鸭坦布苏病毒弱毒株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸭坦布苏病毒弱毒株，该弱毒株是由鸭坦布苏病毒强毒株FX2010经在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代培养后突变获得。本发明还公开了预防或治疗鸭坦布苏病毒病的疫苗，该疫苗是以上述鸭坦布苏病毒弱毒株为种毒的鸭坦布苏病毒病弱毒活疫苗或灭活疫苗。本发明还公开了用于诊断鸭坦布苏病毒病的检测抗原，该检测抗原为上述鸭坦布苏病毒弱毒株的病毒颗粒。本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株，无论是作为活疫苗还是灭活疫苗，在免疫雏鸭和产蛋鸭后，对强毒攻击的保护率都达到100％，且该鸭坦布苏病毒弱毒株作为检测抗原，具有良好的特异性，因此，该鸭坦布苏病毒弱毒株在鸭坦布苏病毒病的防治与诊断方面具有非常好的应用前景。
【专利说明】鸭坦布苏病毒弱毒株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒【技术领域】，尤其涉及一种由鸭坦布苏病毒强毒株经传代培养使其致病力减弱的鸭坦布苏病毒弱毒株，以及该弱毒株用作鸭坦布苏病毒病的活疫苗、灭活疫苗及诊断抗原的应用。
【背景技术】
[0002]2010年4月以来，我国上海、浙江、江苏等地发生了以肉鸭生长迟缓和蛋鸭产蛋急剧下降为特征的一种传染病，短短几个月时间里，南方各省几乎所有的蛋鸭场都受到了该病的侵袭，给养鸭业造成了巨大的经济损失。国内的研究者通过病毒分离鉴定，病毒基因组序列分析，动物回归试验等实验证明该传染病是由一种新的黄病毒——鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)所引起，该病毒属于黄病毒属Ntaya病毒群。该病毒自发现以来，在我国迅速传播，广泛流行。2010-2012年，该病毒在上海、浙江、江苏、安徽、河南、山东、湖南、湖北、福建、河北等地鸭群中均被检测到。
[0003]鸭坦布苏病毒病为新发传染病，具有高度传染性，且一年四季都可流行，给鸭坦布苏病毒病的防控带来了极大的困难，目前，尚无有效的防控措施，更没有疫苗可用，也没有有效、快速简便的血清学检测方法。
【发明内容】
[0004]本发明要解决目前没有有效的防控鸭坦布苏病毒病的疫苗的技术问题，提供一种鸭坦布苏病毒弱毒株，该弱毒株可用于制备预防鸭坦布苏病毒病的活疫苗或灭活疫苗。
[0005]此外，还需要提供一种上述·鸭坦布苏病毒弱毒株的应用，用于制备检测鸭坦布苏病毒抗体的诊断抗原，可快速、灵敏地检测出鸭坦布苏病毒。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0007]在本发明的一个方面，提供了一种鸭坦布苏病毒弱毒株，该弱毒株是由鸭坦布苏病毒强毒株FX2010经突变获得，所述突变至少包含以下5个氨基酸突变位点--第407位D突变为N、第599位V突变为A、第636位M突变为K、第1050位V突变为A、和第1820位T突变为I。
[0008]本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株，是由鸭坦布苏病毒强毒株FX2010经鸡胚成纤维细胞(CEF)连续培养传代而获得。当鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第60代病毒(FX2010-60P)时出现上述5个氨基酸突变位点，即包括第407位(D突变为N)、第599位(V突变为A)、第636位(M突变为K)、第1050位(V突变为A)和第1820位(T突变为I)，经试验证明这5个氨基酸位点的突变使鸭坦布苏病毒对鸭的致病力减弱，SPFX2010-60P的毒力比其母源毒株FX2010弱。
[0009]鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第80代病毒(FX2010-80P)时，与FX2010-60P相比新增I个氨基酸突变位点，即第442位(Y突变为F)。这个位点的突变使鸭坦布苏病毒FX2010-80P对鸭的致病力减弱，即FX2010-80P的毒力比FX2010-60P弱。[0010]鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第100代病毒(FX2010-100P)时，与FX2010-80P相比新增2个氨基酸突变位点，即第376位(E突变为G)和第444位(A突变为V)。这2个位点的突变使鸭坦布苏病毒FX2010-100P对鸭的致病力减弱，即FX2010-100P 的毒力比 FX2OlO-8OP 弱。
