禽流感病毒灭活疫苗的制备方法及产品的制作方法

专利名称：禽流感病毒灭活疫苗的制备方法及产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗的制备方法及其产品，尤其是涉及一种禽流感灭活疫苗的制备方法以及由此方法获得的产品。
背景技术：
当前禽流感灭活疫苗的生产主要是采用鸡胚繁殖法，该培养方式是通过将禽流感病毒接种到鸡胚尿囊液中，随着鸡胚的生长，病毒大量复制繁殖，通过收获接毒鸡胚尿囊液获得大量病毒的方法。该工艺虽简单易行，但资源浪费严重，劳动强度大、生产周期长、生产效率低，尾产物无害化处理难度大，存在生物安全风险。悬浮培养技术在国际生物制药领域早已得到广泛应用，在过去几十年来，全球大规模培养技术发展迅速，从使用转瓶、CellCube等贴壁细胞培养，发展为生物反应器大规模细胞培养。反应器在工业中的应用规模不断扩大，目前全球生物制药生产中生物反应器使用率已经达到70%以上，在兽用生物制品的生产中也得到广泛的应用，如Wellcome集团分布于欧洲、非洲和南美洲8个国家的生产厂商，应用此技术工业化生产口蹄疫疫苗和兽用狂犬疫苗。我国生物制药技术产业中大规模工业化培养动物细胞起步较晚，远远落后于国际先进水平，国内多数生物医药生产企业细胞培养规模及对生物反应器的应用仍停留在起步时期、实验室规模，发展较为缓慢。国内人用和兽用疫苗生产企业100余家，目前只有3 5家人用疫苗的生产企业应用反应器进行动物细胞培养技术生产疫苗，不足10%。此外，目前尚没有采用细胞以及生物反应器等方式大规模生产禽流感灭活疫苗的技术。

发明内容
本发明的一个目的在于提供一种利用细胞及生物反应器等方式生产禽流感灭活疫苗的方法。该方法可以进行大规模生产，且制品的安全性良好，由接种疫苗导致的副反应较少。本发明的另一个目的在于提供一种禽流感灭活疫苗，该疫苗利用细胞及生物反应器来进行生产，制品安全性高，由接种疫苗导致的副反应少。为了解决上述技术问题，本申请的发明人进行了反复研究，发现如下技术方案可以解决上述技术问题。本发明提供一种禽流感灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤I)制苗用细胞的传代与培养将细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用细胞生长液在细胞培养瓶或生物反应器中培养，形成培养细胞；2)病毒适应细胞驯化用细胞维持液将禽流感病毒稀释至浓度为O. I 5wt%的病毒液，将该病毒液接种到长成单层细胞的培养板，添加TPCK胰酶，在温箱吸附O. 5 3h 后补充细胞维持液，置于培养箱中培养；基于相同上述方法，连续传代使病毒适应细胞从而获得驯化好的禽流感生产毒种；3)任选地，建立病毒种子批取低代毒种建立原始种子、基础种子、和/或生产种子;4)制苗用病毒的培养将步骤I)的培养细胞接种步骤2)驯化好的禽流感生产毒种，添加TPCK胰酶，吸附O. 5 3h后，添加细胞维持液继续培养；5)制苗用病毒液的收获病毒培养至10 50h后，取样检测培养基中的葡萄糖残留含量及病毒液血凝价，当两项检测值均趋于稳定时，收获病毒液；6)任选地，制成疫苗成品将收获的病毒液离心分离、灭活、乳化制成疫苗成品。在本发明的制备方法中，优选地，步骤I)中的培养细胞在40代以内。在本发明的制备方法中，优选地，步骤I)中的细胞生长液为含8 10wt%血清的 DMEM培养基、含3 5wt%血清的DMEM低血清培养基、或者无血清培养基。在本发明的制备方法中，优选地，步骤I)中培养条件为溶氧30 60%、pH为 7. O 7. 3、温度为36. 5 37. 5°C、和/或反应器转速为40_50rpm。优选地，步骤I)中进行反应器自动控制、和/或细胞悬浮培养。在本发明的制备方法中，优选地，步骤2)中的TPCK胰酶的添加量为O. I 3. O μ g/ml,即添加TPCK胰酶直至体系中TPCK胰酶浓度为O. I 3. O μ g/ml。在本发明的制备方法中，优选地，步骤2)中的培养条件为pH为7. O 7. 2、温度为 36 37°C、和/或CO2浓度为5%。优选地，步骤2)中进行病毒适应细胞培养。在本发明的制备方法中，优选地，步骤3)中的原始种子为2 5代、基础种子为 6 9代、和/或生产种子不超过13代。在本发明的制备方法中，优选地，步骤4)中培养条件为溶氧40 60%、pH为
