SEQ ID N0:2具有至少98%的同一'丨生的多核苷酸分子。在一个实施方案中，将异源DNA插入绵羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H中。在另一个实施方案中，将异源DNA插入绵羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H内的VEGF编码序列或相邻非编码序列内。本发明包括制备重组副痘病毒的方法，其包括将异源DNA插入副痘病毒的基因组。在一个实施方案中，所述方法包括使用绵羊副痘病毒。在一个实施方案中，所述方法包括使用绵羊副痘病毒株D1701。在一个实施方案中，所述方法包括使用绵羊副痘病毒株D1701-V。在一个实施方案中，所述方法包 括制备绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-Η。在一个实施方案中，所述方法包括制备绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-F。在一个实施方案中，所述方法中使用的异源DNA包括编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，所述方法中使用的异源DNA包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID N0:2或与SEQ ID N0:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。本发明包括疫苗或免疫原性组合物,所述疫苗或免疫原性组合物包含含有来源于犬瘟热病毒的异源DNA的重组副痘病毒以及载体。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701。在另一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701-V。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-H。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。在一个实施方案中，异源DNA包括编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，异源DNA包括编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID NO: 2或与SEQ ID NO: 2具有至少98%的同一'I"生的多核苷酸分子。本发明包括制备疫苗或免疫原性组合物的方法，其包括将含有来源于犬瘟热病毒的源DNA的重组副痘病毒与载体组合。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701。在另一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701-V。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-Η。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。在一个实施方案中，异源DNA包括编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，异源DNA包括编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID N0:2或与SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。本发明包括在动物受试者中诱导抗犬瘟热病毒的免疫应答的方法，其包括给所述动物施用治疗有效量的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物包含含有来源于犬瘟热病毒的异源DNA的重组副痘`病毒以及载体。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701。在另一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒株D1701-V。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-H。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。在一个实施方案中，异源DNA包括编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，异源DNA包括编码犬痕热病毒的F蛋白或其片段。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID N0:2或与SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一个实施方案中，免疫应答为CDV特异性抗体的诱导。在一个实施方案中，诱导了抗-H蛋白-特异性保护性免疫应答。在一个实施方案中，诱导了抗-F蛋白-特异性保护性免疫应答。在另一个实施方案中，免疫应答是抗-H蛋白血清抗体的诱导。在另一个实施方案中，免疫应答是抗-F蛋白血清抗体的诱导。本发明包括接种动物受试者以抗犬痕热疾病的方法,其包括给所述动物施用治疗有效量的包含含有来源于犬瘟热病毒的异源DNA的重组副痘病毒和载体的疫苗或免疫原性组合物。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701。在另一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701-V。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-Η。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-F。在一个实施方案中，异源DNA包括编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，异源DNA包括编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID N0:2或与SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。本发明包括治疗动物受试者以抗犬痕热疾病的方法,其包括给所述动物施用治疗有效量的包括来源于犬瘟热病毒的异源DNA的重组副痘病毒和载体。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701。在另一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701-V。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-H。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-F。在一个实施方案中，异源DNA包括编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，异源DNA包括编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID N0:2或与SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。本发明包括包含来源于犬瘟热病毒的异源DNA的重组副痘病毒用于制备治疗动物以抗犬瘟热疾病的药剂的用途。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701-V。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-H。在另一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括SEQ ID N0:1或与SEQ ID N0:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括SEQ ID NO: 2或与SEQ ID N0:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一个实施方案中，将异源DNA插入绵羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H内。在另一个实施方案中，将异源DNA插入绵羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H内的VEGF编码序列或相邻非编码序列内。本发明包括副痘病毒用于制备用于接种动物以抗犬瘟热疾病的药剂的用途。在一个实施方案中，提供了包括来源于犬痕热病毒的异源DNA的重组副痘病毒。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701。在一个实施方案中，重组副痘病毒包括绵羊副痘病毒株D1701-V。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-Η。