[0011]鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第130代病毒(FX2010-130P)时，与FX2010-100P相比新增3个氨基酸突变位点，即第993位(K突变为R)、第2227位(V突变为A)和2316位(F突变为Y)。这3个位点的突变使鸭坦布苏病毒FX2010-130P对鸭的致病力减弱，即FX2010-130P的毒力比FX2010-100P弱。 [0012]鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第145代病毒(FX2010-145P)时，与FX2010-130P相比新增2个氨基酸突变位点，即第226位(A突变为V)和第2378位(S突变为L)。这2个位点的突变使鸭坦布苏病毒FX2010-145P对鸭的致病力减弱，即FX2010-145P 的毒力比 FX2OlO-13OP 弱。
[0013]鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第168代病毒(FX2010-168P)时，与FX2010-145P相比新增2个氨基酸突变位点和在3' NCR(3'非编码区)上的I个核苷酸突变位点，氨基酸突变位点为第453位(R突变为K)和第3313位(V突变为A)，核苷酸突变位点为3/ NCR上的第246位(T突变为C)。这3个位点的突变使鸭坦布苏病毒FX2010-168P对鸭的致病力减弱，即FX2010-168P的毒力比FX2010-145P弱。
[0014]鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第180代病毒(FX2010-180P)时，与FX2010-168P相比新增4个氨基酸突变位点和在3' NCR(3'非编码区)上的I个核苷酸突变位点，氨基酸突变位点为第980位(R突变为G)、第1435位(V突变为L)、第2171位(F突变为L)和第2793位(R突变为G)，核苷酸突变位点为3' NCR上的第187位(C突变为T)。这5个位点的突变使鸭坦布苏病毒FX2010-180P对鸭的致病力减弱，即FX2010-180P的毒力比FX2010-168P弱。与亲本强毒株FX2010相比，传代毒FX2010-180P共有19个氨基酸的突变以及3'非编码区2个核苷酸的突变，正是这些突变导致了鸭坦布苏病毒致病力的明显减弱，该鸭坦布苏病毒弱毒株FX2010-180P的全基因组核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0015]本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株(FX2010-180P)，已于2012年7月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:V201231，其分类命名为鸭坦布苏病毒弱毒株(FX2010-180P)Duck Tembusu virus (FX2010-180P)。
[0016]在本发明的另一方面，还提供了一种预防或治疗鸭坦布苏病毒病的疫苗，该疫苗是以上述鸭坦布苏病毒弱毒株FX2010-180P为种毒的鸭坦布苏病毒病弱毒活疫苗，或是以上述第60代、80代、100代、130代、145代、168代及180代鸭坦布苏病毒弱毒株为种毒的鸭坦布苏病毒病弱毒灭活疫苗。
[0017]FX2010-180P弱毒株IO3 ciTCID5tl剂量肌肉注射可诱导雏鸭和产蛋鸭产生高滴度的抗体，对强毒攻击的保护率达100% ,该弱毒株可以作为鸭坦布苏病毒病活疫苗的种毒株。
[0018]FX2010-180P弱毒株在CEF和DFl细胞上培养的病毒滴度可达107_°TCID5(l/mL，该病毒细胞培养液灭活并与蛋白佐剂混合乳化后，经肌肉注射可诱导雏鸭和产蛋鸭产生有效的免疫应答，对强毒攻击的保护率达100%，该弱毒株可以作为鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的种毒株。与强毒株相比，用弱毒株生产灭活疫苗具有生物安全的优势，而且，弱毒株更加适应CEF和DFl细胞，在细胞上培养的病毒毒价更高，使灭活疫苗更容易制备和生产。