7.O 7. 2、温度为36 37°C、和/或反应器转速为50rpm。在本发明的制备方法中，优选地，步骤2)中细胞维持液为含I 2wt%血清的 DMEM培养基或无血清培养基；和/或步骤4)中细胞维持液为含I 2wt%血清的DMEM培
养基或无血清培养基。在本发明的制备方法中，优选地，步骤4)中TPCK胰酶的添加量为O. I 3. O μ g/ ml,即添加TPCK胰酶直至体系中TPCK胰酶浓度为O. I 3. O μ g/ml。在本发明的制备方法中，优选地，步骤5)中病毒液葡萄糖残留含量稳定于O. 5 I. 5g/L，和病毒液血凝价HA彡29。在本发明的制备方法中，优选地，在步骤6)中，离心分离采用高速冷冻连续流离心机，其转速> 9000rpm。优选地，在步骤6)中，灭活采用甲醛溶液。优选地，甲醛溶液终浓度为O. lvt%。此外，在37°C灭活16小时以上。在本发明的制备方法中，优选地，在步骤6)中，采用如下方法进行乳化将2 3重量份油相置于乳化罐中，搅拌的同时加入2 I重量份水相(即灭活病毒液制备的水相)，充分混匀后进行乳化。在本发明的制备方法中，优选地，所述生物反应器为激流式生物反应器，其细胞培养载体为聚酯纤维载体。在本发明的制备方法中，优选地，所述细胞为犬肾细胞MDCK、非洲绿猴肾细胞 VERO或鸡胚成纤维细胞DF-I。
在本发明的制备方法中，优选地，所述的禽流感灭活疫苗为H9亚型、F株禽流感灭
活疫苗。在本发明的制备方法中，优选地，步骤2)或步骤4)中TPCK胰酶浓度为1.2yg/ ml ο本发明还提供一种禽流感灭活疫苗，其通过本发明所述的制备方法得到。采用本发明的制备方法，可以实现禽流感灭活疫苗的大规模生产。此外，使用模拟机体生理环境的密闭生物反应器高密度、大批量悬浮培养细胞生产禽流感病毒，全密闭、管道化系统减少了污染细胞、病毒的机会；自动化程度的提高，减少了人为操作的因素；通过自动调节PH，溶氧、温度及振荡速度等生产参数，实现细胞及病毒的高效表达。生物反应器容积的扩大，提升了终端产品的均一性，应用在疫苗生产方面，可增加制品的安全性，减少由接种疫苗导致的副反应，提高疫苗的质量和产量。再有，该方法克服禽流感疫苗的生产瓶颈，用细胞繁殖病毒替代鸡胚生产技术。
具体实施例方式在下面的描述中，除非特别说明，“ % ”均表示重量百分数，即“wt% ”。在本发明中，所谓的“禽流感”(Bird Flu或Avian Influenza)是由禽流感病毒 (AIV)引起的一种急性传染病，目前已知其可以感染人类。本发明所述的“灭活疫苗”是一种采用物理方法、化学方法等杀死病原生物而制得的用于预防接种的生物制品。通常，灭活疫苗是先对病毒或细菌培养，然后将其灭活。灭活的方式是本领域所熟知的那些，例如加热灭活，或者使用福尔马林溶液灭活。灭活疫苗即可由整个病毒或细菌组成，也可由它们的裂解片段组成为裂解疫苗。在本发明中，禽流感灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤I)制苗用细胞的传代与培养；2)病毒适应细胞驯化；3)任选地，建立病毒种子批；4)制苗用病毒的培养；5)制苗用病毒液的收获；6)任选地,制成疫苗成品。在本发明中，步骤3)是任选的，也就是说，本发明的制备方法可以仅包括步骤I)、
2)、4)、5)、6)。优选地，本发明包括步骤I) 6)。在本发明中，步骤6)可以采用本领域所熟知的方式，也可以采用本发明所描述的方式，因而也是任选的。即使省略步骤6)，也属于本发明的范围。当然，优选地，本发明的制备方法中包括步骤6)。下面将详细描述本发明的疫苗、病毒的选择以及繁殖病毒用细胞的种类。<疫苗、培养基、病毒与细胞的种类>在本发明中，禽流感灭活疫苗包括H5亚型、H9亚型等，优选为H9亚型，更优选为 H9亚型、F株的禽流感灭活疫苗。在本发明中，培养基包括细胞生长液、细胞维持液等。本发明所用的细胞生长液包括含8 10wt%血清的DMEM培养基、含3 5wt%血清的DMEM低血清培养基和无血清培养基，优选为含3 5wt%血清的DMEM低血清培养基，更优选为无血清培养基。在本发明中，所用的细胞维持液包括含I 2wt%血清的DMEM培养基或无血清培养基。在本发明中，所用的禽流感病毒优选为禽流感鸡胚适应毒、禽流感鸭胚适应毒，更优选为禽流感鸡胚适应毒。在本发明中，繁殖病毒用细胞的种类并没有特别限制，只要其能够使禽流感病毒进行繁殖即可。繁殖病毒用细胞优选为MDCK、VERO或DF-I细胞。