在一个实施方案中，重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。在另一个实施方案中，异源DNA包括编码⑶V的H蛋白的基因。在另一个实施方案中，异源DNA包括编码⑶V的F蛋白的基因。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID NO:1或与SEQID N0:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ IDN0:2或与SEQ ID N0:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。本发明提供了确定存在于动物受试者中的副痘病毒的来源的方法。 本文中描述的副痘病毒可在其基因组组成和表达的蛋白质上与野生型株系相区别。这样的区别允许区分接种的和感染的动物。重组绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-H可用于DIVA测定。重组绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-F可用于DIVA测定。下列详细描述公开和包括了这些和其它实施方案。附图概述通过参考所附附图获得对本发明的更好的理解，其中:

图1:质粒pdV-⑶V-H和pdV_⑶V-F的构建。将⑶V H以及⑶V F基因作为BamH1-KpnI 片段克隆入转移质粒 pdV-Recl，以获得质粒pdV-CDV-H(lA)或pdV-CDV_F (IB)。

图2:用D1701-V-CDV-F或D1701-V-CDV-H感染的细胞的免疫过氧化物酶染色(IPMA) ο Vero 细胞用重组 D1701-V-CDV-F (2A)或 D1701-V-CDV_H(2B)进行感染。对照(未感染的)Vero细胞示于2C中。深色染色的细胞显示特异性蛋白质表达。图3:由重组体表达的⑶V-F或-H蛋白的免疫荧光染色。用重组D1701-V-⑶V-H感染Vero细胞8小时(3A)和12小时(3B);或用重组D1701-V-CDV-H感染Vero细胞24小时(3C)。利用兔抗-⑶V-H抗体(1: 2000稀释的)或利用兔抗-⑶V-F抗体(1: 200稀释的)，以及抗-兔-Alexa-555 (1:2000稀释的)实现特异性染色。对于阴性对照，使用未感染的细胞(D)。特异性染色的细胞由箭头标示。图4: ORFV重组体感染的细胞中表达的⑶V的F-基因的Western印迹分析。从未感染的Vero细胞(ni)、从用重组D1701-V-CDV-F(M0I=3.0)感染4至72小时(感染后4、
8、24、48和72小时)的细胞以及从CDV Ondersteport (参照株)感染的细胞(CDV对照)制备蛋白质裂解物。图5:D1701-V-CDV-H的单步骤生长曲线(SSGC)。用亲代病毒D1701-V(空心圆)或用重组D1701-V-CDV-H(实心圆)感染(Μ0Ι=3.0) Vero细胞。图6.通过免疫荧光检测⑶V-H特异性抗体。用重组D1701-V-⑶V-H(IO7Pfu)肌内(1.m.)免疫的小鼠的血清(1: 1000稀释)，图6A-C显示用CDV株Onderstepoort感染的Vero细胞。箭头显示与小鼠抗血清的特异性反应。图6D显示未感染的Vero细胞。图7:克隆的H基因片段的序列。犬瘟热病毒H蛋白的编码区(SEQ IDNO:1; 1824nt)，加上用作用于限制性酶切克隆和分析(BamHI和KpnI)的接头序列的5’ -末端上的20nt和3’ -末端上的21nt。ATG起始密码子以下划线标示。图8:克隆的F基因片段的序列。犬瘟热病毒F蛋白(SEQ ID N0:2;1989nt)的编码区，加上用作用于限制性酶切克隆和分析(BamHI和KpnI)的接头序列的5’-末端上的19nt和3’-末端上的16nt。ATG起始密码子以下划线标示。发明详述除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语将包括复数形式，并且复数术语将包括单数形式。下列定义可用于本发明的实施方案的描述中使用的术语。它们替代通过引用并入本文的每一篇参考资料中包含的任何矛盾的定义。“约”或“大致”，当与可测量的数字变量结合使用时，除非约用于指以周表示的时间间隔(其中“约3周”为17至25天，约2至约4周为10至40天)，否则是指，指定的变量值以及在指定的值的实验误差内(例如，在平均值的95%置信区间内)或在指定的值的10%偏差内(以较大者为准)的所有变量值。如本文中所使用的，术语“动物”和“受试者”包括易于发生犬瘟热感染的任何动物，包括哺乳动物，家养的和野生的。如本文中所使用的，“抗体”为包含抗原结合位点的任何多肽，无论其来源、产生方法或其它特征。其是指由于对抗原的免疫应答而特异性结合该抗原的免疫球蛋白分子或其片段。免疫球蛋白为包含具有“恒定区”和“可变区”的“轻链”和“重链”多肽的血清蛋白，并且基于恒定区的组成进行分类(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。“特异”于给定的抗原的抗体表示，抗体的可变区排他地识别并且结合特异性抗原。该术语包括但不限于:多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、四聚体抗体、四价抗体、多特异性抗体、单链抗体、结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、融合蛋白、ScFc融合蛋白、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂种抗体、突变型抗体和CDR-移植抗体。抗体可以是来源于天然来源或来源于重组来源的完整免疫球蛋白，或可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。“抗体”可被转变成抗原结合蛋白，其包括但不限于抗体片段，所述抗体片段包括但不限于:Fab、F(ab’)2、Fab’片段、Fv片段、单链Fv(ScFv)片段、Fd片段、dAb片段、双体抗体(diabody)、CDR3肽、受限的FR3-CDR3-FR4肽、纳米抗体、双价纳米抗体、小模块免疫药物(small modular immunopharmaceutical, SMIP)和微小抗体(minibody)和任何上述片段，以及它们的化学或遗传操作的对应物，以及保留抗原结合功能的其它抗体片段。通常，此类片段包含抗原结合结构域。如本领域技术人员所认识到的，任何此类分子可被工程化(例如“种系化”)以减弱其免疫原性，增强其亲和力，改变其特异性或用于其它目的。如本文中所使用的，“抗原”或“免疫原”是指，包含一个或多个表位(线性表位、构象表位或两者)的分子，所述表位在暴露给受试者后诱导特异于该抗原的免疫应答。术语抗原是指亚单位抗原一与抗原天然结合的完整生物分离和分开的抗原一以及杀死的、减毒的或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生虫或其它微生物。术语抗原还指抗体，例如抗-独特型抗体或其片段，以及可模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成的肽模拟位(mimotopes)。术语抗原还指在体内，例如在DNA免疫应用中表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸。如本文中所使用的，“抗原性”是指蛋白质或多肽被针对所述蛋白质或多肽产生的抗体免疫特异性结合的能力。“缓冲剂”意指，防止另一种化学物质的浓度变化的化学系统。质子供体和受体系统用作防止氢离子浓度(PH)的显著变化的缓冲剂。缓冲剂的其它实例为包含弱酸及其盐(共轭碱)或弱碱及其盐(共轭酸)的混合物的溶液。如本文中所使用的，“犬”包括通常称为狗的动物，且还包括犬科的其它成员。术语“犬瘟热病毒”是指，单负病毒目(Mononega virales)中的副粘液病毒科的麻疫病毒属的成员。如本文中所使用的，术语“细胞系”或“宿主细胞”意指，其中可复制或维持病毒的原核或真核细胞。

“细胞免疫应答”或“细胞介导的免疫应答”是由T淋巴细胞或其它白细胞或两者介导的免疫应答，且包括细胞因子、趋化因子和由活化的T细胞、白细胞或两者产生的类似分子的产生。“保守置换”已在本领域中进行了定义，并且对于本领域技术人员来说是已知的，其被公认为按照它们的相关物理性质分类残基。如本文中所使用的，术语“培养物”意指，在其它种类或类型不存在的情况下生长的细胞或微生物的群体。如本文中所使用的，术语“DIVA”意指，能够区分感染的动物与接种的动物的疫苗或免疫原性组合物。“剂量”是指施予受试者的疫苗或免疫原性组合物。“第一剂量”或“初次剂量”是指在第O天给予的此类组合物的剂量。“第二剂量”或“第三剂量”或“年剂量”是指，第一剂量之后提供的此类组合物的量，其可以是与第一剂量相同或不同的疫苗或免疫原性组合物。“表位”是指，结合T细胞受体或特异性抗体的抗原的特定位点，其通常包括约3个