[0019]在本发明的另一方面，还提供了一种用于诊断鸭坦布苏病毒病的检测抗原，该检测抗原为上述鸭坦布苏病毒弱毒株的病毒颗粒。
[0020]鸭坦布苏病毒弱毒株FX2010-180P的细胞培养液经差速离心纯化后的病毒颗粒，可作为检测抗原检测鸭坦布苏病毒特异性抗体。
[0021]本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株，肌肉注射雏鸭和产蛋鸭7天和14天后，可诱导雏鸭和产蛋鸭产生高滴度的抗体，该鸭坦布苏病毒弱毒株，无论是作为活疫苗还是灭活疫苗，对强毒攻击的保护率都达到100%。此外，该鸭坦布苏病毒弱毒株作为检测抗原，具有良好的特异性。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0023]图1是本发明鸭坦布苏病毒在CEF上连续传代培养导致的不同代次病毒的氨基酸突变点及3’ NCR上的核苷酸突变点列表图；
[0024]图2是本发明实施例3的雏鸭免疫FX2010-180P后7天和14天的抗体效价图；
[0025]图3是本发明实施例3的产蛋鸭免疫FX2010-180P后7天和14天的抗体效价图；
[0026]图4是本发明实施例4的实验鸭免疫灭活疫苗后14天的抗体效价图；
[0027]图5是本发明实施例5的FX2010-180P病毒作为间接ELISA包被抗原检测鸭坦布苏病毒抗体的特异性结果柱状图；
[0028]图6是本发明实施例5的FX2010-180P病毒作为阻断ELISA包被抗原检测鸭坦布苏病毒抗体的特异性结果柱状图。
[0029]本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株(FX2010-180P)，已于2012年7月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:V201231，其分类命名为鸭坦布苏病毒弱毒株(FX2010-180P)Duck Tembusu virus (FX2010-180P)。
【具体实施方式】
[0030]下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京:科学出版社，2004)中所述的方法进行。
[0031]为了研制能有效防控鸭坦布苏病毒病的疫苗，本发明通过将鸭坦布苏病毒强毒株FX2010 (本实验室分离获得的鸭坦布苏病毒奉贤2010分离株，参见已发表的文章YanP，Zhao Y，Zhang X，Xu D，Dai X，Teng Q，Yan L，Zhou J，Ji X，Zhang S，Liu G Zhou Y，Kawaoka Y，Tong G, Li Z.An infectious disease of ducks caused by a newly emergedTembusu virus strain in mainland China.Virology.2011.417 (I):1_8)经鸡胚成纤维细胞(CEF)连续传代培养并用有限稀释法纯化而获得了新的鸭坦布苏病毒弱毒株，该弱毒株具有连续传代过程中产生的多个氨基酸及核苷酸的突变，这些氨基酸及核苷酸的突变是鸭坦布苏病毒致病力减弱的直接原因，其中第180代病毒即FX2010-180P弱毒株对鸭的致病力最弱，其作为鸭坦布苏病毒病弱毒活疫苗效果最佳；第60代、80代、100代、130代、145代、168代及180代弱毒株，都适于制成有效的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，只是第180代弱毒株由于致病力最弱，用于生产灭活疫苗时相对具有生物安全的优势。[0032]在下面的具体实施例中，第180代病毒(FX2010-180P)高剂量(105_5TCID5tl)接种对雏鸭及产蛋鸭不引起任何不良反应，也没有对鸭造成任何明显的病理损伤。该弱毒株IO3 tlTCID5ci的剂量肌肉注射可诱导雏鸭和产蛋鸭产生高滴度的抗体，对强毒攻击的保护率达100%;该毒株在CEF或DFl细胞上培养的病毒滴度可达107_°TCID5(l/mL，该病毒细胞培养液灭活并与蛋白佐剂混合乳化后，经肌肉注射可诱导雏鸭和产蛋鸭产生有效的免疫应答，对强毒攻击的保护率达100% ;该毒株经纯化后的病毒颗粒可以作为检测抗原检测鸭坦布苏病毒特异性抗体。