这些细胞均是本领域所已知的，例如CN101189326A、CN1894400A所公开的那些。例如，非洲绿猴肾细胞(VER0细胞)是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的。DF-I细胞为鸡胚胎成纤维细胞，其生产企业包括上海拜力生物科技有限公司等。这些细胞均可稳定传代，在规定代次内无外源病毒、无致瘤性、致畸性，对禽流感病毒有较好的敏感性，能够大规模连续培养。下面将详细描述本发明的制备方法。<疫苗的制备过程>I、制苗用细胞的传代与培养取生长良好的MDCK、VERO或DF-I单层细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代， 用细胞生长液在细胞培养板/瓶中37°C继续培养，形成良好单层时，用于继续传代、接毒或接种于细胞培养瓶或生物反应器中进行悬浮培养。在本发明中，EDTA-胰酶细胞分散液是本领域所已知的那些，优选使用O. 02wt% EDTA+0. 25wt%胰酶的消化液，例如使用上海沪峰生物科技有限公司的产品。在本发明中，细胞生长液是本领域所已知的那些，例如前文所述。这里不再赘述。在本发明中，优选地，I 10代(优选为2 8代、更优选为3 6代)细胞定为原始细胞、10 20代(优选为12 18代、更优选为13 16代)定为基础细胞、20 35 代(优选为22 32代、更优选为25 28代)定为工作细胞，生产用细胞需控制在40代以内(例如36 39代)。在本发明中，细胞生长液优选为含8 10%血清的DMEM培养基。DMEM培养基为美国GIBCO公司生产的产品。血清优选为牛血清。牛血清为美国飞世尔科学国际公司、海克隆生物化学制品有限公司生产的产品。2、病毒适应细胞驯化用细胞维持液将H9亚型禽流感鸡胚毒病毒液稀释，再将病毒液分别接种到长满单层细胞的24孔培养板上，添加TPCK胰酶，于37°C温箱吸附，添加细胞维持液，置二氧化碳培养箱中培养，根据细胞病变适时收获，如不出现细胞病变可盲传2 4代使病毒适应细胞。基于上述相同方法，连续传代使病毒适应细胞，测定病毒液血凝价HA及50%组织细胞感染量TCID5tlt5根据检测结果，判断病毒对细胞的适应程度，当病毒液血凝价，HA > 29， 每O. Iml病毒含量TCID5tl ^ 107_°°，确定病毒适应细胞驯化成功。在本发明的上述步骤中，上述病毒液的浓度优选为O. I 5wt%，更优选为I. O 3. Owt %,更优选为I I. 5wt%。在本发明的上述步骤中，上述吸附时间优选为O. 5 3h，更优选为O. 8 2h，更优选为lh。在本发明中，TPCK胰酶，又称为TPCK处理胰酶，为本领域所已知的，其CAS号为9002-07-7，可以商购自Sigma-Aldrich公司。在上述步骤中，添加TPCK胰酶至其浓度为
0.I 3. O μ g/ml,优选为 O. 5 I. 5 μ g/ml,更优选为 I. 2 μ g/ml。在本发明中，细胞维持液优选为含I 2%血清的DMEM培养基。本发明所用的 DMEM培养基为美国GIBCO公司生产的产品。血清优选为牛血清。本发明所用的牛血清为美国飞世尔科学国际公司、海克隆生物化学制品有限公司生产的产品。3、H9亚型(F株)病毒种子批的建立选取效价稳定的低代细胞毒建立三级种子批，其中原始种子为2 5代(优选为 3 4代)、基础种子为6 9代(优选为7 8代)、生产种子13代以内(例如10 12 代)。其中效价稳定的判断标准如下原始种子的病毒液血凝价为22彡HA < 25，每O. Iml病毒含量102_°° ( TCID50 < IO4.00 ；基础种子的病毒液血凝价为25彡HA彡29，每O. Iml病毒含量 IO4-00 ( TCID50 ( IO7.00 ；生产种子的病毒液血凝价HA彡29，每O. Iml病毒含量TCID5tl彡107_°°。4、生物反应器培养细胞、繁殖病毒(I)校准生物反应器上的pH探头、溶氧探头及温度探头，并装入消毒桶中高压灭菌；将激流袋及灌注袋充气保压过夜。(2)将灭菌后的pH探头、溶氧探头及温度探头装入保压合格的激流袋中，安装到生物反应器上，连接激流袋与灌注袋，加入PH为7. 2的缓冲盐水，启动生物反应器自控系统，调整自控参数为pH为7. O 7. 3，温度为36 37°C，反应器转速为40_50rpm，缓冲盐水在系统中循环，过夜。