氨基酸残基至约20个氨基酸残基。 如本文中所使用的，“赋形剂”是指疫苗或免疫原性组合物中不是抗原的任何组分。“片段”是指蛋白质或基因的截短的部分。“功能片段”和“生物学活性片段”是指，保留全长蛋白质或基因的生物学性质的片段。“免疫原性活性片段”是指引发免疫应答的片段。如本文中所使用的，术语“F蛋白”是指犬瘟热病毒的融合蛋白。如本文中所使用的，术语“H”蛋白是指犬瘟热病毒的血凝素糖蛋白。如本文中所用的，术语“异源的”意指来源于不同的物种或株系。如本文中所用的，术语“同源的”意指来源于相同的物种或株系。“同源性”或“百分比同源性”是指，在对齐序列和引入空位(如有必要的话)以获得最大百分比序列同源性并且还将任何保守置换当作序列同源性的一部分后，候选序列中与比较序列中的残基相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。“同源物”或“物种同源物”包括在两种或更多种不同物种中发现的、具有显著的多核苷酸序列同源性并且具有相同或相似的生物学功能和/或性质的基因。优选地，代表物种同源物的多核苷酸序列将在中等严紧条件下杂交，例如如本文中所描述的，并且具有相同或相似的生物学活性和/或性质。在另一个方面，代表物种同源物的多核苷酸将共有大于约60%的序列同源性、大于约70%的序列同源性、大于约80%的序列同源性、大于约90%的序列同源性、大于约95%的序列同源性、大于约96%的序列同源性、大于约97%的序列同源性、大于约98%的序列同源性或大于约99%的序列同源性。“体液免疫应答”是指至少部分由抗体介导的免疫应答。“同一性”或“百分比同一性”是指，在对齐两个序列和引入空位(如有必要的话)以获得最大百分比序列同一性并且不将任何保守置换当作序列同一性的一部分后，候选序列中与比较序列中的残基相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。受试者中的“免疫应答”是指，针对抗原的体液免疫应答、细胞免疫应答或体液和细胞免疫应答的产生。免疫应答可能足以用于诊断目的或其它测试，或可能足以预防疾病的体征或症状，包括由病原体感染引起的不利的健康效应或其并发症。免疫应答通常可使用本领域已知的标准免疫测定和中和测定来测定。如本文中所使用的，“免疫原性的”或“免疫原性”是指引发特异性针对抗原的免疫应答的能力。如本文中所使用的，术语“免疫原性组合物”或“免疫有效量”或“有效地产生免疫应答的量”是指，当单独地或与药学上可接受的载体一起给动物施用时，能够被免疫系统识另Ij，从而导致特异性免疫应答的产生(即，具有免疫原性活性)的组合物或抗原。如本文中所使用的，“鼻内”施用是指，物质例如疫苗或免疫原性组合物经由或通过鼻引入受试者体内，且包括主要经由鼻粘膜的物质转运。如本文中所使用的，“分离的”意指，从其天然存在的环境中取出，单独地或在异源宿主细胞或染色体或载体(例如，质粒、噬菌体等)中。分离的微生物意指，其中生物大体上不含其它微生物(例如在培养物中，例如当与其天然存在的环境分离时)的组合物。“分离的”，当用于描述任何具体定义的物质，例如多核苷酸或多肽时，是指与通常在其中发现所述物质例如多肽或核酸的原始细胞环境分离的所述物质。因此，如本文中所使用的，例如，用本发明的多核苷酸构建的重组细胞系利用“分离的”核酸。或者，如果特定蛋白质或指定的免疫原性片段被要求保护或用作疫苗或免疫原性组合物，那么其被认为是分离的，因为其已被鉴定，分离并且与其天然存在的形式相比，在一定程度上被纯化。如果在产生抗原的重组细菌或真核表达载体中产生蛋白质或其特定的免疫原性片段，那么其被认为是以分离的蛋白质或核酸的形式存在。例如，利用多核苷酸构建的重组细胞系利用“分离的”核酸。“药剂”是指，可用于预防、治愈或改善疾病或预防一些生理病况或事件的任何试剂。术语〃感染复数"(Μ0Ι)是指，每细胞的生物数目的比率，其描述了多少接种物将被用于给定的感染中。如本文中所使用的，"单克隆抗体〃是指由单个杂交瘤细胞品系产生的抗体，其全都针对特定抗原上的一个表位。用于产生单克隆抗体的抗原可提供为病原体的分离的蛋白质或整个病原体。“杂交瘤”是由通过融合骨髓瘤细胞与产生特定抗体的细胞而形成的杂交细胞组成的克隆性细胞系。通常，单克隆抗体是小鼠来源的。然而，单克隆抗体还指，通过噬菌体展示技术或与噬菌体展示等同的方法，或由非小鼠来源的杂交细胞产生的、针对抗原的特定表位的抗体的克隆性群体。如本文中所使用的，“ 口服”或“经口”施用是指，物质例如疫苗或免疫原性组合物经由或通过口引入受试者的体内，其包括吞咽或经由口腔粘膜的转运(例如，舌下或口腔吸收)或两者。气管内施用也是口服或经口施用的方法。如本文中所使用的，“口鼻”施用是指，物质例如免疫原性组合物或疫苗经由或通过鼻和口引入受试者的身体内，如可以例如通过将一滴或多滴小滴置于鼻中进行的。口鼻施用包括与经口和鼻内施用相关的转运过程。如本文中所使用的，术语“副痘病毒”、“副痘病毒株”是指属于痘病毒科和副痘病
毒属的病毒。

如本文中所使用的，术语“绵羊副痘病毒”和“0RFV”是指属于痘病毒科、副痘病毒属以及绵羊副痘病毒种的病毒。此类病毒也称为传染性痘疮病毒、接触性脓疮皮炎病毒或orf病毒。它们具有使之与其它痘病毒相区别的独特的螺旋形外壳。术语“绵羊副痘病毒株D1701”是指，美国专利6，365，393 (其通过引用并入本文)中描述的病毒。“绵羊副痘病毒株D1701-V”是指适应猿猴细胞系VeiO的绵羊副痘病毒株D1701。“胃肠外施用”是指，物质例如疫苗或免疫原性组合物经由或通过不包括消化道的途径引入受试者的体内。胃肠外施用包括但不限于皮下、肌内、经皮肤、真皮内、腹膜内、目艮内和静脉内施用。如本文中所使用的，术语“病原体”或“病原性微生物”意指，能够在其宿主动物中诱导或引起病害、疾病或异常状态的微生物一例如犬瘟热病毒。“药学上可接受的”是指，在合理的医学判断范围内，适用于接触受试者的组织而无过度毒性、刺激、过敏应答等，具有合理的收益风险比，并且对于它们期望的用途是有效的物质。如本文中所使用的，"多克隆抗体"是指，针对特定病原体或抗原而产生的抗体的混合群体。一般地，群体包含多个抗体组，每一个组针对病原体或抗原的特定表位。为了产生多克隆抗体，通过接种入或感染宿主来引入完整病原体或分离的抗原，所述病原体或抗原诱导宿主产生针对所述病原体或抗原的抗体。如本文中所使用的，术语“痘病毒”是指属于痘病毒科的病毒。此类病毒是椭圆形的、相当大的双链DNA病毒。如本文中所使用的，术语“多核苷酸”意指，包含在链中共价键合的核苷酸单体的有机聚合物分子。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)为具有独特生物学功能的多核苷酸的实例。如本文中所使用的，术语“多肽”意指，包含在链中键合的两个或更多个氨基酸的有机聚合物分子。如本文中所使用的，术语“预防”、“防止”或“阻止”等意指，抑制微生物的复制，抑制微生物的传播或抑制微生物在其宿主中产生其本身。如本文中所使用的，这些术语等还可意指，抑制或阻断或缓解感染的一个或多个体征或症状。如本文中所使用的，关于疫苗或免疫原性组合物，“保护作用”、“保护”、“保护性免疫”等是指，疫苗或组合物预防或减轻由生物(所述疫苗或免疫原性组合物中使用的抗原源自于所述生物)引起的疾病的症状。术语“保护作用”和“保护”等还指，疫苗或免疫原性组合物可用于治疗性治疗已存在于受试者中的疾病或疾病的一种或多种症状。“重组产生的PPV”或“重组PPV”为在其基因组中具有插入和/或缺失的PPV。使用分子生物学方法制备插入和缺失。术语“特异性结合”、“特异地结合”等定义为，形成在生理或测定条件下可测量的并且是选择性的复合物的两种或更多种分子。如果在适当选择的条件下，这样的结合基本上不被抑制，然而同时非特异性结合被抑制，则抗体或其它抑制剂被认为“特异性结合”蛋白质。特异性结合的特征在于高亲和力，并且对于化合物或蛋白质是选择性的。非特异性结合通常具有低亲和力。例如，I gG抗体的结合的特征通常在于至少约10_7M或更高，例如至少约10_8M或更高，或至少约10_9M或更高，或至少约10_1CI或更高，或至少约10_nM或更高，或至少约IO-12M或更高的亲和力。该术语也适用于例如抗原结合结构域特异于许多抗原不具有的特定表位的情况，在该情况下具有抗原结合结构域的抗体通常不结合其它抗原。如本文中所使用的，“特异性免疫原性片段”是指，序列的可被特异于该序列的抗体或T细胞识别的部分。如本文中所使用的，“大体上同一的”是指至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%的序列同一性的程度。如本文中所使用的，术语“治疗有效量”意指，微生物或亚单位抗原或多肽或多核苷酸或其组合的足以在施用了其的受试者中引起免疫应答的量。如本文中所使用的，〃治疗剂"是指帮助治疗病毒、细菌、寄生虫或真菌感染、由其引起的疾病或病况的任何分子、化合物、病毒或治疗，优选经减毒或杀死的病毒，或亚单位或化合物。如本文中所使用的，“治疗有效量”是指，抗原或疫苗或免疫原性组合物的可在接受所述抗原或疫苗或免疫原性组合物的受试者(例如，狗)中诱导免疫应答的量，所述量足以预防或缓解由病原体例如病毒、细菌、寄生虫或真菌的感染引起的疾病的体征或症状，包括不利的健康效应或其并发症。可诱导体液免疫或细胞介导的免疫或体液及细胞介导的免疫。动物对抗原、疫苗或免疫原性组合物的免疫原性应答可通过测量抗体滴度、淋巴细胞增殖测定来间接评估，或通过在用野生型株系攻击后监测体征和症状来直接评估。由疫苗或免疫原性组合物赋予的保护性免疫可通过测量攻击生物脱落的减少和/或临床体征例如死亡率、发病率、温度的下降以及受试者的总体身体状况、健康和行为来评估。治疗上有效的疫苗或免疫原性组合物的量可发生变化，这取决于具体使用的免疫原或受试者的状况，并且可由本领域技术人员测定。如本文中所使用的，术语“治疗”、〃医治〃或“医疗”等意指，预防、减轻或消除微生物的感染。