[0033]由此可知，本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株可作为预防或治疗鸭坦布苏病毒病的活疫苗或灭活疫苗的生产毒株，也可作为检测鸭坦布苏病毒病特异性抗体的检测抗原，在鸭坦布苏病毒病的防治与诊断方面具有很好的应用前景。
[0034]实施例1鸭坦布苏病毒传代培养及序列分析
[0035]用分离到的在自然界中引起鸭发病的鸭坦布苏病毒强毒株FX2010，接种鸡胚成纤维细胞(CEF)长成单层的T75细胞培养瓶，每瓶接种ImL病毒液，吸附1_2小时后，弃去病毒液，加入12mL含10%胎牛血清的DMEM培养液，36-72小时后，吸取培养上清液，再接种CEF长成单层的T75细胞培养瓶，连续传代培养173代，然后用有限稀释法纯化5次后，传代至第180代。把第60代、80代、100代、130代、145代、168代及180代病毒进行全基因测序，结果如图1所示(图1中，灰色阴影表示与前面测序的病毒基因相比新增加的突变点；氨基酸位置是指该位点在多聚蛋白上的位置；核苷酸位置是指该位点在3, NCR上的位置)，鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF传代至第60代(FX2010-60P)时，发生了 5个氨基酸的突变，而第 80 代(FX2010-80P)、100 代(FX2010-100P)、130 代(FX2010-130P)和145代(FX2010-145P)病毒分别新增1、2、3和2个氨基酸的突变，第168代(FX2010-168P)和180代(FX2010-180P)分别新增2个和4个氨基酸突变，并在3' NCR分别新增I个核苷酸突变。与亲本强毒株FX2010相比，传代毒FX2010-180P共有19个氨基酸的突变以及3'非编码区2个核苷酸的突变，正是这些突变导致了鸭坦布苏病毒致病力的明显减弱，该鸭坦布苏病毒弱毒株FX2010-1·80P的全基因组核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。鸭坦布苏病毒FX2010强毒株在传代培养过程中的突变点，第226、376、407、442、444、453、599、636、980、993、1050、1435、1820、2171、2227、2316、2378、2793、3313 位氨基酸分别位于 Μ、E、NS1、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5蛋白上，2个核苷酸突变点位于Y NCR上。本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株(FX2010-180P)，已于2012年7月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:V201231，其分类命名为鸭坦布苏病毒弱毒株(FX2010-180P)Duck Tembusu virus (FX2010-180P)。
[0036]实施例2不同代次病毒对鸭的致病力分析
[0037]把上述实施例1中不同代次病毒感染雏鸭和产蛋鸭，通过观察鸭的临床症状，剖检后的病理变化以及病毒在鸭体内的增殖及分布情况，分析不同代次病毒对鸭的致病力。具体方法如下:
[0038](I)雏鸭鼻腔感染试验
[0039]60只21日龄健康雏鸭，随机分成6组，每组10只。第1_5组分别鼻腔接种FX2010 (剂量为 IO3.5TCID50)、FX2010-60P、FX2010-80P、FX2010_100P 和 FX2010-130P (剂量为IO5 5TCID5tl),第6组为空白对照组。接种后第4天，剖检，观察脏器的病理变化，并取脾、肺、肾和脑等组织，每克组织加lmLPBS，研磨后，离心，取上清，用DF-1细胞分离病毒。
[0040](2)产蛋鸭鼻腔感染试验
[0041]60只180日龄健康产蛋鸭，随机分成6组，每组10只。第1_5组分别鼻腔接种FX2010 (剂量为 IO3.5TCID50)、FX2010-60P、FX2010-80P、FX2010_100P 和 FX2010-130P (剂量为IO5 5TCID5tl),第6组为空白对照组。接种后第4天，剖检，观察脏器的病理变化，并取脾、肺、肾、脑和卵巢组织，每克组织加lmLPBS，研磨后，离心，取上清，用DF-1细胞分离病毒。