(3)系统自控暂停，排出缓冲盐水，加入含8 10%血清的DMEM培养基(或者为含3 5%血清的DMEM培养基、或者为无血清培养基)，启动生物反应器自控系统，调整自控参数为pH为7. O 7. 3，温度为36. 5 37. 5°C，反应器转速为40_50rpm。在本发明的上述步骤中，DMEM培养基是本领域所已知的，其是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。例如，美国GIBCO公司或上海博华生物科技有限公司所生产的DMEM培养基。(4)将灌注袋中的培养基全部转入激流袋，停止反应器培养基循环。将消化好的细胞液转入灌注袋中，细胞总数不低于2X 109cells，吸附一定时间后启动培养基循环，调整溶氧30 60%，pH为7. O 7. 3，温度为36. 5 37. 5 °C，反应器转速为40 60rpm，开始细胞培养。在本发明的上述步骤⑷中，吸附时间可以为O. 5 3h，优选为O. 8 2. 0h，更优选为I. O I. 5h。(5)每日定时取样测定葡萄糖残留含量，计算耗糖量达到1.4g/L时，停止培养， 排出细胞培养液，转入37°C的缓冲盐水清洗细胞，排出缓冲盐水，在灌注袋内接入含I
1.5wt%的H9亚型(F株)禽流感病毒及TPCK胰酶的病毒维持液，吸附一定时间。然后调整培养参数为溶氧40 60 %，pH为7. O 7. 2，温度为36 37°C，反应器转速为40 60rpm， 启动自控，进行病毒培养。在本发明的上述步骤(5)中，TPCK胰酶的病毒维持液中TPCK胰酶的浓度可以为O.1 3. O μ g/ml,优选为O. 5 1. 5 μ g/ml,更优选为1. 2 μ g/ml。由于病毒维持液的量远大于禽流感病毒的量，因而病毒维持液中TPCK胰酶浓度相当于TPCK胰酶在整个体系的添加量。在本发明的上述步骤(5)中，反应器转速优选为50 60rpm，更优选为50rpm。在本发明的上述步骤(5)中，吸附时间的选择与步骤⑷的相同，这里不再赘述。本发明的生物反应器并没有特别限制，只要能够进行细胞培养、病毒繁殖即可。本发明的生物反应器优选为激流式生物反应器。例如杭州安普所生产的激流式生物反应器。 该生物反应器适合所有贴壁依赖性生长的细胞，不需要对相应细胞进行悬浮驯化，同时生物反应器自动化、智能化程度高，占地小、易操作，便于产量快速放大，质量均衡稳定。本发明所用生物反应器的生产耗材可以为一次性抛弃型培养袋。材料对细胞生长无任何不良影响，能够提供良好的溶解氧，不释放有毒有害物质，气密性良好，耐受机械张力；不需要清洗、消毒，节约能源及相应的人力资源。5、制苗用病毒液的收获在培养10 50h后，每隔2 3小时取样测定葡萄糖残留含量及病毒液血凝价，病毒液葡萄糖残留含量稳定于O. 5 I. 5g/L(优选为O. 6 I. 3g/L,更优选为O. 8 I. 2g/ L)，病毒液血凝价HA > 29时收获毒液，于_20°C保存备用。在本发明的上述步骤中，培养10 50h、优选为20 40h、更优选为30h之后进行
葡萄糖残留含量及病毒液血凝价的测定。6、病毒液纯化、灭活及乳化制成疫苗产品收获病毒液冻融2次后，用高速冷冻连续流离心机经> 9000rpm的离心，收获分离液，用甲醛溶液灭活，甲醛溶液终浓度O. 1%，37°C灭活16小时。将3份油相置于乳化罐中，搅拌的同时加入I份灭活液制备的水相，充分混匀后再通过管线式乳化机乳化2次，制成禽流感灭活疫苗(H9亚型，F株)。定量分装，加盖密封， 贴标签，置2 8°C保存。在本发明中，油相的组成并没有特别限制，只要其能够用于疫苗制备即可。优选地，本发明的油相包括白油和第一表面活性剂。相对于100重量份油相，白油的用量为 80-100重量份，优选为85-98重量份，更优选为90-94重量份。相对于100重量份油相，第一表面活性剂的用量为0-20重量份，优选为2-15重量份，更优选为6-10重量份。在本发明中，优选地，白油为注射用白油。本发明所用的第一表面活性剂优选为 Span(称为司本或司盘)或Tween(即吐温)，更优选为Span。Span的实例包括但不限于 Span-20、Span-40> Span-60> Span-80、或 Span-85。Tween 的实例包括但不限于 Tween-20、 Tween-40 > Tween-60、或 Tween-80。在本发明中，油相的制备步骤是本领域所已知的。例如，将白油和第一表面活性剂混合后，高压灭菌制备得到油相。在本发明中，水相的组成并没有特别限制，只要其能够用于疫苗制备即可。本发明的水相包括纯化后灭活的AIV抗原液,优选还包括第二表面活性剂。相对于100重量份水相，抗原液的用量为80-100重量份，优选为85-98重量份，更优选为90-96重量份。相对于100重量份水相，第二表面活性剂的用量为0-20重量份，优选为2-15重量份，更优选为 4-10重量份。
