专利名称：一种厚朴果实提取物的提取方法及其抗菌用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种厚朴果实提取物的提取方法及其抗菌用途。
背景技术：
在世界范围内，尤其是发展中国家，感染性疾病拥有很高的发病率和死亡率。抗生素以及农药虽然可以保护人类和 农作物免受病原微生物的侵害，但是它们的毒副作用对人类的健康却是不利的。另一方面，抗生素和农药的滥用也导致了严重的生态和环境问题。病原体的耐药性也使得人们不得不寻找更加良好的抗菌剂以用于临床和农业生产。药用植物在适应自然环境、对抗自然界中的微生物感染的过程中逐渐形成其固有的化学防御机制，近年来，药用植物逐渐受到了科学界的广泛关注。大量的药用植物的挥发油和提取物被证明具有抗菌活性，这为抗微生物感染带来了新的希望。厚朴为木兰科植物厚朴(Magnolia officinalis Rehd. et ffils.)或凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd. et ffils. var. biloba Rehd. et ffils)的干燥干皮、根皮及枝皮。在我国，厚朴主产于四川、湖北和陕西等地，凹叶厚朴主产于浙江、湖南、江西、广西、安徽等地。厚朴有下气除满、燥湿消痰之功效，为我国常用的传统中药之一。《神农本草经》将厚朴列为上品；《本草汇言》中记载“厚朴，宽中化滞，平胃气之药也。凡气滞于中，郁而不散，食积于胃，羁而不行，或湿郁积而不去，用厚朴之温可以燥湿，苦可以下气也。”《本经》中所述“厚朴温中益气，厚肠胃……。”目前市场上所售藿香正气丸、鳖甲煎胶囊、保济丸、香砂养胃丸等药物中均以厚朴为其主药。从以往关于厚朴化学成分的研究来看，酚类化合物、生物碱、挥发油应为厚朴的主要化学组分；除此之外，还含有其他物质如棕榈酸、二十六烷醇、槲皮素、胡萝卜苷、皂苷、鞣质等。厚朴中酚类化合物主要为厚朴酚与和厚朴酚，这两种物质也被认为是厚朴的主要活性物质。现代药理学的研究显示，厚朴及其主要活性物质厚朴酚与和厚朴酚具有多种药理活性，主要为抗菌作用、抗肿瘤作用、抗氧化作用、对消化系统的作用、对中枢神经系统的作用、镇痛抗炎作用和其他作用。但是，厚朴是一种木本中药材，从种植到采收时间漫长，一般要经过10年的生长年限后才能开始采收其树皮，随着树龄的增大，树皮的厚度也增加，所得的药材质量也越高。但是由于过度的砍伐和剥皮，使厚朴资源遭到极大的破坏。且厚朴对保持水土和生态平衡也起着不可忽视的作用，所以处理这种厚朴药用与保护生态环境之间的矛盾显得尤为迫切。由于厚朴的广泛种植，厚朴果实的资源十分丰富、且每年均可再生，但从目前的研究和应用状况来看，对厚朴果实的研究和资源开发还未见报道，极大的浪费了厚朴的资源。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种厚朴果实提取物的提取方法及其抗菌用途。
一种厚朴果实提取物，其特征如下I)所述的提取物是按下述提取方法获得的称取干燥的厚朴果实粉，加入无水乙醇，常温下超声提取40-60分钟后，旋蒸浓缩至20-30mL，加入5-7倍量的蒸馏水，继续旋蒸至无乙醇味，冷冻干燥即得厚朴果实提取物。2)所述的提取物中含有18%_20%总酚，10%_15%厚朴酚，7%-10%和厚朴酚。作为优选方案所述的厚朴果实粉与无水乙醇的比例为厚朴果实粉/无水乙 醇=lg/(10 15)ml。在本发明中，根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)制定的M27-A3微量稀释法测定厚朴果实提取物对四种细菌、四种霉菌和四种念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)。供试菌为大肠杆菌Escherichia coli (CCAM 080173)、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus (CCAM080177)、枯草芽抱杆菌 Bacillus subtil is (CMCC 63501)、施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri (CCAM 080041)、黄曲霉 Aspergillus flavus (CCAM 080001)、米曲霉 Aspergillus oryzae (CCAM 080006)、黑曲霉 Aspergillus niger (CCAM 080002)、米根霉 Rhizopus oryzae (CCAM 080148)、白色念珠菌 Candida albicans (ATCC 64550)、热带念珠菌 Candida tropicalis (032)、克柔念珠菌 Candida krusei (09-1394)、近平滑念珠菌Candida parasilosis(07-305)。