此类术语等还可意指，减少微生物的复制，减少微生物的传播，降低微生物在其宿主中产生其本身的能力， 或预防微生物在其宿主中产生其本身。这些术语等，如本文中所用的，还可意指减轻、缓解或消 除微生物感染的一个或多个体征或症状，或加速从微生物感染中恢复。如本文中所使用的，术语“接种”和“预防接种”等意指，给动物施用疫苗或免疫原性组合物。如本文中所使用的，术语〃疫苗〃和“疫苗组合物”意指，包含病毒或细菌(经修饰的活的、减毒的或杀死的)或亚单位疫苗或上述物质的任何组合的组合物，其预防或减少感染，或其预防或减少感染的一个或多个体征或症状。抗病原体的疫苗的保护性作用通常通过诱导受试者的免疫应答来实现。一般而言，消除或减少的感染发病率、体征或症状的缓解或微生物从感染的受试者的加速消除表示疫苗组合物的保护性作用。本文中描述的疫苗提供了抗由犬瘟热病毒引起的感染的保护性作用。如本文中所使用的，术语〃变体〃是指，给定的蛋白质和/或基因序列的衍生物，其中除了突变差异外，衍生的序列基本上与给定的序列相同。所述差异可以是天然发生的，或合成或遗传上产生的。“载体”或“载体病毒”为适合于异源DNA的插入的PPV，其可将插入的DNA转运入细胞或生物体，并且适当时，其使得异源DNA能够被表达。如本文中所使用的，术语“兽医学上可接受的”是指，在合理的医学判断范围内，适用于接触动物的组织而无过度毒性、刺激、过敏性应答等，具有合理的收益风险比，并且对于它们期望的用途是有效的物质。如本文中所使用的，术语“兽医学上可接受的载体”是指不干扰活性成分的生物学活性的功效，并且对于施用其的兽医受试者是无毒性的载体介质。病毒、免疫原性组合物和疫苗本发明包括副痘病毒用于制备包含来源于犬瘟热病毒的异源DNA的重组副痘病毒的用途。在一个实施方案中，使用绵羊副痘病毒(PPVO)来制备包含来源于犬瘟热病毒的异源DNA的重组副痘病毒。在另一个实施方案中，使用绵羊副痘病毒株D1701。该株系描述于美国专利 6，365，393;Rziha 等人，2000，J.Biotechnol.，83，137-145 和 Cottone,等人，1998，Virus Research，56，53-67中。在其它实施方案中，使用绵羊副痘病毒株D1701-V。插入副痘病毒的基因序列包括来源于犬瘟热病毒的异源DNA。在一个实施方案中，异源DNA包括编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。包含犬瘟热病毒的H基因的克隆的片段的完整序列(SEQ ID NO:1)示于图7中。其包含全长编码区(1824nt)，并且在5’ _(20nt)和3’ -(2Int)末端上具有用于限制性酶切克隆和分析(BamHI和KpnI)的接头序列。在一个实施方案中，异源DNA包括编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因或其片段。在一个实施方案中，异源DNA包括SEQ ID N0:2或与SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。包含犬瘟热病毒的F基因的`克隆的片段的完整序列(SEQ ID NO: 2)示于图8中。其包含全长编码区(1989nt)，并且在5’-(19nt)和3’-(16nt)末端上具有用于限制性酶切克隆和分析(BamHI和KpnI)的接头序列。多核苷酸的序列信息使得可容易地获得该多核苷酸的每一个可能的片段。因此，本发明提供了H蛋白的片段。因此，本发明还提供了F蛋白的片段。在一个实施方案中，提供了功能片段。在另一个实施方案中，提供了生物学活性片段。可通过常规方法，例如通过过滤或层析纯化片段。可利用本领域技术人员已知的方法通过重组产生片段。在制备重组副痘病毒时，将异源DNA插入绵羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H内。在另一个实施方案中，将异源DNA插入绵羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H内的VEGF编码序列或相邻非编码序列内。用于将异源DNA插入副痘病毒的方法是标准的并且对于本领域技术人员来说是已知的。它们描述于美国专利6，365，393中。在一个实施方案中，包含来源于犬瘟热病毒的异源DNA的重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-H或绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，将这些病毒保藏在欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)，PortonDown, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK,其为 Health Protection Agency CultureCollections (HPA Culture Collections)的一部分。质粒pdV-CDV-H(7，975nt)的序列为SEQ ID NO: 3，其示于序列表中。质粒pdV-CDV-F(8, 134nt)的序列为SEQ ID NO:4，其示于序列表中。本发明还包括，与本文中描述的序列具有至少约99%、至少约98%、至少约97%、至少约96%、至少约95%、至少约93%、至少约90%、至少约85%、至少约80%、至少约75%、至少约70%、至少约65%、至少约60%、至少约55%和至少约50%的同一性和/或同源性的多核苷酸序列。本发明还包括，在中度至高度严紧条件下与本文中描述的SEQ ID NO的任一序列的非编码链或互补链杂交的多核苷酸序列，以及其物种同源物。示例性高严紧性条件包括，在65°C至75°C下于包含0.2X SSC/0.1%SDS的缓冲液中的终洗涤，而示例性中度严紧性条件包括，在35°C至45°C下于包含2X SSC/0.1%SDS的缓冲液中的终洗涤。在本领域中应理解，等同的严紧性条件可通过温度和缓冲液或盐浓度的变化来实现，如Ausubel，等人(Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons(1994)，pp.6.0.3 至 6.4.10中描述的。可在细胞、细胞系和宿主细胞中繁殖重组PPV。所述细胞、细胞系或宿主细胞可以是例如但不限于，哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞。其中可繁殖PPV的细胞、细胞系和宿主细胞对于本领域技术人员来说是已知的并且可获得的。在一个实施方案中，使用VeiX)细胞。在其它实施方案中，使用牛肾或羊睾丸细胞。在用于免疫原性组合物或疫苗之前，还可将重组PPV进一步减毒或灭活。减毒和灭活的方法对于本领域技术人员来说是公知的。用于减毒的方法包括但不限于，在适当的细胞系的细胞培养物中连续传代、紫外辐射以及化学诱变。用于灭活的方法包括但不限于，利用福尔马林、β-丙内酯(BPL)或二乙烯亚胺(BEI)的处理或本领域技术人员已知的其它方法。可通过将病毒悬浮物与37%的甲醛混合至0.05%的终甲醛浓度来进行利用福尔马林的灭活。通过在室温下恒定地搅拌约24小时来混合病毒-甲醛混合物。然后，通过在适当的细胞系上测定生长来测试灭活的病毒混合物的残留活病毒。可通过将本发明的病毒悬浮物与0.1M BEI (0.175Ν NaOH中的2_溴-乙胺)混合至ImM的终BEI浓度来进行通过BEI的灭活。通过在室温下恒定地搅拌约48小时来混合病毒-BEI混合物，随后添加1.0M硫代硫酸钠至0.1mM的终浓度。继续混合另外2小时。通过在适当的细胞系上测定生长来测试灭活的病毒混合物的残留活病毒。重组PPV可用于免疫原性组合物和疫苗中。免疫原性组合物和疫苗任选地可包括用作药物媒介物、赋形剂或介质的一种或多种兽医学上可接受的载体，包括液体、半固体或固体稀释剂。如本文中所使用的，“兽医学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。稀释剂可包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可包括本领域技术人员已知的氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等等。稳定剂包括本领域技术人员已知的白蛋白等等。防腐剂包括本领域技术人员已知的硫柳汞等等。佐剂包括但不限于本领域技术人员已知的RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、明矾、氢氧化铝凝胶、水包油乳剂、油包水乳剂例如弗氏完全和不完全佐剂、嵌段共聚物(CytRx, Atlanta Ga.) ,SAF-M(Chiron, Emeryville Calif.)、AMPHIGEN 佐剂、皂苷、QuilA、QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.)、GP1-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc.，Birmingham, AL)或其它阜苷级分、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli)的不耐热 肠毒素(重组的或其他形式)、霍乱毒素或胞壁酰二肽等等。