本发明所用的第二表面活性剂与第一表面活性剂可以相同或者不同，优选为二者不同。第二表面活性剂优选为Tween。Tween的实例包括但不限于Tween-20、Tween-40> Tween-60、或 Tween-80。在本发明中，水相的制备是本领域所已知的。例如，将纯化后灭活的AIV抗原液与灭菌的第二表面活性剂混合，充分摇动，直到第二表面活性剂完全溶解。本发明的病毒液纯化方法，简单、快捷、有效去除杂蛋白，病毒损失少，病毒液回收率高。下面将进一步描述灭活疫苗的检验方法。〈疫苗的检验方法〉(I)性状的检测方法①外观采用裸眼观察所得乳液的外观。②剂型取一清洁吸管，吸取Iml疫苗滴于冷水中，除第I滴外，观察其余液滴是否发生扩散现象。③稳定性吸取IOml疫苗加入离心管中，在离心机中以3000rpm(即r/min)离心15分钟，取出离心管，测定管底析出水相部分的体积。不超过O. 5ml为合格；超过0.5ml为不合格。④粘度用旋转式粘度计在20±0. 1°C测定疫苗的动力粘度。不超过200cP为合格；超过200cP为不合格。(2)无菌检验方法按现行《中国兽药典》(2010年版)附录进行检验，检测是否有菌生长。(3)安全检验方法用10 14日龄SPF鸡10只，各肌肉或皮下注射疫苗I. 0ml，观察14日，观察是否出现因注射疫苗而引起的局部和全身不良反应。(4)效力检验方法①血清学方法用21 28日龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射本发明制备的禽流感灭活疫苗(H9亚型、F株)O. 2ml，另5只作对照。接种后21 28日，每只鸡分别采血，分离血清，用禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体。计算HI抗体效价的几何平均值(GMT)。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于I : 64，且对照组HI抗体效价应不高于I : 4,为合格；免疫组HI抗体效价的几何平均值低于I : 64，或对照组HI抗体效价高于I : 4， 为不合格。②免疫攻毒法
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用21 28日龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射本发明制备的禽流感灭活疫苗(H9亚型、F株)O. 2ml，另5只作对照。接种后21 28日，用I : 10稀释的AIV F毒种进行翅静脉注射，每只鸡O. 2ml。攻毒后第5日，分别采集每只鸡的泄殖腔拭子，每个样品经尿囊腔接种9 11日龄SPF鸡胚5枚，每胚O. 2ml，孵育观察5日，逐胚测定鸡胚液的HA效价。每个样品接种的5枚鸡胚中只要有I枚鸡胚胚液的HA效价彡I : 16 (微量法)， 即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传I次后再进行判定。测定免疫组中10只鸡中病毒分离阴性的鸡的只数，若有至少有9只鸡病毒分离阴性，则为合格，否则为不合格；测定对照组中5只鸡中病毒分离阳性的鸡的只数，应全部为阳性。(5)甲醛、汞类防腐剂残留量测定方法分别按现行《中国兽药典》(2010年版)附录进行测定，观察是否符合兽用生物制品通则的规定。实施例I<1>生物反应器的选择杭州安普的激流式生物反应器，100L培养体积。<2>制苗用细胞的选择(I)选择犬肾细胞MDCK(购自中国兽医药品监察所)为制苗用细胞。(2)细胞代次I 10代细胞定为原始细胞、10 20代定为基础细胞、20 35代定为工作细胞， 生产用细胞需控制在40代以内。液氮保存，保存期定为36个月。(3)细胞特性按现行《中国兽药典》(2010年版)附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染，对H9亚型禽流感病毒敏感。