实验结果表明厚朴果实提取物对各菌种都有很好的抑制活性的作用。对四种细菌的MIC均为62. 5 μ g/mL，对四种霉菌的MIC在250-500 μ g/mL之间，对四种念珠菌的MIC在500-1000 μ g/mL 之间。厚朴果实提取物对黑曲霉菌丝生长、生物量、孢子产率和孢子萌发率有好的抑制作用。实验表明I)对黑曲霉菌丝生长的抑制效果厚朴果实提取物在2mg/mL时能完全抑制黑曲霉菌丝的生长；另外，在浓度低于2mg/mL时，提取物也表现出了延迟黑曲霉菌丝生长的效果，在浓度为I. 5mg/mL时能延迟黑曲霉菌丝生长5天，在浓度为lmg/mL时延迟时间为4天，在浓度为0. 25mg/mL和0. 5mg/mL时能延迟黑曲霉菌丝生长I天。2)对黑曲霉菌生物量的抑制效果不同浓度的提取物都能不同程度的降低黑曲霉生物量的扩增，各提取物浓度越高，黑曲霉生物量扩增越低，厚朴果实提取物在2mg/mL时能完全抑制黑曲霉生物量的扩增。3)对黑曲霉菌孢子产率和孢子萌发率的抑制效果不同浓度的提取物能不同程度的减少黑曲霉孢子的产生和孢子的萌发，且随着提取物的浓度增加，抑制活性增强，可见提取物对黑曲霉孢子产率和萌发率的抑制均呈现浓度依赖性。厚朴果实提取物在2mg/m时能完全抑制黑曲霉孢子的产生和萌发。另外，厚朴果实提取物在所试的浓度范围内对黑曲霉孢子产生表现出很强的抑制活性。在其浓度为0. 25mg/mL-l. 5mg/mL时，对黑曲霉孢子产量抑制率为 79. 85%-99. 05%。总之，本发明厚朴果实的提取方法中资源十分丰富、且每年均可再生，制备方法简单易行，容易操作；所制备的提取物有较好的抗菌用途，可作为抗菌类药物制剂的原料，制成片剂、注射剂、胶囊、栓剂、缓释剂、复方制剂等抗菌药物。
图I为本发明厚朴果实提取物对黑曲霉菌丝生长的影响，图中数据为数值为平均值(n=3) 土标准偏差
图2为本发明厚朴果实提取物对黑曲霉孢子产率的影响，图中数值为平均值(n=6) +SD图3为本发明厚朴果实提取物对黑曲霉孢子萌发率的影响，图中数值为平均值(n=6) +SD
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明及其抗菌效果作进一步的描述，本具体实施方式
并非对其保护范围的限制。实施例I厚朴果实提取物的制备
称取干燥的厚朴果实粉20g，加入无水乙醇200mL，常温下超声提取40分钟后，旋蒸浓缩至30mL，加入7倍量的蒸馏水，继续旋蒸至无乙醇味，冷冻干燥即得厚朴果实提取物。此法获得的厚朴果实提取物得率可达20. 0%以上。实施例2称取干燥的厚朴果实粉20g，加入无水乙醇300mL，常温下超声提取60分钟后，旋蒸浓缩至20mL，加入5倍量的蒸馏水，继续旋蒸至无乙醇味，冷冻干燥即得厚朴果实提取物。此法获得的厚朴果实提取物得率可达20. 0%以上。对实施例I和2的提取物进行含量测定总酚含量的测定精密称取没食子酸对照品5mg，转入烧杯中，在烧杯中加入适量的75%乙醇使没食子酸完全溶解后，转移至25mL棕色容量瓶中，用少量75%乙醇荡洗烧杯后，同样转入该容量瓶，再次加入75%乙醇定容至刻度，即得对照品溶液母液。分别从母液中取出lmL、2mL、3mL、4mL、5mL加入到IOmL棕色容量瓶，分别用75%乙醇定容至刻度，即得浓度分别为20 μ g/mL>40 μ g/mL>60 μ g/mL>80 μ g/mL、100 μ g/mL的没食子酸对照品溶液，放置备用。精密量取上述没食子酸对照品溶液各O. 5mL，加入2. 5mL Folin酚试剂(10倍稀释)，混匀后放置3min，加入2mL浓度为75g/L的Na2CO3溶液，在50°C下水浴5min后，冷却至室温，在760nm下检测吸光度，并绘制标准曲线。每个对照品平行测定三次。取提取物