[0042](3)雏鸭肌肉注射感染试验
[0043]70只21日龄健康雏鸭，随机分成7组，每组10只。第1_6组分别肌肉注射FX2010(剂量为 IO3 5TCID5tl)、FX2010-100P、FX2010-130P、FX2010-145P、FX2010-168P 和FX2010-180P (剂量为105_ 5TCID50)，第7组为空白对照组。接种后第4天，剖检，观察脏器的病理变化，并取脾、肺、肾和脑等组织，每克组织加lmLPBS，研磨后，离心，取上清，用DF-1细胞分离病毒。其中，FX2010、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭另外取心脏、肝脏、气管、胰脏、法氏囊和小肠等组织分离病毒。
[0044](4)产蛋鸭肌肉注射感染病毒
[0045]70只180日龄健康产蛋麻鸭，随机分成7组，每组10只。第1_6组分别肌肉注射 FX2010(剂量为 103.5TCID5tl)、FX2010-100P、FX2010-130P、FX2010-145P、FX2010-168P 和FX2010-180P(剂量为IO5 5TCID5tl),第7组为空白对照组。接种后第4天，剖检，观察脏器的病理变化，并取脾、肺、肾、脑和卵巢等组织，每克组织加lmLPBS，研磨后，离心，取上清，用DF-1细胞分离病毒。其中，FX2010、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭另外取心脏、肝脏、气管、胰脏、小肠等组织分离病毒。
[0046]上述试验结果如下:
[0047]1、不同代次病毒鼻腔感染对雏鸭的致病力(见下表1)
[0048]表1雏鸭鼻腔感染不同代次病毒的评价总结
[0049]
【权利要求】
1.一种鸭坦布苏病毒弱毒株，其特征在于，该弱毒株是由鸭坦布苏病毒强毒株FX2010经突变获得，所述突变至少包含以下5个氨基酸突变位点:第407位D突变为N、第599位V突变为A、第636位M突变为K、第1050位V突变为A、和第1820位T突变为I。
2.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒弱毒株，其特征在于，所述突变的氨基酸位点还包含:第442位Y突变为F。
3.根据权利要求2所述的鸭坦布苏病毒弱毒株，其特征在于，所述突变的氨基酸位点还包含:第376位E突变为G、第444位A突变为V。
4.根据权利要求3所述的鸭坦布苏病毒弱毒株，其特征在于，所述突变的氨基酸位点还包含:第993位K突变为R、第2227位V突变为A、第2316位F突变为Y。
5.根据权利要求4所述的鸭坦布苏病毒弱毒株，其特征在于，所述突变的氨基酸位点还包含:第226位A突变为V、第2378位S突变为L。
6.根据权利要求5所述的鸭坦布苏病毒弱毒株，其特征在于，所述突变还包含2个氨基酸突变位点和I个核苷酸突变位点，其中，氨基酸突变位点为第453位R突变为K和第3313位V突变为A，核苷酸突变位点为3'非编码区的第246位T突变为C。
7.根据权利要求6所述的鸭坦布苏病毒弱毒株，其特征在于，所述突变还包含4个氨基酸突变位点和I个核苷酸突变位点，其中，氨基酸突变位点为第980位R突变为G、第1435位V突变为L、第2171位F突变为L和第2793位R突变为G，核苷酸突变位点为3'非编码区的第187位C突变为T。
8.根据权利要求7所述的鸭坦布苏病毒弱毒株，其特征在于，该弱毒株的保藏号为CCTCC NO:V201231o
9.一种预防或治疗鸭坦布苏病毒病的疫苗，其特征在于，该疫苗是以权利要求7或8所述的鸭坦布苏病毒弱毒株为种毒的鸭坦布苏病毒病弱毒活疫苗，或是以权利要求1至8中任一项所述的鸭坦布苏病毒弱毒株为种毒的鸭坦布苏病毒病弱毒灭活疫苗。
10.一种用于诊断鸭坦布苏病毒病的检测抗原，其特征在于，该检测抗原为权利要求1至8中任一项所述的鸭坦布苏病毒弱毒株的病毒颗粒。
【文档编号】A61P31/14GK103571798SQ201210279232
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月7日 优先权日:2012年8月7日
【发明者】李泽君, 李国新, 肖亚莉, 李雪松, 滕巧泱 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所