<3>制苗用毒种(I)制苗用毒种为H9亚型禽流感病毒经细胞传代适应后的细胞毒F株，其中原始种子为2 5代、基础种子为6 9代、生产种子不超过13代。在-70°C以下，保存期为18 个月。在_20°C以下，保存期为3个月。(2)纯净按现行《中国兽药典》(2010年版)附录进行，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。(3)效检毒种标准毒种为H9亚型(F株)禽流感鸡胚毒，每O. Iml病毒含量应彡IO7 tlEID5tl，含毒鸡胚液对I %鸡红细胞凝集价应> I 256，毒种代次为E2 E8代。<4>疫苗制造方法(I)利用生物反应器培养细胞将消化好的细胞液转入灌注袋中，细胞总数不低于2X IO9个细胞，吸附I小时后启动培养基循环，调整溶氧30 60%，pH为7. O 7. 3，温度为36. 5 37. 5°C，反应器转速为40-50rpm，开始细胞培养。
(2)利用生物反应器繁殖制苗用毒液细胞培养结束，排出细胞培养液，转入37°C的缓冲盐水清洗细胞，排出缓冲盐水， 在灌注袋内接入含I 1.5%的H9亚型(F株)禽流感病毒及I. 2 μ g/ml TPCK胰酶的病毒维持液，吸附I小时。然后调整培养参数为溶氧40 60%，pH为7. O 7. 2，温度为36 370C，反应器转速为50rpm，启动自控，进行病毒培养。(3)收获毒液24小时后，每隔4小时取样测定葡萄糖残留含量及病毒液血凝价，当病毒液葡萄糖残留含量稳定于O. 5 I. 5g/L，病毒液血凝价HA > 29时收获毒液，于_20°C保存备用， 保存期不超过6个月。(4)离心分离将收获病毒液冻融2次后，用高速冷冻连续流离心机经> 9000rpm的离心，收获分离液，用甲醛溶液灭活，甲醛溶液终浓度O. lvt%，37°C灭活16小时，得到纯化后灭活的AIV 抗原液。(5)成品油相的制备取注射用白油94份，再加入司本-80 (Span-80) 6份，混合后，高压灭菌备用。水相的制备将纯化后灭活的AIV抗原液96份，加入灭菌的吐温_80 (Tween-80) 4 份，充分摇动，直到吐温-80完全溶解。疫苗成品的制备取油相3份于乳化罐中，搅拌的同时加入I份水相，充分混匀后再通过管线试乳化机乳化2次，制成禽流感灭活疫苗(H9亚型，F株)，定量分装，加盖密封， 贴标签，置2 8°C保存，保存期不超过12个月。所得产品的成品检验结果参见表I。实施例2-3除了分别选用非洲绿猴肾细胞系VERO(购自中国兽医药品监察所)、鸡胚成纤维细胞系DF-I (购自中国兽医药品监察所)之外，其他步骤均与实施例I相同，获得禽流感灭活疫苗(H9亚型，F株)。所得产品的成品检验结果参见表I。表I、疫苗成品检验结果
权利要求
1.一种禽流感灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤1)制苗用细胞的传代与培养将细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用细胞生长液在细胞培养瓶或生物反应器中培养，形成培养细胞；2)病毒适应细胞驯化用细胞维持液将禽流感病毒稀释至浓度为O. I 5 ^%的病毒液,将该病毒液接种到长成单层细胞的培养板，添加TPCK胰酶，在温箱吸附O. 5 3h后补充细胞维持液，置于培养箱中培养；基于相同上述方法，连续传代使病毒适应细胞从而获得驯化好的禽流感生产毒种；3)任选地，建立病毒种子批将低代毒种作为原始种子、基础种子、和/或生产种子；4)制苗用病毒的培养将步骤I)的培养细胞接种步骤2)驯化好的禽流感生产毒种，添加TPCK胰酶，吸附O.5 3h后，添加细胞维持液继续培养；5)制苗用病毒液的收获病毒培养至10 50h后，取样检测培养基中的葡萄糖残留含量及病毒液血凝价，当两项检测值均趋于稳定时，收获病毒液；6)任选地,制成疫苗成品将收获的病毒液离心分离、灭活、乳化制成疫苗成品。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤I)中的培养细胞在40代以内。
3.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于步骤I)中的细胞生长液为含 8 10wt%血清的DMEM培养基、含3 5wt%血清的DMEM培养基、或无血清培养基。