可由本领域技术人员容易地测定用于本发明的佐剂和添加剂的量和浓度。在一个实施方案中，本发明涉及包含约50 μ g至约2000 μ g佐剂的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施方案中，以约100 μ g至约1500 μ g,或约250 μ g至约1000 μ g,或约350 μ g至约750 μ g的量包含佐剂。在另一个实施方案中，以约500 μ g/2ml免疫原性组合物或疫苗的量包含佐剂。免疫原性组合物和疫苗还可包括抗生素。此类抗生素包括但不限于，来自氨基糖苷类、卡巴配能类、头孢菌素类、糖肽类、大环内酯类、青霉素类、多肽类、喹诺酮类、磺胺类和四环素类的抗生素。在一个实施方案中，本发明涉及含有约I μ g/ml至约60μ g/ml的抗生素的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施方案中，免疫原性组合物和疫苗包含约5 μ g/ml至约55 μ g/ml的抗生素，或约10 μ g/ml至约50 μ g/ml的抗生素,或约15 μ g/ml至约45 μ g/ml的抗生素,或约20 μ g/ml至约40 μ g/ml的抗生素,或约25 μ g/ml至约35 μ g/ml的抗生素。在另一个实施方案中，免疫原性组合物和疫苗包含少于约30 μ g/ml的抗生素。除了重组PPV外，免疫原性组合物和疫苗还可包括其它抗原。抗原可以为灭活的微生物的完整或部分制剂的形式，或通过遗传工程技术或化学合成获得的抗原性分子的形式。适合用于根据本发明的用途的其它抗原包括但不限于来源于病原性细菌或病原性病毒的抗原。重组犬瘟热病毒免疫原性组合物和疫苗还可任选地包含具有一种或多种另外的犬抗原例如犬艾希体(Ehrlichia canis)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPI)、犬II型腺病毒(CAV-2)、犬腺病毒(CAV)、犬冠状病毒(CCV)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospiraicterohemorrhagiae, LI)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola, LC)、感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa,LG)、波摩那钩端螺旋体(Leptospira pomona,LP)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)等的混合物。抗原的一个组合包括犬细小病毒、犬腺病毒和犬副流感病毒的分离株，具有或不具有冠状病毒和钩端螺旋体(包括新出现的血清型感冒伤寒型钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体)。可给动物施用本文中描述的免疫原性组合物和疫苗以诱导有效的抗CDV的免疫应答。因此，本文中描述了刺激有效的抗CDV的免疫应答的方法，包括给动物施用治疗有效量的包含含有来源于犬瘟热病毒的异源DNA的重组副痘病毒的免疫原性组合物或疫苗。在一个实施方案中，所述方法导致抗-H蛋白血清抗体的诱导。在另一个实施方案中，所述方法导致抗-F蛋白血清抗体的诱导。可给动物施用本文中描述的免疫原性组合物和疫苗以接种动物受试者以抗犬瘟热病。可给动物施用免疫原性组合物和疫苗以预防或治疗动物的犬瘟热病。因此，本文中描述了接种动物以抗犬瘟热病，和预防或治疗犬瘟热病的方法，包括给动物施用治疗有效量的包含含有来源于犬瘟热病毒的异源DNA的重组副痘病毒的免疫原性组合物或疫苗。施用的形式、剂量、途径可以以各种形式制备免疫原性组合物和疫苗，这取决于施用途径。例如，可以以适用于注射用途的无菌水溶液或分散体的形式，或使用冷冻干燥技术以冻干的形式制备免疫原性组合物和疫苗。通常在约4°C下维持冻干的免疫原性组合物和疫苗，且可将其在稳定溶液例如盐水或/和HEPES中进行重建。或者，可通过冷冻干燥保存免疫原性组合物和疫苗。还可以以悬浮液或乳剂的形式制备免疫原性组合物和疫苗。

免疫原性组合物和疫苗包括治疗有效量的上述重组PPV。可将纯化的病毒直接用于免疫原性组合物或疫苗，或可将其进一步减毒或灭活。通常，免疫原性组合物或疫苗包含约 I X IO2 至约 I X IO12PFU,或约 I X IO3 至约 I X IO11PFU,或约 I X IO4 至约 I X IO10PFU,或约
IX IO5至约I X IO9PFU,或约I X IO6至约I X 108PFU。可由本领域技术人员确定有效地提供保护作用的免疫原性组合物或疫苗中病毒的精确量。免疫原性组合物和疫苗通常以约0.5ml至约5ml的体积包含兽医学上可接受的载体。在另一个实施方案中，载体的体积为约Iml至约4ml，或约2ml至约3ml。在另一个实施方案中，载体的体积为约1ml，或为约2ml，或为约3ml或为约5ml。适用于免疫原性组合物和疫苗的兽医学上可接受的载体可以是本文中描述的任何载体。本领域技术人员可容易地确定，在施用之前病毒是否需要进行减毒或灭活。在另一个实施方案中，可将重组PPV给动物直接施用而无需另外的减毒。病毒的治疗上有效的量可发生变化，这取决于几个因素(包括动物的状况和感染的程度)，并且可由本领域技术人员测定。根据本发明的方法，可给动物施用单次剂量，或可选择地，可以以约2至约10周的间隔进行2次或更多次接种。加强方案可能是需要的，并且可调整给药方案以提供最佳免疫。本领域技术人员可容易地确定 最佳施用方案。可将免疫原性组合物和疫苗直接施用入血流、肌肉或内脏器官。可将它们进行口服或鼻内施用。用于胃肠外施用的适当方法包括但不限于静脉内、动脉内、腹膜内、硬膜内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内和皮下施用。用于胃肠外施用的适当装置包括针(包括显微操作针)注射器、无针注射器和输注技术。胃肠外制剂通常为可包含赋形剂例如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选至约3至约9，或约4至约8，或约5至约7.5，或约6至约7.5，或约7至7.5的pH)的水溶液，但对于一些应用，可更适当地将它们配制为无菌非含水溶液，或配制为干燥形式以与适当的媒介物例如无菌无热原水结合使用。在无菌条件下例如通过冷冻干燥来制备胃肠外制剂可容易地使用本领域技术人员公知的标准制药技术来实现。本文中描述的重组副痘病毒和免疫原性组合物和疫苗可用于制备用于接种动物以抗犬瘟热病的药剂。本发明提供了确定动物受试者中存在的副痘病毒的来源的方法。利用DIVA疫苗一能够区分感染的与接种的动物的疫苗一的接种提供了用于确定存在于动物受试者中的副痘病毒的来源的方法。该区分可通过多种诊断方法的任一种来实现，包括但不限于ELISA、Western印迹和PCR。此类和其它方法可易于被本领域技术人员认识到，并且对于本领域技术人员来说是已知的。本文中描述的副痘病毒可在其基因组组成和表达的蛋白质上与野生型株系相区另IJ。这样的区别允许区分接种的动物与感染的动物。例如，可确定在某些实验室测试中对于副痘病毒被测试为阳性的动物是具有野生型副痘病毒株还是具有先前通过接种获得的
重组副痘病毒。可使用多种测定来进行确定。例如，可从对于副痘病毒测试为阳性的动物分离病毒，且基于核酸的测定可用于确定指示先前的接种的副痘病毒基因组的存在。基于核酸的测定包括Southern或Northern印迹分析、PCR和测序。或者,可使用基于蛋白质的测定。在基于蛋白质的测定中，可从对于副痘病毒测试为阳性的动物分离怀疑被感染的细胞或组织。可从此类细胞或组织制备细胞提取物，并且可使用适当的针对病毒蛋白质的抗体将所述提取物经历例如Western印迹，所述病毒蛋白质可区别地鉴定先前接种的重组副痘病毒或野生型副痘病毒的存在。可使用多种技术来评估动物中诱导的免疫应答的程度和性质。例如，可从接种的动物收集血清，并且在例如常规ELISA中测试特异于副痘病毒的抗体的存在或不存在。可通过测定例如T细胞增殖(其指示细胞免疫应答的诱导)来实现淋巴组织中的响应性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测。相关技术详尽地描述于本领域中，例如，Coligan等人Current Protocols in Immunology, John ffiley&Sons Inc.(1994)中。重组绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-H可用于DIVA测定。在一个实施方案中，其可用于检测犬瘟热N-基因或蛋白质以区分感染的与接种的动物的测定中。在另一个实施方案中，其可用于检测犬瘟热P-基因或蛋白质以区分感染的与接种的动物的测定中。在另一个实施方案中，其可用于检 测犬瘟热L-基因或蛋白质以区分感染的与接种的动物的测定中。在另一个实施方案中，其可用于检测犬瘟热M-基因或蛋白质以区分感染的与接种的动物的测定中。重组绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F可用于DIVA测定。在一个实施方案中，其可用于检测犬瘟热N-基因或蛋白质以区分感染的与接种的动物的测定中。在另一个实施方案中，其可用于检测犬瘟热P-基因或蛋白质以区分感染的与接种的动物的测定中。在另一个实施方案中，其可用于检测犬瘟热L-基因或蛋白质以区分感染的与接种的动物的测定中。在另一个实施方案中，其可用于检测犬瘟热M-基因或蛋白质以区分感染的与接种的动物的测定中。本发明还通过下列示例性、非限定性实施例来进行描述。