O.5mL，按前述方法进行检测，将结果带入标准曲线方程，计算总酚含量，每个样品平行测定三次。得到厚朴果实提取物中总酚含量约为18%-20%。厚朴酚与和厚朴酚含量的测定参照《中国药典2010年版》中方法，即以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(78 22)为流动相；检测波长为294nm。用HPLC分离检测厚朴酚与和厚朴酚。结果显示厚朴果实中含10%-15%厚朴酚，7%-10%和厚朴酚。实施例3 :厚朴果实提取物MIC值得测定根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)制定的M27-A3微量稀释法测定厚朴果实提取物对四种细菌、四种霉菌和四种念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)。供试菌为大肠杆菌 Escherichia coli (CCAM 080173)、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus (CCAM080177)、枯草芽抱杆菌 Bacillus subtil is (CMCC 63501)、施氏假单胞菌 Pseudomonasstutzeri (CCAM 080041)、黄曲霉Aspergillus fIavusCCCAM 080001)、米曲霉Aspergillusoryzae (CCAM 080006)、黑曲霉 Aspergillus niger (CCAM 080002)、米根霉 Rhizopusoryzae (CCAM 080148)、白色念珠菌 Candida albicans (ATCC 64550)、热带念珠菌Candida tropicalis (032)、克柔念珠菌 Candida krusei (09-1394)、近平滑念珠菌 Candidaparasilosis(07-305)采用二倍稀释法，首先向96孔板每孔中放入100 μ I培养基，然后在第一孔中加入100 μ I厚朴果实提取物(4000 μ g/ml),依次自左向右进行二倍性稀释，最后所得的孔中分别含乙醇提取物浓度范围为31. 25 2000 μ g/ml，再接种100 μ I细菌菌悬液(I X IO8CFU/ml)或霉菌孢子悬浮液(I X 106CFU/ml)或念珠菌菌悬液(I X 104CFU/ml),最终所得的每孔终体积为200 μ 1，倒数第二孔中加入200 μ I所用的培养基作为培养基对照组，倒数第一孔中加入100 μ I菌悬液和100 μ I培养基作为生长对照组，将96孔板加盖后，用封口膜密封以减少培养过程中水分的蒸发，细菌置于37°C、霉菌和念珠菌置于28°C培养箱中培养48h，肉眼观察无菌生长孔所含最低药物浓度即为最小抑菌浓度(MIC)，实验重复3次。实验结果如下表所示，表明厚朴果实提取物对所试的各菌种都有很好的抑制活 性。对四种细菌的MIC均为62. 5 μ g/mL,对四种霉菌的MIC在250-500 μ g/mL之间，对四种念珠菌的MIC在500-1000 μ g/mL之间。表I厚朴果实提取物的MIC
权利要求
1.一种厚朴果实提取物，其特征在于 1)所述的提取物是按下述提取方法获得的 称取干燥的厚朴果实粉，加入无水乙醇，常温下超声提取40-60分钟后，旋蒸浓缩至20-30mL，加入5-7倍量的蒸馏水，继续旋蒸至无乙醇味，冷冻干燥即得厚朴果实提取物； 2)所述的提取物中含有18%-20%总酚，10%-15%厚朴酚，7%-10%和厚朴酚。
2.如权利要求I所述的一种厚朴果实提取物，其特征在于所述的提取方法中厚朴果实粉与无水乙醇的比例为厚朴果实粉/无水乙醇=Ig/(10 15)ml。
3.权利要求I所述厚朴果实提取物的抗细菌用途。
4.权利要求I所述厚朴果实提取物的抗霉菌用途。
5.权利要求I所述厚朴果实提取物的抗念珠菌用途。
6.如权利要求3所述的用途，其中细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌。
7.如权利要求4所述的用途，其中曲霉菌为黄曲霉菌、米曲霉菌、黑曲霉菌、米根霉菌。
8.如权利要求5所述的用途，其中念珠菌为白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种厚朴果实提取物的提取方法及其抗菌用途，本发明采用超声提取方法，制备的厚朴果实提取物含有18%-20%总酚，10%-15%厚朴酚，7%-10%和厚朴酚；本发明的提取方法简单易行，容易操作；所制备的提取物有较好的抗菌用途，可作为抗菌类药物制剂的原料。
文档编号A61K131/00GK102716188SQ20121023925
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月11日 优先权日2012年7月11日
发明者王有为, 田俊, 胡国清, 臧晓燕, 陈玉欣, 陈玲, 马冰馨 申请人:武汉大学