4.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于步骤I)中培养条件为溶氧 30 60%，pH为7. O 7. 3，温度为36. 5 37. 5°C，反应器转速为40_50rpm，进行反应器自动控制、细胞悬浮培养。
5.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤2)中，添加TPCK胰酶直至体系中TPCK胰酶浓度为O. I 3. O μ g/ml。
6.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于步骤2)中的培养条件为pH为 7. O 7. 2，温度为36 37°C，CO2浓度为5%，进行病毒适应细胞培养。
7.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于步骤3)中的原始种子为2 5 代、基础种子为6 9代、和生产种子不超过13代。
8.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于步骤4)中培养条件为溶氧40 60%，pH为7. O 7. 2，温度为36 37°C，反应器转速为50rpm。
9.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于步骤2)中细胞维持液为含I 2wt%血清的DMEM培养基或无血清培养基；和/或步骤4)中细胞维持液为含I 2wt%血清的DMEM培养基或无血清培养基。
10.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤4)中，添加TPCK胰酶直至体系中TPCK胰酶浓度为O. I 3. O μ g/ml。
11.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于步骤5)中病毒液葡萄糖残留含量稳定于O. 5 I. 5g/L,病毒液血凝价HA彡29。
12.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于在步骤6)中，离心分离采用高速冷冻连续流离心机，其转速> 9000rpm ;灭活采用甲醛溶液，其浓度为O. lvt%，37°C灭活 16小时以上。
13.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于在步骤6)中，采用如下方法进行乳化将2 3重量份的油相置于乳化罐中，搅拌的同时加入2 I重量份灭活后病毒制备的水相，充分混匀后进行乳化。
14.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于所述生物反应器为激流式生物反应器，其细胞培养载体为聚酯纤维载体。
15.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于所述细胞为犬肾细胞MDCK、非洲绿猴肾细胞VERO或鸡胚成纤维细胞DF-I。
16.根据权利要求I或2所述的制备方法，所述的禽流感灭活疫苗为H9亚型、F株禽流感灭活疫苗。
17.根据权利要求5或10所述的制备方法，其特征在于步骤2)或步骤4)中TPCK胰酶浓度为I. 2 μ g/ml。
18.一种禽流感灭活疫苗，其特征在于，其通过权利要求I 17任一项所述的制备方法得到。
全文摘要
本发明公开了一种禽流感灭活疫苗的制备方法及产品，通过禽流感适应毒适应传代细胞系的筛选、驯化，病毒适应细胞后连续扩增，直至接种至细胞培养瓶或生物反应器中培养，收获培养物经灭活后，与矿物油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明避免采用禽用疫苗制造大批使用鸡胚的病毒繁殖方法，既降低资源消耗、减少环境污染、保障生物安全，又降低成本、提高生产效率；本发明能够产出高效价的病毒制备相应疫苗，满足快速、高效生产疫苗的要求。
文档编号A61P31/16GK102600464SQ201210059610
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者石宝兰 申请人:扬州优邦生物制药有限公司, 扬州威克生物工程有限公司