实施例实施例1.表达CDV H和CDV F蛋白的重组病毒D1701-V-CDV-H和D1701-V-CDV-F的产生产生包含编码⑶V的H蛋白的基因的重组绵羊副痘病毒以及包含编码⑶V的F蛋白的基因的重组绵羊副痘病毒。评估H和F蛋白的表达。为了产生重组绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-H和D1701-V-CDV-F，使用绵羊副痘病毒(PPVO)载体系统(美国专利6，365，393; Rziha等人，2000，J.Biotechnol., 83, 137-145;Fischer 等人，2003，J.Virol.77，9312-9323;Henkel 等人，2005，J.Virol.79，314-325)。通过 PCR 从病毒株 Rockborn 获得 CDV H 基因和 F基因，将其克隆为大小为1865bp⑶或2024bp (F)的BamH1-KpnI DNA片段，随后进行BamH1-KpnI限制性酶切降解,进行琼脂糖凝胶(0.8%w/v)电泳,然后通过Qiaex II凝胶提取(Qiagen;Germany)来进行纯化。质粒 pdV-Recl (Fischer 等人,2003)用 BamHI 和KpnI进行双降解，随后用于连接(Fast ligation试剂盒，Promega;Germany)。在转化大肠杆菌 DH5aF’ (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; Germany)后，通过质粒 DNA 的BamH1-KpnI限制性降解选择插入物-阳性菌落。这导致产生转移质粒pdV-⑶V_H(图1A)或转移质粒PdV-CDV-F(图1B)。质粒中的相关限制性位点及其核苷酸位置标示于图中。还标示了氨节青霉素抗性基因(AmpiR)以及T7和SP6启动子。利用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen;Germany)制备两种转移质粒,将其用于DNA测序。为此目的,分别使用位于pdV-Recl 中的插入位点上游的引物 0RF32N(SEQ ID NO: 5; 5’ -GCGCGCTGCGGGTGCGCTACCAATTCGCGC-3’)和位于 pdV-Recl 中的插入位点下游的引物 0RF31N(SEQ ID NO:6; 5’-GCATCCCGTTACCACCGGAGACCGACGCTCCC-3’)以及内部 H-基因特异性引物 CDH-F (SEQ ID NO: 7; 5’ -CAGATGCAGTGGAGCTACTACTTC-3’)和 CDH-R (SEQ ID NO: 8; 5’ -GGATCTAGAGGTAATGTCAACCGC-3’)。这允许测定插入的H基因的完整序列(SEQ ID NO: 1)0内部F基因特异性引物⑶F-F (SEQID N0:9，5’-CCCTGCTATGCAACATATGTCGTGTG-3’)和CDF-R(SEQ ID NO: 10，5’-CGTTATACCATATCAGGGTATTGCCTCC-3’)允许测定完整 F 基因序列(SEQ ID NO: 2)。利用Bluo-Gal染色选择重组体用0.1MOI (感染复数)的表达IacZ的病毒D1701_VrV感染Vero细胞(IO6个细胞)，2小时后按照制造商的推荐(Amaxa Nucleofector; Lonza, Germany)通过核转染(nucleofection)用 2 μ g 的 pdV-CDV-H 或 pdV-CDV-F 质粒 DNA 进行转染。3-4 天后收获病毒裂解物，将其用于在6孔板(Fisher Scientific;Germany)中在Vero细胞上进行滴定。当空斑变得可见时，如所描述的(Fischer等人，2003)，覆盖含有Bluo-Gal的琼脂糖。挑选具有白色外观的病毒空斑，将单个空斑洗脱物(在4°C下于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中过夜)在48孔板的单个孔中用于同时感染Vero细胞(IXlO5个细胞)。通过空斑-PCR选择重组体通过Pasamontes 等人(J.Virol.Methods35:137-141; 1991)的改进方法从每一个病毒空斑分离株分离DNA。将病毒裂解物(0.2ml)冷冻(_70°C )和解冻(37°C )3次，在冰上超声3次，每次20-30秒(超声水浴)。在酚氯仿提取后，添加10 μ g酵母tRNA或3 μ IGlycoBlue (Ambion;Germany),然后进行乙醇沉淀。用70%(v/v)乙醇洗漆DNA沉淀2次,在干燥后将其溶解在14 μ I重蒸懼水中。

对于CDV H-特异性PCR，将4 μ I DNA与I μ I引物混合物(由4.0pmolCDH-F(SEQ ID NO: 7)和 4.0pmol CDH-R(SEQ ID NO:8)引物组成)和 5 μ I ReddyMix2XPCR(Abgene, Thermo Fisher Scientific;Germany)在冰上混合。通过在 98°C下温育 2 分钟，随后进行40个循环(在96°C下进行I分钟，在65°C下进行30秒，在72°C下进行30秒)，然后在72°C进行2分钟的终延伸步骤来在Trio Thermoblock (Biometra; Germany)中进行PCR。除了在68°C (而非65°C )下进行30秒外，分别使用引物CDF-F和CDF-R，将相同条件用于⑶V F-特异性PCR。在水平l%(w/v)琼脂糖-溴化乙锭(0.3微克/ml)凝胶中分离PCR产物。稀释来自显示大小为686bp的H基因特异性PCR片段的空斑分离株的病毒裂解物，如上所述使用Bluo-Gal琼脂糖覆盖法再进行空斑纯化至少3次。也如对于包含H基因的病毒空斑所描述的，进一步对来自利用质粒PdV-CDV-F的转染的空斑分离株(其显示大小为766bp的F基因特异性PCR片段)进行空斑纯化。最后，在LacZ基因特异性PCR中，使用 4μ1 DNA, 3.95pmol 引物 lacZ-F (SEQ ID NO: 11; 5’-cgatactgtcgtcgtcccctcaa-3，)和 4.13pmol 引物 IacZ-R(SEQ ID NO: 12; 5’-caactcgccgcacatctgaact-3’)测试对于H或对于F基因呈阳性的重组病毒空斑分离株的DNA。在添加5 μ I AccuPrime SuperMix
II(Invitrogen, Fisher Scientific;Germany)后，通过在 98°C下加热 2 分钟，随后进行 40个循环(在96°C下进行I分钟，在62°C下进行30秒，和在68°C下进行90秒)，然后在68 °C下进行终延伸步骤2分钟来进行PCR。如上所述进行PCR产物的分离。大小为508bp的LacZ基因特异性片段的不存在表明，相应的重组病毒空斑分离株在3轮空斑纯化后，不含表达LacZ的亲代病毒D1701-VrV。在制备高滴度的D1701-V-CDV-H和D1701-V-CDV-F的病毒储备液后，如下所述制备病毒DNA，将其用于在CDV-PCR和LacZ-PCR中进行测试。重组病毒空斑的免疫组织化学染色(IPMA)首先通过IPMA测定插入的外来基因的成功表达，所述IPMA包括在24-孔板中在Vero细胞上滴定的重组病毒空斑的免疫组织化学染色。在病毒空斑出现后，从每一个孔抽吸培养基，通过在层流洁净工作台中将板敞开约10分钟来干燥细胞。此后，在_20°C下用冰冷无水甲醇固定细胞，进行15-20分钟。在用冰冷1%(ν/ν)的在PBS中的胎牛血清(FCS)洗涤2次后，用含有10%(v/v)FCS的PBS在室温(RT)下封闭细胞90分钟。通过在RT下用1:2.000稀释的抗F蛋白的多克隆兔(R)抗血清(由P.Plattet&A.Zurbriggen提供;Univ.Bern, Switzerland)(图2A)或在1%的FCS (在PBS中)中以1:1.000稀释的多克隆H蛋白-特异性兔抗血清 MC711 (由 V.von Messling 提供;Univ.Quebec, Canada)(图 2B)温育60分钟来实现外来基因表达的检测。在用PBS-T(包含0.05%(v/v)Tween-20的PBS)洗涤3次后,添加1:2000稀释的偶联有过氧化物酶的抗-兔第二抗体(Jackson-1mmunoRes.,DIANOVA; Germany)，在RT下温育60分钟。在用PBS-T和PBS充分洗涤后，如制造商的说明书所推荐的，添加底物(Vector Nova Red, Axxora;Germany),直至棕红色的阳性染色变得可见。作为阴性对照，用1:100稀释的抗F蛋白的多克隆兔抗血清(图2C)温育未感染的细胞。还将用D-1701-VrV或D-1701-V感染的细胞用作阴性对照。发现病毒空斑和感染的细胞对于CDV的F蛋白(图2A)和H蛋白(图2B)呈强阳性。实施例2.D1701-V-CDV-H 和 D1701-V-CDV-F 的表征病毒储备液的制备为了获得D1701-V-CDV-H和D1701-V-CDV-F的高滴度重组病毒储备液，用0.5的MOI同时感染10-20个T150培养瓶(Greiner;Germany)。