专利名称：黏附特异性多肽序列聚己内酯多元醇-磷酸三钙支架的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组织工程生物支架，尤其是黏附特异性多肽序列聚己内酷多元醇-磷酸三钙支架。
背景技术：
成体干細胞具有较强组织再生修复功能，但量少且细胞活性随体外扩增次数增多而下降，限制了干細胞在临床上的应用。培养可用于临床的干細胞于三维类细胞外基质环境中可延缓干細胞衰老。发现可延缓干细胞衰老，维持干細胞分化潜能的新型生物支架及其培养体系，对干細胞体外扩增及组织工程临床应用有重要意义。以三维聚己内酯多元醇-磷酸三钙 (polycaprolactone-tricalcium phosphate PCL-TCP)生长支架为基础，结合不同特定细胞粘附胶原多肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸Arg—Gly—Asp RGD序列、天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸Asp—Gly—GIu—Ala DGEA序列)制备三维类细胞外基质环境新型组织工程生物支架，国内外尚无类似研究报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供黏附特异性多肽序列聚己内酷多元醇-磷酸三钙支架，以解决上述背景技术中的缺点。本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现
本发明结合不同特定細胞粘附胶原多肽序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸Arg—Gly— Asp RGD序列、天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸Asp—Gly—GIu—Ala DGEA序列)修饰PCL — TCP支架，将多肽分子以交联方式固定干支架表面，交联比例为比例为0.2毫克多肽/每平方毫米表面积支架。黏附特异性多肽序列支架制备方法，包括以下步骤
第一歩PCL — TCP 活化=PCL 一 TCP 支架用 10% (w/w) 1，6-hexanediamine/ isopropanol (DEA/IPA己ニ胺/异丙醇)溶液处理，常温25°C，时间30分钟到90分钟，完成后用0. 3%Tween 20 (吐温20)和去离子水充分洗涤，干燥；
第二步0. IM多肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸Arg—Gly—Asp RGD序列及天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸Asp — Gly — GIu — Ala DGEA序列)，EDC (1-乙基-(3-ニ 甲基氨基丙基)碳酰ニ亚胺盐酸盐)，N-hydroxysuccinimide (NHS，N-羟基琥珀酰亚胺) 分别配制于 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES，2_(N_ 吗啉)乙磺酸)缓冲液 (pH=5. 5)中；
第三步精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg—Gly—Asp RGD)序列及天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸(Asp — Gly — GIu — Ala DGEA)序列溶液首先和EDC溶液以1:1摩尔比混合；
第四步相当于25%EDC摩尔量的NHS加入到混合液，使得最终溶液中多肽EDC =NHS摩尔比=4:4:1 ；
第五步溶液配好立即处理支架，将已活化的PCL — TCP支架置入多肽EDC =NHS混合溶液中，比例为0.2毫克多肽/每平方毫米表面积支架。常温下处理时间3小时左右； 第六步完成后用磷酸缓冲液冲洗，干燥即形成支架。有益效果
本发明制成的组织工程支架，对于多次传代(10，20，30)骨髄间充质干細胞及其他来源的干細胞如来源于脂肪组织的干細胞，培养后的形态观察，老化細胞量及増殖速度測定、细胞增殖计数、3H标胸腺嘧啶摄取率測定、CFU克隆増殖试验、β-半乳糖苷酶试剂盒试剂盒測定衰老程度測定、增殖衰老相关蛋白质(PPARr，stro-1, P53, C-myc, Bcl-2, TERT)表达变化情况、检测不同传代細胞表面抗原及凋亡細胞量，证实本发明制成的组织工程支架能够延缓干细胞衰老，维持间充质干細胞及其他类型的干細胞的分化潜能。
图1为本发明的实施工艺流程图。
具体实施例方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进ー步阐述本发明。參见图1，黏附特异性多肽序列支架的实施工艺流程图，PCL 一 TCP支架用10% (w/w) 1，6-hexanediamine/ isopropanol (DEA/IPA 己ニ胺 / 异丙醇)溶液处理活化，常温25°C，时间30分钟到90分钟，完成后用0. 3%Tween 20 (吐温20)和去离子水充分洗涤， 干燥；0. IM多肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸Arg—Gly—Asp RGD序列及天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸Asp — Gly — GIu — Ala DGEA序列)，EDC (1_乙基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亚胺盐盐)，N-hydroxysuccinimide (NHS, N-羟基琥珀酰亚胺)分別配制于 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES，2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲液(pH of 5.5)中。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg—Gly—Asp RGD)序列及天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸(Asp — Gly—GIu—Ala DGEA)序列溶液首先和EDC溶液以1:1摩尔比混合；相当于25%EDC摩尔量的NHS溶液加入到混合液，使得最终溶液中多肽EDC =NHS摩尔比=4:4:1。溶液配好立即处理支架，将已活化PCL — TCP支架置入多肽、EDC、NHS混合溶液中，比例为0.2毫克多肽/每平方毫米表面积支架。常温下处理时间3小时左右。完成后用磷酸缓冲液冲洗，干燥即形成支架。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
权利要求
1.黏附特异性多肽序列聚己内酷多元醇-磷酸三钙支架，其特征在于，结合不同特定細胞粘附胶原多肽序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸Arg—Gly—Asp RGD序列、天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸Asp — Gly — GIu — Ala DGEA序列)修饰PCL — TCP支架，将多肽分子以交联方式固定于PCL — TCP支架表面，交联比例为比例为0. 2毫克多肽/每平方毫米表面积支架。
2.黏附特异性多肽序列聚己内酷多元醇-磷酸三钙支架的制备方法，其特征在干，包括以下步骤第一歩PCL — TCP 支架活化PCL — TCP 支架用 10% (w/w) 1，6-hexanediamine/ isopropanol (DEA/IPA己ニ胺/异丙醇)溶液处理，常温25°C时间30分钟到90分钟，完成后用0. 3%Tween 20 (吐温20)和去离子水充分洗涤，干燥；第二步0. IM多肽(精氨酸-甘氨酸天冬氨酸Arg~Gly—Asp RGD序列及天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸Asp — Gly — GIu — Ala DGEA序列)，EDC (1_乙基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亚胺盐酸盐)，N-hydroxysuccinimide (NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)分別配制于 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES，2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲液(pH of 5. 5)中；第三步精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg—Gly— Asp RGD)序列及天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸(Asp — Gly — GIu — Ala DGEA)序列溶液首先和EDC溶液以1:1摩尔比混合；第四步相当于25%EDC摩尔量的NHS溶液加入到混合液，使得最终溶液中多肽EDC NHS 摩尔比=4:4:1 ；第五步将已活化的PCL — TCP支架置于多肽、EDC、NHS溶液中，比例为0. 2毫克多肽对每平方毫米表面积支架；常温下处理时间3小时左右；第六步完成后用磷酸缓冲液冲洗，干燥即形成支架。
全文摘要
黏附特异性多肽序列聚己内酯多元醇-磷酸三钙支架，延缓干细胞衰老，维持干细胞分化潜能的组织工程生物支架。以三维PCL－TCP聚合物陶瓷复合支架[聚乙内酯多元醇(PCL，Polycaprolactone)磷酸三钙(TCP,Tri-calciumphosphate)]生长支架为基础，结合不同特定细胞粘附胶原多肽序列(RGD、DGEA)修饰PCL－TCP支架，将多肽分子以交联方式固定于支架表面，制备延缓干细胞衰老，维持干细胞分化潜能的新型组织工程生物支架。
文档编号A61L27/38GK102552980SQ201210007080
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者吴献青, 周叶方, 彭浩 申请人:中南大学湘雅三医院