3天后，观察到约80%的致细胞病变效应(CPE)，收获和收集所有培养瓶的细胞和上清液，用于离心(以13，OOOrpm在4°C下进行2小时)。小心地除去上清液，将病毒沉淀在4°C下于l_2ml PBS中溶解过夜。使用3次10秒的脉冲(100W)(每一次脉冲之间中断10秒)在冰上通过超声处理(超声细胞破碎器，Branson; Germany)完全分散病毒悬浮物，随后离心(以500_700xg在4°C下进行10分钟)以除去细胞碎片。将上清液贮存在冰上，而将细胞沉淀重悬浮于1.0ml PBS中，在冰上进行超声处理(2次20秒，之间中断10秒，随后再进行一次30秒)。在低速离心后，将上清液与第一上清液组合，分成等分，滴定，然后于-70°C下贮存。病毒DNA的表征以Μ0Ι0.5感染Vero细胞，2_3天后(约80%CPE)通过胰蛋白酶消化收获细胞，在4 下进行短暂的低速离心。按照制造商的方案，使用Master Pure DNA IsolationKit (Epicentre Biotech nology, Biozym Scientific;Germany)分离 DNA。为了验证⑶V H或F基因在正确的基因座中插入，按照标准方法，将2ygDNA进行限制性酶降解，在0.8%(w/v)琼脂糖凝胶上进行分离，将其转移至尼龙膜(GEHealthcare; Germany)以进行Southern印迹杂交。将CDV H或F基因特异性探针(CDV-H或⑶V-F PCR的产物)进行凝胶分离,使用RediPrime (GE Healthcare; Germany)进行放射性标记(32P_dCTP，MP Biomedicals;Germany)。随后将其用于在下述条件下进行的Southern印迹杂交:在50°C下于包含0.5%(w/v)脱脂奶粉、1.0%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)和0.5mg/ml 变性小牛胸腺 DNA(KT-DNA, Sigma;Germany)的 4X SSPE(1X=0.18M NaCl，IOmMPP, ImM EDTA, pH7.4)中。在X-射线(Kodak X-Omat;Germany)暴露后，通过在 45°C下于0.4NNaOH 中温育 30-60 分钟，随后在 100°C下于 0.1X SSC, 0.5%SDS, 0.2M Tris-HCl (ρΗ7.4)中进行短暂温育，从滤膜除去探针。为了进行第二杂交，如所描述的(Cottone等人，1998.病毒 Res.56，53-67)，使用包含 vegF-E 基因座的 D1701-V 的 HindIII 片段 H。Southern 印迹结果确认，H或F基因正确插入至D1701-VrV的基因组内。

⑶V H或F基因特异性RNA的检测用3-5 的 MOI 感染 Vero 细胞，使用 SurePrep Total RNA Extraction Kit (FisherScientific;Germany)在感染后(p.1.)不同时间分离总RNA。此外,从在胞喃唳阿拉伯糖苷(AraC;0.04mg/ml, Sigma;Germany)或环己酸亚胺(CHX, 0.lmg/ml, Serva;Germany)存在的条件下感染的细胞提取RNA，以测试插入的H-或F-基因的早期表达。作为对照，从未感染的细胞分离RNA。在含有甲醛的变性1%琼脂糖凝胶中分离RNA，且如所描述的(Kroczek，R.A.&Siebert, E.Anal.Biochem.184:90-95，1990)，将其转移至尼龙膜。将放射性标记的 CDVH或⑶V F PCR片段在42°C下在UltraHyb溶液(Ambion;Germany)中用作杂交探针。结果清楚地显示⑶V-H或⑶V-F基因的立即早期表达，这归因于其在ORFV的早期vegF-E启动子的控制之下的调节(Rziha 等人 1999，J.Biotechnol.，73，235-242)。利用免疫荧光检测⑶V的H或F蛋白对于免疫荧光，在4-腔室载玻片(BD Falcon;Germany)中以1.0的MOI感染Vero细胞(IXlO5个细胞/ml)。在感染后不同时间点，用培养基洗涤细胞，用3.7%(v/v)的不含甲醇的甲醒(Pierce, Thermo Fisher Scientific;Germany)在 37°C下固定细胞 15 分钟。在用PBS洗涤3次后，通过用0.2%(v/v) Triton X-1OO在37°C下处理5分钟来透化细胞。在PBS洗涤后，用5%的在PBS中的FCS在37°C下封闭细胞30-40分钟。为了进行⑶V-H或⑶V-F蛋白检测，用兔抗-⑶V-H抗体(1:2000稀释)或用兔抗-⑶V-F抗体(1:200稀释)和抗-兔-Alexa-555 (1:2000稀释)在37°C温育细胞I小时。在于PBS中洗涤5次后，将载玻片于37°C下黑暗中用以1:2000稀释于PBS中的第二抗-兔Alexa-555或抗-兔Alexa-488抗体(Molecular Probes;Germany)温育30分钟。作为阴性对照,使用未感染的细胞。使用由Dr.Rudiger Raue 提供的 ORFV-特异性兔抗血清PAS2274 (Pfizer Inc, UK)进行用ORFV感染后晚期的细胞的检测。将血清以1:100稀释于具有1%FCS的PBS中，以1:2000的稀释度使用第二抗体抗-兔Alexa-488。按照制造商的说明书(Biotium;Germany),利用鬼笔环肽-647进行肌动蛋白细胞骨架的染色，然后在RT下于黑暗中利用0.04 μ g/ml DAPI (4’，6-二脒基-2’ -苯基吲哚二盐酸盐；Roche Molecular Biochemicals;Germany)进行细胞核染色，进行20-30分钟。在于PBS中充分洗漆后,用Mowiol-DABCO包埋载玻片，使用Axiovision软件，用Zeiss ApoTome进行荧光成像。利用DAPI对细胞核进行染色。图3中显示的结果明确证实，⑶V H蛋白或⑶V F蛋白在用每一种重组体(MOI=L O)感染的Vero细胞中强表达。可通过利用抗血清PAS2274的特异性染色额外鉴定晚期感染的细胞。通过使用未感染的细胞或用D1701-V或D1701-VrV感染的细胞来测试染色的特异性。通过Western印迹检测CDV H或F蛋白以3.0的MOI同时感染Vero细胞(3X105个细胞)，将其在37°C下于5%C02大气中进行温育。在感染后不同时间上，收获细胞+上清液，离心(8，900Xg，10分钟，4°C )，用1.0ml PBS洗涤细胞沉淀3次，将其重悬浮于0.15ml含有l%(v/v)Triton X-1OO的PBS中。在冰上进行30分钟后，将裂解物以15.000Xg，4°C离心15分钟，保存上清液以用于SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)。为此，将3份裂解物与I份4X DualColor蛋白上样缓冲液(Fermentas; Germany)混合，煮沸5分钟，进行超声处理，并且如所推荐的(FMC Bioproducts, Biozym; Germany),利用 Tris-Tricine-SDS 电泳缓冲液，使用8%(w/v)ProSieve50凝胶，通过SDS-PAGE分离约IOyg蛋白质。将预染的蛋白质Ladder (Fermentas; Germany)用作分子量标记物。电泳后，按照制造商的说明书(Pierce, Thermo Fisher Scientific;Germany),将蛋白质转移至 PVDF 膜。在室温下于 3XRotiblock (Roth; Germany)中进行膜封闭3小时后，使用以1:10，000稀释于IX RotiBlock中的多克隆兔抗-H或抗-F抗血清(由Dr.P.Plattet&Dr.A.Zurbriggen提供；Univ.Bern, Switzerland)。在 4°C 下过夜温育后，将膜于 TBS-T(具有 0.05%v/v Tween-20 的Tris-缓冲盐溶液)中充分洗涤5次，用偶联有过氧化物酶的抗-兔抗体(1:20，000; Jackson-1mmunoRes., Dianova;Germany)在RT下温育I小时。在TBS-T洗漆后，如所推荐的(Immobilon Western, Millipore; Germany),使用ECL底物。通过使用化学发光X-射线胶片(CL-XPosure, Pierce, Thermo Fisher Scientific;Germany)来检测反应的蛋白质。在感染后在不同时间点上确认了具有预期的分子量的CDV H或F蛋白(H=80kDa;F0=60kDa, Fl=40kDa)的表达。图4代表性显示了 CDV的F蛋白的检测。上图框显示与多克隆F特异性兔抗血清的反应，检测到经切割的(Fl) CDV基因产物。中图框显示肌动蛋白-β蛋白的检测，其证明已将相当的蛋白质的量加载入每一个孔。下图框显示晚期ORFV主要包膜蛋白(F13L)的检测。

体外病毒的产生为了测试⑶V基因至ORFV载体的基因组内的插入是否会影响病毒生长，通过滴定实验或单步骤病毒生长曲线(SSGC)比较重组体与亲代D1701-V的病毒产生。如图5中对于D1701-V-⑶V-H病毒代表性显示的，在感染后(p.1.)在指定的小时上收获总细胞裂解物，以一式三份进行滴定。感染性后代的产量与亲代D1701-V病毒难以区分。该实验支持结论:与亲代载体病毒相比，CDV基因的插入不会导致改变的体外生长特征。实施例3.利用免疫荧光进行的CDV-H特异性抗体的检测用QW株Onderstepoort感染Vero细胞(图6A-C)或不感染Vero细胞(图6D),将细胞固定，且与用重组D1701-V-CDV-H(10TPFU)肌内免疫的小鼠的血清(1: 1000稀释)一
起温育。利用DAPI对细胞核进行染色。核外染色为与小鼠抗血清的特异性反应性的结果。图框D显示相衬图，且更好地显现了特征在于细胞融合的CDV-感染的细胞。 该测定显示，用表达⑶V-H抗原的ORFV重组体免疫小鼠导致特异性血清抗体的产生。 实施例4.利用免疫荧光进行的CDV-F特异性抗体的检测
4-6 周龄的 Balb/C 小鼠(n=5/ 组)用含有 IO6PFU 或 IO7PFU 的 D1701-V-CDV-F 的0.1ml以2周的间隔肌内免疫1、2或3次。每周I次采集个体的血清样品，直至最后一次免疫后2周。为了测试D1701-V-⑶V-F的免疫原性，按照上述方案通过免疫荧光和Western印迹分析血清。综上所述，这些结果显示，⑶V H-在ORFV重组体D1701-V-⑶V-H中的成功表达。它们还显示F基因在OR FV重组体D1701-V-⑶V-F中的成功表达。
序舛
< Martinon5 Olivier MichelReddy3 Nanda Kumar D
<120)副fi病谒获体
<130>PCT1700
<160〉12
<170>PatentIn version 3.5
<210>I
<211>1824
<212>DKA<213>犬盤热病毒
`<220>
<221> niiscfeature<223> H *Η
<400> I
atgctctcctaccaagacaa ggtgggtgcc ttct.at.aaag ataatgcasg agctaattca60
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gataaagatg tccttactga gtccaattta gtggtgttgc ctacacagaa ttttagatat1560

权利要求
1.一种重组副痘病毒，其包括副痘病毒和来源于犬瘟热病毒的异源DNA。
2.权利要求1的重组副痘病毒，其中所述副痘病毒为绵羊副痘病毒(ORFV)。
3.权利要求2的重组副痘病毒，其中所述副痘病毒为绵羊副痘病毒株D1701。
4.权利要求3的重组副痘病毒，其中所述重组副痘病毒选自绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-H 和绵羊副痘病毒 D1701-V-CDV-F。
5.权利要求1的重组副痘病毒，其中所述异源DNA选自编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因、编码H蛋白的所述基因的片段、编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因以及编码F蛋白的所述基因的片段。
6.权利要求5的重组副痘病毒，其中所述异源DNA为编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因或其片段。
7.权利要求5的重组副痘病毒，其中所述异源DNA为编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因或其片段。
8.权利要求1的重组副痘病毒，其中所述异源DNA选自SEQID NO: 1，与SEQ ID NO:1具有至少约98%的同一性的序列，SEQ ID N0:2，和与SEQ ID NO:2具有至少约98%的同一性的序列。
9.权利要求1的重组副痘病毒,其中将所述异源DNA插入在绵羊副痘病毒株D1701的HindIII 片段 H/H 内。
10.权利要求9的重组副痘病毒，其中将所述异源DNA插入在绵羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H内的VEGF编码序列或相邻非编码序列内。
11.一种制备权利要求1的重组副痘病毒的方法，其包括将异源DNA插入副痘病毒的基因组。
12.权利要求11的方法，其中所述副痘病毒为绵羊副痘病毒。
13.权利要求11的方法，其中所述副痘病毒为绵羊副痘病毒株D1701。
14.权利要求11的方法，其中所述重组副痘病毒选自绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-H和绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-F。
15.权利要求11的方法，其中所述异源DNA选自编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因、编码H蛋白的所述基因的片段、编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因以及编码F蛋白的所述基因的片段。
16.权利要求15的方法，其中所述异源DNA为编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因或其片段。
17.权利要求15的方法，其中所述异源DNA为编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因或其片段。
18.权利要求11的方法，其中所述异源DNA选自SEQID NO: 1，与SEQ ID NO:1具有至少约98%的同一性的序列，SEQ ID NO:2和与SEQ ID NO:2具有至少约98%的同一性的序列。
19.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1的重组副痘病毒和载体。
20.权利要求19的免疫原性组合物，其中所述副痘病毒为绵羊副痘病毒。
21.权利要求20的免疫原性组合物，其中所述副痘病毒为绵羊副痘病毒株D1701。
22.权利要求19的免疫原性组合物，其中所述重组副痘病毒选自绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-H 和绵羊副痘病毒 D1701-V-CDV-F。
23.权利要求19的免疫原性组合物，其中所述异源DNA选自编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因，编码H蛋白的所述基因的片段，编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因和编码F蛋白的所述基因的片段。
24.权利要求23的免疫原性组合物，其中所述异源DNA为编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因或其片段。
25.权利要求23的免疫原性组合物，其中所述异源DNA为编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因或其片段。
26.权利要求19的免疫原性组合物，其中所述异源DNA选自SEQID N0:1，与SEQ IDNO:1具有至少约98%的同一性的序列，SEQ ID NO:2和与SEQ ID NO:2具有至少约98%的同一'I"生的序列。
27.—种制备权利要求19的免疫原性组合物的方法，其包括将权利要求1的重组副痘病毒与载体组合。
28.权利要求27的方法，其中所述副痘病毒为绵羊副痘病毒。
29.权利要求28的方法，其中所述副痘病毒为绵羊副痘病毒株D1701。
30.权利要求27的方法，其中所述重组副痘病毒选自绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-H和绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-F。
31.权利要求27的方法，其中所述异源DNA选自编码犬瘟热病毒的H蛋白的基因，编码H蛋白的所述基因的片段，编码犬瘟热病毒的F蛋白的基因和编码F蛋白的所述基因的片段。
32.权利要求27的方法，其中所述异源DNA选自SEQID ΝΟ:1，与SEQ ID ΝΟ:1具有至少约98%的同一性的序列，SEQ ID NO:2和与SEQ ID NO:2具有至少约98%的同一性的序列。
33.一种在动物受试者中诱导抗犬瘟热病毒的免疫应答的方法，其包括给所述动物施用治疗有效量的权利要求19至26的任一项的免疫原性组合物。
34.权利要求33的方法，其中诱导了抗-H或抗-F蛋白-特异性保护性免疫应答。
35.一种用于治疗动物受试者以抗犬瘟热病的方法，其包括给所述动物施用治疗有效量的权利要求19至26的任一项的免疫原性组合物。
36.权利要求1至10的任一项的重组副痘病毒用于制备药剂的用途，所述药剂用于治疗动物以抗犬瘟热病。
37.权利要求1至10的任一项的重组副痘病毒用于测定的用途，所述测定用于区分感染的动物与接种的动物。
38.权利要求37的用途，其中所述重组副痘病毒选自绵羊副痘病毒D1701-V-⑶V-H和绵羊副痘病毒D1701-V-CDV-F。
全文摘要
本发明涉及包含来源于犬瘟热病毒的异源DNA的重组副痘病毒，此类构建体的制备，以及其在免疫原性组合物和疫苗中的用途。本发明还涉及重组副痘病毒用于诊断的用途。
文档编号A61K39/175GK103079593SQ201180035295
公开日2013年5月1日 申请日期2011年7月18日 优先权日2010年7月20日
发明者O·M·马蒂农, N·K·D·雷迪 申请人:Ah美国42有限责任公司